本申請要求2014年12月19日提交的美國專利申請序列號62/094,663的優(yōu)先權，其全部內容通過引用全文并入本文。
背景技術：
：本發(fā)明一般涉及生物活性分子在眼組織中的用途，更具體地涉及使用離子電滲法(iontophoresis)將黃體素(lutein)遞送至黃斑。由于其抗氧化和光保護作用以及其在眼黃斑中的獨有分布，黃體素(和玉米黃質(zeaxanthin))與降低發(fā)生年齡相關性黃斑變性(amd)和白內障摘除的風險相關1。年齡是amd最主要的風險因素之一，通常影響50歲以上的個體2-4。amd有兩種類型，“干性amd”和“濕性amd”。當黃斑細胞由于被稱為“玻璃疣”(drusen)的廢物積累而受損時，會發(fā)生干性amd。這是amd最常見且最不嚴重的類型。出現(xiàn)干性amd癥狀的患者預計很大數(shù)量將會發(fā)展為濕性amd，當黃斑下方的異常血管生長并導致不可逆的細胞損傷時發(fā)展為濕性amd2-4。黃體素通過口服補充被廣泛使用，原理為全身循環(huán)可以通過黃體素結合蛋白(xanthophyll-bindingprotein)將黃體素帶入脈絡膜循環(huán)以攝入黃斑5。然而，有幾個報告表明，只有很小百分比的黃體素到達黃斑6-8。此外，由于眼屏障的限制，后眼部的治療處理困難。由于眼睛受到淚膜、角膜、玻璃體、血液視網膜和血液-水屏障的保護，所以非常難以足夠的濃度和最小的副作用將藥物遞送到眼，特別是視網膜9,10。已經使用原位施用(in-situapplication)來克服這個問題；然而緩慢遞送系統(tǒng)(如植入物)是非常具有侵入性且昂貴的。在過去幾年中，許多研究的結果強調了這些治療的風險11,12。最近，玻璃體內注射黃體素已被用于在手術期間染色特定的視網膜前膜和其他眼結構13-16。這是將黃體素向黃斑原位遞送的第一組數(shù)據(jù)，其利用了黃體素的內在染色效果。黃體素延遲amd發(fā)展的潛力和不同試驗中顯示的推定的神經保護作用尚未通過眼內遞送后的原位施用證實。用于預防目的的玻璃體內注射黃體素作為將黃體素遞送到黃斑的策略可能太具侵入性，其缺點在于患者接受度差。眼離子電滲法是一種通過電力驅使高濃度的靶分子跨鞏膜和/或跨角膜的微創(chuàng)方法。它使用小電流施加到包含感興趣的分子和載體的離子電滲室(iontophoreticchamber)17。幾個報告顯示，在人眼黃斑中發(fā)現(xiàn)的高濃度黃體素除了具有潛在的神經保護作用外還有延遲amd發(fā)展的潛力18-20。在這里，我們報告了一種向視網膜遞送黃體素的新方法，所以它在旁中心凹(parafovea)黃斑區(qū)域的存在能夠被顯著增強并從而延緩amd的發(fā)展并保護視網膜內皮細胞。用于眼科用途的不同離子電滲法遞送系統(tǒng)已經被創(chuàng)建，并已被用于安全且有效地將藥物遞送到人眼的前部和后部21。通過這種技術，使跨角膜和鞏膜遞送大量生物活性分子(包括大分子)成為可能。在本報道的研究中，黃體素乳狀液通過離子電滲法擴散遞送到黃斑中22-23。理念是開發(fā)一種通過離子電滲法驅使高濃度的帶電黃體素跨鞏膜和/或跨角膜的微創(chuàng)方法。鞏膜和角膜離子電滲施用后，我們已經使用雙光子顯微鏡、拉曼光譜和hplc來評估不同眼組織中黃體素的分布和濃度。這種方法的主要優(yōu)點是使用更加安全并且更容易獲得患者依從性的醫(yī)療裝置，避免頻繁和高劑量注射或手術植入的并發(fā)癥。該程序可以在正常眼保健約見期間在醫(yī)生辦公室中快速進行而不需要手術環(huán)境。發(fā)明概述離子電滲法，一種使用低電流來增強電離的化合物進入組織的穿透性的微創(chuàng)方法，發(fā)現(xiàn)其對黃體素的眼內遞送是有效的。將14只著色的兔子通過在角膜和鞏膜施用充滿黃體素乳狀液的離子電滲儲器(分別具有或不含電流(分別為20.0和0.0ma))進行治療。離子電滲法后，收集來自兩只眼睛的眼組織(試驗和對照)，并通過視覺比較評估經治療的眼睛和未經治療的對側的眼睛的黃體素遞送?？缃悄ず涂珈柲るx子電滲法施用導致在所有經治療的眼睛中將黃體素遞送到兔角膜(時間0h)。黃體素的施用還在鞏膜緣產生了橙色痕跡，并在眼結膜中形成了輕微的橙色著色，證明乳狀液也轉移到這些組織中。在這項研究中，我們首次顯示離子電滲法是黃體素眼內遞送的一種有效技術。