本發(fā)明涉及一種具有降低的免疫抑制活性但維持神經再生活性的FK506衍生物、其制備方法、以及包含其的用于預防或治療神經系統(tǒng)疾病的藥物組合物。

背景技術：

FK506，也稱為他克莫司或藤霉素，是一種23元大環(huán)內酰胺，并且可以從鏈霉菌屬(Streptomyces tsukubaensis)中分離。已知FK506及其類似的藥物與細胞質的抑免蛋白(通常稱為FK506結合蛋白(FKBP))相互作用以修飾若干生物化學反應(Kang,C.B.等,Neurosignals 2008)。

特別地，F(xiàn)K506在臨床上防止同種異體移植排斥(Kino,H.等,J.Antibiot.1987；Kino,H.等,J.Antibiot.1987；Fung,J.J.等,Transplantation 2004)并作為用于治療自身免疫疾病(例如特應性)的免疫抑制劑使用(Parsons,W.H.等,Ann.N.Y.Acad.Sci.1993)。FK506是T細胞受體信號傳導中的重要成分并抑制能抑制T淋巴細胞活性的鈣調神經磷酸酶的活性。

在FK506的免疫抑制活性機制的特定研究中，F(xiàn)K506的化學結構可以分為兩個區(qū)域：結合至鈣調神經磷酸酶的效應區(qū)(Goulet,M.T.等,Perspect.Drug Discov.1994；Parsons,W.H.等,Ann.N.Y.Acad.Sci.1993；Griffith,J.P.等,Cell 1995)和與FKBP形成復合物的結合位點。FKBP結合位點包含哌啶酸酯部分、三羰基和環(huán)己烷環(huán)，并且在與FKBP12蛋白的復合物形成中起重要作用。這允許剩余的效應區(qū)自由地結合鈣調神經磷酸酶從而形成三重復合物。

為了發(fā)揮上述免疫抑制作用，重要的是FK506首先結合FKBP12蛋白。一旦形成兩部分復合物，則該復合物可以與鈣調神經磷酸酶相互作用(Goulet,M.T.等,Perspect.Drug Discov.1994；Parsons,W.H.等,Ann.N.Y.Acad.Sci.1993)。FK506-FKBP復合物與鈣調神經磷酸酶的相互作用抑制由T細胞增殖介導的白細胞介素-2，導致免疫抑制作用。

FK506由雜合PKS/NRPS(聚酮合酶/非核糖體肽合成酶)系統(tǒng)合成。使用從分支酸鹽衍生的DHCHC(4,5-二羥基環(huán)己-1-烯羧酸)作為起始材料進行生物合成過程，其中DHCHC通過使用兩分子丙二酰輔酶A、兩分子甲氧基丙二酰基-酰基載體蛋白(ACP)、五分子甲基丙二酰輔酶A和一分子烯丙基丙二酰輔酶A的10步縮合延伸(Andexer,J.N.等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2011；Mo,S.J.等,J.Am.Chem.Soc.2011)。通過FkbL作用從賴氨酸衍生的哌啶酸酯通過NRPS KfbL與線性聚酮化物鏈縮合并環(huán)化以產生大環(huán)內酯環(huán)。該環(huán)通過后PKS修飾過程進一步修飾，例如由FkbM(S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性甲基轉移酶)導致的C-31上的氧甲基化或由FkbD(P450羥化酶)在C-9上的氧化反應(Motamedi,H.等,J.Bacteriol.1996；Shafiee,A.等,J.Antibiot.1997)。

最近，本發(fā)明人已經確定，后PKS修飾途徑包括通過表征所有FK506生物合成中間體的兩個獨立的平行途徑(Ban,Y.H.等,J.Nat.Prod.2013)。

除了上述免疫抑制活性之外，已報道FK506或其衍生物具有抗真菌(Nakagawa,H.等,Clin.Drug Invest.1996)、抗炎癥(Migita,K.等,Curr.Med.Chem.2003)、以及神經保護和神經再生作用(Gold,B.G.Expert Opin.Invest.Drugs 2000；Gold,B.G.等,J.Pharmacol.Exp.Ther.1999)。然而，盡管具有上述藥理活性，但FK506或其衍生物具有免疫抑制活性，從而導致問題，例如難以用于需要免疫反應的一般患者。

