本發(fā)明涉及一種抗菌海藻酸鈣敷料，尤其涉及一種含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料，以及該抗菌海藻酸鈣敷料的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在處理病人傷口時，需要在傷口上覆蓋敷料，防止細(xì)菌侵入和防止水分損失。傳統(tǒng)的敷料如紗布、棉墊等對創(chuàng)面雖有保護(hù)作用，但保濕吸液能力差，只能吸收自身重量的4-5倍，而且對于一些傷口在移除傳統(tǒng)敷料時，敷料容易粘連傷口組織，造成二次傷口破壞。

用海藻酸鈣纖維做成的醫(yī)用敷料能與創(chuàng)口滲出液及血液中的鈉離子進(jìn)行離子交換，釋放出鈣離子，鈣離子能加速毛細(xì)血管末端中血塊的形成，有很好的止血效果；在使用過程中，海藻酸鈣由于離子交換逐漸轉(zhuǎn)換為水溶性的海藻酸鈉，在創(chuàng)口表面形成凝膠層，防止創(chuàng)面組織與敷料的粘連，并能使創(chuàng)面保持一定溫度與濕度，促進(jìn)傷口愈合。海藻酸鈣的吸液量可達(dá)自身重量的10-20倍。海藻酸鈣敷料是一類性能非常好的功能型敷料。

在海藻酸鈣敷料中添加抗菌劑將提高該敷料的抗菌性，更加完善其功能。納米銀有較強(qiáng)的抗菌性能，但是由于納米銀的不穩(wěn)定性以及對人體細(xì)胞的毒性較大，美國FDA已經(jīng)明確禁止納米銀在醫(yī)療方面的使用，我國CFDA在醫(yī)用某些方面限制了納米銀的使用。

近年來，穩(wěn)定性更好、對人體細(xì)胞毒性更小的納米金作為抗菌劑的研究逐漸被報道。Zhao yuyun等(Zhao Y,Tian Y,Cui Y,et al.Small molecule-capped gold nanoparticles as potent antibacterial agents that target gram-negative bacteria[J].Journal of the American Chemical Society,2010,132(35):12349-12356；Zhao Y,Chen Z,Chen Y,et al.Synergy of non-antibiotic drugs and pyrimidinethiol on gold nanoparticles against superbugs[J].Journal of the American Chemical Society,2013,135(35):12940-12943.和Zhao Y,Ye C,Liu W,et al.Tuning the composition of AuPt bimetallic nanoparticles for antibacterial application[J].Angewandte Chemie International Edition,2014,53(31):8127-8131.)報道的氨基嘧啶或氨基嘧啶/含氨基小分子的雙組份藥物修飾的納米金抗菌劑和納米金鉑雙金屬抗菌劑有很強(qiáng)的廣譜抗菌性，其對人體細(xì)胞的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于納米銀，并且不會產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性，是一類非常有前途的抗菌劑。Anna Regiel-Futyra(Regiel-Futyra A,Kus-M,Sebastian V,et al.Development of Noncytotoxic Chitosan–Gold Nanocomposites as Efficient Antibacterial Materials[J].ACS applied materials&interfaces,2015,7(2):1087-1099.報道的殼聚糖絡(luò)合的納米金也具有優(yōu)異的抗菌性和對人體細(xì)胞低的毒性。

上述報道合成的納米金需要透析處理，工藝較復(fù)雜，工藝有待進(jìn)一步簡化；單純的納米金溶液不易用于臨床的傷口治療與修復(fù)，抗菌性能有待進(jìn)一步提高。

目前，國內(nèi)外尚無公開文獻(xiàn)報道添加納米金制作的抗菌海藻酸鈣敷料。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

因此，基于現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種具有廣譜抗菌性且對人體細(xì)胞毒性較低的含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料，還提供了所述含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料的制備方法及其應(yīng)用。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料，所述含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料為附著有具有抗菌作用的含金納米顆粒的海藻酸鈣織物或海藻酸鈣填充條。優(yōu)選地，所述織物為無紡織物、機(jī)織物或針織物。

根據(jù)本發(fā)明提供的含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料，其中，所述含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料中含金納米顆粒的含量為0.01～1％重量百分比。優(yōu)選地，所述含金納米顆粒的平均粒徑小于50nm，優(yōu)選為1～10nm。

