本發(fā)明涉及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種明膠雜化復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著現(xiàn)代工業(yè)所導(dǎo)致的環(huán)境污染日益加重，癌癥已成為危害人類健康的一個重大難題，越來越多的患者因?yàn)榛及┌Y無法治愈而死亡。小分子抗癌藥是一種常用的抗癌藥物，其通常具有一定的作用靶點(diǎn)(如染色體修飾、熱休克蛋白、分子伴侶和蛋白激酶等)，與正常細(xì)胞相比，這些靶點(diǎn)對于癌細(xì)胞更為重要。但是其存在體內(nèi)代謝較快、維持有效血藥濃度較短、生物利用率低等缺點(diǎn)。因此，為了提高其療效常常需要較大的給藥劑量或多次給藥，同時由于其缺乏選擇性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時也會對正常細(xì)胞產(chǎn)生很強(qiáng)的毒副作用。

通過納米技術(shù)構(gòu)建納米藥物為小分子抗癌藥物的管理提供了合適的載體?？偟膩碚f，抗腫瘤納米藥物在體內(nèi)的1)長循環(huán)、2)腫瘤組織富集和滲透、3)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞和4)胞內(nèi)藥物可控釋放是極為關(guān)鍵的4個環(huán)節(jié)，設(shè)計可從整體上克服上述4個障礙環(huán)節(jié)的納米藥物載體對成功治療腫瘤極為重要。但是，現(xiàn)有的納米藥物載體或者由于尺寸太大導(dǎo)致所得藥物的腫瘤滲透性較差，或者由于尺寸太小即使所得藥物具有較好的腫瘤滲透性但是卻很容易被腎臟排出體外，或者存在載藥量有限的不足，或者存在釋藥過程不易控制的不足等，故均無法高效地治療癌癥。

因此，為了充分發(fā)揮小分子藥物的治療優(yōu)勢，本領(lǐng)域急需開發(fā)一種新型的、可滿足上述4個關(guān)鍵要求的、載藥量高、具有優(yōu)異腫瘤滲透性且在胞內(nèi)可實(shí)現(xiàn)藥物可控釋放的納米藥物載體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種新型的、可滿足上述4個關(guān)鍵要求的、載藥量高、具有優(yōu)異腫瘤滲透性且在胞內(nèi)可實(shí)現(xiàn)藥物可控釋放的納米藥物載體。

本發(fā)明的第一方面，提供了一種復(fù)合物，所述復(fù)合物包含：

納米粒子；和

可生物降解的明膠，所述明膠交聯(lián)于所述納米粒子表面；

且所述復(fù)合物的粒徑為20nm-500μm。

在另一優(yōu)選例中，所述復(fù)合物的粒徑為30nm-300μm，較佳地50nm-100μm，更佳地80nm-50μm，最佳地100nm-10μm。

在另一優(yōu)選例中，所述納米粒子的粒徑為5-80nm；和/或

所述明膠的純度≥85％。

在另一優(yōu)選例中，所述納米粒子的粒徑為10-50nm，較佳地為15-45nm，更佳地為20-40nm。

在另一優(yōu)選例中，所述明膠的純度≥90％，較佳地≥95％，更佳地≥99％，優(yōu)選為約100％。

在另一優(yōu)選例中，所述明膠的分子量為0.1萬－500萬，較佳地為0.5萬－100萬，更佳地為1萬－20萬。

在另一優(yōu)選例中，按所述復(fù)合物的總重量計，所述納米粒子的含量為1-30wt％，較佳地2-25wt％，更佳地3-20wt％。

在另一優(yōu)選例中，在所述復(fù)合物中，所述明膠對所述納米粒子的包覆率≥95％。

在另一優(yōu)選例中，在所述復(fù)合物中，所述明膠對所述納米粒子的包覆率≥98％，較佳地≥99％，優(yōu)選100％。

在另一優(yōu)選例中，所述納米粒子的比表面積為10m²/g－1500m²/g；和/或

所述納米粒子具有介孔結(jié)構(gòu)；和/或

所述納米粒子的介孔孔徑為1nm—50nm；和/或

所述納米粒子選自下組：鋰藻土、磷酸鈣微球/納米棒、碳納米球、氧化鐵、二氧化硅、陶瓷、碳納米球/納米管、氧化鈦、氧化鋅、氧化鎂、氧化鋯、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述納米粒子的比表面積為50m²/g－1200m²/g，較佳地100m²/g－1000m²/g。

