本發(fā)明涉及納米材料靶向給藥領(lǐng)域，尤其是涉及一種以納米金剛石為載體負(fù)載順鉑的靶向給藥體系。
背景技術(shù)：
：隨著碳納米材料應(yīng)用研究的進(jìn)步，碳納米材料給藥系統(tǒng)已成為納米生物醫(yī)藥領(lǐng)域的一個(gè)重要研究方向。目前由于碳納米材料能有效地被細(xì)胞攝取，并且碳納米材料的表面可以與多種無機(jī)或有機(jī)分子以共價(jià)或非共價(jià)方式連接形成復(fù)合物，所以碳納米材料能成為一種有效的藥物輸送載體，可以協(xié)助一些水溶性差的藥物進(jìn)入細(xì)胞，從而增強(qiáng)它們的藥理活性。由于碳納米材料都具有尺寸極小、易于被細(xì)胞吸收、易于與化學(xué)/生物分子共價(jià)或非共價(jià)鍵結(jié)合的表面結(jié)構(gòu)，所以它們已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于構(gòu)建藥物輸送體系領(lǐng)域。但是已有研究發(fā)現(xiàn)碳納米管之類的碳納米材料可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死，這限制了它們的進(jìn)一步應(yīng)用和推廣。然而比較其他碳納米材料(碳黑、多壁碳納米管和單壁碳納米管)和納米金剛石對(duì)成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的毒性，發(fā)現(xiàn)納米金剛石本身的細(xì)胞毒性最小。納米金剛石作為一個(gè)具有更好生物相容性的碳納米家族的新成員，可用來構(gòu)建納米金剛石藥物載體。納米金剛石很容易進(jìn)入細(xì)胞，而且不會(huì)影響細(xì)胞的生物活性。dna、蛋白質(zhì)、抗原抗體等生物分子可以固定在納米金剛石的表面，并保持其生物活性。因此納米金剛石能夠作為有效的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，用于構(gòu)建靶向給藥體系。順鉑是細(xì)胞周期非特異性藥物，具有細(xì)胞毒性，可抑制腫瘤細(xì)胞的dna復(fù)制過程，有較強(qiáng)的廣譜抗腫瘤作用。但由于其水溶性較差，且有很強(qiáng)的腎毒性和神經(jīng)毒性，因此需要開發(fā)新的靶向給藥體系，以降低順鉑毒性。在文獻(xiàn)[dhars,danielwl,giljohannda,mirkinca,lippardsj:polyvalentoligonucleotidegoldnanoparticleconjugatesasdeliveryvehiclesforplatinum(iv)warheads.jamchemsoc2009,131:14652-14653.]中，達(dá)爾等人將順鉑通過胺鍵共價(jià)連接到金納米顆粒上殺傷肺癌細(xì)胞，但是共價(jià)結(jié)合方式影響順鉑的釋放。文獻(xiàn)[guanb,zouf,zhij.nanodiamondastheph-responsivevehicleforan anticancerdrug.small.2010jul19；6(14):1514-9.]中記載關(guān)波等人合成了單純負(fù)載順鉑的納米金剛石給藥體系，這一載藥體系可利用腫瘤細(xì)胞自身的滲透性，富集于腫瘤組織，殺傷腫瘤細(xì)胞，但它不能特異地選擇致癌位點(diǎn)來相結(jié)合發(fā)生作用，使腫瘤細(xì)胞特異性死亡。由于表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,egfr)在許多實(shí)體腫瘤中高表達(dá)或表達(dá)異常，所以它可以作為腫瘤治療的主要靶點(diǎn)。本發(fā)明提供一種新的靶向給藥體系將表皮生長(zhǎng)因子(egf)作為靶向分子，與腫瘤細(xì)胞表面的egfr特異性結(jié)合，將藥物靶向輸送到腫瘤細(xì)胞。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種以納米金剛石為載體負(fù)載順鉑的靶向給藥體系。該靶向給藥體系可以用于靶向殺傷腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種以納米金剛石為載體負(fù)載順鉑的靶向給藥體系的合成方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種以納米金剛石為載體負(fù)載順鉑的靶向給藥體系在制備殺傷腫瘤細(xì)胞藥物中的應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供一種以納米金剛石為載體負(fù)載順鉑的靶向給藥體系。