本發(fā)明涉及一種醫(yī)藥組成物，特別是涉及一種醫(yī)藥組成物及其應(yīng)用于預(yù)防或減緩糖尿病及其并發(fā)癥的醫(yī)藥組成物。
背景技術(shù)：
：隨著人口老化和生活型態(tài)及飲食方式改變，近年來糖尿病(diabetes)病患者有日漸增加的趨勢，據(jù)報導(dǎo)在2013年全球共有三億八千二百萬名糖尿病患者，在臺灣糖尿病已高居國人十大死因前四名。糖尿病是一種代謝性疾病，其特征是長時間血糖高于標(biāo)準(zhǔn)值，而造成的原因是胰島素分泌或作用產(chǎn)生缺陷而導(dǎo)致代謝障礙。糖尿病患者更因長期血液中含有高血糖易并發(fā)其他疾病。常見的糖尿病治療方法包含飲食控制、運動治療、以及藥物治療等方法。大豆異黃酮(soyisoflavone)是大豆生長中形成的次級代謝產(chǎn)物，大豆異黃酮與人類雌激素有相似結(jié)構(gòu)，因在植物中發(fā)現(xiàn)，故常被稱為植物雌激素。其功效除了廣為人知的改善女性更年期癥狀外，研究指出大豆異黃酮也可預(yù)防骨質(zhì)疏松癥等癥狀。此外，研究也指出喂食糖尿病老鼠含有大豆異黃酮的大豆凍干粉可降低糖尿病老鼠的血糖與血脂濃度。當(dāng)植物遭遇逆境或發(fā)芽時，會分泌化學(xué)物質(zhì)以抵抗感染。先前研究發(fā)現(xiàn)，花生在發(fā)育時會分泌許多化學(xué)物質(zhì)，例如二苯乙烯類(stilbenoids)化合物，二苯乙烯類包括白藜蘆醇類(resveratrol)與花生對苯乙烯衍生物(arachidonicacidderivative)等化合物。研究指出給予白藜蘆醇類可以降低血糖的濃度，但根據(jù)報導(dǎo)白藜蘆醇類在動物體內(nèi)的生體可用率低，而同屬于二苯乙烯類的花生對苯乙烯衍生物則有研究指出具有去除自由基(reactiveoxygenspecies；ros)、抗氧化以及延長壽命等效用。縱然目前已發(fā)展許多治療糖尿病的藥物，但在實際預(yù)防或治療糖尿病時效果卻不彰，是因糖尿病的致病機制復(fù)雜，糖尿病患者因長期血液中含有高血糖易并發(fā)其他疾病，因而無法有效預(yù)防或減緩糖尿病及其并發(fā)癥。有鑒于此，亟需用于預(yù)防或減緩糖尿病及其并發(fā)癥的醫(yī)藥組成物，以克服現(xiàn)有技術(shù)的種種缺點。技術(shù)實現(xiàn)要素：因此，本發(fā)明的目的在于提供一種預(yù)防或減緩糖尿病及其并發(fā)癥的醫(yī)藥組成物，在活體外的高葡萄糖環(huán)境中可降低腎上皮細(xì)胞的自由基含量，以及在活體內(nèi)提升胰島素濃度、降低血糖與血脂含量、降低丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性以及降低發(fā)炎反應(yīng)等，可預(yù)防或減緩糖尿病及其并發(fā)癥。本發(fā)明的一實施例是在提供一種預(yù)防或減緩糖尿病及其并發(fā)癥的醫(yī)藥組成物，此醫(yī)藥組成物包含大豆異黃酮(soyisoflavone)與花生對苯乙烯衍生物(peanutstilbenederivatives)的植物來源混合物。本發(fā)明的另一實施例是在提供一種植物來源混合物用于制備用于預(yù)防或減緩糖尿病及其并發(fā)癥的醫(yī)藥組成物的用途，其中前述醫(yī)藥組成物包含有效成分以及醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑，有效成分包含大豆異黃酮與花生對苯乙烯衍生物的植物來源混合物，可預(yù)防或減緩糖尿病及其并發(fā)癥。根據(jù)本發(fā)明的上述實施例，提出一種預(yù)防或減緩糖尿病及其并發(fā)癥的醫(yī)藥組成物，其包含重量比為1：1至10：1的大豆異黃酮與花生對苯乙烯衍生物的植物來源混合物。依據(jù)本發(fā)明一實施例，上述植物來源混合物包含重量比為5：1至10：1的大豆異黃酮與花生對苯乙烯衍生物。依據(jù)本發(fā)明另一實施例，上述的大豆異黃酮可包含但不限于金雀異黃酮(genistein)、大豆異黃酮苷(daidzin)及其任意組合。依據(jù)本發(fā)明又一實施例，上述的花生對苯乙烯衍生物可包含但不限于落花生素-1(arachidin-1)、落花生素-2(arachidin-2)、落花生素-3(arachidin-3)及其任意組合。根據(jù)本發(fā)明的另一實施例，提出一種植物來源混合物用于制備預(yù)防或減緩糖尿病及其并發(fā)癥的醫(yī)藥組成物的用途。此醫(yī)藥組成物包含有效成分以及醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑，有效成分包含每公斤體重1.5毫克至5毫克的大豆異黃酮與每公斤體重0.15毫克至0.5毫克的花生對苯乙烯衍生物的植物來源混合物，且此醫(yī)藥組成物經(jīng)由口服途徑或非口服途徑投予，以預(yù)防或減緩糖尿病及其并發(fā)癥。