根據(jù)本發(fā)明提供的含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料，其中，所述具有抗菌性能的含納米金的納米顆粒選自納米金、由單組份或多組分小分子藥物或大分子修飾的納米金、以及含納米金的雙組份或多組分金屬納米顆粒中的一種或多種。

優(yōu)選地，所述由單組份或多組分小分子藥物或大分子修飾的納米金為以含氨基嘧啶類小分子作為單組份修飾的納米金顆?；蛞院被奏ゎ愋?分子/氨基類小分子作為雙組份修飾的納米金顆粒，所述含氨基嘧啶類小分子與金元素的摩爾含量比為0.5:1～2:1，所述氨基類小分子與金元素的摩爾含量比為0.5:1～2:1。最優(yōu)選地，所述含氨基嘧啶類小分子為4,6-2氨基-2-巰基嘧啶，氨基類小分子為二甲雙胍。

或優(yōu)選地，所述含納米金的雙組份或多組分金屬納米顆粒為納米金-鉑雙金屬納米顆粒。最優(yōu)選地，所述納米金-鉑雙金屬納米顆粒由80％原子百分比的金和20％原子百分比的鉑組成。

根據(jù)本發(fā)明提供的含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料，其中，所述具有抗菌作用的含金納米顆粒是通過將納米金漿噴涂至海藻酸鈣織物或海藻酸鈣填充條或它們各自的半成品而附著于所述海藻酸鈣織物或海藻酸鈣填充條上的。對于海藻酸鈣織物而言，當(dāng)其為無紡織物時，其半成品可以為梳理機(jī)或鋪網(wǎng)機(jī)形成的海藻酸鈣棉網(wǎng)，當(dāng)其為機(jī)織物或針織物時，其半成品可以為熱壓機(jī)干燥之前的中間產(chǎn)品；對于海藻酸鈣填充條而言，其半成品可以為梳理機(jī)形成的海藻酸鈣棉網(wǎng)。或所述具有抗菌作用的含金納米顆粒是通過將海藻酸鈣纖維浸入納米金漿后再制成海藻酸鈣織物或海藻酸鈣填充條而附著于所述海藻酸鈣織物或海藻酸鈣填充條上的。

本發(fā)明還提供了上述含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：

(1)制備海藻酸鈣纖維；

(2)用所述海藻酸鈣纖維制備織物或填充條，并在制備過程之中或之后噴加納米金漿；

(3)對織物或填充條進(jìn)行干燥，制得所述的含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料。該敷料可經(jīng)進(jìn)一步分切、包裝、滅菌等操作以按需制備敷料產(chǎn)品。

優(yōu)選地，當(dāng)步驟(2)中制備織物且所述織物為無紡織物時，則在梳理機(jī)形成的海藻酸鈣棉網(wǎng)上噴加納米金漿，當(dāng)制備織物且所述織物為機(jī)織物或針織物時，則在熱壓機(jī)干燥之前噴加納米金漿，當(dāng)制備填充條時，則在梳理機(jī)形成的海藻酸鈣棉網(wǎng)上噴加納米金漿。

根據(jù)本發(fā)明的含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料的制備方法，其中，使用氣動噴霧器來噴加納米金漿。優(yōu)選地，噴涂距離為100～1000mm，噴涂電壓為5～110V，氣壓為0.1～0.5KPa。

根據(jù)本發(fā)明提供的含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料的制備方法，其中，所述制備方法包括以下步驟：

(1)制備海藻酸鈣纖維；

(2)將所述海藻酸鈣纖維浸入納米金漿中2～30分鐘；

(3)用丙酮、異丙醇和乙醇中的一種或多種對海藻酸鈣纖維進(jìn)行脫水、干燥；

(4)將經(jīng)步驟(3)處理后的海藻酸鈣纖維制成海藻酸鈣織物或海藻酸鈣填充條，即為所述的含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料。該敷料可經(jīng)進(jìn)一步分切、包裝、滅菌等操作以按需制備敷料產(chǎn)品。

根據(jù)本發(fā)明提供的含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料的制備方法，其中，所述納米金漿為所述具有抗菌作用的含金納米顆粒在水中的分散液。優(yōu)選地，所述納米金漿的金含量為0.001～5％重量百分比，相當(dāng)于10-50000ppm，優(yōu)選為0.1～5％重量百分比，相當(dāng)于1000-50000ppm，例如可以為0.8～5％重量百分比，進(jìn)一步可以為1～5％重量百分比。其中，1ppm通?？蓳Q算為1mg/L。