所述靶向給藥體系包括納米金剛石、表皮生長(zhǎng)因子(egf)和藥物順鉑；所述靶向給藥體系以納米金剛石為載體，所述納米金剛石與表皮生長(zhǎng)因子(egf)通過共價(jià)方式結(jié)合形成egf-納米剛石復(fù)合物，所述egf-納米金剛石復(fù)合物通過非共價(jià)方式負(fù)載藥物順鉑。所述egf被用作靶向分子；所述藥物順鉑被用作抗腫瘤藥物。本發(fā)明還提供一種以納米金剛石為載體負(fù)載順鉑的靶向給藥體系的合成方法，包括以下步驟：1)納米金剛石羧基化納米金剛石與混合酸發(fā)生羧基化反應(yīng)，得羧基化的納米金剛石；2)共價(jià)結(jié)合egf在1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺存在的條件下，羧基化的納米金剛石和egf共價(jià)結(jié)合形成穩(wěn)定的egf-納米金剛石復(fù)合物；3)非共價(jià)負(fù)載順鉑所述egf-納米金剛石復(fù)合物通過非共價(jià)方式負(fù)載順鉑，即獲得egf-納米金剛石-順鉑給藥體系。步驟1)具體通過如下步驟實(shí)現(xiàn)：將納米金剛石粉末加入到混合酸中，于60-80℃攪拌8-24h，得第一混合物；將所述第一混合物冷卻至室溫，吸出所述第一混合物中的多余酸，向所述第一混合物中加入堿，于80-100℃攪拌5-20min，得第二混合物；將所述第二混合物靜置，測(cè)定其ph值，然后用去離子水進(jìn)行多次清洗，使其ph值呈中性，得羧基化的納米金剛石。步驟1)中，所述混合酸是硫酸和硝酸的混合物；所述硫酸和硝酸的體積比為1:1-5：1(例如為1:1、2:1、3:1、4:1或5:1等)；所述混合酸將納米金剛石進(jìn)行羧基化。步驟1)中，所述納米金剛石是通過高溫高壓法合成的，所述納米金剛石的粒徑為100nm。所述堿是用來中和多余的酸，所述堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鎂等。步驟2)具體通過如下步驟實(shí)現(xiàn)：將所述羧基化的納米金剛石分散到水中并進(jìn)行超聲10-60min，得羧基化的納米金剛石水溶液；向所述羧基化的納米金剛石水溶液中加入經(jīng)過濾菌的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(edc)水溶液、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)水溶液和egf水溶液，于30-50℃下?lián)u晃0.5-2h，得第三混合物；將所述第三混合物在離心轉(zhuǎn)速為12000rpm的條件下進(jìn)行離心處理3min，去除上清液后得egf-納米金剛石復(fù)合物。所述羧基化的納米金剛石水溶液的濃度為1-5mg/ml(例如為：1、2、3、4或5mg/ml等)。所述1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺水溶液的濃度為1-8mg/ml(例如為：1、2、5、7或8mg/ml等)；所述n-羥基琥珀酰亞胺水溶液的濃度為1-6mg/ml(例如為：1、2、3、4或6mg/ml等)。所述egf水溶液的濃度為1-5mg/ml(例如為：1、2、3、4或5mg/ml等)。步驟3)具體通過如下步驟實(shí)現(xiàn)：將egf-納米金剛石復(fù)合物分散于水中，然后加入順鉑水溶液，于30-50℃搖晃0.5-2h，得第四混合物，將所述第四混合物在離心轉(zhuǎn)速為12000rpm的條件下進(jìn)行離心處理3min，然后去除上清液后，即獲得egf-納米金剛石-順鉑給藥體系。將所述egf-納米金剛石-順鉑給藥體系進(jìn)行高壓滅菌，于2-8℃保存。所述順鉑水溶液的濃度為0.5-5mg/ml(例如為：1、2、3、4或5mg/ml等)。在1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(edc)水溶液和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)水溶液的存在下，egf上的氨基和納米金剛石上的羧基共價(jià)結(jié)合形成穩(wěn)定的egf-納米金剛石復(fù)合物，然后egf-納米金剛石復(fù)合物通過非共價(jià)方式吸附吸附的方式負(fù)載順鉑。egf-納米金剛石復(fù)合物通過非共價(jià)方式吸附順鉑，可以使藥物順鉑集中作用腫瘤細(xì)胞，提高順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。此外，本發(fā)明還提供了一種以納米金剛石為載體負(fù)載順鉑的靶向給藥體系在制備殺傷腫瘤細(xì)胞藥物中的應(yīng)用。另外注意的是，如果沒有特別說明，本發(fā)明所記載的任何范圍包括端值以及端值之間的任何數(shù)值以及以端值或者端值之間的任意數(shù)值所構(gòu)成的任意子范圍。