在本發(fā)明中，評估離子電滲法后眼中黃體素分布，以確定通過該技術將大量黃體素遞送到后視網膜。結果表明，離子電滲法是一種有效的將帶正電荷的黃體素脂質體乳狀液遞送到兔眼中的方法。此外，使用優(yōu)化的黃體素乳狀液的制劑和替代的離子電滲原型(prototype)進行實驗以評價不同眼組織中的黃體素分布。還進行了用人類尸體的眼睛進行試驗，向眼睛施用低電流來評價通過角膜和鞏膜的黃體素遞送。收集來自經治療和未經治療的眼睛的角膜、鞏膜、脈絡膜、外周和中央視網膜，并通過雙光子顯微鏡分析以觀察含黃體素的脂質體的分布?？珈柲るx子電滲施用導致黃體素主要遞送到后視網膜區(qū)域，揭示離子電滲法后黃體素的途徑通過睫狀體/平坦部、隨后被動擴散直到到達后視網膜發(fā)生。在脈絡膜中黃體素的不存在可以通過著色的視網膜上皮的緊密連接的狹窄尺寸來解釋，這使得較大脂質體囊泡難以通過，從而將黃體素限制在視網膜內層中。通過這項工作，我們首次通過一種新穎的微創(chuàng)方法，將黃體素原位遞送到后眼部分。結果表明，鞏膜的黃體素離子電滲法是將黃體素遞送給黃斑的有效策略，其代表了用于延遲后眼部分疾病(如amd)的當前方法的替代方法。離子電滲法具有作為微創(chuàng)方法的優(yōu)點，因此比化合物眼內遞送的其他方法(即植入物和眼內注射)更安全。因此，離子電滲法將具有更高的患者依從性，因為它避免了手術植入或頻繁和高劑量玻璃體內注射的并發(fā)癥。另一個優(yōu)點是這種技術比那些方法更便宜，并且可以在正常的眼保健約見期間在醫(yī)生辦公室中快速執(zhí)行而不需要手術環(huán)境。附圖簡要說明該專利或申請文件包含至少一個以色彩描繪的附圖。本專利或專利申請公開文本的彩色附圖的副本將由美國專利商標局(theoffice)在請求并支付必要的費用后提供。圖1是1:50稀釋于0.9％nacl(藍色)或蒸餾水(紅色)的lipo+吸收光譜(300至750nm)的圖表；示出了對照光譜(不含黃體素的脂質體溶液)。圖2是1:50稀釋于0.9％nacl(藍色)或蒸餾水(紅色)的lipo+熒光光譜(480至650nm)的圖表；示出了對照光譜(不含黃體素的脂質體溶液)。圖3是動態(tài)光散射和電泳遷移率的圖表，用于估計lipo+溶液的粒度分布和lipo+溶液的電荷：測試在蒸餾水中1:50的稀釋(紅色)，并將在水中的1:50脂質體稀釋(不含黃體素)作為對照。圖4是離子電滲法施用后黃體素軌跡的示意圖；鞏膜施用將黃體素沉積到眼睛后部，而角膜施用則將黃體素置于角膜上皮細胞的上部(橙色斑點)；箭頭表示離子電滲施用后黃體素的入口。具體實施方式術語“施用(administration)”或“施用(administering)”化合物應被理解為是指可以以治療有用的形式和治療有效量被引入個體體內的形式向需要治療的該個體提供本發(fā)明化合物，該形式包括但不限于：口服劑型，例如片劑、膠囊劑、糖漿劑、懸浮劑等；可注射劑型，例如iv、im或ip等；經皮劑型，包括乳膏劑(cream)、膠凍劑(jelly)、粉劑或貼劑；口頰劑型；吸入粉末、噴霧劑、懸浮液等；和直腸栓劑。本文所用的術語“有效量”是指引發(fā)期望的生物學反應所必需的量。如本領域普通技術人員將理解的，復合物或生物活性劑的有效量可以根據(jù)如期望的生物學終點(biologicalendpoint)、待遞送的生物活性劑、包被基質的組成、靶組織等而變化。如本文所用，術語“提取物”是指通過萃取制備的產物。提取物可以是在溶劑中的溶液形式，或者提取物可以是不含或基本上不含溶劑的濃縮物或精華。術語提取物可以是從特定提取步驟或一系列提取步驟獲得的單一提取物，或者提取物也可以是從單獨的提取步驟獲得的提取物的組合。例如，可以通過在水中用酒精提取蔓越莓來獲得“a”，而通過超臨界二氧化碳提取蔓越莓可以獲得提取物“b”。提取物a和b然后可以組合以形成提取物“c”。因此，這樣的組合提取物也被術語“提取物”所涵蓋。如本文所用，術語“級分”(fraction)是指包含由特定物理、化學性質或物理或化學性質表征的特定組的化學化合物的提取物。術語“預防”，當其使用涉及如癌癥、感染性疾病或其他醫(yī)學疾病或病癥的病癥時，在本領域中是熟知的，并且包括與不接受組合物的對象相比，施用組合物在對象中降低頻率或延遲醫(yī)療病癥的發(fā)生、癥狀。因此，預防癌癥包括例如相對于未經治療的對照群體減少接受預防性治療的患者群體中可檢測到的癌性生長的數(shù)量，和/或與未經治療控制群體相比延遲經治療的群體中可檢測到的癌性生長的出現(xiàn)，例如，統(tǒng)計學和/或臨床上顯著的量。