更優(yōu)選地，所述海藻酸鈣纖維是通過以下步驟制得：

(1)將海藻酸鈉或海藻酸鉀用水溶解，過濾；

(2)經(jīng)過噴絲板噴出初生絲；

(3)利用氯化鈣溶液為凝固液凝固海藻酸鈣纖維；

(4)海藻酸鈣纖維經(jīng)過牽引，加熱后拉伸；

(5)用去離子水、丙酮和乙醇中的一種或多種進(jìn)行洗滌；

(6)干燥。

經(jīng)過上述步驟制備的海藻酸鈣纖維通常為長纖維，可切斷為短纖維以進(jìn)行后續(xù)加工。

更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(3)氯化鈣溶液的濃度為1-10％重量百分比，所述步驟(4)的加熱溫度為60-90℃，優(yōu)選為75～90℃。

根據(jù)本發(fā)明提供的含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料的制備方法，其中，所述納米金漿可以通過以下步驟制得：

(a)按照配比，將氯金酸溶液與含氨基嘧啶類小分子和/或氨基類小分子的溶液或氯鉑酸鉀溶液混合，得到混合溶液；

(b)在攪拌下向所述混合溶液中快速加入還原劑，充分反應(yīng)后即得到所述納米金漿；

其中，所述還原劑的加入時間不超過5分鐘，優(yōu)選不超過1分鐘，更優(yōu)選10～60秒。

優(yōu)選地，步驟(a)中所述含氨基嘧啶類小分子和/或氨基類小分子的溶液還可以包括有機(jī)酸或無機(jī)酸。優(yōu)選為乙酸、丙酸或鹽酸。更優(yōu)選地，酸在混合溶液中的質(zhì)量百分比為0.0005％～10％。優(yōu)選地，步驟(a)中所述含氨基嘧啶類小分子和/或氨基類小分子的溶液中還可以包括非離子表面活性劑。優(yōu)選為吐溫或聚乙二醇。更優(yōu)選地，非離子表面活性劑在所述混合溶液中的質(zhì)量百分比為0.001％～10％。

優(yōu)選地，步驟(b)中所述還原劑可以選自硼氫化鈉、檸檬酸鈉和抗壞血酸鈉中的一種或多種。步驟(b)中所述充分反應(yīng)溫度可以為室溫或室溫以下，例如可以為25℃以下，時間可以為0.5～3小時。

優(yōu)選地，步驟(b)中所述含納米金的納米顆粒在所述納米金漿中的濃度為10～2000ppm，優(yōu)選為400～1000ppm，更優(yōu)選為800～1000ppm。更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述還原劑與氯金酸的摩爾比或者所述還原劑與氯金酸和氯鉑酸鉀的摩爾比為1:1～10:1。

更優(yōu)選地，上述含納米金的納米顆粒的制備方法不包含純化所述納米金漿的步驟。進(jìn)一步優(yōu)選地，純化所述納米金漿的步驟包括用透析袋透析處理或離心過濾處理。換言之，本發(fā)明生產(chǎn)方法不需要用透析袋透析處理或離心過濾處理等方式來純化含金納米顆粒。作為更進(jìn)一步的限定，上述納米金漿的制備方法也可以表述為由步驟(a)和步驟(b)組成。

本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，在制備氯金酸溶液時使用的氯金酸原料可以為四水合氯金酸。

本發(fā)明還提供了上述含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料或按照上述方法而制備的抗菌海藻酸鈣敷料在在制備用于治療燒傷、燙傷、褥瘡感染藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明制得的含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料，具有優(yōu)異的廣譜抗菌性，無細(xì)菌耐藥性，對人體細(xì)胞毒性小的抗菌納米金添加到海藻酸鈣敷料中，具有吸液功能、保濕功能、止血功能、抗菌而對人體細(xì)胞毒性小的作用，可用于治療各種燒傷、燙傷、褥瘡感染等各種創(chuàng)傷感染，是一種極為優(yōu)良的醫(yī)用敷料。

背景中所報道的抗菌納米金的制備方法中，還原劑是以滴加的方式加入，對于工業(yè)化生產(chǎn)，背景報道的滴加方式耗時太長，不能實現(xiàn)，而在本發(fā)明提供的含金納米顆粒的制備方法中，還原劑為一次性快速加入到所述混合溶液，因此更節(jié)約時間，有助于提升生產(chǎn)效率。