本發(fā)明的有益效果如下：1、本發(fā)明的egf-納米金剛石-順鉑給藥體系以納米金剛石為載體，egf為靶向分子，順鉑為抗腫瘤藥物，egf-納米金剛石-順鉑給藥體系可以將藥物集中作用腫瘤細(xì)胞，提高順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。2、本發(fā)明的egf-納米金剛石-順鉑給藥體系通過egf上的氨基和納米金剛石上的羧基共價(jià)結(jié)合形成穩(wěn)定的egf-納米金剛石復(fù)合物，然后egf-納米金剛石復(fù)合物通過非共價(jià)的方式吸附抗腫瘤藥物順鉑。3、本發(fā)明的egf-納米金剛石-順鉑給藥體系的合成方法簡(jiǎn)單方便，而且負(fù)載藥物順鉑的量與細(xì)胞作用時(shí)可以被ph值變化所調(diào)控，具有一定的緩釋作用，會(huì)降低所負(fù)載藥物本身的副作用。附圖說明下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖1示出了egf-納米金剛石-順鉑給藥體系的流程圖。圖2示出了egf-納米金剛石-順鉑給藥體系的粒徑分布圖。圖3a示出了egf-納米金剛石-順鉑給藥體系對(duì)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性。圖3b示出了egf-納米金剛石-順鉑給藥體系對(duì)肝癌細(xì)胞的靶向性。圖4示出了egf-納米金剛石-順鉑給藥體系對(duì)子宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性。圖5示出了egf-納米金剛石-順鉑給藥體系對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。具體實(shí)施方式為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例11)納米金剛石羧基化將0.5g納米金剛石粉末加入到硫酸和硝酸的混合酸(硫酸和硝酸的體積比為3：1)中，于70℃攪拌24h，得第一混合物；將所述第一混合物冷卻至室溫，用吸管吸出所述第一混合物中的多余酸，向所述第一混合物中加入10ml濃度為0.1mol/l的氫氧化鈉水溶液，于90℃攪拌10min，得第二混合物；將所述第二混合物靜置，然后用吸管吸取上層清液并測(cè)定其ph值，將所述第二混合物進(jìn)行多次清洗，使其ph值呈中性，得羧基化的納米金剛石。2)共價(jià)結(jié)合egf將所述羧基化的納米金剛石分散到水中并進(jìn)行超聲20min，得濃度為1mg/ml的羧基化的納米金剛石水溶液；取100μl濃度為1mg/ml的羧基化的納米金剛石水溶液，向所述羧基化的納米金剛石水溶液中加入經(jīng)過濾菌的濃度為2mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(edc)水溶液、濃度為2mg/ml的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)水溶液和濃度為1mg/ml的egf水溶液，于37℃下?lián)u晃1h，得第三混合物；將所述第三混合物在離心轉(zhuǎn)速為12000rpm的條件下進(jìn)行離心處理3min，去除上清液后得egf-納米金剛石復(fù)合物。3)非共價(jià)負(fù)載順鉑將所述egf-納米金剛石復(fù)合物分散于100μl水中，然后加入100μl的濃度為1mg/ml的順鉑水溶液，于37℃搖晃1h，得第四混合物，將所述第四混合物在離心轉(zhuǎn)速為12000rpm的條件下進(jìn)行離心處理3min，去除上清液后獲得以納米金剛石為載體負(fù)載順鉑的靶向給藥體系，即egf-納米金剛石-順鉑給藥體系。將egf-納米金剛石-順鉑給藥體系進(jìn)行高壓滅菌，然后分散于1000μl的 達(dá)爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養(yǎng)基(dmem)中，于4℃保存。egf-納米金剛石-順鉑給藥體系中egf結(jié)合率和順鉑負(fù)載率的測(cè)定方法，具體包括如下步驟：1)egf結(jié)合率的測(cè)定收集egf-納米金剛石復(fù)合物合成過程中經(jīng)過離心處理的上清液，采用2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉(bca)試劑法對(duì)上清液中的egf進(jìn)行檢測(cè)。egf結(jié)合率(μg/100μg)＝(反應(yīng)前egf的量-上清液中egf的量)/反應(yīng)所用的納米金剛石的量。2)順鉑負(fù)載率的測(cè)定用王水將以納米金剛石為載體負(fù)載順鉑的靶向給藥體系溶解，然后用去離子水進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?