預防感染包括例如與未經治療的對照群體相比減少經治療的群體中的診斷出感染的次數(shù)，和/或與未經處理的對照群體相比延遲經治療的群體中的感染癥狀的發(fā)生。“藥學上可接受的”是指載體、稀釋劑或賦形劑必須與制劑的其它成分相容，對其接受者無害。術語“協(xié)同”在本領域中是熟知的，并且是指兩個或更多個成分共同作用使得總效應大于成分的總和。術語“治療”在本領域中是熟知的，并且是指治療以及改善任何病癥或障礙(disorder)的至少一種癥狀。術語“預防性或治療性”治療在本領域中是熟知的，并且包括向宿主施用一或多種主題組合物。如果在臨床表現(xiàn)不期望的病癥(例如宿主動物的疾病或其他不期望的狀態(tài))之前進行施用，則治療是預防性的，即其保護宿主免于發(fā)展不期望的病癥，而如果在表現(xiàn)不期望的病癥后施用，治療是治療性的(即，旨在減輕、改善或穩(wěn)定現(xiàn)有的不期望的病癥或其副作用)。本發(fā)明的化合物可以以將提供最佳藥物功效的劑量施用于需要這種治療的對象(人和動物，包括伴侶動物，如狗、貓和馬)。應當理解，在任何特定施用中使用的所需劑量將隨患者而變化，不僅隨所選擇的特定化合物或組合物變化，而且隨施用途徑、待治療病癥的性質、患者的年齡和病癥、患者隨后遵循的并用藥物或特殊飲食，以及本領域技術人員將認識到的其他因素變化，適當?shù)膭┝孔罱K由服務醫(yī)師酌情決定。實施例1–兔眼中的黃體素的眼內遞送材料和方法配制工作。在目前用于提高化合物穩(wěn)定性的不同遞送系統(tǒng)中，脂質體由于其生物相容性、持續(xù)釋放潛能和攜帶疏水性和親水性化合物的能力而具有優(yōu)勢16。在這項工作中，使用磷脂90h(lipoidgmbh，批次529400-2120046-12-112、cas308068-11-3)和十八胺(sigma-aldrich批次bcbk6340v、cas124-30-1))將結晶黃體素(keminfoods，crystallinelutein批次1401103302)包被在脂質體中。使用溶解在chcl3/meoh(2:1)(sigma-aldrich，批次shbc4982v，cas67-66-3或sigma-aldrich，批次szbc237bv，cas67-56-1)中的90h磷脂、十八胺和黃體素制備脂膜。通過旋轉蒸發(fā)在真空下除去溶劑；通過heidolph旋轉蒸發(fā)器在40℃下真空干燥溶液，調節(jié)旋轉蒸發(fā)器的速度以減少可能導致產物損失的氣泡的形成和飛濺，并在1-2小時后獲得干燥的薄膜。為了除去任何痕量的溶劑，將所述薄膜在室溫下真空放置至少16小時。通過在40-45℃下將蒸餾水(waterultrapure-milliq-aquamax-電導率0.054μs/cm)加入到脂膜中以水合脂質并形成大的脂質體囊泡進行脂膜水合。使用ikaworksultra-turraxt25數(shù)字均質器(staufen，德國)實現(xiàn)大脂質體囊泡的均質化，并且通過使用大規(guī)模高流體處理器m-110eh的擠出在50-60℃和1200巴下進行將脂質體囊泡減小到納米尺寸范圍。該過程重復5次。乳狀液的滅菌在121℃1大氣壓下進行20分鐘。表1顯示了脂質體乳狀液組合物。滅菌后分析終產品的尺寸分布、ζ電位、滲透壓和ph值，并且總結于表2中。表1.黃體素脂質體乳狀液組合物。組合物％w/w90h磷脂1.000十八胺0.005黃體素晶體0.050蒸餾水至100g表2.滅菌后的脂質體特征。眼離子電滲裝置。離子電滲裝置由兩個一次性組件組成：眼睛施藥器(applicator)和返回電極。這兩個組件被連接到可重復使用的發(fā)電機。所述眼睛施藥器由聚碳酸酯儲存器(直徑9mm、高度4.5mm、體積0.5ml)和通過導線連接到所述發(fā)電機(陽極-正電極)的不銹鋼電極(aisi304)組成。所述返回電極是一個25g的皮內針，被插入頸部(前側)并與鱷魚夾連接并通向發(fā)電機(陰極)。所述發(fā)電機(eyegatecci發(fā)電機6121-eye，eyegatepharma，法國巴黎)為恒定電流型，設定范圍為電流0.25ma-2.5ma(10個0.25ma的增量)，以及時間為0.5min-5min(10個0.5分鐘的增量)。在使用萬用表進行研究期間測量產生的施用的電壓。