背景報道的納米金溶液在反應(yīng)完成后需要用透析袋透析或離心沉淀，對于工業(yè)化生產(chǎn)，背景報道的后處理方法復(fù)雜，設(shè)備昂貴。而在本發(fā)明提供的含金納米顆粒的制備方法不需要透析或離心沉淀處理，因此工藝更為簡單，降低了生產(chǎn)成本，進(jìn)一步提升了生產(chǎn)效率。

通過試驗檢測證明，本發(fā)明提供的制備方法所制備的含金納米顆粒的抗菌效果遠(yuǎn)優(yōu)于還原劑滴加和/或經(jīng)過透析處理所制備的含金納米顆粒。

本發(fā)明提供制備方法所制備的含金納米顆粒的細(xì)胞毒性明顯低于納米銀溶液和硝酸銀溶液。

附圖說明

以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方案，其中：

圖1示出了實施例1的納米金與商購納米銀的透射電鏡(TEM)圖；

圖2示出了含實施例1所制備的含金納米顆粒溶液、納米銀溶液和硝酸銀溶液的細(xì)胞毒性比較。

具體實施方式

下面通過具體的實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但是，應(yīng)當(dāng)理解為，這些實施例僅僅是用于更詳細(xì)具體地說明之用，而不應(yīng)理解為用于以任何形式限制本發(fā)明。

本部分對本發(fā)明試驗中所使用到的材料以及試驗方法進(jìn)行一般性的描述。雖然為實現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的，但是本發(fā)明仍然在此作盡可能詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，在上下文中，如果未特別說明，本發(fā)明所用材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的。

以下實施例中使用的試劑和儀器如下：

儀器：

電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP-OES)；型號iCAP 6300；購自：美國Thermo Scientific公司

透射電子顯微鏡(TEM)；型號Tecnai G2 20S-TWIN；購自：美國FEI公司

實施例1

本實施例用于說明本發(fā)明的含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料及其制備方法。

制備海藻酸鈣纖維：

(1)將10公斤海藻酸鈉用水溶解得到200公斤紡絲液，過濾；

(2)經(jīng)過噴絲板噴出初生絲；

(3)利用5％(重量百分比)氯化鈣溶液為凝固液凝固海藻酸鈣纖維；

(4)海藻酸鈣纖維經(jīng)過牽引，經(jīng)過90℃水浴加熱后拉伸；，

(5)用去離子水、丙酮進(jìn)行洗滌；

(6)干燥得到長纖維10公斤。

制備含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料：

(1)將長纖維切斷稱為短纖維進(jìn)行無紡布生產(chǎn)；

(2)在鋪網(wǎng)機(jī)的海藻酸鈣棉網(wǎng)上用氣動噴霧器噴加為4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/二甲雙胍作為雙組份修飾的納米金的納米金漿，納米金漿含金量為5％(重量百分比)，每公斤纖維上噴入該溶液200g。噴涂距離為100mm， 噴涂電壓為5V，氣壓為0.1KPa；

(3)經(jīng)針刺、熱壓機(jī)干燥，制成帶納米金的海藻酸鈣無紡布；

(4)還可以把無紡布分切為敷料片，隨后進(jìn)行包裝、滅菌，即成為含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料。

上述4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/二甲雙胍作為雙組份修飾的納米金的制備方法為：

(a)將40g的四水合氯金酸溶于10L的去離子水中，得到氯金酸溶液。將一定量的4,6-2氨基-2-巰基嘧啶和二甲雙胍溶于10L的去離子水中，還加入一定量的吐溫80和乙酸，以有助于促進(jìn)氨基嘧啶類小分子與氨基類小分子充分溶解于水中，得到含氨基嘧啶類小分子和/或氨基類小分子的溶液。將兩溶液混合，得到混合溶液。

(b)將一定量的抗壞血酸鈉溶于5L的去離子水中，在攪拌下將上述抗壞血酸鈉溶液快速加入(用時40s)到上述混合溶液中，在室溫以下攪拌1小時至充分反應(yīng)，不需采用透析等純化工藝，即得到約25L的濃度約為800ppm的(按照投料比算出的)含有上述4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/二甲雙胍作為雙組份修飾的納米金顆粒的納米金漿。