在另一優(yōu)選例中，所述納米粒子的介孔孔徑為2nm—30nm，較佳地3nm－ 20nm。

本發(fā)明的第二方面，提供了一種本發(fā)明第一方面所述復(fù)合物的制備方法，包括如下步驟：

1)提供第一溶液、第一混合液、界面形成劑和交聯(lián)劑，其中，

所述第一溶液包含第一溶劑和溶于所述第一溶劑中的明膠；

所述第一混合液包含第二溶劑和納米粒子；

2)混合所述第一溶液和所述第一混合液，反應(yīng)得到第一反應(yīng)液；

3)將所述界面形成劑加入所述第一反應(yīng)液，反應(yīng)得到第二反應(yīng)液；和

4)將所述交聯(lián)劑加入所述第二反應(yīng)液，反應(yīng)得到本發(fā)明第一方面所述復(fù)合物。

在另一優(yōu)選例中，所述納米粒子和所述明膠如本發(fā)明第一方面所述。

在另一優(yōu)選例中，所述第一溶劑和所述第二溶劑可相同或不同，分別獨(dú)立地選自下組：水、甲醇、乙醇、丙酮、四氫呋喃、二甲基亞砜、稀鹽酸、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，在步驟4)之后，還任選地包括如下步驟：

5)去除前述步驟所得產(chǎn)物中的界面形成劑，得到第三反應(yīng)液；

6)任選地離心處理前述步驟所得第三反應(yīng)液，去除上清液，制得本發(fā)明第一方面所述復(fù)合物。

在另一優(yōu)選例中，在步驟5)中，所述去除采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀或透析法進(jìn)行。

在另一優(yōu)選例中，在步驟6)中，所述離心處理的離心速率為5000-20000rpm，較佳地8000-15000rpm。

在另一優(yōu)選例中，在步驟6)中，所述離心處理的處理時間為10-120分鐘，較佳地30-80分鐘。

在另一優(yōu)選例中，在步驟6)之后還任選地包括步驟：采用選自下組的物質(zhì)去除所得產(chǎn)物中的醛基：甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、胱氨酸、酪氨酸、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，在步驟2)中，所述第一反應(yīng)液中，所述納米粒子和所述明膠的混合重量比為1-50：10-100。

在另一優(yōu)選例中，在步驟2)中，所述第一反應(yīng)液中，所述納米粒子和所述明膠的混合重量比為1-30：20-50，較佳地2-20：20-40。

在另一優(yōu)選例中，在步驟2)中，所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度為40-80℃，較佳地50-70℃。

在另一優(yōu)選例中，在步驟2)中，所述反應(yīng)的反應(yīng)時間為1-30分鐘，較佳地5-15分鐘。

在另一優(yōu)選例中，所述界面形成劑選自下組：丙酮、乙醇、二甲亞砜、二氯甲烷、甲醇、乙醚、或其組合；和/或

所述交聯(lián)劑選自下組：戊二醛、丁二醛、聚乙二醇二醛、海藻酸多醛、透明質(zhì)酸多醛、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，在步驟3)中，所述界面形成劑與所述第一反應(yīng)液的體積比為1-10：1-3，較佳地1-5：1-2。

在另一優(yōu)選例中，在步驟3)中，所述反應(yīng)在室溫下進(jìn)行，優(yōu)選在10-40℃下進(jìn)行。

另一優(yōu)選例中，在步驟3)中，所述反應(yīng)的反應(yīng)時間為1-60分鐘，較佳地5-40分鐘，更佳地10-30分鐘。

在另一優(yōu)選例中，按重量計，在步驟4)中，所述交聯(lián)劑與所述第二反應(yīng)液中所述明膠的用量比為0.1－50：100－400，較佳地1－40：100－200。