依據(jù)本發(fā)明一實施例，上述的大豆異黃酮與花生對苯乙烯衍生物的重量比為1：1至10：1。依據(jù)本發(fā)明另一實施例，上述的大豆異黃酮與花生對苯乙烯衍生物的重量比為5：1至10：1。依據(jù)本發(fā)明又一實施例，上述的非口服途徑包括肌肉注射途徑、皮下注射途徑、皮內(nèi)注射途徑或腹腔注射途徑。依據(jù)本發(fā)明又一實施例，上述的糖尿病包括第一型胰島素依賴型糖尿病(insulin-dependentdiabeticmellitus；iddm)或第二型非胰島素依賴型糖尿病(non-insulindependentdiabeticmellitus；niddm)。依據(jù)本發(fā)明又一實施例，上述的癥狀可包含但不限于自由基(reactiveoxygenspecies；ros)含量增加、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanineaminotransferase；alt)活性增加、血脂含量增加以及發(fā)炎反應(yīng)增加及其任意組合。應(yīng)用本發(fā)明的預(yù)防或減緩糖尿病及其并發(fā)癥的醫(yī)藥組成物，其包含大豆異黃酮與花生對苯乙烯衍生物的植物來源混合物。經(jīng)體外細(xì)胞試驗以及動物試驗證實，含有上述植物來源混合物的醫(yī)藥組成物可降低細(xì)胞的自由基含量、提升胰島素濃度、降低血糖與血脂含量、降低丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性以及降低發(fā)炎反應(yīng)等，借此預(yù)防或減緩糖尿病及其并發(fā)癥。附圖說明為讓本發(fā)明的上述和其他目的、特征、優(yōu)點與實施例能更明顯易懂，所附圖式的詳細(xì)說明如下：圖1a是顯示根據(jù)本發(fā)明一實施例的醫(yī)藥組成物對腎臟上皮細(xì)胞株經(jīng)高濃度葡萄糖培養(yǎng)液處理后的細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生量長條圖。圖1b是顯示根據(jù)本發(fā)明一實施例的醫(yī)藥組成物對腎臟上皮細(xì)胞株經(jīng)高濃度葡萄糖培養(yǎng)液處理后的細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生量長條圖。圖1c是顯示根據(jù)本發(fā)明一實施例的醫(yī)藥組成物對腎臟上皮細(xì)胞株經(jīng)高濃度葡萄糖培養(yǎng)液處理后的細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生量長條圖。圖1d是顯示根據(jù)本發(fā)明一實施例的醫(yī)藥組成物對腎臟上皮細(xì)胞株經(jīng)高濃度葡萄糖培養(yǎng)液處理后的細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生量長條圖。圖2是顯示根據(jù)本發(fā)明一實施例的醫(yī)藥組成物經(jīng)腹腔注射投予糖尿病小鼠的體重變化百分比長條圖。圖3a是顯示根據(jù)本發(fā)明一實施例的醫(yī)藥組成物經(jīng)腹腔注射投予糖尿病雄性小鼠的血糖濃度變化曲線圖。圖3b是顯示根據(jù)本發(fā)明一實施例的醫(yī)藥組成物經(jīng)腹腔注射投予糖尿病雌性小鼠的血糖濃度變化曲線圖。圖4a是顯示根據(jù)本發(fā)明一實施例的醫(yī)藥組成物經(jīng)腹腔注射投予糖尿病雄性小鼠的胰島素濃度的長條圖。圖4b是顯示根據(jù)本發(fā)明一實施例的醫(yī)藥組成物經(jīng)腹腔注射投予糖尿病雌性小鼠的胰島素濃度的長條圖。具體實施方式承前所述，本發(fā)明提供一種預(yù)防或減緩糖尿病及其并發(fā)癥的醫(yī)藥組成物， 此醫(yī)藥組成物包含大豆異黃酮與花生對苯乙烯衍生物的植物來源混合物。本發(fā)明應(yīng)用于預(yù)防或減緩糖尿病及其并發(fā)癥的醫(yī)藥組成物的用途，利用上述包含大豆異黃酮與花生對苯乙烯衍生物的植物來源混合物作為醫(yī)藥組成物，經(jīng)由口服途徑或非口服途徑投予糖尿病患者，以降低血糖變化、提高胰島素含量、降低自由基含量、降低丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性、降低血脂含量以及降低發(fā)炎反應(yīng)等，借此預(yù)防或減緩糖尿病及其并發(fā)癥。本發(fā)明此處所稱的植物來源混合物包含大豆異黃酮與花生對苯乙烯衍生物，其中大豆異黃酮是指例如金雀異黃酮(genistein)、大豆異黃酮苷(daidzin)的植物去葡萄糖苷大豆異黃酮。上述的大豆異黃酮可由人工化學(xué)合成、或為植物萃取。在一實施例中，上述的人工化學(xué)合成可由任何現(xiàn)有方法所制備，在此不另贅述。在一例示中，上述的大豆異黃酮原料的來源可包括但不限于大豆(glycinemax)、菜豆(phaseolusvulgarisl.)