根據(jù)投料比，4,6-2氨基-2-巰基嘧啶與金元素的摩爾含量比為2:1，二甲雙胍與金元素的摩爾含量比為0.5:1，還原劑抗壞血酸鈉與氯金酸的摩爾含量比為3:1，乙酸占納米金漿的質(zhì)量百分比為0.01％，表面活性劑吐溫80占納米金漿的質(zhì)量百分比為0.01％。

通過常溫溶劑水揮發(fā)，使納米金漿的含金量約為5％重量百分比，相當(dāng)于50000ppm。

在該含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料中，經(jīng)ICP-OES測定每片海藻酸鈣敷料的含金量為1％(重量百分比)。經(jīng)200KV六硼化鑭透射電子顯微鏡測定，該敷料中的納米金顆粒的平均粒徑為5nm。其透射電鏡圖如圖1所示(以商購自張家港耐爾納米科技有限公司的納米銀作對比)。

對比例1

按照與實施例1相同的制備方法制得對比例1的納米金漿，經(jīng)過常溫溶劑水蒸發(fā)，制成納米金抗菌溶液，使其與實施例1中的納米金海藻酸鈣敷料有相同的納米金質(zhì)量百分含量。

對比例1.1

按照與對比例1相似的制備方法制得對比例1.1的納米金抗菌溶液，其區(qū)別在于，對比例1.1中還原劑以滴加的方式加入到混合溶液中，并且采用透析處理24小時的方式得到納米金抗菌溶液，加入純化水，使其與對比例1中的納米金抗菌溶液有相同的納米金質(zhì)量百分含量。

試驗例1

通過試驗例1中的抗菌實驗，證明對比例1的納米金抗菌溶液要優(yōu)于對比例1.1的納米金抗菌溶液。

比較方法如下：采用最小抑菌濃度MIC(mg/L)來衡量，采用微孔稀釋方法(National Committee for Clinical Laboratory Standards.，Methodsfor determining bactericidal activity of antimicrobial agents,M26-A,1999.)，將100μL不同濃度的納米金加入到96微孔板中，10μL相同濃度(10⁴CFU/mL)的細(xì)菌培養(yǎng)液加入每個微孔中，37℃培養(yǎng)24小時后觀察，沒有可看見的細(xì)菌生長的微孔中最少的濃度即為最小抑菌濃度(MIC)。

測試結(jié)果見表1。從測試結(jié)果可見，對比例1的納米金抗菌溶液的抗菌效果遠(yuǎn)優(yōu)于對比例1.1的納米金抗菌溶液的抗菌效果。說明采用與對比例1制備方法相同的含金納米顆粒制備的含納米金的抗菌凝膠，其抗菌效果也應(yīng)遠(yuǎn)優(yōu)于采用與對比例1.1制備方法相同的含金納米顆粒制備的含納米金的抗菌凝膠。

表1對比例1和對比例1.1的納米金抗菌溶液的抗菌性能比較

實施例2

本實施例用于說明本發(fā)明的含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料及其制備方法。

制備海藻酸鈣纖維：

(1)將5公斤海藻酸鈉用水溶解得到100公斤紡絲液，過濾；

(2)經(jīng)過噴絲板噴出初生絲；

(3)利用1％(重量百分比)氯化鈣溶液為凝固液凝固海藻酸鈣纖維；

(4)海藻酸鈣纖維經(jīng)過牽引，經(jīng)過75℃水浴加熱后拉伸；

(5)用去離子水、乙醇進(jìn)行洗滌；

(6)干燥得到長纖維5公斤。

制備含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料：

(1)將長纖維切斷稱為短纖維進(jìn)行醫(yī)用海藻填充條生產(chǎn)；

(2)在梳理機(jī)形成機(jī)的海藻酸鈣棉網(wǎng)上用氣動噴霧器噴加含4,6-2氨基-2-巰基嘧啶作為單組份修飾的納米金的納米金漿，納米金漿含金量為0.1％(重量百分比)，每公斤纖維上噴入該溶液100g。噴涂距離為500mm，噴涂電壓為50V，氣壓為0.35KPa；

(3)經(jīng)熱壓定型機(jī)干燥，制成帶納米金的海藻酸鈣填充條；

(4)還可以把海藻填充條分切，隨后進(jìn)行包裝、滅菌，即成為含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料。

上述4,6-2氨基-2-巰基嘧啶作為單組份修飾的納米金的制備方法為：

(a)將40g的四水合氯金酸溶于10L的去離子水中，得到氯金酸溶液。將一定量的4,6-2氨基-2-巰基嘧啶溶于10L的去離子水中，還加入一定量的吐溫80和乙酸，得到含氨基嘧啶類小分子的溶液。將兩溶液混合，得到混合溶液。

