一種快速止血抗菌羧化淀粉-聚賴氨酸微球及其制備方法，該方法涉及醫(yī)療器械領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：人體受傷或經(jīng)手術(shù)后由于動(dòng)脈破裂、臟器破裂等原因大量出血，若不及時(shí)進(jìn)行阻止會(huì)導(dǎo)致失血過多而危及生命。這無疑成為了日常意外事故或戰(zhàn)傷死亡的主要原因，其中特別是血管豐富密集的四肢與軀干交界處出血或在腦、腎臟、肝臟和病變腫瘤等處手術(shù)時(shí)出血，同時(shí)出血部位容易感染金葡菌、綠膿桿菌和組溶血性鏈球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌與陰性菌，而且不宜壓迫包扎、縫合等機(jī)械性止血，以致快速安全地止血較為困難。目前，急需一種在外科手術(shù)、外傷急救、家庭自救等出血時(shí)進(jìn)行高效止血的具有良好生物相容性、使用方便且價(jià)格已被廣泛接受的可吸收降解性安全止血材料。因此，研發(fā)止血效果好、無毒副作用且易于生產(chǎn)加工的止血材料已成為目前研究的熱點(diǎn)，這對(duì)傷情緩解、手術(shù)成功率等起到了尤為重要的作用。目前，應(yīng)用于外科及外傷出血的止血材料主要包括：殼聚糖類止血材料、淀粉型多聚糖止血材料、氧化纖維素和氧化再生纖維素、纖維蛋白膠等。其中近年來被廣為推崇的是由美國(guó)Medafor公司生產(chǎn)的。AristaTM是一種以馬鈴薯淀粉為原料制備的止血微球，其有效成分是多微孔多聚糖，具有較強(qiáng)的吸水性，能夠較快地吸收血液中的水分，同時(shí)因?yàn)槠渚植磕蜃訚舛鹊脑龃?，加快了?nèi)源性凝血，達(dá)到了牢固、可靠止血的效果。但這種止血材料除了吸水性不夠強(qiáng)、吸水倍數(shù)低、無抑菌性能外，其采用的交聯(lián)劑是表氯醇，存在潛在毒性而且價(jià)格昂貴，不適合大量規(guī)模化生產(chǎn)，極大地限制了它的廣泛應(yīng)用。其次是臨床上使用較廣的美國(guó)強(qiáng)生公司生產(chǎn)的可溶性止血紗布Surgicel，屬于羧甲基纖維素類止血材料。據(jù)報(bào)道雖然止血效果增加且其產(chǎn)生的高酸環(huán)境有一定的抗菌能力，但這種高酸性的化學(xué)環(huán)境會(huì)經(jīng)彌漫性的化學(xué)機(jī)制導(dǎo)致神經(jīng)損傷，應(yīng)避免直接用于外圍神經(jīng)。另外StarchMedicalInc公司研制出的產(chǎn)品PerClotTM也是一種在體內(nèi)可降解吸收、相容性好，同時(shí)能迅速形成凝血塊并在局部發(fā)揮機(jī)械屏障作用的止血材料，但其抗菌能力較弱，安全性較低。基于當(dāng)今市場(chǎng)上各種止血材料以及淀粉微球具有高度三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、比表面積大可達(dá)到增強(qiáng)吸水效果等特點(diǎn)，制備止血微球作為理想的止血材料具有很大優(yōu)勢(shì)。目前制備淀粉類微球的方法有物理法、化學(xué)法、反相懸浮聚合法等。球磨技術(shù)是制備淀粉類微球的一種物理方法，主要以水或乙醇為介質(zhì)，淀粉顆粒在機(jī)械力的作用下發(fā)生破碎。該法制備的淀粉微球粒徑較大，不均勻，動(dòng)力消耗大，成本高，少部分淀粉顆粒外表面破裂、粗糙，水解、酶解速度也大大加快。其中個(gè)別顆粒表面雖沒有任何變化，但內(nèi)部已經(jīng)破裂。而反相懸浮聚合法是近年來發(fā)展起來的制備淀粉微球的一種新型乳液聚合技術(shù)，即將淀粉溶液分散于一定體積的油相中制成油包水型反相乳液后，加入適量交聯(lián)劑，直接使淀粉高分子交聯(lián)成微球。制備淀粉微球所采用的反相懸浮聚合法不僅工藝簡(jiǎn)單易行，而且所得的淀粉微球具有較堅(jiān)固的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，在被淀粉酶降解前其形狀能保持相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。此外，反相懸浮聚合法還能使水溶性單體有效地聚合成粉狀或乳狀產(chǎn)物，其反應(yīng)條件溫和，副反應(yīng)少，便于使用。