、苜蓿(medicagosatival.)、綠豆(vignaradiatal.)、豇豆(vignaunguiculatal.)、鐮扁豆(puerarialobatal.)、紅車軸草(trifoliumpratensel.)等及其任意組合，然以大豆為優(yōu)選。在另一例示中，上述的大豆品系，包括但不限于三國品系、十石品系、和歌島品系、百美豆品系、愛家豆品系、多生豆品系、臺南選1號、臺南2號、黑豆臺南3號、黑豆臺南5號、大豆臺南8號、大豆臺南9號、花蓮1號、花蓮2號、高雄8號、高雄選10號、高雄12號等及其任意組合，然以十石品系為優(yōu)選。在又一實施例中，植物萃取的大豆異黃酮是將大豆原料與無菌水浸泡后，再依序進(jìn)行粉碎步驟、萃取步驟與層析步驟，以形成大豆異黃酮。在一例示中，上述的萃取步驟是以低碳數(shù)醇或濃度至少95％(v/v)的低碳數(shù)醇的水溶液進(jìn)行萃取。在另一例示中，前述的低碳數(shù)醇可包含甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇等，然以甲醇為優(yōu)選。在又一例示中，上述的層析步驟是用以分離去葡萄糖苷大豆異黃酮。上述的層析步驟可包含但不限于液－固相層析(liquid-solidchromatography；lsc)、分子篩層析(sizeexclusionchromatography；sec)、離子交換層析(ion-exchangechromatography；iec)及其任意組合。上述工藝所得 的大豆異黃酮，經(jīng)高效液相層析(highperformanceliquidchromatography；hplc)儀分析后，可包含金雀異黃酮(genistein)、大豆異黃酮苷(daidzin)以及其他不可分離的成分。在又一實施例中，大豆異黃酮可包含但不限于金雀異黃酮(genistein)、大豆異黃酮苷(daidzin)、大豆異黃酮苷素(daidzein)、黃豆黃苷素(glycitein)、丙二酰金雀異黃酮苷(malonylgenistin)、丙二酰大豆異黃酮苷(malonyldaidzin)、金雀異黃酮苷(genistin)、黃豆黃苷(glycitin)、丙二酰黃豆黃苷(malonylglycitin)、乙酰大豆異黃酮苷(acetyldaidzin)、乙酰金雀異黃酮苷(acetylgenistin)、乙酰黃豆黃苷(acetylglycitin)及其任意組合，然以金雀異黃酮(genistein)、大豆異黃酮苷(daidzin)為優(yōu)選。本發(fā)明此處所稱的花生對苯乙烯衍生物是指例如落花生素-1(arachidin-1)、落花生素-2(arachidin-2)、落花生素-3(arachidin-3)的對苯乙烯類(stilbenoids)化合物。本發(fā)明此處所稱的花生對苯乙烯衍生物是可由人工化學(xué)合成、或由植物萃取。在一實施例中，植物萃取的花生對苯乙烯衍生物是根據(jù)臺灣專利申請?zhí)柕?97131709號所述方法制得的花生對苯乙烯衍生物。上述工藝所得的花生對苯乙烯衍生物，經(jīng)高效液相層析儀分析后，可包含落花生素-1、落花生素-2以及落花生素-3。在一實施例中，大豆異黃酮與花生對苯乙烯衍生物是溶于水溶液。在一例示中，上述的水溶液是生理食鹽水溶液。在另一例示中，上述的大豆異黃酮與花生對苯乙烯衍生物的重量比為1：1至10：1。在又一例示中，上述的大豆異黃酮與花生對苯乙烯衍生物的重量比為5：1至10：1。在又一例示中，上述的大豆異黃酮與花生對苯乙烯衍生物的重量比為4：1、4：5或8：1。在一實施例中，上述含有大豆異黃酮與花生對苯乙烯衍生物的植物來源混合物可應(yīng)用于制備預(yù)防或減緩糖尿病及其并發(fā)癥的醫(yī)藥組成物。在一例示中，上述醫(yī)藥組成物包含有效成分以及醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑，其中前述的 有效成分可包含每公斤體重1.5毫克至5毫克的大豆異黃酮與每公斤體重0.15毫克至0.5毫克的花生對苯乙烯衍生物的植物來源混合物。上述所稱的醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑是指醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑，其必需不影響活性成分、與其他成分相容且對其接受者無害。在其他例子中，上述醫(yī)藥組成物還可選擇性添加現(xiàn)有的稀釋劑及/或賦形劑，然以不影響活性成分、與其他成分相容且對其接受者無害為佳。在一實施例中，上述所稱的糖尿病及其并發(fā)癥是指因胰島素分泌或作用產(chǎn)生缺陷引起廣泛性代謝障礙而造成的疾病，而糖尿病患者血液中長期維持高血糖。糖尿病依據(jù)成因可分為第一型胰島素依賴型糖尿病(insulin-dependentdiabeticmellitus；iddm)或第二型非胰島素依賴型糖尿病(non-insulindependentdiabeticmellitus；niddm)。