(b)將一定量的抗壞血酸鈉溶于5L的去離子水中，在攪拌下將上述抗壞血酸鈉溶液快速加入(用時1min)到上述混合溶液中，在室溫以下攪拌1小時至充分反應(yīng)，不需采用透析等純化工藝，即得到約25L的濃度約為800ppm的(按照投料比算出的)含有上述4,6-2氨基-2-巰基嘧啶作為單組份修飾的納米金顆粒的納米金漿。

根據(jù)投料比，4,6-2氨基-2-巰基嘧啶與金元素的摩爾含量比為0.5:1，還原劑抗壞血酸鈉與氯金酸的摩爾含量比為3:1，乙酸占納米金漿的質(zhì)量百分 比為0.0005％，表面活性劑吐溫80占納米金漿的質(zhì)量百分比為0.001％。

通過常溫溶劑水揮發(fā)，使納米金漿的含金量約為5％重量百分比，相當(dāng)于50000ppm。

在該含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料中，經(jīng)ICP-OES測定，每片海藻酸鈣敷料的含金量為0.01％(重量百分比)。經(jīng)200KV六硼化鑭透射電子顯微鏡測定，該敷料中的納米金顆粒的平均粒徑為6nm。

對比例2

按照與實施例2相同的制備方法制得對比例2的納米金漿，再加入一定量去離子水，制成納米金質(zhì)量百分比為0.01％的抗菌溶液，使其與實施例2中的納米金海藻酸鈣敷料有相同的納米金質(zhì)量百分含量。

實施例3

本實施例用于說明本發(fā)明的含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料及其制備方法。

制備步驟如下：

(1)將5公斤海藻酸鈉用水溶解得到100公斤紡絲液，過濾；

(2)經(jīng)過噴絲板噴出初生絲；

(3)利用10％(重量百分比)氯化鈣溶液為凝固液凝固海藻酸鈣纖維；

(4)海藻酸鈣纖維經(jīng)過牽引，經(jīng)過90℃水浴加熱后拉伸；，

(5)用去離子水進(jìn)行洗滌制成的海藻酸鈣纖維；

(6)將海藻酸鈣纖維松散的浸入金含量為1％(重量百分比)的納米金-鉑(雙金屬納米顆粒Au₈₀Pt₂₀)溶液(即納米金漿)中30分鐘，浸泡期間多次攪動；

(7)離心脫水機(jī)脫水；

(8)乙醇浸泡30分鐘；

(9)離心脫水機(jī)脫水；

(10)自然掛干；

(11)將長纖維切斷成短纖維，再經(jīng)過纖維的開松、梳理、鋪網(wǎng)、針刺等制成帶納米金(納米金-鉑雙金屬)的海藻酸鈣無紡布；

(12)還可以將無紡布分切為敷料片，隨后進(jìn)行包裝、滅菌，即成為含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料。

上述納米金-鉑雙金屬納米顆粒的制備方法為：

(a)將27g的四水合氯金酸和8g氯鉑酸鉀溶于10L的去離子水中，得到混合溶液。

(b)將一定量的硼氫化鈉溶于10L的去離子水中，在攪拌下將上述硼氫化鈉溶液快速加入(用時50s)到上述混合溶液中，在室溫以下攪拌1小時至充分反應(yīng)，不需采用透析等純化工藝，即得到約20L的含有納米金-鉑雙金屬納米顆粒的納米金漿。

根據(jù)投料比，還原劑硼氫化鈉與氯金酸和氯鉑酸鉀的摩爾含量比為4:1，金的原子百分比為80％，鉑的原子百分比為20％，因此該金-鉑納米顆粒可表示為Au₈₀Pt₂₀納米顆粒。

通過常溫溶劑水揮發(fā)，使納米金-鉑漿的含金-鉑量約為1％重量百分比，相當(dāng)于10000ppm。

在該含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料中，經(jīng)ICP-OES測定，每片海藻酸鈣敷料的含金量為0.1％(重量百分比)。經(jīng)200KV六硼化鑭透射電子顯微鏡測定，該敷料中的納米金顆粒的平均粒徑為4nm。