技術實現(xiàn)要素：

[技術問題]

在這種情況下，本發(fā)明人的深入研究努力旨在確定PKS變形后參與途徑的FK506的幾個特征，導致證實了一種通過FK506生物合成基因的失活制備9-脫氧-脯氨酰-FK506(9-脫氧-脯氨酰-FK506)、一種新型FK506衍生物的方法，并發(fā)現(xiàn)作為9-脫氧-脯氨酰-FK506、31-O-脫甲基-FK506(31-O-脫甲基-FK506)或9-脫氧-31-O-脫甲基FK506(9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506)的FK506衍生物具有降低的免疫抑制活性并具有神經再生和保護作用，因此可用于治療神經系統(tǒng)疾病。

[技術方案]

本發(fā)明的主要目的是提供一種用于預防或治療神經系統(tǒng)疾病的藥物組合物，其包含選自31-O-脫甲基-FK506、9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506或9-脫氧-脯氨酰-FK506中的一種或多種FK506衍生物，具有降低的免疫抑制活性。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備9-脫氧-脯氨酰-FK506的方法，包括培養(yǎng)其中fkbD基因失活的鏈霉菌菌株的步驟。

本發(fā)明的另一個目的是提供9-脫氧-脯氨酰-FK506、其異構體或其藥學上可接受的鹽。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于促進神經再生的組合物，其具有降低的免疫抑制活性，包含選自31-O-脫甲基-FK506、9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506或9-脫氧-脯氨酰-FK506中的一種或多種FK506衍生物。

[本發(fā)明的有利效果]

根據本發(fā)明的包含9-脫氧-脯氨酰-FK506、31-O-脫甲基-FK506或9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506的組合物具有降低的免疫抑制活性，可以促進神經再生并減少治療神經系統(tǒng)疾病的副作用。

附圖說明

圖1是顯示從通過fkbD基因的框內缺失而失活的菌株(ΔfkbD_框內)獲得的9-脫氧-脯氨酰-FK506的HPLC ESI-MS分析結果的圖。

圖2是9-脫氧-脯氨酰-FK506的ESI-MS/MS分析的結果，其中(A)顯示ESI-MS/MS片段的圖譜，(B)顯示MS/MS光譜。

圖3a和3b是溶于CDCl₃中的9-脫氧-脯氨酰-FK506的NMR波譜，圖3a是¹H NMR波譜，圖3b是¹³C NMR波譜。

圖4是溶于CDCl₃中的9-脫氧-脯氨酰-FK506的HSQC波譜。

圖5a至5c是9-脫氧-脯氨酰-FK506的COSY和HMBC分析的結果，其中圖5a顯示上述化合物的COSY和主要HMBC相關性，圖5b顯示溶于CDCl₃中的9-脫氧-脯氨酰-FK506的COSY波譜，圖5c顯示溶于CDCl₃中的9-脫氧-脯氨酰-FK506的HMBC波譜。

圖6顯示9-脫氧-脯氨酰-FK506與FK506相比的免疫抑制活性。

圖7a顯示9-脫氧-脯氨酰-FK506與FK506相比的神經再生活性，圖7b顯示在用9-脫氧-脯氨酰-FK506處理的PC12細胞上生長的神經突。

圖8顯示31-O-脫甲基-FK506與FK506相比的免疫抑制活性。

圖9a顯示31-O-脫甲基-FK506與FK506相比的神經再生活性，圖9b顯示在用31-O-脫甲基-FK506處理的PC12細胞上生長的神經突。

圖10顯示9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506與FK506相比的免疫抑制活性。

圖11a顯示9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506與FK506相比的神經再生活性，圖11b顯示在用9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506處理的PC12細胞上生長的神經突。

具體實施方式

為了實現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供由式2表示的9-脫氧-脯氨?；?FK506(其是由式1表示的FK506的新型衍生物)、其異構體、或其藥學上可接受的鹽。

[式1]

[式2]

為了實現(xiàn)上述目的，另一方面，本發(fā)明提供一種制備9-脫氧-脯氨酰-FK506的方法。

作為一個實施方式，上述制備方法可以包括培養(yǎng)其中缺失fkbD(P450羥化酶)基因的鏈霉菌菌株的步驟。已知在后PKS修飾中起作用的FkbD酶在C-9處導致氧化反應，但是從未報道過FkbD酶與脯氨?；南嚓P性。