第一型胰島素依賴型糖尿病主要是因免疫系統(tǒng)攻擊胰臟蘭氏小島(isletoflangerhans)的β細(xì)胞，而造成的自體免疫疾病(autoimmunedisease)。而第二型非胰島素依賴型糖尿病主要是由于胰島素分泌缺陷，或胰島素抗阻性(insulinresistance)所引起的糖尿病?？v然兩種類型糖尿病的成因不同，而造成糖尿病的主要病征為持續(xù)性血液中含有高血糖，而糖尿病患者長期血液中含有高血糖易并發(fā)其他疾病，如自由基含量增加、發(fā)炎反應(yīng)增加、并發(fā)高血脂，且經(jīng)常伴隨著脂質(zhì)代謝異常的情況，如血漿中甘油三酯(triglyceride；tg)濃度上升。另外，根據(jù)研究指出，嚴(yán)重糖尿病患者的肝臟清除血脂能力會下降。當(dāng)肝臟中三酸甘油脂不斷的累積后，肝細(xì)胞便會發(fā)生病變形成脂肪肝進(jìn)而嚴(yán)重影響肝功能。上述植物來源混合物在應(yīng)用于醫(yī)藥組成物時，此醫(yī)藥組成物包含有效成分每公斤體重1.5毫克至5毫克的大豆異黃酮與每公斤體重0.15毫克至0.5毫克的花生對苯乙烯衍生物。在一實施例中，上述醫(yī)藥組成物可經(jīng)由例如口服途徑或非口服途徑投予對象，端視實際需求而定。在一例示中，前述非口服途徑可包含但不限于肌肉注射途徑、皮下注射途徑、皮內(nèi)注射途徑或腹腔注射途徑。在其他例示中，前述對象可例如為哺乳動物，例如小鼠。上述含有大豆異黃酮與花生對苯乙烯衍生物的植物來源混合物作為醫(yī)藥組成物，經(jīng)體外細(xì)胞試驗以及動物試驗證實，同時具有預(yù)防或減緩糖尿病及其并發(fā)癥的功效。此處所稱的預(yù)防或減緩是指可以減緩預(yù)防或減緩相關(guān)的臨床癥狀及/或其并發(fā)癥，可包括但不限于降低自由基含量、提高胰島素含量、降低丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性、降低血糖、血脂含量以及降低發(fā)炎反應(yīng)及其任意組合。在此需說明的是，本發(fā)明此處所稱的動物實驗，是指利用藥物例如鏈佐菌素(streptozotocin；stz)，人為誘發(fā)實驗動物產(chǎn)生糖尿病后，評估含有大豆異黃酮與花生對苯乙烯衍生物的醫(yī)藥組成物對于預(yù)防或減緩糖尿病及其并發(fā)癥的效果。以下利用多個實施例以說明本發(fā)明的應(yīng)用，然其并非用以限定本發(fā)明，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作各種變動與潤飾。實施例一：建立生體外細(xì)胞平臺1.培養(yǎng)腎臟上皮細(xì)胞株mdck將腎臟上皮細(xì)胞株mdck(犬腎臟上皮細(xì)胞株madin-darbycaninekidney；mdck；例如獲自于臺灣生物資源保存及研究中心寄存編號ccrc60004；atccccl-34)，根據(jù)臺灣食品工業(yè)發(fā)展研究所生物資源保存及研究中心所建議，培養(yǎng)于含有10％的胎牛血清(fetalbovineserum；fbs)、1.2mg/mlnahco3、0.1mg/ml鏈霉素(streptomycin)n及0.5mg/ml安比西林(ampicillin)，ph值為7.4的mem最低必需培養(yǎng)基(minimalessentialmedium，mem；brl,grandisland,ny)培養(yǎng)液中，置于5％co2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱(nuairnu4500,usa)培養(yǎng)，每2至3天更換新鮮的培養(yǎng)液。待細(xì)胞生長至約九成滿時，以磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffersaline；pbs)輕輕清洗細(xì)胞后，加入1ml的0.25％的胰蛋白酶(trypsin)-edta將細(xì)胞洗下，依實 驗?zāi)康牟煌M(jìn)行分盤或繼代培養(yǎng)。2.高濃度葡萄糖培養(yǎng)液處理平臺根據(jù)臺灣食品工業(yè)發(fā)展研究所生物資源保存及研究中心所建議，將mdck細(xì)胞株以胰蛋白酶-edta洗下后，配制成1×106cells/ml的細(xì)胞液。然后，使用96孔盤進(jìn)行細(xì)胞分盤，每孔注入100μl的mdck細(xì)胞液(1×105cells/100μl/well)，置于5％co2的37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時后，去除mem培養(yǎng)液，再進(jìn)行高濃度葡萄糖培養(yǎng)液處理，每孔注入100μl含有高葡萄糖濃度(30mm)的mem培養(yǎng)液(含有1.2mg/mlnahco3、0.1mg/ml鏈霉素(streptomycin)及0.5mg/ml安比西林(ampicillin))，置于5％co2的37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時后，以離心機于4℃下以1,000×g離心10分鐘。