對比例3

按照與實施例3相同的制備方法制得對比例3的納米金-鉑雙金屬納米顆粒，經(jīng)過常溫溶劑水蒸發(fā)，制成納米金抗菌溶液，使其與實施例3中的納米金海藻酸鈣敷料有相同的納米金質(zhì)量百分含量。

試驗例1

將實施例1采用的4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/二甲雙胍作為雙組份修飾的納米金顆粒與納米銀溶液(購自張家港耐爾納米科技有限公司)的抗菌性能相比較，說明本發(fā)明的含該納米金顆粒的海藻酸鈣敷料也應(yīng)具有良好的抗菌性能。

比較方法如下：采用最小抑菌濃度MIC(mg/L)來衡量，采用微孔稀釋方法(National Committee for Clinical Laboratory Standards.，Methodsfor determining bactericidal activity of antimicrobial agents,M26-A,1999.)，將100μL不同濃度的納米金或納米銀加入到96微孔板中，10μL相同濃度(10⁴CFU/mL)的細(xì)菌培養(yǎng)液加入每個微孔中，37℃培養(yǎng)24小時后觀察，沒有可看見的細(xì)菌生長的微孔中最小的納米金或納米銀的濃度即為最小抑 菌濃度(MIC)。測試結(jié)果見表2。

從測試結(jié)果可見，實施例1采用的納米金顆粒對大腸桿菌和綠膿桿菌的MIC都小于市售含納米銀抗菌劑的MIC，由此說明，該納米顆粒對大腸桿菌和綠膿桿菌的抗菌性能優(yōu)于納米銀溶液，采用該納米顆粒的海藻酸鈣敷料的大腸桿菌和綠膿桿菌的抗菌性能優(yōu)于納米銀溶液。

表2實施例1與納米銀溶液的抗菌性能比較結(jié)果

試驗例2

通過不同納米金含量的海藻酸鈣敷料抑菌圈實驗，來說明含納米金的抗菌海藻酸鈣敷料的抑菌活性。

按照《藥品微生物檢驗手冊》第18章第1節(jié)管碟法進(jìn)行試驗。對實施例1-3和對比例1-3進(jìn)行抑菌圈試驗。試驗結(jié)果見表3。

測試結(jié)果可見，盡管各實施例的納米金重量百分比和類型不同，但均可觀察到明顯的抑菌圈，說明含納米金的海藻酸鈣敷料對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌均有良好的抑菌效果。且同一濃度同一類型的含納米金的海藻酸鈣敷料的抑菌圈均大于納米金抗菌溶液，說明含納米金的海藻酸鈣敷料的抑菌效果要優(yōu)于有相同納米金含量相同納米金類型的納米金抗菌溶液。

表3不同納米金含量的海藻酸鈣敷料和溶液抑菌圈測試結(jié)果

(單位：mm)

試驗例3細(xì)胞毒性實驗

細(xì)胞毒性試驗操作過程：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)在含有10％牛胎血清的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)。在96微孔板的每個孔中加入10⁴個HUVEC細(xì)胞，每個孔中加入含不同濃度的納米顆粒(2-巰基-4,6-二氨基嘧啶/二甲雙胍雙組分修飾的納米金顆粒)的納米金溶液(納米金漿)、納米銀溶液、硝酸銀溶液到200微升。微孔介質(zhì)中在37℃下培養(yǎng)48小時，沒有加入抗菌劑的HUVEC細(xì)胞作為對照。培養(yǎng)完后，微孔中的溶液用磷酸緩沖溶液(PBS，0.01mol/L，pH 7.4)洗一次，加入10％(v/v)的CCK-8溶液在微孔介質(zhì)中，在37℃下培養(yǎng)2小時。在酶聯(lián)免疫檢測儀450nm處測量各樣品孔以及對照孔的吸光值。計算各個樣品孔細(xì)胞相對活力。各樣品孔細(xì)胞相對活力定義為：各個孔吸光值/對照孔的吸光值×100％。試驗結(jié)果見圖2。

從圖2所示的試驗結(jié)果可知，本發(fā)明采用的含金納米顆粒在不同濃度下的細(xì)胞毒性均明顯低于納米銀溶液和硝酸銀溶液。

盡管本發(fā)明已進(jìn)行了一定程度的描述，明顯地，在不脫離本發(fā)明的精神 和范圍的條件下，可進(jìn)行各個條件的適當(dāng)變化。可以理解，本發(fā)明不限于所述實施方案，而歸于權(quán)利要求的范圍，其包括所述每個因素的等同替換。