在另一優(yōu)選例中，在步驟4)中，所述反應(yīng)在室溫下進(jìn)行，優(yōu)選在10-40℃下進(jìn)行。

在另一優(yōu)選例中，在步驟4)中，所述反應(yīng)的反應(yīng)時間為1-24小時，較佳地3-20小時，更佳地5-15小時。

本發(fā)明的第三方面，提供了一種組合物，所述組合物包含：

本發(fā)明第一方面所述的復(fù)合物；和

裝載于所述復(fù)合物納米粒子中的選自下組的一種或多種物質(zhì)：抗腫瘤藥物、造影劑、消炎藥物。

在另一優(yōu)選例中，所述抗腫瘤藥物選自下組：阿霉素(dox)、甲氨蝶呤、紫杉醇、柔紅霉素、伊立替康、托泊替康、長春堿、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述消炎藥物選自下組：地塞米松、氫化可的松、阿司匹林、阿莫西林、青霉素、耐酶青霉素、氨芐青霉素、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢氫 氨芐、頭孢克羅、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述造影劑選自下組：異硫氰酸熒光素、整合顯影劑(如金顆粒、磁顆粒等)、碘制劑、碘苯六醇、或其組合。

本發(fā)明的第四方面，提供了一種本發(fā)明第一方面所述的復(fù)合物或本發(fā)明第三方面所述的組合物的用途，用于1)制備治療和/或診斷癌癥的藥物；和/或2)用于制備治療炎癥的藥物。

本發(fā)明的第五方面，提供了一種藥物，所述藥物包含：

本發(fā)明第一方面所述的復(fù)合物；

裝載于所述復(fù)合物納米粒子中的選自下組的一種或多種物質(zhì)：抗腫瘤藥物、造影劑、消炎藥物；和

藥學(xué)上可接受的載體。

在另一優(yōu)選例中，所述藥物的給藥方式優(yōu)選為靜脈注射。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1為gld納米粒子分別在有無明膠酶(mmp2)下的微觀形貌變化圖。

圖2為組合物gld在不同ph值和溫度下，在磷酸鹽緩沖溶液中的藥物釋放動力學(xué)行為。

圖3為阿霉素dox、攜載阿霉素的鋰藻土微球ld、攜帶阿霉素的明膠/鋰藻土微球藥物組合物gld的腫瘤深度滲透性能結(jié)果。

圖4為阿霉素dox、攜帶阿霉素的明膠/鋰藻土微球藥物組合物gld的細(xì)胞攝取和藥物胞內(nèi)分布結(jié)果。

圖5為阿霉素dox、明膠/鋰藻土微球gl、ld、攜帶阿霉素的明膠/鋰藻土微球藥物組合物gld的抗腫瘤活性。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究，通過在具有特定表面結(jié)構(gòu)的特定粒徑的納米粒子表面交聯(lián)修飾明膠層，制備得到一種載藥量高、具有優(yōu)異腫瘤滲透性且在胞內(nèi)可實(shí)現(xiàn)藥物遞級釋放的復(fù)合物。具體地，本發(fā)明人采用與小分子藥物具有強(qiáng)相互作用的納米粒子作為核心藥物載體，通過在其表面交聯(lián)雜化易與體內(nèi)廣泛存在的膠原酶反應(yīng)的明膠作為包覆層，制備得到一種在體內(nèi)可遞級釋放納米藥物載體的復(fù)合物。通過在所述復(fù)合物內(nèi)裝載抗腫瘤藥物、造影劑或其它藥物等，可實(shí)現(xiàn)對對應(yīng)疾病的高效治療。在此基礎(chǔ)上，發(fā)明人完成了本發(fā)明。

復(fù)合物

本發(fā)明人通過對現(xiàn)有的藥物載體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：尺度為100nm左右的納米藥物雖然可增加長循環(huán)時間、提高藥物在腫瘤周邊的聚集，然而腫瘤內(nèi)部較高滲透壓限制了它們的腫瘤深度滲透性；而尺寸小于10nm的粒子雖然有較高的組織滲透性卻很容易被腎臟排出體外。具體而言，當(dāng)前臨床使用的脂質(zhì)體裝載的抗癌藥物，雖然通過增加藥物的長循環(huán)周期提高了藥物在腫瘤周邊的聚集，在一定程度上減低了毒副作用，然而其較大的尺寸(100nm)導(dǎo)致其腫瘤滲透性較差，這在某種程度上大大降低了其藥物療效。

