本發(fā)明屬于藥品領(lǐng)域，具體涉及白鮮皮提取物的新用途。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)缺血性心肌病的發(fā)病率在不斷上升，該病發(fā)病原因主要是多種原因引起冠狀動(dòng)脈血流量減低，進(jìn)而心肌血液供應(yīng)受阻，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足和代謝產(chǎn)物清除減少，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷甚至死亡。隨著心臟疾病的介入手術(shù)如包括冠狀動(dòng)脈造影術(shù)、ptca+支架術(shù)、二尖瓣球囊擴(kuò)張術(shù)、射頻消融術(shù)、起搏器植入術(shù)、先天性心臟病介入治療、冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)溶栓術(shù)等方法的建立和推廣應(yīng)用，使心臟組織器官缺血后重新得到血液再灌注。多數(shù)情況下，缺血后再灌注可以恢復(fù)受損心肌的正常結(jié)構(gòu)并改善心臟功能，但也有試驗(yàn)表明，一些研究者在通過(guò)以上治療手段使心肌獲得血液的再灌注以后，受損心肌的功能并未得到恢復(fù)，反而損傷程度加重，甚至出現(xiàn)梗死面積擴(kuò)大等不可逆損傷，這種現(xiàn)象即心肌的缺血再灌注損傷(myocardialischemia-reprefusioninjury，miri)。

隨著心肌缺血的治療技術(shù)手段的提高和應(yīng)用的廣泛，心肌病的治療已進(jìn)入再灌注時(shí)期，探索防治miri的藥物已成為重要研究方向。

隨著對(duì)miri的發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，相關(guān)治療藥物如曲美他嗪、利多卡因、雷帕霉素等已經(jīng)應(yīng)用于臨床。但中藥的研究和應(yīng)用還僅局限于丹參及其提取物丹參酮、保元湯等，臨床治療對(duì)療效高、副作用小的中藥的需求巨大。

中藥白鮮皮為蕓香科白鮮屬植物白鮮的干燥根皮，是中國(guó)常用中藥，又名北鮮皮、野花椒根皮、臭根皮等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，中藥白鮮皮具有清熱燥濕、祛風(fēng)止癢以及解毒等功效，用以治療黃水淋漓、濕疹、風(fēng)濕熱等疾病。尚無(wú)相關(guān)報(bào)道顯示白鮮皮水提取物經(jīng)過(guò)乙醇提取沉淀后具有治療心肌的缺血再灌注損傷的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是提供白鮮皮提取物的新用途。

具體內(nèi)容是白鮮皮提取物在制備治療心肌的缺血再灌注損傷藥物中的用途，其中，白鮮皮提取物是由下述方法制備而得：

a、白鮮皮加水熱回流提取3次，每次1小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮至1∶1(相對(duì)密度為1.05～1.10，70℃)，放出，加入乙醇調(diào)節(jié)乙醇含量為50％，減壓濾過(guò)，濾液回收至無(wú)醇味，加水調(diào)節(jié)為至適宜濃度，得備用液。

b、備用液通過(guò)預(yù)處理完畢的d101大孔樹脂，加水洗脫至流出液色淺，合并水洗液，減壓濃縮，噴霧干燥，得到粉末狀提取物。

發(fā)明人通過(guò)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型和大鼠心肌缺血再灌注模型，對(duì)白鮮皮提取物的藥效和藥理作用進(jìn)行了系統(tǒng)考察，表明白鮮皮提取物對(duì)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧有明顯的保護(hù)作用，并且能減少心肌梗死面積，提高超氧化物歧化酶(sod)活性，降低丙二醛(mda)的含量，降低肌酸激酶(ck)的活性，改善心肌缺血再灌注對(duì)心肌細(xì)胞的病理?yè)p害，從而改善對(duì)大鼠心肌缺血癥狀。

本發(fā)明所述藥物可制成的劑型為、膠囊劑、顆粒劑、片劑、滴丸劑、口服液、丸劑、軟膠囊等劑型。

所述膠囊劑所使用的輔料可以為，淀粉、氧化鎂、碳酸鎂、磷酸氫鈣、磷酸二氫鈣、淀粉漿、糖漿、水、乙醇、微粉硅膠、羧甲基淀粉鈉等。

所述顆粒劑使用的輔料可以為淀粉、乳糖、糊精、糖粉、硫酸鈣、蔗糖、廿褳酵、微晶纖維素、葡萄糖。

所述片劑使用的輔料可以為，淀粉、糊精、糖粉、碳酸鈣、磷酸鈣、乳糖、甘露醇、微晶纖維紊、羧甲基淀粉鈉、滑石粉、硬脂酸鎂等。

所述滴丸劑所使用的輔料可以為，聚乙二酵類、硬脂酸、硬脂酸鈉、泊洛沙姆、卟硬脂酸甘油脂等。

所述口服液劑使用的輔料可以為蜂蜜、檸檬酸、聚山梨酯類、苯甲酸鈉、苯甲酸及其鹽、山梨酸等。

所述丸劑使用的輔料可以為水、蜂蜜、糖漿、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素等。

所述軟膠囊劑使用的輔料可以為植物油、peg400、蜂蠟、甘油、明膠、水等。

以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)白鮮皮提取物對(duì)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧的藥效學(xué)作用和對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的藥理作用兩個(gè)方面，對(duì)白鮮皮提取物治療心肌缺血再灌注損傷的臨床前研究來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的有益效果。