動物。在本研究中使用了14種著色的兔子品種hy79b(繁育者：“hypharm”-fr-49450roussay)。所有動物在夾雜物檢測(inclusionexamination)后使用耳標和使用耳朵中的標記物分別被鑒定。動物在到達后3天內進行觀察，每天觀察疾病跡象特別注意眼睛。在相同的環(huán)境條件下，將動物單獨飼養(yǎng)在標準籠中。溫度保持在15-21℃，相對濕度為55±10％。房間連續(xù)通風(每小時≥15空氣體積)。連續(xù)控制和記錄溫度和相對濕度。將動物常規(guī)暴露(籠內)在10-200lx光的12小時光照(從上午7:00至晚上7:00)和12小時黑暗的控制循環(huán)中。在整個研究中，動物可以自由獲取食物和水。他們被喂以標準干顆粒飲食(150克/天)，-14h(lasvendigmbh，soest德國)?？梢詮乃芰掀恐须S意獲得定期分析的自來水。本研究計劃中描述的所有標準操作程序和計劃均已經經過認證的道德委員會審查。所有動物均按照歐洲保護用于實驗17和其他科學目的的脊椎動物保護公約2010/63/ue指令(directive2010/63/ueeuropeanconventionfortheprotectionofvertebrateanimalsusedforexperimentalandotherscientificpurposes)和視力與眼科研究協(xié)會(arvo)的動物在眼科和眼科視力研究的使用聲明(statementfortheuseofanimalsinophthalmicandvisionresearch)18進行處理。實驗程序。將來自hy79品系的14只有色兔隨機分為兩組：對照組(被動施用：無電流；動物編號9-14)和試驗組(離子電滲施用：有電流；動物編號1-8)。這兩組被細分為兩個時間點(0和2小時)。表3總結了研究設計。表3.研究設計。在施用前約10分鐘，通過離子電滲法向麻醉動物(肌內注射混合物甲苯噻嗪/氯胺酮)施用黃體素乳狀液，用開瞼器和局部麻醉(1滴0.4％thea，批次f6757))輔助。將動物通過向右眼角膜和鞏膜施用裝滿黃體素的9mm離子電滲法施藥器10分鐘進行治療。取決于組，每只眼睛施用0.0ma或20.0ma的電荷(參見表3)。恰好在給藥之前，用0.5ml的黃體素脂質體乳劑浸漬所述離子電滲施藥器；裝置的電極被黃體素乳狀液覆蓋。所有施用后均采用平衡鹽溶液(bss)洗滌。動物在離子電滲施用在右眼后立即或施用后2小時(見表3)之后通過靜脈內施用過量的戊巴比妥來安樂死，這是歐洲官方推薦的方法之一17。對來自雙眼的角膜(c)、房水(ah)、睫狀體(cb)、視網膜(r)、玻璃體(v)和鞏膜(sc)進行取樣并稱重。在將它們存儲在-80℃以用于將來的hplc(高效液相色譜)分析之前進行樣品著色的視覺評估。結果有色兔中黃體素乳狀液的眼部離子電滲遞送。為了評估通過離子電滲法遞送黃體素的能力，我們生產了攜帶黃體素(帶正電荷)的脂質體，并將該乳狀液以2.0ma10分鐘施加入有色兔的角膜/鞏膜中。通過對收集的組織進行視覺評估來評價通過離子電滲法進行遞送的功效。表4總結了有無電流施用黃體素乳狀液后的結果。表4.離子電滲施用后的著色。注意：c＝角膜；sc＝鞏膜；cj＝結膜離子電滲施用之后，用20.0ma電流(時間0h)治療的所有眼睛都顯示角膜中呈圓形橙色，其顯示組織中黃體素乳狀液的存在。黃體素的施用還來自兩只眼睛(編號2和編號3)，鞏膜角膜緣帶上有橙色痕跡和眼結膜有輕微的橙色著色。治療2小時后，只有一半的經治療的眼睛在角膜(編號5和編號8)中顯示出這種著色，這一事件可能表明施用之后，乳狀液擴散到眼睛中。在沒有電流的情況下沒有觀察到遞送入不同的眼組織中。討論世界上約10％65歲以上的人患有amd疾病19。不同的試驗已經表明黃體素是潛在的amd發(fā)展延遲劑，也是潛在的神經保護分子13,20-22。此外，黃體素是眼睛的天然成分，具有固有的黃斑向性，特異性先天性地保留在旁中央凹的(para-foveal)區(qū)域中1。這些特征對于用于控制amd的當前產品可能是一個優(yōu)勢。該病理學可用的治療涉及具有副作用的對患者麻煩且昂貴的眼內注射，所以開發(fā)更安全和有效的治療是至關重要的。在過去幾年中，許多研究的結果已經強調了玻璃體內注射的風險。通過玻璃體內注射頻繁施用藥物的需要可導致視網膜脫離、眼內炎和升高的眼內壓。據(jù)報道，非傳染性和感染性炎癥都是玻璃體內注射的并發(fā)癥。