本發(fā)明是利用反相懸浮聚合法，將備受目前國(guó)內(nèi)外關(guān)注的具有止血性能、可生物降解的羧化淀粉與抑菌活性較強(qiáng)的聚賴氨酸制備成止血抗菌微球，能夠達(dá)到止血快速安全、抑菌活性高、毒副作用最少、刺激性最弱且生產(chǎn)成本低、易于工業(yè)生產(chǎn)的止血抗菌材料，在生活中的各方面及生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供了一種快速止血抗菌羧化淀粉-聚賴氨酸微球及其制備方法，這種微球是既有止血性能，又有極強(qiáng)的抑菌能力的生物可吸收降解性材料，主要成分為羧化淀粉和ε-聚賴氨酸。羧化淀粉是一種能起到凝血作用的生物改性多聚糖，同時(shí)具有良好的組織相容性；ε-聚賴氨酸是一種具有抑菌功效的多肽，是賴氨酸的直鏈狀聚合物，具有抑菌譜廣、熱穩(wěn)定性好、水溶性好、安全性高等特性。將羧化淀粉與ε-聚賴氨酸經(jīng)乳化交聯(lián)制備成止血抗菌微球，達(dá)到了止血與抑菌的雙重效果。一種快速止血抗菌羧化淀粉-聚賴氨酸微球及其制備方法，其主要特征在于所述方法包括如下步驟：(1)制備水相溶液：每次吸取20～100μLε-聚賴氨酸的水溶液(1.0～4.5％)在300～1500r/min高速攪拌下滴定到裝有10～50mL的羧化淀粉溶液(0.3～0.6g/mL)中，制備得到羧化淀粉-聚賴氨酸水相溶液。(2)乳化交聯(lián)：將乳化劑加入到分散劑中分散，40～60℃下攪拌0.5～2h，再將步驟(1)中溶液加入到分散劑中，乳化0.5～2.5h，溫度為30～50℃，高速攪拌使體系呈乳液狀，然后將交聯(lián)劑逐滴加入到溶液中，滴加完后攪拌2～6h。(3)精制微球：將步驟(2)中溶液置于透析袋中透析，抽濾，用乙酸乙酯、無水乙醇和蒸餾水依次洗滌3-6次后，干燥、篩分、輻射滅菌，制得止血抗菌微球。本發(fā)明主要是將羧化淀粉與ε-聚賴氨酸交聯(lián)成一種既具有高吸液能力、高止血能力，又能夠有效防止各種細(xì)菌對(duì)傷口感染的快速止血抗菌材料，在羧化淀粉的止血性能基礎(chǔ)上大大提高了其抑菌能力，而且制備微球的原料來源廣泛，成本低廉，工藝簡(jiǎn)便，易于規(guī)?；a(chǎn)。附圖說明圖1為止血抗菌微球1#與AristaTM吸水速率比較圖圖2為止血抗菌微球1#與AristaTM吸水倍率比較圖圖3為止血抗菌微球1#與AristaTM抑菌率比較圖具體體實(shí)施方式現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)闡述，下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述說明限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1(1)羧化淀粉-聚賴氨酸水相溶液的制備每次吸取20μLε-聚賴氨酸的水溶液(1.0％)在300r/min高速攪拌下滴定到裝有10mL的羧化淀粉溶液(0.3g/mL)中，制備得到羧化淀粉-聚賴氨酸溶液。(2)乳化交聯(lián)復(fù)合物的制備將乳化劑按1∶100g/mL的配比加入到植物油中分散，40℃恒溫水浴中攪拌0.5h，再將步驟(1)中溶液按1∶1(V/V)加入到植物油中，乳化0.5h，溫度為30℃，高速攪拌使體系呈乳液狀，然后將三氯氧磷酯按其與水相溶液1∶4g/mL的配比逐滴加入到溶液中，滴加完后攪拌2h。(3)微球的精制將步驟(2)的溶液置于透析袋中透析，抽濾，依次用乙酸乙酯、無水乙醇和蒸餾水各洗滌3次后，干燥、篩分、鈷60輻射滅菌，制得止血抗菌微球。實(shí)施例2(1)羧化淀粉-聚賴氨酸水相溶液的制備每次吸取40μLε-聚賴氨酸的水溶液(2％)在500r/min高速攪拌下滴定到裝有20mL的羧化淀粉溶液(0.4g/mL)中，制備得到羧化淀粉-聚賴氨酸溶液。(2)乳化交聯(lián)復(fù)合物的制備將乳化劑按1∶200g/mL的配比加入到植物油中分散，45℃恒溫水浴中攪拌1h，再將步驟(1)中溶液按1∶1.1(V/V)加入到植物油中，乳化1h，溫度為35℃，高速攪拌使體系呈乳液狀，然后將三偏磷酸鈉按其與水相溶液1∶8g/mL的配比逐滴加入到溶液中，滴加完后攪拌3h。(3)微球的精制將步驟(2)的溶液置于透析袋中透析，抽濾，依次用乙酸乙酯、無水乙醇和蒸餾水各洗滌4次后，干燥、篩分、鈷60輻射滅菌，制得止血抗菌微球。