去除上清液后，每孔再加入100μlph值為7.4的新鮮的mem培養(yǎng)液，后續(xù)分析mdck細(xì)胞株的細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生量。3.配制含大豆異黃酮和花生對苯乙烯衍生物的植物來源混合物的醫(yī)藥組成物因此上述mdck細(xì)胞株接下來根據(jù)表1，分成下列的(a)、(b)、(c)、(d)以及(e)組別：(a)實施例1-1至1-2、實施例2、實施例3-1至3-2以及實施例4：經(jīng)高濃度葡萄糖培養(yǎng)液處理后的細(xì)胞，并添加大豆異黃酮與花生對苯乙烯衍生物的植物來源混合物(b)比較例1-1至1-3、比較例2-1至2-2以及比較例3至4：經(jīng)高濃度葡萄糖培養(yǎng)液處理后的細(xì)胞，并添加含有大豆異黃酮與白藜蘆醇類的植物來源混合物(c)比較例5-1至5-2、比較例6至7以及比較例8-1至8-3：經(jīng)高濃度葡 萄糖培養(yǎng)液處理后的細(xì)胞，只添加大豆異黃酮、花生對苯乙烯衍生物或白藜蘆醇的植物來源混合物(d)控制組：經(jīng)高濃度葡萄糖培養(yǎng)液處理后的細(xì)胞(e)正常細(xì)胞：未經(jīng)處理的細(xì)胞。表1在一例示中，上述(a)組別、(b)組別、或(c)組別所使用的大豆異黃酮為金雀異黃酮(genistein；其濃度為5μm，1.35μg/ml)或大豆異黃酮苷(daidzin；其濃度為4μm，1.67μg/ml)。在另一例示中，(a)組別與(c)組別所使用的花生對苯乙烯衍生物為落花生素-1(arachidin-1；a1；其濃度為0.5μm或1μm，0.18μg/ml或0.36μg/ml)或落花生素-3(arachidin-3；a3；其濃度為5μm，1.48μg/ml)。在又一例示中，(b)組別以及(c)組別所使用的白藜蘆醇 (resveratrol；re.；2μm、3μm或5μm，0.46μg/ml、0.69μg/ml或1.14μg/ml)或異戊二烯基白藜蘆醇(isopentadienylresveratrol；ipdr；其濃度為5μm，1.48μg/ml)。實施例二：含有大豆異黃酮與花生對苯乙烯衍生物的醫(yī)藥組成物活體外評估方法此實施例是利用實施例一建立的活體外的高濃度葡萄糖培養(yǎng)液處理平臺，評估實施例一的含有大豆異黃酮與花生對苯乙烯衍生物的醫(yī)藥組成物降低腎臟上皮細(xì)胞株mdck細(xì)胞內(nèi)的自由基產(chǎn)生量。1.評估細(xì)胞內(nèi)的自由基產(chǎn)生量利用無水dmso將2,7-二氯熒光素-3',6'-二醋酸酯(2,7-dichlorofluoresceindiacetate；h2dcf-da；invitrogen,usa)配制成10mm/μl的溶液。將mdck細(xì)胞株以pbs清洗后，加入含有最終濃度為10μmh2dcf-da的pbs，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中經(jīng)30分鐘反應(yīng)，以pbs沖洗后加入不含酚紅的mem(brl,grandisland,ny)，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)5分鐘后，收集細(xì)胞，以流式細(xì)胞儀(beckmancoulterepicsxl-mcl,usa)個別分析h2dcf-da的產(chǎn)物二氯熒光素(dcf)在激發(fā)光488nm下借由fl1接收波長526nm的散射光的熒光強度，借此評估細(xì)胞內(nèi)的自由基產(chǎn)生量。請參閱圖1a至圖1d，其是繪示根據(jù)本發(fā)明一實施例的醫(yī)藥組成物對腎臟上皮細(xì)胞株經(jīng)高濃度葡萄糖培養(yǎng)液處理后的細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生量長條圖。其中橫軸為不同處理，縱軸為自由基產(chǎn)生量相對百分比(％，以正常細(xì)胞的自由基產(chǎn)生量為100％)。在圖1a、圖1b以及圖1d中，其中圖號＊表示該組的平均值與與比較例7的差異顯著(p<0.05)。圖號＊＊表示該組的平均值與比較例7的差異顯著(p<0.01)。圖號＊＊＊表示該組的平均值與比較例7的差異顯著(p<0.001)。在圖1c中，其中圖號＊表示該組的平均值與控制組的差異顯著(p<0.05)。圖號＊＊表示該組的平均值與控制組的差異顯著(p<0.01)。圖號＊＊＊表示該組的平均值與控制組的差異顯著(p<0.001)。由圖1a至圖1d可知，與正常細(xì)胞相比，經(jīng)高濃度葡萄糖培養(yǎng)液處理后的細(xì)胞(即控制組)，其細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生量明顯增加。