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種復(fù)合物，所述復(fù)合物包含：

納米粒子；和

可生物降解的明膠，所述明膠交聯(lián)于所述納米粒子表面；

且所述復(fù)合物的粒徑為20nm-500μm。

在另一優(yōu)選例中，所述復(fù)合物的粒徑為30nm-300μm，較佳地50nm-100μm，更佳地80nm-50μm，最佳地100nm-10μm。

在本發(fā)明中，所述納米粒子的粒徑為5-80nm；和/或

所述明膠的純度≥85％。

在另一優(yōu)選例中，所述納米粒子的粒徑為10-50nm，較佳地為15-45nm，更佳地為20-40nm。

在另一優(yōu)選例中，所述明膠的純度≥90％，較佳地≥95％，更佳地≥99％，優(yōu)選為約100％。

在另一優(yōu)選例中，所述明膠的分子量為0.1萬－500萬，較佳地為0.5萬－100萬， 更佳地為1萬－20萬。

在另一優(yōu)選例中，按所述復(fù)合物的總重量計，所述納米粒子的含量為1-30wt％，較佳地2-25wt％，更佳地3-20wt％。

在本發(fā)明中，在所述復(fù)合物中，所述明膠對所述納米粒子的包覆率≥95％。

在另一優(yōu)選例中，在所述復(fù)合物中，所述明膠對所述納米粒子的包覆率≥98％，較佳地≥99％，優(yōu)選100％。

在本發(fā)明中，所述納米粒子的比表面積為10m²/g－1500m²/g；和/或

所述納米粒子具有介孔結(jié)構(gòu)；和/或

所述納米粒子的介孔孔徑為1nm—50nm；和/或

所述納米粒子包括(但并不限于)：鋰藻土、磷酸鈣微球/納米棒、碳納米球、氧化鐵、二氧化硅、陶瓷、碳納米球/納米管、氧化鈦、氧化鋅、氧化鎂、氧化鋯、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述納米粒子的比表面積為50m²/g－1200m²/g，較佳地100m²/g－1000m²/g。

在另一優(yōu)選例中，所述納米粒子的介孔孔徑為2nm—30nm，較佳地3nm－20nm。

在本發(fā)明中，本發(fā)明人以能攜載藥物的小尺度納米粒子(粒徑為5～80nm)作為藥物載體亞單元，通過其與可降解功能聚合物的自組裝及原位交聯(lián)技術(shù)制備得到具有遞級釋放功能的納米雜化微球(即本發(fā)明所述復(fù)合物)。該微球可在腫瘤微環(huán)境信號(如高濃度膠原酶mmp2、較低ph值或還原性微環(huán)境)的刺激下可控地降解釋放出內(nèi)部包覆的小尺度納米載體亞單元，該納米載體亞單元的特定粒徑可顯著增強(qiáng)腫瘤組織對其的滲透性及腫瘤細(xì)胞對藥物的攝取，在腫瘤內(nèi)微環(huán)境或外部加熱信號的刺激下，該納米載體亞單元所負(fù)載的藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)可維持長效釋放，進(jìn)而增強(qiáng)疾病治療效果。

在本發(fā)明中，所述納米粒子所具有的較大的比表面積使得其與小分子藥物具有強(qiáng)的分子間相互作用，可顯著提高其載藥量，進(jìn)而延長藥物穩(wěn)定性；所述納米粒子所具有的特定大小的粒徑可使得所得藥物高滲透性地滲透進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，同時還不易被腎臟排出體外，從而提高其利用率。

在本發(fā)明中，所述復(fù)合物中，所述納米粒子表面的明膠層可在一種或多種生物信號(酶、ph、氧化還原等信號)或外部信號(光、熱、電、磁等信號) 的刺激下降解并釋放出攜載藥物的小尺度納米粒子亞單元，以進(jìn)行后續(xù)的滲透進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。

在本發(fā)明中，所述進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的納米粒子在腫瘤細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境信號(如ph、較強(qiáng)還原生物信號)或外部光、熱、磁、電等信號的刺激下可實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)、長效釋放藥物，提高藥效，從而有效治愈疾病。

此外，所述雜化微球還可被熒光試劑標(biāo)記，或在其內(nèi)部包裹成像/顯影劑，如金顆粒、磁顆粒等，用于體內(nèi)生物成像，從而作為一種更進(jìn)一步微觀評價療效的新技術(shù)以用于檢測癌前病變分子異常、細(xì)胞生長動力學(xué)、腫瘤細(xì)胞標(biāo)記物、基因改變等。這種成像與藥物治療等技術(shù)的結(jié)合，可以有效實(shí)現(xiàn)疾病治療與動態(tài)評估的一體化。