實(shí)施例3(1)羧化淀粉-聚賴氨酸水相溶液的制備每次吸取60μLε-聚賴氨酸的水溶液(2.5％)在300～1500r/min高速攪拌下滴定到裝有30mL的羧化淀粉溶液(0.5g/mL)中，制備得到羧化淀粉-聚賴氨酸溶液。(2)乳化交聯(lián)復(fù)合物的制備將乳化劑按1∶300g/mL的配比加入到液體石蠟中分散，50℃恒溫水浴中攪拌1.5h，再將步驟(1)中溶液按1∶1.3(V/V)加入到液體石蠟中，乳化1.5h，溫度為40℃，高速攪拌使體系呈乳液狀，然后將多聚磷酸鈉按其與水相溶液1∶12g/mL的配比逐滴加入到溶液中，滴加完后攪拌3.5h。(3)微球的精制將步驟(2)的溶液置于透析袋中透析，抽濾，依次用乙酸乙酯、無水乙醇和蒸餾水各洗滌4次后，干燥、篩分、鈷60輻射滅菌，制得止血抗菌微球。實(shí)施例4(1)羧化淀粉-聚賴氨酸水相溶液的制備每次吸取80μLε-聚賴氨酸的水溶液(4％)在300～1500r/min高速攪拌下滴定到裝有50mL的羧化淀粉溶液(0.6g/mL)中，制備得到羧化淀粉-聚賴氨酸溶液。(2)乳化交聯(lián)復(fù)合物的制備將乳化劑按1∶500g/mL的配比加入到液體石蠟中分散，60℃恒溫水浴中攪拌2h，再將步驟(1)中溶液按1∶1.5(V/V)加入到液體石蠟中，乳化2h，溫度為45℃，高速攪拌使體系呈乳液狀，然后將多聚磷酸鈉按其與水相溶液1∶20g/mL的配比逐滴加入到溶液中，滴加完后攪拌4h。(3)微球的精制將步驟(2)的溶液置于透析袋中透析，抽濾，依次用乙酸乙酯、無水乙醇和蒸餾水各洗滌5次后，干燥、篩分、鈷60輻射滅菌，制得止血抗菌微球。實(shí)施例5吸水性能對(duì)比實(shí)驗(yàn)本發(fā)明中采用毛細(xì)管法測(cè)定止血抗菌微球的吸水性能，注水于酸式滴定管內(nèi)至酸式滴定管零刻度液面與砂芯漏斗濾板下端齊平。將濾紙放入砂芯漏斗，完全接觸于濾板。打開活塞至濾紙完全吸水，讀取滴定管刻度數(shù)據(jù)，作為初始零刻度。關(guān)閉活塞，稱取0.1g止血抗菌微球1#，均勻鋪在濾紙上，同時(shí)打開活塞，從液面開始下降，于25s，50s，75，100s計(jì)時(shí)觀察液面下降距離，計(jì)算樣品吸水速度及在單位時(shí)間內(nèi)的吸水飽和情況。本發(fā)明實(shí)施例中的止血抗菌微球1#與AristaTM(Medafor公司，美國(guó))吸水性能作對(duì)照，測(cè)定結(jié)果見下表1。表1止血抗菌微球1#與AristaTM吸水性比較止血抗菌微球1#AristaTM吸水速率(mL/g)(第一個(gè)25s)0.33460.2013吸水速率(mL/g)(第二個(gè)25s)0.14350.0463吸水速率(mL/g)(第三個(gè)25s)0.09290.0275吸水速率(mL/g)(第四個(gè)25s)0.04150.0101吸水倍率(mL/g)19.26.3吸水速率分別為在第一，第二，第三和第四個(gè)25s內(nèi)吸水的平均速度，即20s內(nèi)1g樣品的吸水量(mL)。參閱圖1為止血抗菌微球1#與AristaTM吸水速率比較圖所示，并由表1中結(jié)果表明本發(fā)明的止血抗菌微球1#分別在四個(gè)25s內(nèi)的吸水速率均明顯大于AristaTM，說明止血抗菌微球1#比AristaTM吸水更快，更高效。吸水倍率是指1g樣品所能吸水的最大量(mL)。參閱圖2為止血抗菌微球1#與AristaTM吸水倍率比較圖所示，并由表1可見，本發(fā)明的止血抗菌微球1#相對(duì)于AristaTM，其吸水倍率明顯提高，約為AristaTM的3倍。實(shí)施例6鼠肝滲血止血實(shí)驗(yàn)取實(shí)驗(yàn)用小白鼠10只(體重為250～300g，雌雄不限)，隨機(jī)分組，每組5只，分為止血抗菌微球1#實(shí)驗(yàn)組和AristaTM對(duì)照組。將鼠稱重，耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉30～40mg/kg麻醉，固定于手術(shù)臺(tái)上，剪除腹部的毛，無菌操作打開腹腔，暴露肝臟，用手術(shù)刀片在肝臟上劃出長(zhǎng)約1cm，深約0.5cm的交叉?zhèn)?，立即在傷口處依次覆蓋由實(shí)施例1制備的止血抗菌微球1#和已稱重紗布，并于紗布放置砝碼以壓迫止血，即刻起開始計(jì)時(shí)，用紗布按壓20、40、60s，AristaTM對(duì)照組按上述步驟同樣處理，觀察各組止血情況，記錄止血成功例數(shù)見下表2。表2止血抗菌微球1#與AristaTM止血時(shí)間比較止血抗菌微球1#實(shí)驗(yàn)組AristaTM對(duì)照組按壓20s成功止血例數(shù)3/51/5按壓40s成功止血例數(shù)5/53/5按壓60s成功止血例數(shù)5/54/5實(shí)施例7鼠股動(dòng)脈穿刺出血止血實(shí)驗(yàn)取實(shí)驗(yàn)用小白鼠10只(體重為250～300g，雌雄不限)，隨機(jī)分組，每組5只，分為止血抗菌微球1#實(shí)驗(yàn)組和AristaTM對(duì)照組。將鼠稱重，耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉30～40mg/kg麻醉，預(yù)定于手術(shù)臺(tái)上，暴露股動(dòng)脈，用6號(hào)針頭穿刺暴露好的股動(dòng)脈，自由噴血后用紗布拭去多余血液，然后立即在傷口處依次覆蓋止血抗菌微球1#和已稱重紗布，并于紗布放置砝碼以壓迫止血，即刻起開始計(jì)時(shí)，用紗布按壓20、40、60s，AristaTM對(duì)照組按上述步驟同樣處理，觀察各組止血情況，記錄止血成功例數(shù)見下表3。表3止血抗菌微球1#與AristaTM在不同止血時(shí)間內(nèi)成功止血例數(shù)比較止血抗菌微球1#實(shí)驗(yàn)組AristaTM對(duì)照組按壓20s成功止血例數(shù)4/51/5按壓40s成功止血例數(shù)5/53/5按壓60s成功止血例數(shù)5/54/5表2、3的結(jié)果均表明止血抗菌微球1#實(shí)驗(yàn)組和AristaTM對(duì)照組在按壓20、40、60s成功止血例數(shù)有明顯不同，前者較后者多，說明止血抗菌微球1#較AristaTM的止血效果好、效率高。實(shí)施例8抑菌效果檢測(cè)實(shí)驗(yàn)將金葡菌9h肉湯培養(yǎng)物制成菌懸液，取被試樣液(止血抗菌微球1#和AristaTM)和對(duì)照樣液(5mL)各2管。取上述菌懸液，分別在每個(gè)被試樣液和對(duì)照樣液內(nèi)滴加100μL，混合均勻。開始計(jì)時(shí)，作用20min，分別取樣液(0.5mL)投入含5mLPBS的試管內(nèi)，充分混勻，作適當(dāng)稀釋，然后取其中2～3個(gè)稀釋度，分別吸取1ml，置于3個(gè)平皿，用涼至40～45℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15mL作傾注，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使其充分均勻，瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平板，37℃培養(yǎng)48h，作活菌菌落計(jì)數(shù)，試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算抑菌率，見下表4。表4止血抗菌微球1#和AristaTM抑菌率比較樣品類型抑菌率(％)5mLPBS05mL止血抗菌微球1#90.85mLAsritaTM40.2參閱圖3為止血抗菌微球1#與AristaTM抑菌率比較圖所示，并由表4中結(jié)果表明止血抗菌微球的抑菌率高達(dá)90.8％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于AristaTM的抑菌水平，具有較強(qiáng)的抑菌效果，對(duì)傷口處細(xì)菌殺傷能力較強(qiáng)。上述實(shí)施例均為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，任何其他的未背離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性操作或工藝方法與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化等，均應(yīng)為本發(fā)明的等效置換，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明快速止血抗菌微球，制備步驟簡(jiǎn)單、易操作，成本低廉，止血效果好且抗菌性能強(qiáng)，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3