1白鮮皮提取物的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.1試驗(yàn)材料與儀器

白鮮皮(購(gòu)于安國(guó)藥材市場(chǎng)，本所常琪教授鑒定)、h9c2心肌細(xì)胞株(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)理論研究所細(xì)胞資源中心)、dmem高糖培養(yǎng)基(美國(guó)gibco公司)、胎牛血清(美國(guó)gibco公司)、bsa(美國(guó)amersco公司)、注射用音霉素鈉(哈藥集團(tuán)制藥總廠)、注射用硫酸鏈霉素(華北制藥集團(tuán))、co2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)thermo公司)、超靜工作臺(tái)(美國(guó)美國(guó)airclean公司)、倒置顯微鏡cks31(日本奧林巴斯公司)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀model550型(美國(guó)bio-red公司)。大鼠ctn-ielisa檢測(cè)試劑盒(美國(guó)rd公司)、乳酸脫氫酶(ldh)試劑盒、超氧化物歧化酶(sod)試劑盒、丙二醛(mda)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。caspase-3分光光度法檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。jc-1、hoechst33342、mtt、胰酶(美國(guó)sigma公司)。線粒體細(xì)胞色素c檢測(cè)試劑盒(美國(guó)uscn公司)、線粒體蛋白提取試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)、annexinv/pi抗凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)bd公司)。bcl-2、bax等抗體(美國(guó)cst公司)、辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)山羊抗鼠抗體(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1.1復(fù)蘇

在超凈臺(tái)中預(yù)先準(zhǔn)備好含12％胎牛血清(fbs)的dmem高糖培養(yǎng)基10ml至15ml離心管中。盛放細(xì)胞的凍存管自液氮罐中拿出后，迅速放到37℃的溫水中不停的攪拌，直至冰塊全部融化后，快速的把細(xì)胞轉(zhuǎn)移至預(yù)先準(zhǔn)備好的離心管中，使細(xì)胞與培養(yǎng)基充分混合，1000轉(zhuǎn)/min離心5min。吸棄上清液，加入4ml12％胎牛血清的dmem高糖培養(yǎng)基，輕輕混勻后，全部移至培養(yǎng)瓶，放入co2含量為5％，溫度為37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。8h后，觀察細(xì)胞狀態(tài)，換液一次。以后可以根據(jù)細(xì)胞的狀態(tài)，換成10％胎牛血清的培養(yǎng)基。

1.2.1.2傳代

心肌細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80％～90％時(shí)，即可從培養(yǎng)箱中拿出進(jìn)行傳代。首先，吸棄原有培養(yǎng)基，用4mlpbs進(jìn)行沖洗一次。用吸管完全吸盡pbs后，加入2ml0.125％的胰酶，迅速混勻后，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化1min。顯微鏡下觀察細(xì)胞形狀，當(dāng)細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞形態(tài)皺縮變圓，顏色變亮?xí)r，吸棄胰酶，迅速加入4ml含有10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基，終止胰酶消化。用吸管輕輕反復(fù)吹打細(xì)胞，使之完全從瓶壁脫落。吹打均勻后，按照1∶2的比例分瓶移入新的培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2缺氧復(fù)氧模型的建立

h9c2心肌細(xì)胞鋪板后，用完全培基在培養(yǎng)箱中進(jìn)行正常培養(yǎng)24h。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)期時(shí)，基本長(zhǎng)滿孔板，此時(shí)進(jìn)行缺氧處理。缺氧處理方法為：吸棄完全培養(yǎng)基，加入缺氧液后，放入?yún)捬跏痔缀銣嘏囵B(yǎng)箱中。

缺氧處理一定時(shí)間后，進(jìn)行復(fù)氧處理。復(fù)氧處理方法為：從厭氧手套培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，吸棄缺氧液，加入用完全培基稀釋至一定濃度的藥物，放入正常培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)一定時(shí)間，復(fù)氧結(jié)束后，進(jìn)行下游的實(shí)驗(yàn)安排。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組

進(jìn)入實(shí)驗(yàn)的h9c2心肌細(xì)胞被隨機(jī)分為空白對(duì)照組(con組)、缺氧復(fù)氧組(h/r)、白鮮皮總水提物不同劑量處理組(h/r+cortexdictamniaqueousextract)，各組具體處理方式如下：

空白對(duì)照組：整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程均采用完全培養(yǎng)基，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。

模型組(h/r組)：按照上述缺氧復(fù)氧條件進(jìn)行處理，缺氧6h后復(fù)氧，在復(fù)氧時(shí)，用不含藥物的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)12h。

h/r+藥物處理組：按照上述缺氧復(fù)氧條件進(jìn)行處理，缺氧6h后復(fù)氧，在復(fù)氧時(shí)，加入用完全培基稀釋白鮮皮提取物至一定濃度，放入正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。

1.2.4缺氧復(fù)氧損傷模型的確立

h9c2心肌細(xì)胞以1×10⁴個(gè)/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24h至細(xì)胞融合率為80％～90％后，用缺氧液置換正常培養(yǎng)基后，放入?yún)捬跏痔缀銣嘏囵B(yǎng)箱中，進(jìn)行缺氧6h，培養(yǎng)箱內(nèi)氣體為純氮?dú)夂突旌蠚?氫氣5％+氮?dú)?5％)。從厭氧箱中拿出96孔板，吸盡缺氧液，加入完全培養(yǎng)基后放入正常培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，即為復(fù)氧。復(fù)氧時(shí)間分別為8h、12h、16h、24h。復(fù)氧結(jié)束后，通過(guò)mtt方法測(cè)定細(xì)胞的活力，從而確定能保證缺氧復(fù)氧模型成功的最佳復(fù)氧時(shí)間。

1.2.5白鮮皮提取物最佳作用濃度的確定(mtt方法)