制備方法

本發(fā)明還提供了一種所述復(fù)合物的制備方法，包括如下步驟：

1)提供第一溶液、第一混合液、界面形成劑和交聯(lián)劑，其中，

所述第一溶液包含第一溶劑和溶于所述第一溶劑中的明膠；

所述第一混合液包含第二溶劑和納米粒子；

2)混合所述第一溶液和所述第一混合液，反應(yīng)得到第一反應(yīng)液；

3)將所述界面形成劑加入所述第一反應(yīng)液，反應(yīng)得到第二反應(yīng)液；和

4)將所述交聯(lián)劑加入所述第二反應(yīng)液，反應(yīng)得到所述復(fù)合物。

在另一優(yōu)選例中，所述納米粒子和所述明膠如本發(fā)明所述。

在另一優(yōu)選例中，所述第一溶劑和所述第二溶劑可相同或不同，分別獨(dú)立地選自包括(但并不限于)下組的物質(zhì)：水、甲醇、乙醇、丙酮、四氫呋喃、二甲基亞砜、稀鹽酸、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，在步驟4)之后，還任選地包括如下步驟：

5)去除前述步驟所得產(chǎn)物中的界面形成劑，得到第三反應(yīng)液；

6)任選地離心處理前述步驟所得第三反應(yīng)液，去除上清液，制得所述復(fù)合物。

在另一優(yōu)選例中，在步驟5)中，所述去除采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀或透析法進(jìn)行。

在另一優(yōu)選例中，在步驟6)中，所述離心處理的離心速率為5000-20000rpm，較佳地8000-15000rpm。

在另一優(yōu)選例中，在步驟6)中，所述離心處理的處理時間為10-120分鐘，較 佳地30-80分鐘。

在另一優(yōu)選例中，在步驟6)之后還任選地包括步驟：采用選自下組的物質(zhì)去除所得產(chǎn)物中的醛基：甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、胱氨酸、酪氨酸、或其組合。

在本發(fā)明中，在步驟2)中，所述第一反應(yīng)液中，所述納米粒子和所述明膠的混合重量比為1-50：10-100。

在另一優(yōu)選例中，在步驟2)中，所述第一反應(yīng)液中，所述納米粒子和所述明膠的混合重量比為1-30：20-50，較佳地2-20：20-40。

在另一優(yōu)選例中，在步驟2)中，所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度為40-80℃，較佳地50-70℃。

在另一優(yōu)選例中，在步驟2)中，所述反應(yīng)的反應(yīng)時間為1-30分鐘，較佳地5-15分鐘。

在本發(fā)明中，所述界面形成劑包括(但并不限于)：丙酮、乙醇、二甲亞砜、二氯甲烷、甲醇、乙醚、或其組合；和/或

所述交聯(lián)劑包括(但并不限于)：戊二醛、丁二醛、聚乙二醇二醛、海藻酸多醛、透明質(zhì)酸多醛、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，在步驟3)中，所述界面形成劑與所述第一反應(yīng)液的體積比為1-10：1-3，較佳地1-5：1-2。

在另一優(yōu)選例中，在步驟3)中，所述反應(yīng)在室溫下進(jìn)行，優(yōu)選在10-40℃下進(jìn)行。

另一優(yōu)選例中，在步驟3)中，所述反應(yīng)的反應(yīng)時間為1-60分鐘，較佳地5-40分鐘，更佳地10-30分鐘。

在另一優(yōu)選例中，按重量計，在步驟4)中，所述交聯(lián)劑與所述第二反應(yīng)液中所述明膠的用量比為0.1－50：100－400，較佳地1－40：100－200。

在另一優(yōu)選例中，在步驟4)中，所述反應(yīng)在室溫下進(jìn)行，優(yōu)選在10-40℃下進(jìn)行。

在另一優(yōu)選例中，在步驟4)中，所述反應(yīng)的反應(yīng)時間為1-24小時，較佳地3-20小時，更佳地5-15小時。

在本發(fā)明中，所述納米粒子和所述明膠的交聯(lián)反應(yīng)在水和界面形成劑(如丙酮)的兩相界面上進(jìn)行。首先，天然大分子明膠在水分子中水平分散有利于提高其與納米粒子表面的相互作用，使得納米粒子可以均勻分散在明膠的水溶液中；非溶劑丙酮的加入會降低明膠在水中的溶解度，誘導(dǎo)明膠由分子水平分散逐漸聚集并形成分散相；水和丙酮的比率可用于調(diào)整分散相尺寸，在明膠分散相形成的過程中納米粒子會被明膠原位包裹，并通過交聯(lián)劑的交聯(lián)處理形成具有良好膠體穩(wěn)定性的雜化微球。