其次，與經(jīng)高濃度葡 萄糖培養(yǎng)液處理的控制組相比，比較例5-1至5-2、比較例6至7以及比較例8-1至8-3無法有效降低細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生量。再者，與比較例5-1至5-2、比較例6至7以及比較例8-1至8-3相比，無論實施例1-1至1-2、實施例2、實施例3-1至3-2以及實施例4或比較例1-1至1-3、比較例2-2以及比較例3至4，均可大量減少產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生量。然而，由圖1a與圖1d可知，相較于比較例1-1至1-3須高劑量(2μm、3μm或5μm)的白藜蘆醇與金雀異黃酮，實施例1-1至1-2僅需低劑量(0.5μm或1μm)的落花生素-1與金雀異黃酮即可有效降低細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生量。由圖1c可知，相較于比較例2-2須高劑量(3μm)的白藜蘆醇與大豆異黃酮苷，或相較于比較例4須高劑量(5μm)的異戊二烯基白藜蘆醇與大豆異黃酮苷以及比較例3須高劑量(5μm)的異戊二烯基白藜蘆醇與金雀異黃酮，實施例3-1至3-2僅需低劑量(0.5μm或1μm)的落花生素-1與大豆異黃酮苷即可有效降低細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生量。上述結(jié)果證明，實施例一的含有大豆異黃酮與花生對苯乙烯衍生物的醫(yī)藥組成物確實可有效降低細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生量。實施例三：利用動物實驗評估醫(yī)藥組成物預(yù)防或減緩糖尿病及其并發(fā)癥的效果此實施例是利用活體實驗動物，評估實施例一的含有大豆異黃酮與花生對苯乙烯衍生物的醫(yī)藥組成物在活體內(nèi)(invivo)防預(yù)防或減緩糖尿病及其并發(fā)癥的效果。1.建立實驗動物1.1動物飼養(yǎng)將48只6周齡的無特定病原(specificpathogen-free；spf)小鼠(品系：c57bl/6)；來源：國家實驗動物中心)，每組各有6只雄性小鼠與6只雌性小鼠，隨機分組為如表2所示：表2c57bl/6小鼠飼養(yǎng)在無特定病原的正壓環(huán)境中，控溫保持在24℃，并維持于12小時切換的光暗循環(huán)，飼養(yǎng)期間不限制飼料及水的供應(yīng)。c57bl/6小鼠的飼養(yǎng)條件均依循國家衛(wèi)生研究院公告的相關(guān)實驗動物管理指南進(jìn)行。1.2給予小鼠醫(yī)藥組成物秤取5g的金雀異黃酮(genistein；sigma,st.louis,mo,usa)與1g的落花生素-1(arachidin-1；sigma,st.louis,mo,usa)，溶于10ml無菌生理食鹽水(saline)中，配置成實施例1，其含有重量比為5：1或10：1的大豆異黃酮與花生對苯乙烯衍生物。按體重計算，實施例1的小鼠每日每公斤的投予混合液的劑量為0.3mg/kgbodyweight/day至5mg/kgbodyweight/day。比較例5的小鼠每日每公斤的投予落花生素-1的劑量為0.15mg/kgbodyweight/day至0.5mg/kgbodyweight/day。比較例7的小鼠每日每公斤的投予金雀異黃酮的劑量為1.5mg/kgbodyweight/day至5mg/kgbodyweight/day。控制組則給予生理食鹽水，上述組別皆以實驗材料均配制于10ml的生理食鹽水，且以腹腔注射給予小鼠，每次注射100μl，自注射鏈佐霉素建立小鼠糖尿病動物試驗起，每天投以一次，持續(xù)給予30天。2.評估醫(yī)藥組成物預(yù)防或減緩實驗動物的糖尿病及其并發(fā)癥的效果2.1建立小鼠糖尿病動物試驗?zāi)Ｊ绞紫?，實驗小鼠在禁?小時后，腹腔注射(intraperitonealinjection)40mg/kg體重的鏈佐菌素(溶解于10mm的檸檬酸鈉，ph4.5；sigma-aldrichchemical,st.louis,mo,u.s.a.)。接著，每兩天給予鏈佐霉素，給予次數(shù)共三 次，以建立小鼠糖尿病動物試驗?zāi)Ｊ健Ｈ缓?，在初次給予射鏈佐霉素十天后，利用葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase)法測定血糖以確認(rèn)是否成功誘發(fā)糖尿病，當(dāng)實驗期間無禁食的小鼠血糖值達(dá)250mg/dl則視為造癥成功，若小鼠血糖值未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)，則再給予小鼠濃度為250mg/ml的蔗糖水溶液。