培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞消化后，用完全培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù)，等量(1×104個(gè)/孔)接種到96孔板中，每孔培養(yǎng)液體積為100μl，置37℃、5％co2孵箱培養(yǎng)48h達(dá)到細(xì)胞80～90％融合。棄原培養(yǎng)基，pbs漂洗兩次。培養(yǎng)板各孔中培養(yǎng)的細(xì)胞被隨機(jī)分為con組、h/r組、h/r+cortexdictamniaqueousextract(0.4μg/ml、1.56μg/ml、6.25μg/ml、25μg/ml、100μg/ml)。以無(wú)細(xì)胞孔看作為空白孔。按照試驗(yàn)分組方法分別處理后，在復(fù)氧結(jié)束時(shí)，每孔加入5mg/ml的mtt20μl至培養(yǎng)基中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，然后吸棄培養(yǎng)孔上清液，再加入二甲基亞礬(dmso)150μl/孔，放置搖床輕微震蕩20min后，用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm波長(zhǎng)下的od值。吸光度的下降認(rèn)為是細(xì)胞活力的下降，正常對(duì)照組的細(xì)胞活力看作100％。每組6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6細(xì)胞上清液中l(wèi)dh測(cè)定

待各實(shí)驗(yàn)孔細(xì)胞復(fù)氧完成時(shí)，用移液器收集細(xì)胞上清液，按照l(shuí)dh試劑盒中測(cè)定方法進(jìn)行操作，如下表tab1所示。

tab1preparationprocedureofsolutionforcoenzymeiandsubstratebuffer

計(jì)算公式：

1.2.7培養(yǎng)細(xì)胞上清液中肌鈣蛋白i測(cè)定

1.2.7.1實(shí)驗(yàn)步驟

(1)從鋁箔袋中取出所需板條，室溫平衡20min。

(2)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μl。

(3)樣本孔先加待測(cè)樣本10μl，再加樣本稀釋液40μl，空白孔不加。

(4)除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶(hrp)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μl，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃恒溫箱溫育60min。

(5)棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次。

(6)每孔加入底物a、b各50μl，37℃避光孵育15min。

(7)每孔加入終止液50μl，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的od值。

1.2.7.2計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的od值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按照曲線方程來(lái)計(jì)算各樣本中ctn-i濃度值。

1.2.8細(xì)胞上清液中sod活性測(cè)定

1.2.8.1試劑組成與配制

底物應(yīng)用液的配制

試劑一：緩沖液，4℃保存。

試劑二：底物貯備液，4℃保存。

底物貯備液和緩沖液按1∶200的比例混勻，配成底物應(yīng)用液，現(xiàn)用現(xiàn)配，用多少配多少，用不完的4℃可保存7天。

酶工作液的配制

試劑三：酶貯備液，4℃保存。

試劑四：酶稀釋液，4℃保存。

酶貯備液和酶稀釋液按1∶10的比例混勻，配成酶工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配，用多少配多少，用不完的4℃可保存3天。

1.3.3.2操作表

酶工作液、底物應(yīng)用液和酶稀釋液的配置過(guò)程如tab2所示。

tab2preparationprocedureofsolutionforenzymeandsubstrate

注：對(duì)照、對(duì)照空白、測(cè)定空白一批實(shí)驗(yàn)只需要各做1-2個(gè)孔。

1.2.8.2計(jì)算方法

1.2.9細(xì)胞上清液中mda含量測(cè)定

1.2.9.1試劑配制

試劑一：20ml液體1瓶，4℃保存。

試劑二：12ml液體1瓶，用時(shí)加340ml雙蒸水混勻，4℃冷藏(注意：不要碰到皮膚上)。

試劑三：粉劑1支，用時(shí)將粉劑加入到90℃～100℃的熱雙蒸水60ml中，在溶解過(guò)程中可適當(dāng)加熱，充分溶解后用雙蒸水補(bǔ)足至60ml再加冰醋酸60ml，混勻，配好的試劑避光室溫保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：10nmol/ml四乙氧基丙烷5ml，4℃冷藏。

1.2.9.2操作

復(fù)氧結(jié)束后，吸取細(xì)胞上清液，根據(jù)mda測(cè)定試劑盒說(shuō)明書，進(jìn)行mda含量的測(cè)定，詳見tab3。

tab2operatingprocedureofthemeasurementofmdacontent

旋渦混勻器混勻，試管口用保鮮薄膜扎緊，用針頭刺一個(gè)小孔，95℃水浴(或用水浴鍋開蓋煮沸)60min，取出后流水冷卻。然后在532nm處，用酶標(biāo)儀測(cè)定各管的吸光度值。

1.2.9.3計(jì)算方法

1.2.10線粒體膜電位測(cè)定

(1)各組細(xì)胞按照要求處理完成后，把細(xì)胞培養(yǎng)液用排槍輕輕吸棄，加適量pbs洗滌2次。

(2)每孔加入100μl2μmol/l的jc-1染料，放于培養(yǎng)箱孵育30min。

(3)用排槍輕輕吸棄含染料上清并用pbs緩慢洗滌細(xì)胞3次，再加入100μl10μg/mlhoechst33342染料放于培養(yǎng)箱孵育15min。

(4)孵育15min后，輕輕棄去含染料上清并用pbs洗滌3次。

(5)各組細(xì)胞洗滌完畢后，每孔加入100μlpbs通過(guò)高內(nèi)涵上機(jī)檢測(cè)。

(6)調(diào)節(jié)高內(nèi)涵各參數(shù)，觀察并拍照，獲取圖片。

1.2.11胞漿中細(xì)胞色素c含量的測(cè)定

(1)利用線粒體提取試劑盒，按照試劑盒操作步驟獲取細(xì)胞漿蛋白。-20℃冰箱保存待用。

(2)按照細(xì)胞色素c檢測(cè)試劑盒說(shuō)明，把標(biāo)準(zhǔn)品梯度系列稀釋，確定標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔和樣品孔。

(3)分別加入100μl的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液、空白液和樣品至定位的孔中。用封板膜封住，37℃孵育2h。

(4)吸棄孔中液體，各孔加入100μl檢測(cè)試劑a工作液，用封板膜封住，37℃孵育1h。

(5)吸棄每孔中液體，每孔加入350μl1×洗滌液，靜置1～2min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干。如此重復(fù)3次。最后一次一定要把水分除盡。