應(yīng)用

本發(fā)明還提供了一種組合物，所述組合物包含：

所述的復(fù)合物；和

裝載于所述復(fù)合物納米粒子中的選自下組的一種或多種物質(zhì)：抗腫瘤藥物、造影劑、消炎藥物。

在另一優(yōu)選例中，所述抗腫瘤藥物包括(但并不限于)：阿霉素(dox)、甲氨蝶呤、紫杉醇、柔紅霉素、伊立替康、托泊替康、長春堿、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述消炎藥物包括(但并不限于)：地塞米松、氫化可的松、阿司匹林、阿莫西林、青霉素、耐酶青霉素、氨芐青霉素、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢氫氨芐、頭孢克羅、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述造影劑包括(但并不限于)：異硫氰酸熒光素、整合顯影劑(如金顆粒、磁顆粒等)、碘制劑、碘苯六醇、或其組合。

本發(fā)明還提供了一種所述的復(fù)合物或所述的組合物的用途，用于1)制備治療和/或診斷癌癥的藥物；和/或2)用于制備治療炎癥的藥物。

本發(fā)明還提供了一種藥物，所述藥物包含：

所述的復(fù)合物；

裝載于所述復(fù)合物納米粒子中的選自下組的一種或多種物質(zhì)：抗腫瘤藥物、造影劑、消炎藥物；和

藥學(xué)上可接受的載體。

在另一優(yōu)選例中，所述藥物的給藥方式優(yōu)選為靜脈注射。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下主要優(yōu)點(diǎn)：

(1)所述復(fù)合物具有載藥量高、腫瘤滲透性優(yōu)異、可遞級釋放藥物的特點(diǎn)；

(2)所述復(fù)合物的制備方法簡單、條件可控、成本低、易于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化；

(3)所述復(fù)合物具有良好的生物相容性和智能響應(yīng)性；

(4)在所述復(fù)合物中，明膠的存在可有效提高微球(即本發(fā)明復(fù)合物)的膠體穩(wěn)定性，明膠分子中的胺基和羧基官能團(tuán)可用于雜化微球表面修飾，如可修飾上rgd多肽、葉酸等腫瘤靶向基團(tuán)，或熒光劑(如異硫氰酸熒光素、藻紅b、羅丹明)或成像/顯影劑(如碘他拉葡胺、碘克沙酸、碘海醇、碘異肽醇、碘普羅胺、碘維索、gd-dtpa及其線型、環(huán)型多胺多羧類螯合物)等。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。

除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。

實(shí)施例1提純明膠

稱取2g市售的未提純的明膠(呈暗黃色，購自sigma，型號g-9382)，向其中加入50ml超純水，在60℃水浴的條件下攪拌2小時，后加入50ml沉淀劑丙酮，在室溫下攪拌1h，后去除上清液，再次向其中加入50ml超純水，在60℃水浴下加熱溶解。待完全溶解后，分裝凍干即得純化的明膠(gelatin)。無特殊說明，構(gòu)建微球用的明膠均為純化的明膠(gelatin)。

經(jīng)測試，該純化的明膠的純度高達(dá)90％。

實(shí)施例2制備復(fù)合物gl

①稱取50mg純化的明膠，溶于5ml超純水中，在60℃條件下，攪拌溶解；

②稱取20mg粒徑為10－30nm的鋰藻土(lp)(其比表面積為100m²/g-900m²/g)，分散于2ml超純水中，超聲30分鐘以便均勻分散；

③將步驟①所制得的gelatin溶液迅速加入0.5-1ml步驟②所制得的lp溶液，60℃下反應(yīng)10分鐘；

④向步驟③所制得的混合溶液中滴加20ml界面形成劑丙酮，滴加完畢后室溫下反應(yīng)20分鐘；

⑤向步驟④所制得的溶液中逐滴加入50μl不同濃度的戊二醛溶液(1-25wt％)，室溫下反應(yīng)12小時；

⑥利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將步驟⑤的溶液中的丙酮蒸發(fā)；

⑦將步驟⑥所得的乳白色液體離心處理，其中離心速率為12000rpm，時間為60分鐘；

⑧除去步驟⑥所得的上清液，將沉淀物用5ml超純水再次溶解，放入冰箱4℃存儲待用。

說明：如果是用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所用的材料，可通過在gl中加入甘氨酸溶液，室溫下攪拌4h除去過量的醛基后離心純化。