隨后，每隔三天后，監(jiān)測糖尿病小鼠的血糖濃度與體重，其中血糖濃度測試是在小鼠禁食4小時后進(jìn)行采血。2.2評估醫(yī)藥組成物對于糖尿病小鼠的體重與血糖濃度的影響在實驗期間，每隔3天測量血糖與體重一次。請參閱圖2，其是繪示根據(jù)本發(fā)明一實施例的醫(yī)藥組成物經(jīng)腹腔注射投予糖尿病小鼠的體重變化百分比長條圖。縱軸代表體重變化百分比(％)，橫軸分別代表比較例5、比較例7、實施例1以及控制組。由圖2的結(jié)果可知，在鏈佐菌素誘導(dǎo)糖尿病模式30天后，與控制組做比較，比較例5、比較例7以及實施例1均有減緩糖尿病小鼠體重變化的趨勢。評估糖尿病小鼠的血糖濃度是利用市售評估葡萄糖量的商品，例如葡萄糖檢測套組(glucosedetectionkit)(accu-chek，roche,usa)，以評估實施例三的動物模式中，糖尿病小鼠的血糖濃度。簡言之，進(jìn)行實驗時，以12只小鼠為一組，依上述各組別進(jìn)行處理，并每3天記錄血糖濃度變化。將小鼠的血液以13,000rpm進(jìn)行離心3分鐘，以分離血清和血漿。接著，取上層的血清10μl，加入葡萄糖檢測套組反應(yīng)試劑1.0ml，混合均勻后，在37℃恒溫水槽中反應(yīng)10分鐘。然后，利用accu-checkreader對其吸光度的不同以量測血糖值。葡萄糖檢測套組反應(yīng)試劑的原理是利用葡萄糖氧化成葡萄糖酸和過氧化氫，借著葡萄糖的色素基氧化呈現(xiàn)深淺不同的顏色，利用血糖機測定受體顏色反應(yīng)，再依標(biāo)準(zhǔn)曲線對照推算血糖值(mg/dl)，其結(jié)果如圖3a與圖3b所示。請參閱圖3a與圖3b，其是繪示根據(jù)本發(fā)明一實施例的醫(yī)藥組成物經(jīng)腹腔注射投予糖尿病小鼠的血糖濃度變化曲線圖?？v軸代表血糖濃度(mg/dl)，橫軸分別時間(天數(shù))。圖3a為雄性小鼠的血糖濃度變化的曲線圖，圖3b為雌性小鼠的血糖濃度變化的曲線圖。其中圖號▲所示的曲線301代表實施例1的血糖濃度變化，圖號◆所示的曲線303代表比較例5的血糖濃度變化，圖號 ■所示的曲線305代表比較例7的血糖濃度變化，圖號●所示的曲線307代表控制組的血糖濃度變化。由圖3a與圖3b可知，在給予鏈佐菌素21天后，相較于其他組別(控制組、比較例5、比較例7)，將實施例1給予小鼠后，小鼠的血糖濃度明顯低于其他組別。由上述結(jié)果證明，實施例1(包含大豆異黃酮與花生對苯乙烯衍生物的醫(yī)藥組成物)確實可有效降低血糖濃度。2.3評估醫(yī)藥組成物對于糖尿病小鼠的胰島素濃度的影響此例示是利用市售評估胰島素濃度的商品，例如胰島素檢測套組(ultrasensitivemouseinsulinassaykit)(crystalchem，usa)，以評估實施例三的動物模式中糖尿病小鼠的胰島素濃度。此例示是在注射鏈佐菌素7天后，對小鼠進(jìn)行腿靜脈，取0.5ml小鼠血液，接續(xù)利用小鼠胰島素檢測套組量測胰島素濃度(ng/ml)。有關(guān)小鼠胰島素檢測套組的操作方法如下例示。首先，在96孔微量盤中，每孔分別加入95μl分析稀釋液(assaydiluentrd1-63)與5μl待測樣品，或加入100μl不同稀釋倍率的標(biāo)準(zhǔn)液，在4℃下作用約2小時。接著，加入200μlpbst(1×phosphatebuffersaline,0.5％tween20)清洗五次。在96孔微量盤中，每孔分別加入連接酵素的胰島素抗體作為檢測抗體(detectingantibody)。之后，在室溫下作用約30分鐘。接著，加入200μlpbst(1×phosphatebuffersaline,0.5％tween20)清洗七次。然后，加入等體積的冷光呈色劑，例如tmb過氧化酶受質(zhì)(tmbperosidasesubstrate；kpl,inc.,md,u.s.a.)，在室溫避光反應(yīng)30分鐘后，加入等量的中止液(stopsolution；kpl,inc.,md,u.s.a.)以中止呈色反應(yīng)。隨后，利用冷光熒光分析儀，例如anthos2020elisa判讀儀(anthos2020elisareader；anthos2020,cambridge,u.k.)，檢測在波長450nm的吸光值(od450nm)，以分析小鼠血液中的胰島素的生成量，其結(jié)果如圖4a與圖4b所示。請參閱圖4a與圖4b，其是繪示根據(jù)本發(fā)明一實施例的醫(yī)藥組成物經(jīng)腹腔注射投予糖尿病小鼠的胰島素濃度的長條圖?？v軸代表平均胰島素含量(ng/ml)，橫軸分別代表比較例5、比較例7、實施例1以及控制組。圖4a為雄性小鼠的胰島素濃度的長條圖，圖4b為雌性小鼠胰島素濃度的長條圖。由圖4a與圖4b的結(jié)果可知，在給予鏈佐菌素7天后，雌性小鼠的各組別間的胰島素濃度并無明顯差異。但如圖4a所示，相較于其他組別(控制組、比較例5以及比較例7)，將實施例1給予糖尿病雄性小鼠后，胰島素濃度明顯高于其他組別。由上述結(jié)果證明，實施例1(包含大豆異黃酮與花生對苯乙烯衍生物的醫(yī)藥組成物)確實可有效提高胰島素濃度。