隨著批準使用后玻璃體內注射頻率的增加，已經廣泛研究了傳染性眼內炎的發(fā)病率23,24。在這項工作中，我們首次測試了一種原位遞送黃體素微創(chuàng)技術。離子電滲法具有微創(chuàng)方法的優(yōu)點，并且因此更安全和更容易從而改善患者的依從性，因此避免了手術植入術或頻繁高劑量玻璃體內注射的并發(fā)癥12。事實上，不同的臨床前和臨床研究報道了重復眼部離子電滲法施用的安全性14,25,26。另一個優(yōu)點是該方法較便宜，并且可以在正常的眼保健約見期間在醫(yī)生辦公室中快速進行而不需要手術環(huán)境。不同的研究建立了離子電滲法用于治療人類眼睛疾病的用途，例如控制活躍性角膜移植物排斥反應27、治療干眼癥14,28、非感染性前葡萄膜炎15和圓錐角膜疾病29。在這項調查中，我們使用了離子電滲法，其涉及在10分鐘內施用弱直流電驅動帶電分子穿過眼組織。離子電滲施用導致攜帶黃體素(電離的藥物)的脂質體乳狀液穿過眼睛的角膜段。本研究是一種有效的概念證明，其清楚地顯示了通過離子電滲技術黃體素乳狀液的眼內遞送。實施例2-在尸體眼睛中的黃體素眼內遞送材料和方法配制工作。由于較高的穿透入眼組織中，已經證明對于離子電滲施用帶正電荷的顆粒比帶負電荷的顆粒作為藥物載體是更適合的候選物38。此外，電場迫使正電荷分子移動到眼膜(帶負電)39。在這項工作中，我們利用了在生理ph值下存在于人眼中的膜是帶負電荷的事實，并且用于開發(fā)通過離子電滲施用的攜帶待遞送黃體素的帶正電荷的乳狀液。由于黃體素是具有大分子量、親脂性和不溶于水的分子的事實，這種類胡蘿卜素不經修飾通過離子電滲法的遞送幾乎是不可能的1。為了克服這一點，制備了帶有帶正電荷的脂質體囊泡作為黃體素分子載體的制劑(lipo+)。使用磷脂90h(lipoidgmbh，lot529400-2120046-12-112，cas308068-11-3)、十八胺(sigma-aldrichlotbcbk6340v，cas124-30-1)結晶黃體素(keminhealth，結晶黃體素1401103302)制備脂膜。為了制備4-5l，將化合物溶于500-800ml的chcl3/meoh(1:1v/v)(sigma-aldrich，批號shbc4982v，cas67-66-3/sigma-aldrich，批號szbc237bv，cas67-56-1)在30-35℃加熱。請參見表5中的制劑組成。通過旋轉蒸發(fā)在真空下除去溶劑。該溶液在40℃下通過heidolph旋轉蒸發(fā)器在真空下干燥，1-2小時后得到干燥的薄膜。將所述薄膜在室溫下真空放置至少16小時，以確保完全除去任何痕量的溶劑。通過氣相色譜(gc)分析有機溶劑的含量，并保證小于25ppm。通過在65℃下向脂膜中加入蒸餾水(waterultrapure-milliq-byaquamax-電導率0.054μs/cm)進行脂膜水合以形成大的脂質體囊泡。使用ikaworksultra-turraxt25數(shù)字勻漿器(staufen，德國)以2000-4000rpm實現(xiàn)這些大脂質體泡囊的均質化，并且通過使用大規(guī)模高流處理器m-110eh在50-60℃和1200巴下擠出將脂質體囊泡減小至納米尺寸范圍。該過程重復5次。乳狀液的滅菌在121℃下在1大氣壓下進行20分鐘。在所述滅菌過程之后，記錄脂質體制劑的特征：ph(使用mettlertoledos20儀器)、滲透壓(使用osmomat3000)、粒度和ζ電位(使用動態(tài)光散射(dls)，也稱為光子相關光譜學技術-nicomp380dls)。表5.黃體素脂質體乳狀液組合物。組合物％w/w90h磷脂2.000十八胺0.007黃體素晶體0.100蒸餾水至100g制劑的分光光度測定。使用分光光度法測定lipo+溶液的吸光度和熒光性質(1:50稀釋在水或0.9％nacl中)。使用僅包含脂質體(不含黃體素)的溶液作為對照。每個樣品追蹤300和750nm之間的吸光度光譜，以及在480nm和650nm之間的熒光光譜，在370nm處激發(fā)(選自吸光度光譜結果)。粒度和ζ電位。動態(tài)光散射用于評估lipo+溶液中組分尺寸的分布。進行電泳以評估溶液的ζ電位。眼部離子電滲法裝置。眼部離子電滲法的原理是將電場施用到含有至少一種產物的電解物質中，以通過眼睛的生物膜將產物遞送到待治療的身體或器官中12。