結(jié)果

對所得復(fù)合物gl進(jìn)行粒徑、包覆率等測試，結(jié)果表明實(shí)施例2所得復(fù)合物gl的粒徑為(105±10)nm，其中明膠層對鋰藻土納米粒子的包覆率約為90％。

實(shí)施例3制備組合物gld

向?qū)嵤├?所制備的5mlgl微球分散液中加入1ml阿霉素水溶液(1mg/ml)，在避光的條件下攪拌24小時，在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心處理40分鐘，除去上清液(用來測藥物包裹率)，將所得到的沉淀物分散于5ml超純水中，制得微球藥物組合體gld。

說明：明膠/鋰藻土微球可用于對包括抗癌藥、消炎藥在內(nèi)的許多藥物裝載，所制備的藥物組合體可用于對癌癥、皮膚病及其他相關(guān)疾病的治療。

實(shí)施例4組合物gld對明膠酶的降解響應(yīng)性研究

將250ng的明膠酶(mmp2)溶于1mlhepes溶液，然后在其中加入1mlgld納米粒子，在37℃培養(yǎng)24小時，用透射電鏡分別觀察有無mmp2處理下的gld納米粒子的微觀形貌的變化。

圖1為gld納米粒子分別在有無明膠酶(mmp2)下的微觀形貌變化圖。

從圖1中可以看出，未加mmp2酶的gld微球呈現(xiàn)球形，而加了mmp2酶的gld微球，則可以看到很多的碎片。這主要是因?yàn)閙mp2酶可以使gld微球表面的明膠在酶的作用下降解，釋放出更小的類纖維狀的納米粒子，其尺寸在40-50nm之間，由此就達(dá)到了逐級進(jìn)行釋放的目的。

實(shí)施例5組合物gld的藥物釋放研究

采用激發(fā)發(fā)射光譜研究gld的藥物釋放性能

將含有30μg阿霉素的組合物gld分散在2ml磷酸鹽緩沖溶液(pbs)中，并轉(zhuǎn)移到透析袋(截留分子量:14kda)中，然后將透析袋浸入8mlpbs溶液(ph值分別為7.4、6.5或5.0，溫度分別為25或37℃)。一定的時間間隔后從釋放體系中取出100μl溶液進(jìn)行熒光分法分析(λex＝480nm,λem＝580nm)，更新100μl新鮮pbs溶液。不同時間的累積釋放(cr)的阿霉素可用如下公式計算：

cr＝100×ft/ftot

其中ft和ftot分別表示t時刻溶液熒光度和用于釋放的雜化微球中所含有總阿霉素的熒光度。

圖2為組合物gld在不同ph值和溫度下，在磷酸鹽緩沖溶液中的藥物釋放動力學(xué)行為。

從圖2a可以看出，ph從7.4降低到6.5、5.0，dox的累積釋放量得到明顯的增加。比如，在120小時，其在ph為7.4時的釋放量為(30±2)％，上升到在ph為6.5時的(41±3)％，ph為5.0時的(55±3)％。

從圖2b可以看出，隨著溫度的增加(25℃、37℃、42℃),dox的累積釋放量也得到很好地提高。比如，在120小時，dox釋放量從25℃時的(20±2)％， 上升到37℃時的(30±2)％，再到42℃時的(36±2)％。

這表明gld納米微球無論是在酸性環(huán)境下還是在溫度升高的情況下都可以實(shí)現(xiàn)逐步釋放dox，從而達(dá)到增強(qiáng)抗腫瘤效果，另一方面也充分地說明了gld納米微球的ph和熱敏感性。

實(shí)施例6腫瘤球深度滲透研究

通過激光共聚焦來觀察腫瘤球的形狀大小及gld的腫瘤深度滲透性情況：在底部涂有瓊脂糖的96孔板中培育a549腫瘤球模型：將96孔板涂覆一薄層的2％瓊脂糖溶液，高溫高壓滅菌后加入含有50μl密度為2000/孔的a549細(xì)胞株的dmem培養(yǎng)液，培育一周待腫瘤球增長呈直徑約為300μm后，將dox、ld、gld分別加入，再孵育6天后在激光共聚焦下觀察形狀大小、阿霉素藥物的腫瘤球深度滲透能力。