(6)加入100μl檢測(cè)試劑b工作液，貼上封板膜后，37℃孵育30min。

(7)重復(fù)操作(5)，洗滌5次。

(8)加入90μl基質(zhì)液，用封板膜封住，37℃孵育15～25min(不超過(guò)30min)。

(9)加入50μl終止液。液體此時(shí)開始變黃色。輕輕拍打板子的另一面，使其混勻。

(10)用酶標(biāo)儀在450nm下測(cè)定各孔吸光度值，記錄并作標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，來(lái)計(jì)算各樣品細(xì)胞漿中細(xì)胞色素c的含量。

1.2.12分光光度法檢測(cè)caspase-3的活性表達(dá)

(1)吸取50μl含100～200μg蛋白的細(xì)胞或組織裂解上清；如果組織不足50μl，用lysisbuffer補(bǔ)足至總體積50μl(各組均采用同樣的蛋白量進(jìn)行測(cè)定和比較)；

(2)加入50μl的2×reactionbuffer(注意：使用前每50μl2×reactionbuffer加入0.5μldtt)；

(3)加入5μlcaspase-3substrate并于37℃避光孵育4h；

(4)用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)405nm測(cè)定其od值。通過(guò)計(jì)算od誘導(dǎo)劑/od陰性對(duì)照的倍數(shù)來(lái)確定凋亡誘導(dǎo)劑組caspase-3的活化程度。

注意：以lysisbuffer和reactionbuffer作為空白對(duì)照。

1.2.13fitc-annexinv/pi雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

(1)按照實(shí)驗(yàn)方法分別處理各組后，用pbs洗滌細(xì)胞兩次，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化后，用完全培基進(jìn)行中和，收集細(xì)胞于離心管中，1000轉(zhuǎn)/min離心5min。

(2)棄去上清液后，加適量pbs重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取105個(gè)細(xì)胞于離心管中，重懸后，1000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄去上清液。

(3)加入100μl的bindingbuffer輕輕重懸細(xì)胞，再加入5μl的fitc-annexinv和5μl的pi，室溫避光孵育15min。

(4)上機(jī)前加入400μl的bindingbuffer輕輕混勻，即可上機(jī)檢測(cè)。

1.2.14westernblotting檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

h9c2心肌細(xì)胞總蛋白提?。?/p>

(1)各組細(xì)胞按照要求處理結(jié)束后，用胰蛋白酶消化液消化并收集各組細(xì)胞與離心管中。

(2)離心收集細(xì)胞，條件為1000轉(zhuǎn)/min，離心5min。

(3)加入適量(約10倍量)的含1％蛋白酶抑制劑pmsf(苯甲基磺酰氟)的哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑，與細(xì)胞充分混勻后，放置冰上裂解40min。

(4)裂解完成后，在4℃下進(jìn)行離心，離心條件為12000轉(zhuǎn)/min，20min。

(5)離心完成后，取上清液分裝，-20℃條件下保存待用。

bca法蛋白定量：

(1)bsa標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作稀釋bsa標(biāo)準(zhǔn)品。

(2)配置bca工作液：根據(jù)bsa標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品的數(shù)量，取適量的試劑a和試劑b，按照50∶1的體積混勻待用。新配制的bca工作液室溫密閉條件下可穩(wěn)定保存24h。

(3)微孔檢測(cè)樣品蛋白濃度：將稀釋好的bsa標(biāo)準(zhǔn)品和樣品(原液或者稀釋液)各25μl分別加到已經(jīng)標(biāo)記的96孔板中。每孔加入200μl的bca工作液，充分混勻，避光，37℃孵育30min。冷卻至室溫后，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)562nm處的吸光值。根據(jù)bsa標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中的蛋白濃度(范圍：20-2000μg/ml)。

(4)測(cè)完蛋白濃度后，計(jì)算含20～40μg蛋白(同批次實(shí)驗(yàn)上樣量相同)的蛋白溶液體積即為上樣量。將sds-page上樣緩沖液與蛋白樣品按1∶4混勻，在沸水浴中煮5～10min，使蛋白變性，冰浴1min冷卻，-20℃保存樣品待用。用時(shí)直接取適量上樣即可。

聚丙烯酰胺凝膠電泳：

(1)清洗玻璃板、梳子、卡槽等并晾干待用。把對(duì)齊后的玻璃板放入夾中垂直卡在架子上，卡緊后，準(zhǔn)備灌膠，防止漏膠。

(2)分離膠的配制。根據(jù)蛋白分子量大小確定分離膠濃度后，按照操作說(shuō)明選擇所需體積，將一定比例的30％acri-bis(29∶1)、分離膠緩沖液和雙蒸水在試管中混勻。加入10％aps(現(xiàn)用現(xiàn)配)混勻，再加入一定量的temed，迅速混勻后灌入凝膠模具中。再用雙蒸水把模具灌滿，把氣泡趕出。室溫靜置至少30min，待分離膠和雙蒸水之間出現(xiàn)清晰的界面后，表明凝膠已經(jīng)聚合好。用濾紙輕輕吸去分離膠上層的雙蒸水，注意不要碰到膠面。

(3)濃縮膠的配制。根據(jù)所需體積，將一定比例的30％acri-bis(29∶1)、濃縮膠緩沖液和雙蒸水在試管中混勻。加入10％aps(現(xiàn)用現(xiàn)配)混勻，再加入一定量的temed，迅速混勻后，將濃縮膠從一個(gè)角緩慢的加至分離膠上，直至加滿模具。把梳子從一端輕輕插入濃縮膠中，壓平，插齒梳時(shí)要使梳子保持水平，濃縮膠內(nèi)無(wú)氣泡。

(4)上樣。將兩塊凝膠板中間加滿電泳液，小心豎直向上拔出齒梳。用微量移液器將10μl樣品緩慢加入凝膠孔中。

(5)電泳

把凝膠卡槽放入電泳槽中并在電泳槽中加入適量的電泳液，打開電源，調(diào)節(jié)電壓在70-80v之間，恒壓電泳濃縮膠。當(dāng)樣品進(jìn)入下層分離膠時(shí)，調(diào)節(jié)電壓至110v，恒壓電泳分離膠。電泳結(jié)束后，把濃縮膠切去，留分離膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