作為另一個實施方式，上述制備方法可以還包括將通過使用乙酸乙酯離心分離fkbD基因缺失菌株的培養(yǎng)液而獲得的上清液進行分配并通過使用60％甲醇水溶液的制備型反相HPLC進行分段的步驟。作為另一個實施方式，在分段步驟后可以還包括使用50％乙腈的半制備型反相HPLC的步驟。

此外，用于制備9-脫氧-脯氨酰-FK506的菌株可以是能夠在生物體內部產生FK506的鏈霉菌的菌株。例如，菌株可以選自鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)KCTC11604BP、鏈霉菌屬(Streptomyces kanamyceticus)KCTC9225、鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)ATCC55098、鏈霉菌屬(Streptomyces tsukubaensis)No.9993、鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)ATCC53770、鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)6260、鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)49A、鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)94128、鏈霉菌屬(Streptomyces glaucescens)MTCC5115和鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)BICC7522，但不限于此，只要可以制備FK506即可。

菌株可以在含有微生物可利用的營養(yǎng)源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。作為菌株的營養(yǎng)源，可以使用但不限于本領域的常規(guī)營養(yǎng)源，例如含有丙二酸、乙醇、甲硫氨酸和碳氮源的培養(yǎng)基。

本發(fā)明人使用化學物理分析鑒定了制備的物質為9-脫氧-脯氨酰-FK506(FK506的新型衍生物)，其通過雙交換同源重組產生的框內缺失使鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)KCTC11604BP的fkbD基因失活。

分析的9-脫氧-脯氨酰-FK506的化學物理特性如下：(a)無定形白色粉末；(b)旋光率：[α]²³_D＝1.64(c＝0.1，甲醇)；(c)UV吸收光譜(甲醇)：λ_max為(log e)227nm(2.0)；(d)IR吸收光譜(膜)：ν_max 3450，2960，1750，1640，1170，1050cm^-1；(e)¹H和¹³C-NMR，參見表1；(f)(+)-ESI-MS：m/z 793.1[M+NH₄]⁺；(+)-MS/MS：m/z 776.1，758.1，740.1，547.9；(+)-HR-ESI-MS：m/z 776.4940[M+H]⁺；和(g)分子式和分子量：C₄₃H₇₀NO₁₁，776.4949。

作為具體的實施方式，本發(fā)明的化合物可以包含異構體或其藥學上可接受的鹽。

異構體是指具有相同化學式的不同化合物，并且作為實例可以包括9-脫氧-脯氨酰-FK506的結構異構體、幾何異構體、光學異構體(對映異構體)、立體異構體或非對映異構體。

藥學上可接受的鹽可以是具有對患者相對無毒的濃度、無害的有效作用和不降低9-脫氧-脯氨酰-FK506的有益作用的副作用的任何有機或無機酸加成鹽。例如，該鹽可以是由藥學上可接受的游離酸形成的酸加成鹽。酸加成鹽可以通過常規(guī)方法制備，即將化合物溶于過量的酸水溶液中，并使用水混溶有機溶劑例如甲醇、乙醇、丙酮或乙腈沉淀該鹽。該鹽也可以通過加熱酸或醇(例如，乙二醇單甲醚)的水溶液和等摩爾化合物，然后通過蒸發(fā)或抽濾沉淀的鹽以干燥該化合物來制備。有機或無機酸可用作游離酸。藥學上可接受的鹽可以是使用堿制備的藥學上可接受的金屬鹽。

作為另一個具體實施方式，本發(fā)明的化合物可以是處于本發(fā)明范圍內的溶劑合物或前藥的形式。溶劑合物可優(yōu)選地包括水合物或乙醇溶劑合物。

本發(fā)明的化合物可以根據本領域中的常規(guī)方法合成。例如，可以使用本發(fā)明的制備方法由變體制備化合物。

為了實現(xiàn)上述目的，另一方面，本發(fā)明提供用于預防或治療神經系統(tǒng)疾病的藥物組合物，其包含選自9-脫氧-脯氨酰-FK506、由下式3表示的31-O-脫甲基-FK506和由下式4表示的9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506中的一種FK506衍生物。

[式3]

[式4]