圖3為阿霉素dox、攜載阿霉素的鋰藻土微球ld、攜帶阿霉素的明膠/鋰藻土微球藥物組合物gld的腫瘤深度滲透性能結(jié)果。

圖3中橫坐標(biāo)為腫瘤微球深度，從圖3可以看出，攜帶阿霉素的明膠/鋰藻土微球藥物組合物gld將dox藥物遞送到腫瘤微球的中部(微球直徑為330μm，因此160μm處照片反映了藥物在微球的中部的藥物分布)，而對照組阿霉素dox、攜載阿霉素的鋰藻土微球ld在微球中部的熒光強(qiáng)度明顯降低，說明它們不利于藥物在腫瘤深處的滲透。

實(shí)施例7藥物的細(xì)胞攝取和胞內(nèi)積蓄研究

通過激光共聚焦顯微鏡觀察樣品在a549細(xì)胞內(nèi)的藥物分布情況：首先將a549細(xì)胞接種到塑料培養(yǎng)皿上，孵育一天后將dox、gld分別加入其中，孵育2小時和48小時。待到指定時間后，去除培基，用pbs清洗3次，用2.5％的戊二醛固定15分鐘，去除戊二醛溶液，再用pbs清洗3次，后加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)染色15分鐘，之后用pbs清洗3次，再加入1ml的pbs，最后在激光共聚焦下進(jìn)行3維觀察。

圖4為阿霉素dox、攜帶阿霉素的明膠/鋰藻土微球藥物組合物gld的細(xì)胞攝取和藥物胞內(nèi)分布結(jié)果。

從圖4可以看出，第一列為dox和gld微球在細(xì)胞內(nèi)2小時和48小時的明場效果，第二列為dox的紅色熒光效果，第三列為dapi將細(xì)胞核染為藍(lán)色，最后一列是將前兩列結(jié)合在一起。從這些圖中可知，dox和gld已經(jīng)攝取進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)部，其中g(shù)ld更多的是進(jìn)入細(xì)胞核中，而dox進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)部的則比較少；gld比dox有更高的dox累積量，這主要是因?yàn)間ld可以在細(xì)胞內(nèi)部釋放出更小的納米粒子，這促進(jìn)了gld在酸性條件下可以釋放出更多的dox來殺死癌細(xì)胞，這從48小時時的細(xì)胞數(shù)明顯比2小時少許多就可以看出來。

實(shí)施例8抗腫瘤活性研究

利用人體肺癌細(xì)胞a549細(xì)胞為腫瘤模型研究藥物的抗腫瘤行為。細(xì)胞培養(yǎng)具體步驟：將細(xì)胞培養(yǎng)于含10％小牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素的dmem培養(yǎng)液中，在37℃、5％co2氛圍下的培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。將a549細(xì)胞接種到96孔板中，孵育一天后將gl、dox、ld、gld和空白對照組的培基溶液按相應(yīng)濃度(dox濃度)加入其中，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，使用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(mtt)測定法檢測細(xì)胞活性和細(xì)胞增殖：向30μl的四甲基偶氮唑鹽試劑，繼續(xù)孵育4小時后，去除培基，加入200μl的二甲基亞砜(dmso),37℃震蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解，使用連續(xù)光譜酶標(biāo)儀在490nm處測定溶液的光吸收值。

圖5為阿霉素dox、明膠/鋰藻土微球gl、ld、攜帶阿霉素的明膠/鋰藻土微球藥物組合物gld的抗腫瘤活性。

從圖5中可以看出，明膠/鋰藻土微球gl沒有明顯的細(xì)胞毒性，dox、ld和gld均表現(xiàn)出癌細(xì)胞毒性，而且與對照組相比，gld表現(xiàn)出更好的抗癌活性。例如，gld的ic50(細(xì)胞存活率為50％時的樣品濃度)為0.25μm,而dox和ld則分別為1.57μm、0.56μm，這可能是因?yàn)榫哂羞f級藥物釋放功能的gld納米微球促進(jìn)了dox的腫瘤滲透性和癌細(xì)胞對藥物的攝取率，進(jìn)而提高對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。