，采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(icp-oes)對(duì)負(fù)載的順鉑的量進(jìn)行檢測(cè)。順鉑負(fù)載率(μg/100μg)＝順鉑的量/反應(yīng)所用的納米金剛石的量。用zetasizer3000hs(malverninstruments,malvern,england)儀檢測(cè)egf-納米金剛石-順鉑給藥體系的粒徑分布(見圖2)和zeta電位(見表1)。圖2橫坐標(biāo)標(biāo)尺是非線性的(橫坐標(biāo)為log10)。表1egf-納米金剛石-順鉑給藥體系的zeta電位以及其給藥體系中egf結(jié)合率、順鉑的負(fù)載率名稱zeta電位(mv)順鉑負(fù)載率(μg/100μg)egf結(jié)合率(μg/100μg)egf-納米金剛石-順鉑-15.9±2.31.0±0.423.6±3.2應(yīng)用例1肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組1：選用肝癌細(xì)胞(hepg2細(xì)胞)為腫瘤細(xì)胞，將hepg2細(xì)胞接種于96孔板，每孔細(xì)胞的個(gè)數(shù)為3×103個(gè)，以dmem+10％胎牛血清+青鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，細(xì)胞增殖到50-60％匯合度；然后吸去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(pbs溶液)將培養(yǎng)好的細(xì)胞沖洗3遍，將沖洗后的細(xì)胞分為三組，然后分別用實(shí)施例1中納米金剛石(濃度為0.1mg/ml)的無血清培養(yǎng)基、實(shí)施例1合成的egf-納米金剛石-順鉑給藥體系(濃度為0.1mg/ml)的無血清培養(yǎng)基、與給藥體系順鉑量一致的含順鉑(濃度為0.6μg/ml)的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4h；分別吸去含納米金剛石的培養(yǎng)基、含egf-納米金剛石-順鉑給藥體系的培養(yǎng)基和含順鉑的培養(yǎng)基，然后用pbs溶液分別將培養(yǎng)好的三組細(xì)胞沖 洗3遍，再將每組沖洗后的細(xì)胞分別用dmem+10％胎牛血清+青鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，然后用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cck8試劑盒)分別檢測(cè)三組細(xì)胞的毒性。實(shí)驗(yàn)組2：選用肝癌細(xì)胞(hepg2細(xì)胞)為腫瘤細(xì)胞，將hepg2細(xì)胞接種于96孔板，每孔細(xì)胞的個(gè)數(shù)為3×103個(gè)，以dmem+10％胎牛血清+青鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，細(xì)胞增殖到50-60％匯合度；然后吸去培養(yǎng)基，用pbs溶液將培養(yǎng)好的細(xì)胞沖洗3遍，將沖洗后的細(xì)胞分為兩組，然后分別用含egfr抗體(濃度為5ug/ml)的無血清培養(yǎng)基、單一的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)2h；然后分別吸去含egfr抗體的培養(yǎng)基和單一的培養(yǎng)基，用pbs溶液分別將培養(yǎng)好的兩組細(xì)胞沖洗3遍，再將沖洗后的兩組細(xì)胞分別用實(shí)施例1合成的egf-納米金剛石-順鉑給藥體系(濃度為0.1mg/ml)的培養(yǎng)基培養(yǎng)4h；然后吸去egf-納米金剛石-順鉑給藥體系的培養(yǎng)基并用pbs溶液將培養(yǎng)好的細(xì)胞沖洗3遍，再將沖洗后的細(xì)胞用dmem+10％胎牛血清+青鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，然后用cck8試劑盒分別檢測(cè)兩組細(xì)胞的毒性。對(duì)照組：選用肝癌細(xì)胞(hepg2細(xì)胞)為腫瘤細(xì)胞，將hepg2細(xì)胞接種于96孔板，每孔細(xì)胞的個(gè)數(shù)為3×103個(gè)，以dmem+10％胎牛血清+青鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，細(xì)胞增殖到50-60％匯合度；然后吸去培養(yǎng)基，用pbs溶液將培養(yǎng)好的細(xì)胞沖洗3遍；將沖洗后的細(xì)胞用無血清的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)4h，然后吸去無血清的dmem培養(yǎng)基，用pbs溶液將培養(yǎng)好的細(xì)胞沖洗3遍，再將沖洗后的細(xì)胞用dmem+10％胎牛血清+青鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，然后用cck8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的毒性。