(6)轉(zhuǎn)膜

a、備膜。電泳結(jié)束后，用剪刀裁剪nc膜和濾紙，nc膜與膠的大小相當(dāng)，但略大，濾紙的大小應(yīng)當(dāng)稍微小于nc膜，將切好的nc膜和濾紙置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15min。

b、裝膜。將nc膜、海綿墊片、濾紙預(yù)先在轉(zhuǎn)膜緩沖液中飽和15min。將轉(zhuǎn)膜用的夾子打開，按照夾子黑面-纖維墊-1張濾紙-凝膠-nc膜一1張濾紙一纖維墊一夾子白面的順序依次疊放，最后夾子卡緊，迅速將其放入轉(zhuǎn)膜槽中，注滿轉(zhuǎn)膜緩沖液，防止產(chǎn)生氣泡。

c、轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)膜槽置于冰水混合物中，根據(jù)蛋白分子量(分子量越大，所需時(shí)間越長(zhǎng))使用110v恒壓轉(zhuǎn)膜50～70min。

(7)免疫結(jié)合

a、封閉。將nc膜用tbs-t漂洗3次，每次15min，漂洗后將nc膜放入加有5％脫脂奶粉的平皿中，室溫下在搖床上緩慢搖動(dòng)2h。

b、一抗孵育。將封閉后的nc膜放入tbs-t中，搖床漂洗3次，每次15min。洗完后盡可能的瀝干膜，放入含有一抗的雜交袋中，用封口機(jī)封住雜交袋，放入冰箱中4℃過(guò)夜。

c、二抗孵育。將經(jīng)過(guò)一抗孵育的nc膜在tbs-t中漂洗3次，每次15min，然后加入含有二抗的平皿中，室溫下在搖床上孵育2h。

d、顯影。二抗孵育結(jié)束后，用tbs-t漂洗三次，每次15min。將現(xiàn)配的ecl發(fā)光工作液滴加在膜上，室溫避光孵育計(jì)時(shí)5min，顯色后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描、拍片。

1.2.15統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有計(jì)數(shù)資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±sd)表示，使用統(tǒng)計(jì)軟件spss18進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以單因素方差分析(one-wayanova)方法進(jìn)行比較，以p＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差別。

1.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.3.1h9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型的建立

在缺氧6h，復(fù)氧不同的時(shí)間點(diǎn)上，通過(guò)mtt方法測(cè)定細(xì)胞的存活率，如圖1所示，在復(fù)氧8～24h之間，細(xì)胞存活率的變化經(jīng)過(guò)了兩個(gè)階段。第一個(gè)階段為復(fù)氧損傷的階段，細(xì)胞存活率逐漸降低，至復(fù)氧12h時(shí)，在缺氧6h的條件下其存活率達(dá)到了最低值，為51.3％；第二個(gè)階段為復(fù)氧12h之后，細(xì)胞在正常條件下培養(yǎng)，逐漸擺脫了缺氧復(fù)氧對(duì)其的影響，其生長(zhǎng)狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)的一個(gè)過(guò)程。

從上面的結(jié)果來(lái)分析，本實(shí)驗(yàn)取缺氧6h、復(fù)氧12h對(duì)細(xì)胞損傷最為嚴(yán)重的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行研究，此時(shí)的細(xì)胞存活率為50％左右，排除了其他因素的影響，以期能更好的顯示出藥物的療效。

1.3.2對(duì)h9c2細(xì)胞存活率的影響

在缺氧結(jié)束時(shí)，給予不同劑量的白鮮皮提取物，通過(guò)mtt方法測(cè)定各給藥劑量組和模型組的細(xì)胞存活率。與h/r組相比較，白鮮皮提取物不同劑量給藥組細(xì)胞的存活率均有不同程度的增加。其中，小劑量組0.4μg/ml的細(xì)胞存活率有增加的趨勢(shì)，但是統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示與h/r組相比，并無(wú)顯著性差異。而同樣與h/r組相比較，1.56μg/ml組的細(xì)胞存活率有顯著性差異(p＜0.05)，6.25μg/ml、25μg/ml、100μg/ml三個(gè)給藥劑量組均有較顯著性差異(p＞0.01)。而6.25μg/ml、25μg/ml、100μg/ml三個(gè)給藥劑量組之間相互比較，則沒(méi)有顯著性差異(p＞0.05)(圖2)。

根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，表明白鮮皮提取物各給藥劑量組對(duì)缺氧復(fù)氧損傷的h9c2心肌細(xì)胞均有一定的保護(hù)作用，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，選擇了1.56μg/ml、6.25μg/ml分別作為低劑量和高劑量組進(jìn)行研究，分別表示為h/r+l和h/r+h。

1.3.3ldh含量的測(cè)定

分別考察了con、h/r、h/r+l、h/r+h四組的ldh釋放量。從測(cè)定結(jié)果可以看出，與h/r組相比較，各給藥劑量組均能有效的降低培養(yǎng)細(xì)胞上清液中的ldh釋放量(p＜0.01)，且隨著給藥濃度的增加，ldh釋放量逐漸減少(圖3)。

1.3.4心肌肌鈣蛋白(ctni)的測(cè)定

通過(guò)測(cè)定缺氧復(fù)氧損傷后細(xì)胞上清液中ctni的逸出量，測(cè)定結(jié)果表明，與h/r組進(jìn)行比較，白鮮皮提取物給藥劑量組中h/r+l、h均有顯著性降低(p＜0.01，p＜0.01)，即白鮮皮提取物各給藥劑量組均可顯著減輕缺氧復(fù)氧條件對(duì)心肌細(xì)胞的的損傷程度(圖4)。