典型的離子電滲設置由兩個部件組成：眼部施藥器和連接到發(fā)電機(generator)的返回電極。在該實驗中，所述眼部施藥器包括2個電極，分別觸及角膜和鞏膜組織。所述眼部施藥器(opiatechnologiessas，巴黎，法國)由聚氨酯樹脂制成，并且包括2個儲存器：中央圓形儲存器(直徑8mm、高度4.5mm、體積1ml)和施用在角膜上被環(huán)形儲器(內徑12.5mm、外徑18mm、高4.5mm、體積1ml)包圍的不銹鋼電極和施用在鞏膜上(角膜緣周圍的平坦部區(qū)域)的不銹鋼電極。每個不銹鋼電極與引線相連到不同的恒流發(fā)電機(陽極-正極)。將返回電極分配給每個發(fā)電機并分別接觸視神經(對于角膜電極)和鞏膜的赤道區(qū)域(對于鞏膜電極)，單獨閉合每個電路。所述發(fā)電機(iono-25，iacersrl，意大利)是恒定電流型，電流設定范圍為0.25ma-2.5ma(0.5ma增量為5)和時間自動調節(jié)以遞送20ma.分鐘的總輸出量。在研究期間針對每個電路使用2個萬用表測量施用的所得電壓。尸體眼睛。來自不同健康供體的六只人類尸體眼球從威尼托眼庫基金會(venetoeyebankfoundation)(veneziazelarino，意大利)獲得。根據(jù)“赫爾辛基宣言”的指導原則使用人眼進行涉及使用人體組織的研究，并在死亡后3至16小時后移出，并立即在4℃下保存在富含6％葡聚糖的角膜儲存培養(yǎng)基中。平均供體年齡為63.6±5.9歲。平均內皮細胞密度為2125±389個/mm2。淹沒在富含葡聚糖的溶液中的每個眼球都在5天內運送到實驗室。四只眼球經過角膜-鞏膜離子電滲法將0.1％的黃體素眼科溶液輸送到視網膜組織。使用兩只眼球作為對照：在不存在制劑的情況下進行離子電滲法。準備眼睛。每只眼球都輕輕地安裝在特別設計的支架上，朝上。鞏膜和角膜的被動電極分別施用于視神經和鞏膜。眼睛通過填充有0.9％氯化鈉溶液的管與柱壓力計連接，以便在實驗過程中將眼睛內部的壓力保持在15mm汞柱。首先對眼球進行15至42mm汞柱之間的三個預處理循環(huán)，以穩(wěn)定實驗期間的眼組織和結構。這個預處理確保在每個實驗開始時獲得獨特的參考狀態(tài)，并將角膜和鞏膜厚度恢復到生理水平。預處理后，使用超聲角膜測厚計(pachmate，dgh，exton，usa)測量中心角膜厚度(cct)。在這些樣品中，平均cct為558±19μm。用溶液浸漬。將塑料浴中的活性電極(陰極)施用到角膜和鞏膜表面。塑料管填充泡沫，用lipo+浸泡20分鐘。在這種預浸泡處理之后，將管輕輕地施用到眼球的前表面，并再次用2mllipo+溶液填充。將電流密度設定為2.5ma，并且用連接到角膜和鞏膜的兩個發(fā)電機遞送5分鐘。經角膜-鞏膜離子電滲法后，將眼球保持在眼保持器上，朝上，眼睛內部的壓力為15mm汞柱，持續(xù)80分鐘。這個時期允許通過跨鞏膜離子電滲法到達視網膜的黃體素被動地通過視網膜組織擴散到黃斑，特別是中央凹周圍的區(qū)域。將本研究中使用的6只眼睛中的兩只用作對照，因此不用所述制劑進行浸漬。組織評估。80分鐘后，分離出視網膜組織，而不引起可能損害其用于高分辨率雙光子成像的嚴重的損傷。使用標準化方案進行視網膜、脈絡膜、角膜和鞏膜組織的解剖47。使用雙光子顯微鏡用于評估視網膜的黃斑區(qū)域黃體素的穿透。在開始對眼組織進行圖像采集之前，獲取lipo+溶液(0.005％、0.002％和0.001％稀釋在0.9％氯化鈉中)的幾個疊層(stack)以了解施用和增強黃體素發(fā)出雙光子熒光(tpf)信號的最佳濾波器。濾波器550/80nm(semrock)是黃體素研究中最合適的(基于分光光度學研究)，但是發(fā)現(xiàn)濾波器525/20nm(semrock)在信噪比(snr)方面給出了良好的結果。因此，用于眼組織評估的激發(fā)為835nm，并且對于反射光反射通過非退掃描檢測器(non-descanneddetector)(ndd1)反向收集由眼組織成分發(fā)出的tpf光。共振拉曼光譜：共振拉曼散射用于評估離子電滲法遞送黃體素至尸體眼中的人視網膜的功效。將以473.5nm波長為中心的單模激光源(50mw功率)作為激發(fā)源進行共振拉曼光譜測量。通過鏡片和顯微鏡物鏡(na＝0.25)的組合將激光束聚焦在眼組織上，使得被照射的視網膜區(qū)域的直徑為1mm；使用中性密度濾光片在視網膜平面上將激光功率降低至1mw。