結(jié)合圖3a比較實(shí)驗(yàn)組1和對(duì)照組，在培養(yǎng)基中加入納米金剛石，細(xì)胞存活率為98.86±8.81％，表明納米金剛石本身在給藥濃度下對(duì)hepg2細(xì)胞沒有毒性；在培養(yǎng)基中加入egf-納米金剛石-順鉑給藥體系，細(xì)胞的存活率為55.82±13.10％，表明egf-納米金剛石-順鉑給藥體系在給藥濃度下可以有效地殺死hepg2細(xì)胞；在培養(yǎng)基中加入與給藥體系順鉑量一致的順鉑，細(xì)胞的存活率為100.24±2.01％，表明與給藥體系順鉑量一致的順鉑在給藥濃度下對(duì)hepg2細(xì)胞沒有毒性，進(jìn)一步驗(yàn)證egf-納米金剛石-順鉑給藥體系可以將藥物順鉑集中作用于腫瘤細(xì)胞，提高順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。結(jié)合圖3b比較實(shí)驗(yàn)組2和對(duì)照組，在培養(yǎng)基中加入egfr抗體后再加入egf-納米金剛石-順鉑給藥體系，細(xì)胞存活率為101.93±4.60％，表明egf-納米金剛石-順鉑給藥體系在hepg2細(xì)胞表面的egfr封閉后喪失靶向殺傷腫瘤 細(xì)胞的能力。進(jìn)一步證明了egf-納米金剛石-順鉑給藥體系靶向殺死hepg2細(xì)胞的特異性。應(yīng)用例2子宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組1：選用子宮頸細(xì)胞(hela細(xì)胞)為腫瘤細(xì)胞，將hela細(xì)胞接種于96孔板，每孔細(xì)胞的個(gè)數(shù)為3×103個(gè)，以dmem+10％胎牛血清+青鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，細(xì)胞增殖到50-60％匯合度；然后吸去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(pbs溶液)將培養(yǎng)好的細(xì)胞沖洗3遍，將沖洗后的細(xì)胞分為三組，然后分別用實(shí)施例1中納米金剛石(濃度為0.1mg/ml)的無血清培養(yǎng)基、實(shí)施例1合成的egf-納米金剛石-順鉑給藥體系(濃度為0.1mg/ml)的無血清培養(yǎng)基、與給藥體系順鉑量一致的含順鉑(濃度為0.6μg/ml)的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4h；分別吸去含納米金剛石的培養(yǎng)基、含egf-納米金剛石-順鉑給藥體系的培養(yǎng)基和含順鉑的培養(yǎng)基，然后用pbs溶液分別將培養(yǎng)好的三組細(xì)胞沖洗3遍，再將每組沖洗后的細(xì)胞分別用dmem+10％胎牛血清+青鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，然后用cck8試劑盒分別檢測(cè)三組細(xì)胞的毒性。對(duì)照組：選用子宮頸癌細(xì)胞(hela細(xì)胞)為腫瘤細(xì)胞，將hela細(xì)胞接種于96孔板，每孔細(xì)胞的個(gè)數(shù)為3×103個(gè)，以dmem+10％胎牛血清+青鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，細(xì)胞增殖到50-60％匯合度；然后吸去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(pbs溶液)將培養(yǎng)好的細(xì)胞沖洗3遍；將沖洗后的細(xì)胞用無血清的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)4h，然后吸去培養(yǎng)基，用pbs溶液將培養(yǎng)好的細(xì)胞沖洗3遍，再將沖洗后的細(xì)胞用dmem+10％胎牛血清+青鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，然后用cck8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的毒性。