1.3.5對(duì)缺氧復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞上清液中sod活力的影響

與con組相比，h/r組細(xì)胞上清液中的sod活力有顯著性降低(p＜0.01)。白鮮皮提取物各給藥劑量組h/r+l、h，均可明顯提高h(yuǎn)9c2心肌細(xì)胞上清液中sod的活力(p＜0.01)，且隨著白鮮皮提取物給藥劑量的增加，上清液中sod的活力逐漸增強(qiáng)(圖5)。這說(shuō)明白鮮皮提取物可有效升高缺氧復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞上清液中sod的活性，并且具有一定的濃度依賴性，劑量越高，作用越明顯。

1.3.6對(duì)缺氧復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞上清液中mda含量的影響

h/r組與con組進(jìn)行比較，h/r細(xì)胞上清液中mda的含量明顯較高。而h/r組與白鮮皮提取物各劑量比較，兩個(gè)給藥組的細(xì)胞上清液中mda含量均有顯著性下降(p＜0.01，p＜0.01)，且呈劑量依賴性關(guān)系(圖6)。表明白鮮皮提取物可以明顯降低缺氧復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞中上清液的mda含量。

1.3.7對(duì)缺氧復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響

實(shí)驗(yàn)采用jc-1熒光探針?lè)z測(cè)細(xì)胞的線粒體膜電位，線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。通過(guò)jc-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變，可以很容易地檢測(cè)到細(xì)胞膜電位的下降，同時(shí)也可以用jc-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變，作為細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)，具體的測(cè)定結(jié)果如fig8所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，h/r組線粒體膜電位顯著降低，細(xì)胞凋亡比例顯著升高。而白鮮皮各劑量給藥組可顯著抑制心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷引起的膜電位的降低，細(xì)胞凋亡比例顯著降低，且具有劑量依賴性(圖7)。

1.3.8細(xì)胞色素c的表達(dá)量

通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(elisa)測(cè)定實(shí)驗(yàn)中各組胞漿中細(xì)胞色素c的釋放量，測(cè)定結(jié)果表明，與con組相比較，h/r組胞漿中細(xì)胞色素c的釋放量顯著增加(p＜0.01)；而與h/r組相比較，白鮮皮提取物各給藥劑量組(h/r+l和h/r+h)顯著降低了胞漿中細(xì)胞色素c的含量(p＜0.01；p＜0.01)，且隨著給藥濃度的增加，線粒體向胞漿中釋放的細(xì)胞色素c的含量逐漸減低，有一定的濃度依賴性(圖8)。

1.3.9對(duì)缺氧復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞caspase-3活性的影響

caspase-3是caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行蛋白，是凋亡過(guò)程中主要的凋亡效應(yīng)分子，它的激活標(biāo)志著細(xì)胞凋亡進(jìn)入了不可逆轉(zhuǎn)的階段。caspase-3活性的檢測(cè)結(jié)果如fig10所示，通過(guò)與con組相比較，h/r中的caspase-3的活化水平有非常顯著的升高(p＜0.01)；各給藥劑量組與h/r組相比較，活化的caspase-3均有不同程度的減少，且此作用具有劑量依賴性關(guān)系(圖9)。表明白鮮皮提取物具有的抗凋亡作用可能與抑制caspase家族級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活有關(guān)系。

1.3.10對(duì)缺氧復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞凋亡率的影響

本實(shí)驗(yàn)采用fitc-annexinv/pi雙染的方法，通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)，具體的試驗(yàn)結(jié)果如tab4、圖10所示。與空白對(duì)照組相比，模型組心肌細(xì)胞凋亡率達(dá)到了8.80±1.09，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有顯著性差異。而與模型組相比較，白鮮皮提取物各給藥組的心肌細(xì)胞凋亡率有顯著性降低，僅為3.14±0.57和2.79±0.30，且細(xì)胞凋亡率隨著給藥濃度的增加而減小。說(shuō)明白鮮皮提取物對(duì)缺氧復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞凋亡具有抑制作用。

tab3effectsofaqueousextractofcortexdictamnionh/r-inducedh9c2myocardialcellsapoptosis.

note：datawerepresentedasmeans±sdfromthreeindependentexperiments.

**，p＜0.01vsh/r；##，p＜0.01vscon.

1.3.11對(duì)缺氧復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)量的影響

通過(guò)westernblot的實(shí)驗(yàn)方法，研究了白鮮皮提取物對(duì)有關(guān)于凋亡蛋白表達(dá)量的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，同con組相比較，h/r組中的促凋亡蛋白bax的表達(dá)量顯著上調(diào)(p＜0.01)，而抗凋亡蛋白bcl-2的表達(dá)量則顯著下降，從而使bcl-2/bax的比例降低，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。與h/r組相比較，白鮮皮提取物各劑量給藥組可顯著抑制缺氧復(fù)氧引起的bcl-2表達(dá)的下調(diào)或者bax表達(dá)的增加(p＜0.05)，使的bcl-2/bax的比例升高(p＜0.05)，抑制了細(xì)胞凋亡(圖11)。

1.4結(jié)論

白鮮皮提取物有效提高缺氧復(fù)氧損傷的大鼠心肌細(xì)胞的存活率，降低受損細(xì)胞ldh、ctn-i的釋放量，且具有一定的濃度依賴性。

白鮮皮提取物顯著增強(qiáng)缺氧復(fù)氧損傷的h9c2心肌細(xì)胞抗氧化酶sod的活性，從而減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物mda的含量，可能通過(guò)抗氧化機(jī)制發(fā)揮對(duì)缺氧復(fù)氧細(xì)胞的保護(hù)作用。

白鮮皮提取物對(duì)缺氧復(fù)氧的心肌細(xì)胞具有顯著的抑制凋亡作用，且其抗凋亡作用的機(jī)制涉及到線粒體通路的多個(gè)環(huán)節(jié)，可能是通過(guò)線粒體途徑來(lái)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生顯著的抗凋亡作用。