由于FK506是T細胞受體信號傳導中的重要酶，并抑制能抑制T淋巴細胞活性的鈣調神經磷酸酶的活性，因此其用作臨床預防同種異體移植排斥和治療自身免疫疾病(例如特應性)的免疫抑制劑。除了免疫抑制活性之外，已經報道FK506具有抗真菌、抗炎、神經保護和神經再生作用。然而，盡管具有藥理活性，但由于免疫抑制活性，因此存在著難以用于需要免疫反應的一般患者的問題。

用9-脫氧-脯氨酰-FK506、31-O-脫甲基-FK506或9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506處理CD3/CD28激活的人T細胞的結果，本發(fā)明人證實了白細胞介素-2的分泌顯著增加以達到正常水平。還證實了FK506衍生物顯示出優(yōu)異的神經再生活性。因此，根據本發(fā)明的藥物組合物可以顯示對神經系統(tǒng)疾病的治療效果，而沒有免疫抑制活性。

作為一個實施方式，神經系統(tǒng)疾病可以是神經變性疾病。神經變性疾病是指以中樞神經系統(tǒng)神經元的退化變化為特征的疾病，引起幾種癥狀，例如癡呆、阿爾茨海默氏病、帕金森病、進行性核上性麻痹、多系統(tǒng)萎縮、橄欖體腦橋小腦萎縮(OPCA)、Shy-Drager綜合征：紋狀體黑質變性、亨廷頓病、肌萎縮性側索硬化(ALS)、特發(fā)性震顫、皮質基底神經節(jié)變性、彌漫性路易體病、關島的帕金森-ALS-癡呆復合體或皮克氏病。

作為另一個實施方式，神經系統(tǒng)疾病可以包括癲癇、麻痹、中風、缺血性腦疾病、脊髓損傷疾病、周圍神經疾病、行為障礙、發(fā)育障礙、智力遲鈍、唐氏綜合征或精神分裂癥，但不限于此。

作為另一個實施方式，神經系統(tǒng)疾病可以是由神經元損傷或細胞死亡引起的疾病。

本發(fā)明人證實了9-脫氧-脯氨酰-FK506、31-O-脫甲基-FK506或9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506促進PC12細胞中的神經突生長并誘導神經再生，因此可用于促進神經再生或用于預防或治療神經系統(tǒng)疾病。

如本文所用，術語“預防”可以指通過將根據本發(fā)明的用于預防或治療神經系統(tǒng)疾病的組合物施用于受試者來抑制或延緩神經系統(tǒng)疾病發(fā)作的所有作用。

如本文所用，術語“治療”可以指通過將本發(fā)明的組合物施用于疑似發(fā)生神經系統(tǒng)疾病的受試者來改善或緩解神經系統(tǒng)疾病的癥狀的所有作用。

本發(fā)明的藥物組合物可以作為單一制劑或通過另外含有使用藥學上可接受的載體或者賦形劑配制的單位劑型的已公知對神經元疾病具有治療效果的藥物而制備的組合制劑，或包封在多劑量容器中。

如本文所用，術語“藥學上可接受的載體”可以指不抑制待引入受試者的化合物的生物活性和性質而不刺激受試者的載體或稀釋劑。可用于本發(fā)明的載體的類型沒有特別限制，可以使用任何載體，只要其是本領域通常使用的藥學上可接受的載體即可。載體的非限制性實例可以包括生理鹽水、無菌水、林格氏溶液、緩沖鹽水、白蛋白注射溶液、葡萄糖溶液、麥芽糖糊精溶液、甘油和乙醇。載體可以單獨使用或以兩種或更多種的組合使用，并且可以包括非天然存在的載體。

此外，如果需要，可以加入其它常規(guī)添加劑，例如抗氧化劑、緩沖劑和/或抑菌劑，并且還可以加入稀釋劑、分散劑、表面活性劑、粘合劑或潤滑劑以用于可注射制劑，例如，水溶液、懸浮液和乳液；丸劑；膠囊劑；顆粒劑；或片劑。