2.4評估醫(yī)藥組成物對于糖尿病小鼠的血清生化值的影響糖尿病小鼠血液中含有高血糖易并發(fā)其他疾病，如血漿中甘油三酯濃度上升，肝功能受到影響等。故此例示是在給予小鼠鏈佐菌素30天后，犧牲糖尿病小鼠采其全血以檢測血清生化值。分析以全自動血液分析儀(cobasmiraplus,roche,usa)或酵素免疫分析儀進(jìn)行各項生化檢測，上述分析方法可利用現(xiàn)有方法進(jìn)行，此處不另贅述。請參閱表3，其是繪示根據(jù)本發(fā)明一實施例的小鼠血清生化值結(jié)果，分析項目包含丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanineaminotransferase；alt)、甘油三酯(triglyceride；tg)、總膽固醇(totalcholesterol；t-chol)、蛋白質(zhì)(totalprotein；t-p)、膽紅素(totalbilirubin；t-bili)以及血中尿素氮(bloodureanitrogen；bun)等血清生化值。由表3的結(jié)果可知，在alt與tg項目，與正常小鼠相比，經(jīng)鏈佐菌誘導(dǎo)糖尿病的小鼠(即控制組)，其alt與tg項目數(shù)值明顯增加。再者，將實施例1給予糖尿病小鼠后，alt與tg項目數(shù)值明顯低于控制組，結(jié)果與正常小鼠相近，甚至更低于正常小鼠，代表給予糖尿病小鼠實施例1確實可預(yù)防或減緩糖尿病及其并發(fā)癥。在t-chol、t-p、t-bili與bun等項目，各組間均無統(tǒng)計的顯著差異(p>0.05)。由表3的血清生化值試驗證實，本發(fā)明的實施例1對于小鼠的肝、膽與腎等并無毒性。故此，前述評估所得的實施例1可單獨使用或與至少一個醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑混合，而形成醫(yī)藥組成物。至于醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑的種類與添加量應(yīng)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，此處不另贅述。表3控制組實施例1比較例5比較例7正常小鼠alt71.33±55.2855.33±20.1546.00±7.4858.67±28.4758.40±31.32tg49.33±26.4914.67±10.9318.67±9.6924.00±17.8920.00±12.65t-chol62.67±7.8760.00±16.0060.67±8.5559.33±8.5558.40±4.56t-p3.87±0.604.13±0.704.33±0.474.33±0.784.64±0.22t-bili0.71±0.030.75±0.060.71±0.070.72±0.070.70±0.04bun21.00±8.4218.00±5.6219.40±3.8319.40±4.7320.16±4.01總言之，由上述多個實施例證實，本發(fā)明以大豆異黃酮與花生對苯乙烯衍生物的植物來源混合物作為有效成分，經(jīng)體外試驗與動物試驗證實具有預(yù)防或減緩糖尿病及其并發(fā)癥的功效，可結(jié)合醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑制得醫(yī)藥組成物。需補充的是，本發(fā)明雖以特定的工藝、特定的分析方法或特定儀器作為例示，說明本發(fā)明包含大豆異黃酮與花生對苯乙烯衍生物的醫(yī)藥組成物及其用于制備預(yù)防或減緩糖尿病及其并發(fā)癥的醫(yī)藥組成物的用途，惟本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中任何具有通常知識者可知，本發(fā)明并不限于此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，本發(fā)明以包含大豆異黃酮與花生對苯乙烯衍生物的植物來源混合物制得的醫(yī)藥組成物，也可使用其他的工藝、其他分析方法或其他儀器進(jìn)行。由上述實施例可知，本發(fā)明的預(yù)防或減緩糖尿病及其并發(fā)癥的醫(yī)藥組成物，其優(yōu)點在于使用含有大豆異黃酮與花生對苯乙烯衍生物的植物來源混合物作為有效成分，可結(jié)合其他醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑制得醫(yī)藥組成物，借此同時預(yù)防或減緩糖尿病及其并發(fā)癥。雖然本發(fā)明已經(jīng)以多個實施例公開如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作各種變動與潤飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁12