本發(fā)明涉及一類(lèi)基于纖維素的抗菌止血微球的制備方法，屬于功能高分子材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在各種突發(fā)事故和急救中，對(duì)傷員出血?jiǎng)?chuàng)面的快速而有效的止血，對(duì)于改善急救效果和存活率具有重要意義。因此，開(kāi)發(fā)用于大面積深層次噴射狀出血的快速止血材料，具有重要的臨床用用價(jià)值。
天然高分子材料纖維素具有良好的生物相容性和生物可降解性，基于纖維素的止血微球材料已有較多報(bào)道。但目前已有的微球材料雖然止血效果良好，但不具有抗菌性能，在止血后，由于微球較強(qiáng)的親水性能，容易造成傷口的細(xì)菌滋生和感染。此外，目前所制備的纖維素基止血微球材料大量使用環(huán)氧氯丙烷、三羥甲基丙烷等化學(xué)交聯(lián)劑，交聯(lián)劑的殘留容易引起較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，影響微球的生物相容性。
目前可在微球中復(fù)合的抗菌成分，銀由于其較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，不適宜使用；抗生素已被世界衛(wèi)生組織限制使用；季銨鹽、殼聚糖等陽(yáng)離子抗菌劑雖具有一定的抗菌性，但不具有廣譜性、且容易因細(xì)菌的耐藥性而失去抗菌效果；茶樹(shù)油等天然精油，具有較強(qiáng)的抗菌性能，且源自天然，適合于在止血微球中使用以提高其抗菌性能。
但茶樹(shù)油由于其疏水性，在天然高分子纖維素制備的微球中復(fù)合時(shí)，包埋效率低，穩(wěn)定性差，嚴(yán)重影響了微球?qū)Σ铇?shù)油的復(fù)合效果和抗菌性能的實(shí)現(xiàn)。
基于上述問(wèn)題，本發(fā)明擬實(shí)現(xiàn)一種可對(duì)茶樹(shù)油進(jìn)行穩(wěn)定包埋的抗菌性纖維素基止血微球的制備方法，以提高其抗菌性能。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為了解決傳統(tǒng)基于纖維素的止血微球不具有抗菌性能，且生物相容性差，而提供一類(lèi)基于纖維素的抗菌止血微球的制備方法。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
本發(fā)明的一類(lèi)基于纖維素的抗菌止血微球的制備方法，具體制備步驟如下：
1)將兩親性纖維素衍生物以質(zhì)量濃度為0.1～5％溶于有機(jī)溶劑中，獲得溶液A；
2)將海藻酸鹽以質(zhì)量濃度為0.1～15％溶解于水中，獲得溶液B；
3)將溶液A和B以質(zhì)量比為1:1～8:1混合，獲得溶液C，并加入占溶液C質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01～0.5％的水包油型乳化劑、占溶液C質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1～2.0％的茶樹(shù)油，在30～80℃條件下加熱攪拌反應(yīng)1～10h；
4)將步驟3)得到的反應(yīng)液體通過(guò)離心將微球分離，用洗滌助劑進(jìn)行洗滌，過(guò)濾、干燥后獲得微球產(chǎn)物。
所述的兩親性纖維素衍生物為羧甲基纖維素接枝聚乳酸、羧甲基纖維素接枝聚丙烯酸甲酯、羧甲基纖維素接枝聚丙烯酸乙酯、羧甲基纖維素接枝聚丙烯酸丙酯、羧甲基纖維素接枝聚丙烯酸正丁酯、羧甲基纖維素接枝聚丙烯酸叔丁酯、羧甲基纖維素接枝聚己內(nèi)酯、羧甲基纖維素接枝-聚-(4-乙烯基吡啶)、羧甲基纖維素接枝聚異丙基丙烯酰胺、羧甲基-羥丁基纖維素、羧甲基-羥戊基纖維素、羧甲基-羥己基纖維素、羧甲基-羥庚基纖維素、羧甲基-羥辛基纖維素、羧甲基-羥壬基纖維素、羧甲基-羥癸基纖維素、羧甲基-羥十一基纖維素、羧甲基-羥十二基纖維素、羧甲基纖維素接枝膽固醇、羧甲基纖維素接枝-聚-(N,N-二己基丙烯酰胺)中的一種；
所述的有機(jī)溶劑為乙醇、丙酮、甲醇中的一種；
所述海藻酸鹽為海藻酸鈉，海藻酸鉀，海藻酸銨，海藻酸鈣中的一種；
所述的水包油型乳化劑為十二烷基磺酸鈉、失水山梨醇單油酸酯聚氧乙烯醚、聚氧乙烯脂肪醇醚、烷基酚聚氧乙烯醚、十二烷基氧化胺中的一種；
所述的洗滌助劑為二甲基亞砜或N,N-二甲基乙酰胺。
有益效果：
本發(fā)明通過(guò)乳化內(nèi)凝膠法，通過(guò)兩親性纖維素衍生物在水包油型乳液液滴內(nèi)進(jìn)行疏水締合內(nèi)交聯(lián)，形成具有交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的微球材料；該交聯(lián)過(guò)程不用外加交聯(lián)劑，避免了化學(xué)交聯(lián)劑進(jìn)行微球交聯(lián)所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。在兩親性纖維素衍生物中復(fù)合海藻酸鹽，保證微球具有一定的親水性能，可繼續(xù)保持微球的止血效應(yīng)。乳化內(nèi)凝膠制備微球的過(guò)程，確保了茶樹(shù)油在微球中穩(wěn)定的復(fù)合，提高了微球的抗菌效果。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，茶樹(shù)油的加入可促進(jìn)兩親性纖維素中疏水集團(tuán)的疏水締合作用，可提高微球的交聯(lián)效果和穩(wěn)定性。此外，還發(fā)現(xiàn)使用海藻酸鹽可提高茶樹(shù)油的包合率，獲得止血性能更好的微球。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1：將0.5g羧甲基纖維素接枝聚乳酸溶于99.5g乙醇中，獲得溶液A。將0.5g海藻酸鈉溶解于49.5g水中，獲得溶液B，將上述溶液A和B混合，并加入0.075g的乳化劑Tween-80，以及1.5g的茶樹(shù)油，在50℃條件下加熱攪拌3h。將微球離心后，用DMSO進(jìn)行洗滌，過(guò)濾、干燥后獲得微球產(chǎn)物。
實(shí)施例2：將0.4g羧甲基纖維素接枝聚乳酸溶于79.6g乙醇中，獲得溶液A。將0.7g海藻酸鉀溶解于69.3g水中，獲得溶液B，將上述溶液A和B混合，并加入0.075g的乳化劑Tween-80，以及1.5g的茶樹(shù)油，在50℃條件下加熱攪拌3h。將微球離心后，用DMSO進(jìn)行洗滌，過(guò)濾、干燥后獲得微球產(chǎn)物。
實(shí)施例3：將2g羧甲基纖維素接枝聚丙烯酸叔丁酯溶于98g丙酮中，獲得溶液A。將2g海藻酸鈉溶解于18g水中，獲得溶液B，將上述溶液A和B混合，并加入0.12g的乳化劑AEO-9，以及1.8g的茶樹(shù)油，在70℃條件下加熱攪拌1h。將微球離心后，用DMAc進(jìn)行洗滌，過(guò)濾、干燥后獲得微球產(chǎn)物。
實(shí)施例4：將4.5g羧甲基纖維素接枝-聚-(4-乙烯基吡啶)溶于95.5g乙醇中，獲得溶液A。將3g海藻酸銨溶解于27g水中，獲得溶液B，將溶液A和B混合，并加入0.026g的乳化劑十二烷基氧化胺，以及1.3g的茶樹(shù)油，在40℃條件下加熱攪拌8h。將微球離心后，用洗滌助劑進(jìn)行洗滌，過(guò)濾、干燥后獲得微球產(chǎn)物。
實(shí)施例5：將2g羧甲基-羥癸基纖維素溶于98g甲醇中，獲得溶液A。將2g海藻酸鉀溶解于18g水中，獲得溶液B，將上述溶液A和B混合，并加入0.1g的乳化劑十二烷基磺酸鈉，以及1.5g的茶樹(shù)油，在40℃條件下加熱攪拌3h。將微球離心后，用洗滌助劑進(jìn)行洗滌，過(guò)濾、干燥后獲得微球產(chǎn)物。
實(shí)施例6(實(shí)施例1的對(duì)照實(shí)施例，不用茶樹(shù)油)：將0.5g羧甲基纖維素接枝聚乳酸溶于99.5g乙醇中，獲得溶液A。將0.5g海藻酸鈉溶解于49.5g水中，獲得溶液B，將上述溶液A和B混合，并加入0.075g的乳化劑Tween-80，在50℃條件下加熱攪拌3h。將微球離心后，用DMSO進(jìn)行洗滌，過(guò)濾、干燥后獲得微球產(chǎn)物。
實(shí)施例7(實(shí)施例1的對(duì)照實(shí)施例，不用海藻酸鈉)：將0.5g羧甲基纖維素接枝聚乳酸溶于99.5g乙醇中，獲得溶液A。將溶液A與50g水混合后，將上述溶液中加入0.075g的乳化劑Tween-80，以及1.5g的茶樹(shù)油，在50℃條件下加熱攪拌3h。將微球離心后，用DMSO進(jìn)行洗滌，過(guò)濾、干燥后獲得微球產(chǎn)物。
采用下述方法對(duì)所制備的微球?qū)Σ铇?shù)油的包合率進(jìn)行測(cè)定：茶樹(shù)油的DMSO或DMAc溶液的紫外吸收光譜中，在265nm處有穩(wěn)定的紫外吸收，這是茶樹(shù)油成分的特征吸收峰。測(cè)定不同濃度的茶樹(shù)油DMSO或DMAc溶液的紫外標(biāo)準(zhǔn)吸光度曲線后，測(cè)定包合物的洗滌溶劑中洗出的茶樹(shù)油的濃度，從而得到未被包合的茶樹(shù)油的質(zhì)量m1。包合時(shí)茶樹(shù)油的投料量m減去未被包合的茶樹(shù)油的質(zhì)量m1，即為被包合的茶樹(shù)油的質(zhì)量m2。茶樹(shù)油在微球中的包合率可通過(guò)下式計(jì)算：
包合率＝m2/m
測(cè)得茶樹(shù)油在實(shí)施例1所獲得的微球中的包合率為63.7％；茶樹(shù)油在實(shí)施例2所獲得的微球中的包合率為47.9％；茶樹(shù)油在實(shí)施例3所獲得的微球中的包合率為54.7％；茶樹(shù)油在實(shí)施例4所獲得的微球中的包合率為66.8％；茶樹(shù)油在實(shí)施例5所獲得的微球中的包合率為64.1％；茶樹(shù)油在實(shí)施例7所獲得的微球中的包合率為33.2％。
由上述結(jié)果可見(jiàn)，增加兩親性纖維素衍生物的疏水締合作用有助于茶樹(shù)油在微球中的高效包合；但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，若在微球中不使用海藻酸鹽，微球?qū)Σ铇?shù)油的包合效率反而顯著降低，這說(shuō)明適量加入海藻酸鹽，有助于提高微球?qū)Σ铇?shù)油的包合性能。
采用下述方法測(cè)定所制備的微球的溶脹性能：
將0.2g左右精確稱量的微球置于尼龍布袋中后放入盛有吸收液體的燒杯中，在室溫下溶脹一定時(shí)間后除去布袋表面的水分，稱量吸水后樹(shù)脂的質(zhì)量。吸水倍率Q通過(guò)下式計(jì)算：
式中，Q—吸水倍率(克/克)；m1—吸水前微球的質(zhì)量(克)；m2—吸水后微球的質(zhì)量(克)。
測(cè)得實(shí)施例1所制備的微球溶脹30分鐘的吸水倍率為39.6克/克，溶脹12小時(shí)后的吸水倍率為43.8克/克。測(cè)得實(shí)施例2所制備的微球溶脹30分鐘的吸水倍率為49.2克/克，溶脹12小時(shí)后的吸水倍率為53.8克/克。測(cè)得實(shí)施例3所制備的微球溶脹30分鐘的吸水倍率為31.4克/克，溶脹12小時(shí)后的吸水倍率為33.8克/克。測(cè)得實(shí)施例4所制備的微球溶脹30分鐘的吸水倍率為36.6克/克，溶脹12小時(shí)后的吸水倍率為39.8克/克。測(cè)得實(shí)施例5所制備的微球溶脹30分鐘的吸水倍率為29.6克/克，溶脹12小時(shí)后的吸水倍率為31.8克/克。測(cè)得實(shí)施例6所制備的微球溶脹30分鐘的吸水倍率為41.8克/克，溶脹12小時(shí)后的吸水倍率為39.8克/克。測(cè)得實(shí)施例7所制備的微球溶脹30分鐘的吸水倍率為18.8克/克，溶脹12小時(shí)后的吸水倍率為19.4克/克。
由上述結(jié)果可見(jiàn)，由于微球中兩親性纖維素衍生物的疏水締合作用，微球具有良好的穩(wěn)定性；由于纖維素的親水性能以及海藻酸鹽良好的吸水性，微球具有良好的吸水性能，有助于提高微球的止血性能；在微球中加入茶樹(shù)油，有助于促進(jìn)微球的疏水締合作用，有助于使微球具有良好的穩(wěn)定性，在水中溶脹較長(zhǎng)的時(shí)間也不會(huì)出現(xiàn)溶脹倍率下降的問(wèn)題。
采用以下方法測(cè)試微球的抗菌性能：