拉曼散射光由光電倍增管(pmt)收集，光譜分辨率為10cm-1并且具有平均80次暗計數(shù)速率。拉曼信號強度記錄為每秒光子計數(shù)(cps)。在三個視網膜區(qū)域進行測量：離子電滲遞送部位的內部鞏膜(即面向睫狀體的周邊鞏膜)；視網膜中-邊緣，其包括圍繞血管弓的視網膜區(qū)域和視神經頭；和黃斑。在每個區(qū)域的四個范圍進行測量，以收集足夠的數(shù)據(jù)以正確估計研究和對照眼睛的數(shù)據(jù)。在實驗前，為了找到拉曼讀數(shù)與眼組織的實際黃體素含量之間的相關性，使用裝有不同濃度黃體素的薄的石英比色杯進行校準實驗。結果lipo+光譜特征。lipo+溶液的吸光度和熒光光譜首先在本研究中提出以確定雙光子激發(fā)波長。吸收光譜在300和750nm之間進行跟蹤，如圖1所示。lipo+溶液在370nm處顯示吸收峰，并將其用作激發(fā)波長以追蹤480nm與650nm之間的lipo+熒光光譜(圖2)。lipo+顯示兩個熒光帶峰：500-530nm和540-570nm?；谶@些結果，為雙光子實驗選擇的濾波器(filter)為550/88。lipo+物理特性。在離子電滲測試之前還測定了粒徑和ζ電位以確定lipo+正電荷和大小。這些測定針對在蒸餾水中1:50lipo+稀釋液分別通過動態(tài)光散射和電泳進行，并與不含黃體素的脂質體溶液(作為對照)進行比較。根據(jù)圖3，lipo+聚集峰在3.5μm(平均)，并且在300nm(平均)也觀察到較小的峰，表示各個脂質體。此外，ζ電位測定顯示針對lipo+溶液的+5mv電荷。離子電滲施用后尸體眼中黃體素分布。雖然為雙光子實驗選擇的濾波器是550/88(基于以前的熒光實驗)，黃體素脂質體制劑的初步分析顯示525/20濾波器在snr方面給出了更好的結果。在這種初始校準(0.005、0.002和0.001％的lipo+稀釋在0.9％nacl中)，觀察到脂質體為球形囊泡，并且顯微鏡被正確校準(數(shù)據(jù)未顯示)。這是一個非常重要的對照，因為視網膜色素細胞充滿了黑色素(一種以與黃體素相同的波長激發(fā)的色素)。此外，通過這種對照，我們能夠區(qū)分黃體素脂質體和色素。為了評估在離子電滲施用后在人眼中攜帶黃體素的脂質體的分布，將五只尸體眼睛暴露于角膜/鞏膜中2.5ma的電流5分鐘，靜置80分鐘(控制眼內壓為15mm汞柱)，并且收集眼睛的不同結構：角膜、鞏膜、脈絡膜、外周和中央視網膜。通過雙光子顯微鏡(在835nm激發(fā))評價脂質體的分布。使用第六只尸體眼睛作為對照：所述眼睛從未與脂質體制劑接觸。在這種情況下，當835nm激光打開時，沒有檢測到脂質體，表明信號對于外源黃體素是特異性的(數(shù)據(jù)未顯示)。收集的不同眼睛組織的分析顯示，組合的角膜-鞏膜離子電滲法后，黃體素在視網膜中豐富，而所有經測試的眼睛的脈絡膜組織中均未發(fā)現(xiàn)富含黃體素的脂質體。此外，根據(jù)視網膜的檢查，lipo+溶液不能穿過視網膜血管壁，因為脂質體僅在血管周圍的組織中發(fā)現(xiàn)。對于前段(anteriorsegment)測定(鞏膜和角膜)，沒有發(fā)現(xiàn)富含黃體素的脂質體，既不在角膜基質中也不在鞏膜組織中，但在角膜上皮細胞中發(fā)現(xiàn)。在視網膜中，還可以觀察到靠近感光體的外部部分中的黃體素比視網膜內部的神經節(jié)細胞更多。由于脈絡膜分析顯示在目前施用后該區(qū)域不存在脂質體，這些結果表明通過睫狀體/平坦部(parsplana)進行離子電滲經鞏膜施用黃體素后，黃體素脂質體通過眼膜被動擴散，直至到達靠近中央凹的后視網膜。圖4顯示了眼睛內黃體素途徑的示意圖。角膜離子電滲施用后角膜組織的分析顯示脂質體位于該組織的上皮細胞之上。還進行了不同眼組織的共振拉曼光譜分析。拉曼信號疊加在可能源自內在類胡蘿卜素熒光素和脂褐素熒光的熒光背景上。為了獲得沒有背景信號的拉曼峰高的準確讀數(shù)，我們通過對于每個測量光譜的測量的拉曼線形狀的多項式擬合(高達5階)減去了光譜中可能重疊的噪聲尖峰的影響。選擇1530cm-1處c＝c雙鍵信號的最終峰高作為黃體素存在的標志。在內部鞏膜中，在受治療的眼睛中測量的1530cm-1處的拉曼峰值比對照眼睛大7倍，提供離子電滲法通過完整鞏膜將黃體素遞送至眼睛的功效的證據(jù)。在視網膜的中邊緣，在受治療的眼睛中測量的1530cm-1處的拉曼峰值比對照眼睛大1.7倍，這表明在離子電滲治療結束時大量的黃體素到達視網膜的后極。