2.白鮮皮提取物的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.1材料與方法

2.1.1實(shí)驗(yàn)材料

動(dòng)物：

spf級(jí)wistar大鼠48只，雄性，體重(130±10)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供[scxk(京)20124)001]。飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所spf級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)[syxk(京)20084)019]。保持14h照明，10h黑暗的循環(huán)環(huán)境，自由飲水及攝食。

儀器：

mp150型16道生理信號(hào)記錄系統(tǒng)(美國(guó)biopac公司)；dm4000b型正置熒光顯微鏡及成像系統(tǒng)(德國(guó)leica公司)；heraeuslabofuge400r型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)thermoscientific公司)；mqx200型酶標(biāo)儀(美國(guó)bio-tek公司)；cm1900型冷凍切片機(jī)(德國(guó)leica公司)；alc-v8s型小動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物科技有限公司)；u725型超低溫冰箱(美國(guó)nbs公司)。

試劑：

肌酸激酶(ck)、超氧化物歧化酶(sod)、血清丙二醛(mda)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物科技有限公司)，紅四氮唑(ttc)(美國(guó)amresc。公司)，地奧心血康(地奧集團(tuán)成都藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：1109006)。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1動(dòng)物分組

將48只大鼠隨機(jī)分為6組，每組6只。分別為

假手術(shù)組(shamoperation，so)、模型組(modelgroup，mg)、白鮮皮低劑量組(cdl)、中劑量組(cdm)、高劑量組(cdh)，以及陽(yáng)性藥組(positivedrugcontrolgroup，pc)。

2.2.2給藥方法

將白鮮皮提取物用菌蒸餾水溶解，配成低、中、高三個(gè)劑量分別為0.128、0.64、1.28g/(kg*bw)的劑量進(jìn)行給藥]，陽(yáng)性藥組給予地奧心血康0.054g/(kg*bw)(按成人給藥劑量換算)，假手術(shù)組與模型組按相同劑量的溶劑灌胃。各組每天灌胃給藥1次。每周稱重1次，及時(shí)調(diào)整給藥量，連續(xù)給藥15日。

2.2.3模型制備

用20％烏拉坦[1000mgkkg*bw)]麻醉大鼠，仰位固定，固定銀針電極插于四肢皮下，接心電圖機(jī)監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)肢體n導(dǎo)聯(lián)心電圖。行氣管插管術(shù)，接動(dòng)物呼吸機(jī)正壓呼吸(頻率75次/分，潮氣量5ml/min，吸呼比2∶1)。在胸骨左側(cè)第3～4肋間開胸，剪開心包膜，暴露心臟。于肺動(dòng)脈圓錐及左心耳間找出冠狀動(dòng)脈左前降支，并用圓形無(wú)創(chuàng)縫合針5/0絲線置于左冠狀動(dòng)脈前降支起始部下2mm處結(jié)扎。除假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎外，其余各組均進(jìn)行結(jié)扎。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支后，以心電圖ii導(dǎo)聯(lián)t波高聳與qrs波融合、qrs波變寬振巾幅加大為結(jié)扎成功的標(biāo)志。結(jié)扎30min后松開結(jié)扎線，再灌注120min。

2.2.4心電圖st-t段的測(cè)量

大鼠麻醉仰位固定后，于四肢皮下插入針形電極連接mp150型心電圖機(jī)。連續(xù)心電監(jiān)測(cè)，并依次描記結(jié)扎前、缺血30min和再灌注120min時(shí)遼導(dǎo)聯(lián)心電圖(紙速50mm/s，增益1mv＝10mm)。

2.2.5大鼠血清ck、sod活性及血清mda含量的測(cè)定

再灌注結(jié)束后，處死大鼠，立即腹主動(dòng)脈取血，3500r/min離心10min分離血清。按試劑盒說(shuō)明書所示方法測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

2.2.6大鼠心肌ttc染色及心肌梗死面積測(cè)定再灌注結(jié)束后，摘取心臟，用生理鹽水洗凈心臟內(nèi)積血，去除血管、脂肪、右心室，自結(jié)扎線以下至心尖，將心臟平行均勻切成五片，將心肌片置入1％ttc溶液中，37℃染色10mm，將染色結(jié)果拍攝存儲(chǔ)，用imageproplus(版本6.0，美國(guó)mediacybernetics公司)讀入存儲(chǔ)的數(shù)據(jù)，計(jì)算每塊心肌片的梗死面積與總面積。按照心肌梗死面積/總心肌面積x100％計(jì)算心肌梗死率。

2.2.7大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)觀察

取心臟下1/3心肌組織，oct固定液包埋，制作冰凍切片。從各組取5張切片，he染色，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織的形態(tài)變化。

2.2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各組數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)中，采用spss統(tǒng)計(jì)軟件(版本17.0)，根據(jù)資料要求進(jìn)行方差分析。

2.3結(jié)果

2.3.1大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌梗死面積

大鼠左心室薄片經(jīng)ttc染色觀察梗死發(fā)生的狀況，在體視顯微鏡下觀察表明，模型組梗死區(qū)域較大，白鮮皮提取物低、中、高劑量組(圖12d、圖12e、圖12f)給藥后心肌缺血再灌注損傷后的梗死區(qū)域小于模型組(圖12b)。對(duì)梗死區(qū)域(白色部分)面積用imageproplus軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算梗死區(qū)面積與整個(gè)心肌薄片面積的比值，結(jié)果表明，白鮮皮提取物中、高劑量組的比值明顯低于模型組(p＜0.01)，而低劑量組與模型組比較則差異無(wú)顯著性(p＞0.05)。白鮮皮提取物中、高劑量組與陽(yáng)性藥組(圖12c)比較，心肌梗死面積比值差異無(wú)顯著性(p＞0.05)。對(duì)照組大鼠心肌未見明顯梗死區(qū)(圖12a)。