結(jié)合圖4比較實(shí)驗(yàn)組1和對(duì)照組，在培養(yǎng)基中加入納米金剛石，細(xì)胞存活率為99.01±7.83％，表明納米金剛石在給藥濃度下對(duì)hela細(xì)胞沒有毒性；在培養(yǎng)基中加入egf-納米金剛石-順鉑給藥體系，細(xì)胞的存活率為51.98±9.12％，表明egf-納米金剛石-順鉑給藥體系在給藥濃度下可以有效地殺死子hela細(xì)胞；在培養(yǎng)基中加入與給藥體系順鉑量一致的順鉑，細(xì)胞的存活率為99.80±7.78％，表明給藥體系順鉑量一致的順鉑在給藥濃度下對(duì)hela細(xì)胞沒有毒性，進(jìn)一步驗(yàn)證egf-納米金剛石-順鉑給藥體系可以將藥物集中作用腫瘤細(xì)胞，提高順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。應(yīng)用例3神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組1：選用神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(c6細(xì)胞)為腫瘤細(xì)胞，將c6細(xì)胞接種于96孔板，每孔細(xì)胞的個(gè)數(shù)為3×103個(gè)，以dmem+10％胎牛血清+青鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，細(xì)胞增殖到50-60％匯合度；然后吸去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(pbs溶液)將培養(yǎng)好的細(xì)胞沖洗3遍，將沖洗后的細(xì)胞分為三組，然后分別用實(shí)施例1中納米金剛石(濃度為0.1mg/ml)的無血清培養(yǎng)基、實(shí)施例1合成的egf-納米金剛石-順鉑給藥體系(濃度為0.1mg/ml)的無血清培養(yǎng)基、與給藥體系順鉑量一致的含順鉑(濃度為0.6μg/ml)的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4h；分別吸去含納米金剛石的培養(yǎng)基、含egf-納米金剛石-順鉑給藥體系的培養(yǎng)基和含順鉑的培養(yǎng)基，然后用pbs溶液分別將培養(yǎng)好的三組細(xì)胞沖洗3遍，再將每組沖洗后的細(xì)胞分別用dmem+10％胎牛血清+青鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，然后用cck8試劑盒分別檢測(cè)三組細(xì)胞的毒性。對(duì)照組：選用神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(c6細(xì)胞)為腫瘤細(xì)胞，將c6細(xì)胞接種于96孔板，每孔細(xì)胞的個(gè)數(shù)為3×103個(gè)，以dmem+10％胎牛血清+青鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，細(xì)胞增殖到50-60％匯合度；然后吸去培養(yǎng)基，用pbs溶液將培養(yǎng)好的細(xì)胞沖洗3遍；將沖洗后的細(xì)胞用無血清的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)4h，然后吸去含培養(yǎng)基，用pbs溶液將培養(yǎng)好的細(xì)胞沖洗3遍，再將沖洗后的細(xì)胞用dmem+10％胎牛血清+青鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，然后用cck8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的毒性。結(jié)合圖5比較實(shí)驗(yàn)組1和對(duì)照組，在培養(yǎng)基中加入納米金剛石，細(xì)胞存活率為95.22±7.11％，表明納米金剛石在給藥濃度下對(duì)c6細(xì)胞沒有毒性；在培養(yǎng)基中加入egf-納米金剛石-順鉑給藥體系，細(xì)胞的存活率為30.60±3.42％，表明egf-納米金剛石-順鉑給藥體系在給藥濃度下可以有效地殺死c6細(xì)胞；在培養(yǎng)基中加入給藥體系順鉑量一致的順鉑，細(xì)胞的存活率為99.45±2.00％，表明給藥體系順鉑量一致的順鉑在給藥濃度下對(duì)c6細(xì)胞沒有毒性，進(jìn)一步驗(yàn)證egf-納米金剛石-順鉑給藥體系可以將藥物集中作用腫瘤細(xì)胞，提高順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定，對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，這里無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。當(dāng)前第1頁12