在黃斑中，在受處理的眼睛中測量的1530cm-1處的拉曼峰值比對照中的大1.3倍，表明離子電滲法在黃斑中遞送黃體素是有效的。討論年齡相關性黃斑變性(amd)是發(fā)達國家50歲以上人群不可逆轉失明的主要原因40,41。有超過800萬美國人患有amd，預計在2020年該疾病的總發(fā)病率將增加超過50％37。幾個流行病學研究強調，黃體素補充導致早期amd患者的黃斑色素光密度(mpod)水平升高，其與保護免得黃斑病相關42,21。事實上，黃體素天然集中在視網膜中，在那里其與玉米黃質一起形成黃斑色素。作為藍光過濾器，黃體素可以保護黃斑中心的底層光感受器免受光化學損傷43。黃體素的抗氧化性質還可以保護黃斑免受氧化應激44。緩慢amd進展的可用解決方案是基于眼內注射或手術，其包括已被證實的副作用和可能的并發(fā)癥，如視網膜脫離、眼內壓增加以及非傳染性和傳染性炎癥23,33。在這項工作中，我們使用黃體素的微創(chuàng)原位遞送到人眼的后段。離子電滲法具有更安全和更簡單方法的優(yōu)勢，使患者依從并促進高濃度的感興趣的產品通過不同眼睛層直到其到達視網膜。不同的報告已經確定了使用眼部離子電滲法治療不同疾病(如干眼癥、非感染性葡萄膜炎和圓錐角膜)的重復治療的安全性14,15,25,26,28,29。在這里，使用尸體眼睛作為臨床前模型，我們施用弱電流推動黃體素進入眼睛，沒有副作用。我們觀察到黃體素脂質體主要沉積在中央凹附近的外周和中央視網膜中，但在脈絡膜區(qū)域不存在。通過這種觀察，可以在通過睫狀體/平坦部、隨后被動擴散通過眼膜直至到達后視網膜區(qū)域的經鞏膜施用之后外推黃體素的途徑(圖4)。我們首次證明經鞏膜的離子電滲法是將黃體素置入人眼視網膜的有效途徑，為加強黃斑色素提供了新的途徑。沉積在后部區(qū)域時，假定黃體素能夠通過被動擴散/蛋白質梯度到達感光體存在的視網膜的外部部分。可以認為在脈絡膜中沒有觀察到黃體素的原因是由于神經視網膜屏障，其網眼大小為80-90nm45(脂質體尺寸為341nm，有時可形成2-3μm的簇，表明黃體素脂質體保持被限制在視網膜中)(圖4)。重要的是，共振拉曼光譜分析顯示離子電滲后黃斑中的黃體素濃度增加。這一觀察清楚地表明經鞏膜的離子電滲法是一種有效的將黃體素遞送到黃斑的方法，并且是一種用于預防amd發(fā)病、阻止其發(fā)展和/或治療已形成的疾病的當前方法的有效替代方法。在施用角膜離子電滲法后，角膜基質中不存在脂質體。這個事實可以被解釋為因為黃體素是疏水性的，基質的70％是由水組成，因此非常親水46，這使得黃體素不可能穿透入該組織。前面的描述和附圖包括本發(fā)明的說明性實施例。前述實施例和本文描述的方法可以基于本領域技術人員的能力、經驗和偏好而變化。僅以一定順序列舉方法的步驟不構成對該方法的步驟的順序的任何限制。前面的描述和附圖僅僅解釋和說明本發(fā)明，并且本發(fā)明不限于此，除非權利要求如此限制。本領域技術人員獲得其前面的公開內容將能夠在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下進行修改和變化。參考文獻1.kijlstraa.,tiany.,kellye.r.,berendschott.t.2012.lutein:morethanjustafilterforbluelight.progretineyeres.31:303-315.2.yemelyanova.y.,katzn.b.,bernsteinp.s.2001.ligand-bindingcharacterizationofxanthophyllcarotenoidstosolubilizedmembraneproteinsderivedfromhumanretina.expeyeres.72:381-392.3.boner.a.,landrumj.t.,guerral.h.,ruizc.a.2003.luteinandzeaxanthindietarysupplementsraisemacularpigmentdensityandserumconcentrationsofthesecarotenoidsinhumans.jnutr.133:992-998.4.landrumj.t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