將上述微球溶脹于蒸餾水中，濃度為0.4g/mL備用。將菌株接種至平板，37℃孵育箱24h后取出，將接種的細(xì)菌用無(wú)菌棉簽挑至無(wú)菌生理鹽水中，調(diào)節(jié)至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌液濃度，并用M-H肉湯稀釋100倍備用。利用對(duì)倍稀釋法將待測(cè)溶液稀釋成1:5，1:10，1:20，1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，放入等量菌液，用無(wú)菌橡膠塞蓋住所有試管，將以上試管置于37℃孵育箱作用24h。取試驗(yàn)液或稀釋液作活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算被測(cè)物的抑菌率。以不長(zhǎng)菌的最低濃度為被測(cè)物的最小抑菌濃度。
測(cè)得實(shí)施例1所獲得的微球?qū)Υ竽c桿菌的最小抑菌濃度為1.3×10-3g/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為2.5×10-3g/mL。測(cè)得實(shí)施例2所獲得的微球?qū)Υ竽c桿菌的最小抑菌濃度為1.0×10-2g/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為5.0×10-3g/mL。測(cè)得實(shí)施例3所獲得的微球?qū)Υ竽c桿菌的最小抑菌濃度為
5.0×10-3g/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為1.3×10-3g/mL。測(cè)得實(shí)施例4所獲得的微球?qū)Υ竽c桿菌的最小抑菌濃度為6.25×10-4g/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為2.5×10-3g/mL。測(cè)得實(shí)施例5所獲得的微球?qū)Υ竽c桿菌的最小抑菌濃度為1.3×10-3g/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為2.5×10-3g/mL。測(cè)得實(shí)施例7所獲得的微球?qū)Υ竽c桿菌的最小抑菌濃度為8.0×10-2g/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為4.0×10-2g/mL。由以上結(jié)果可見(jiàn)，所制備的微球具有良好的抗菌性能。而測(cè)試結(jié)果表明，實(shí)施例6所獲得的微球?qū)Υ竽c桿菌及金黃色葡萄球菌均無(wú)抑制效果。
采用以下方法測(cè)試微球的止血性能：
每組材料測(cè)試時(shí)選用健康新西蘭白兔10只，雌雄兼用。用3％的戊巴比妥鈉按1mL/kg的劑量靜脈注射麻醉動(dòng)物后，固定在手術(shù)臺(tái)上。在兔耳中部制造1cm2的創(chuàng)面，并使創(chuàng)面包含動(dòng)脈。用預(yù)制塑料片按住動(dòng)脈近心端，切斷耳動(dòng)脈，放開(kāi)近心端使其自由出血5s，然后按住近心端并擦去涌出的血，在創(chuàng)面上貼敷所制備的2g微球，蓋上紗布并加壓，放開(kāi)近心端，觀察直至停止出血，記錄止血時(shí)間，并計(jì)算每組材料的平均止血時(shí)間。
測(cè)得實(shí)施例1所制備微球的平均止血時(shí)間為36.7秒；測(cè)得實(shí)施例2所制備微球的平均止血時(shí)間為29.3秒；測(cè)得實(shí)施例3所制備微球的平均止血時(shí)間為39.3秒；測(cè)得實(shí)施例4所制備微球的平均止血時(shí)間為38.1秒；測(cè)得實(shí)施例5所制備微球的平均止血時(shí)間為43.7秒；測(cè)得實(shí)施例6所制備微球的平均止血時(shí)間為33.8秒；測(cè)得實(shí)施例7所制備微球的平均止血時(shí)間為58.3秒。由上述結(jié)果可見(jiàn)，所制備的微球具有良好的止血性能。特別是將海藻酸鹽與兩親性纖維素衍生物復(fù)合所獲得的微球止血性能最佳。