2.3.2大鼠心肌缺血再灌注損傷心電圖st-t段的變化

大鼠麻醉后仰位固定，記錄結(jié)扎前各組心電圖，然后記錄結(jié)扎30min后和再灌注2h的心電圖，測(cè)量st-t段抬高的毫米數(shù)，并計(jì)算st-t抬高的毫伏數(shù)。結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組缺血30min和再灌注2h的st-t段顯著抬高(p＜0.01)(圖13b)，表明造模手術(shù)成功。

各給藥組給藥后心電圖數(shù)據(jù)表明，白鮮皮提取物高劑量組在缺血30min和再灌注2h時(shí)，st-t段明顯降低，與模型組比較差異均有非常顯著性(p＜0.01)。白鮮皮提取物中劑量組在缺血30min和再灌注2h時(shí)，st-t段降低，與模型組比較差異有顯著性(p＜0.05)。白鮮皮提取物低劑量組在缺血30min和再灌注2h時(shí)，st-t段雖有降低，但與模型組比較差異無(wú)顯著性(p＞0.05)(圖13g)。

2.3.3大鼠心肌缺血再灌注損傷后血清ck的活性

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)采集大鼠腹主動(dòng)脈血液，分離血清，按試劑盒說(shuō)明書要求測(cè)定各組ck的活性。結(jié)果表明，大鼠缺血再灌注手術(shù)結(jié)束后，白鮮皮提取物中、高劑量組的ck活性與模型組比較，差異均有顯著性(p＜0.01)，白鮮皮提取物低劑量組則無(wú)明顯改變(圖14)。

2.3.4心肌缺血再灌注損傷大鼠血清sod活性及mda含量

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組大鼠腹主動(dòng)脈采血，分離血清，按照試劑盒說(shuō)明書要求測(cè)定血清sod活性及mda含量。結(jié)果表明，模型組大鼠血清中sod活性降低，mda含量明顯增加(與假手術(shù)組比，較p＜0.01)。與模型組比較，白鮮皮提取物中、高劑量組給藥后，血清中sod活性明顯升高(p＜0.05和p＜0.01)，白鮮皮提取物低劑量組則無(wú)明顯差異(p＞0.05)；白鮮皮提取物低、中、高劑量組給藥后，血清中mda的含量明顯降低(p＜0.05和p＜0.01)(圖15)。

2.3.5大鼠心肌缺血再灌注損傷后心肌組織的病理變化

各組心肌組織he染色后，光鏡下觀察心肌組織和細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果表明，假手術(shù)對(duì)照組心肌排列整齊，結(jié)構(gòu)清楚，橫紋清晰可見，核呈橢圓形位于細(xì)胞中央，心肌細(xì)胞分布均勻，心肌血管，心肌間質(zhì)等均成正常結(jié)構(gòu)(圖16a)。模型組心肌細(xì)胞排列不規(guī)則，結(jié)構(gòu)紊亂，橫紋模糊或消失，細(xì)胞間有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，局部橫紋不清或消失，肌纖維空隙增寬。局灶區(qū)域有肌溶解改變，并可見灶狀液化壞死(圖16b)。白鮮皮提取物低、中、高劑量組術(shù)后心肌he染色表明，心肌的病理變化呈現(xiàn)由重至輕的遞減改變，病變程度明顯輕于模型組，且以白鮮皮提取物中、高劑量組病變更輕，白鮮皮提取物水提物高劑量組給藥后心肌形態(tài)已基本接近假手術(shù)組(圖16：c-e)。

2.4結(jié)論

白鮮皮中、高劑量組給藥后能明顯減少心肌梗死面積，明顯降低缺血30min和再灌注120min時(shí)st段的抬高，并能降低大鼠血清中mda含量，升高sod活性，減少因缺血導(dǎo)致的心肌組織病理?yè)p害。

以上藥效和藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，白鮮皮提取物具有對(duì)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧有明顯的保護(hù)作用，并且能減少心肌梗死面積，顯著降低大鼠心肌缺血再灌注損傷心電圖s-t段的升高，提高超氧化物歧化酶(sod)活性，降低丙二醛(mda)的含量，降低肌酸激酶(ck)的活性，改善心肌缺血再灌注對(duì)心肌細(xì)胞的病理?yè)p害，從而改善對(duì)大鼠心肌缺血癥狀

附圖說(shuō)明

圖1不同復(fù)氧時(shí)間對(duì)h9c2細(xì)胞活力的影響

圖2不同劑量的白鮮皮提取物對(duì)缺氧復(fù)氧h9c2心肌細(xì)胞的作用

圖3各給藥組ldh含量測(cè)定

圖4各給藥組心肌肌鈣蛋白(cardiactroponini(ctn-i))的測(cè)定

圖5各給藥組超氧化物歧化酶(sod)活性測(cè)定

圖6各給藥組丙二醛(mda)含量的測(cè)定

圖7白鮮皮提取物對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的h9c2心肌細(xì)胞線粒體跨膜電位的影響

圖8白鮮皮提取物對(duì)細(xì)胞色素c表達(dá)量的影響

圖9白鮮皮提取物對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的h9c2心肌細(xì)胞caspase-3活性的影響

圖10白鮮皮提取物對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的h9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響

圖11白鮮皮提取物對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的h9c2心肌細(xì)胞bcl-2、bax的影響

圖12白鮮皮提取物對(duì)大鼠缺血再灌注損傷后心肌梗死區(qū)域及梗死面積比率的影響

圖13白鮮皮提取物對(duì)大鼠缺血再灌注過(guò)程中心電圖st-t改變的影響

圖14白鮮皮提取物對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷后血清ck活性的影響

圖15白鮮皮提取物對(duì)大鼠缺血再灌注損傷后血清sod活性及mda含量的影響

圖16白鮮皮提取物對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌組織的保護(hù)作用。