此外，本發(fā)明的藥物組合物可以含有藥學有效量的9-脫氧-脯氨酰-FK506、31-O-脫甲基-FK506或9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506。如本文所用，術語“藥學有效量”是指足以以適用于醫(yī)學治療的合理的利益/風險比治療疾病的量，并且化合物通?？梢砸?.001至1000mg/kg、優(yōu)選地0.05至200mg/kg、更優(yōu)選地0.1至100mg/kg的量每天單劑量或多劑量施用。然而，對于本發(fā)明的目的，優(yōu)選根據所需反應的類型和程度、是否在一些情況下使用其它制劑、具體組合物、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、給藥時間和途徑、組合物的分泌速率、治療周期、以及同時或與特定組合物組合使用的藥物、以及其它在制藥領域中公知的各種因素和類似因素來給予特定患者特定治療有效量。

本發(fā)明的藥物組合物可以作為獨立的治療劑或與其它治療劑組合施用，并且與常規(guī)治療劑相繼或同時施用。本發(fā)明的藥物組合物可以作為單劑量或多劑量施用。重要的是根據所有上述因素進行施用，使得可以以最小量獲得最大效果而沒有任何副作用，并且組合物可以容易地由本領域普通技術人員確定。

如本文所用，術語“施用”是指以適當?shù)姆绞綄⒈景l(fā)明的藥物組合物引入患者。本發(fā)明的組合物可以通過能夠將組合物遞送至靶組織的口服或各種腸胃外途徑施用。

對施用根據本發(fā)明的藥物組合物的方法沒有特別限制，并且可以遵循本領域中常規(guī)使用的方法。作為給藥方法的非限制性實例，組合物可以以口服或腸胃外途徑給藥。根據預期的給藥方法，根據本發(fā)明的藥物組合物可以配制成各種劑型。

本發(fā)明的藥物組合物可以例如以1至20mg/kg、優(yōu)選地1至10mg/kg的量施用于包括人的哺乳動物。對組合物的給藥頻率沒有特別限制，并可以是每天一次或數(shù)次。

作為實現(xiàn)上述目的的另一方面，本發(fā)明提供用于促進神經再生的具有降低的免疫抑制活性的組合物，其包含選自31-O-脫甲基-FK506、9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506和9-脫氧-脯氨酰-FK506中的一種或多種FK506衍生物。

作為實例，組合物可以用作促進體外神經突生長的組合物。

為了實現(xiàn)上述目的，另一方面，本發(fā)明提供用于預防或治療神經系統(tǒng)疾病的方法，包括向受試者施用用于加速神經再生的組合物的步驟。

如本文所用，術語“受試者”可以指所有動物，包括其中已經開展或可能發(fā)展神經系統(tǒng)疾病的人。動物不僅可以是人，還可以是需要治療相似癥狀的牛、馬、羊、豬、山羊、駱駝、羚羊、狗、貓和其它哺乳動物，但不限于此。

本發(fā)明的預防或治療方法可以具體包括以藥學有效量將組合物施用于已經發(fā)展或正在發(fā)展神經系統(tǒng)疾病的風險的受試者的步驟。

如本文所用，術語“施用”是指以任何適當?shù)姆绞綄⒈景l(fā)明的藥物組合物引入患者，并且只要該組合物可以遞送至靶組織，該組合物可以通過口服或各種胃腸外途徑施用。

實施例

在下文中，將參考以下實施例更詳細地描述本發(fā)明。然而，這些實施例僅用于說明的目的，并且本發(fā)明不受這些實施例的限制。

實施例1.材料制備方法和條件

(1)變體和培養(yǎng)條件的構建

根據Ban,Y.H.等人公開的制備方法(J.Nat.Prod.2013,76,1091-1098)，通過雙交換同源重組產生的框內缺失來滅活鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)KCTC11604BP的fkbD基因，以制備ΔfkbD_框內菌株。

將KCTC11604BP菌株的孢子和fkbD基因缺失的ΔfkbD_框內在ISP4-瓊脂板上傳代培養(yǎng)，并在R2YE培養(yǎng)基中制備種子培養(yǎng)物。將在種子培養(yǎng)物中生長6天的50mg營養(yǎng)細胞接種到包含在250mL帶擋板燒瓶中的50mL R2YE培養(yǎng)基中，然后在定軌搖床(固定在180rpm)中在28℃下溫育6天。

(2)提取和分離

將4L的ΔfkbD_框內菌株的培養(yǎng)肉湯離心分離，并將上清液用乙酸乙酯進行溶劑-溶劑分配兩次。分離溶于乙酸乙酯中的層并在減壓下蒸發(fā)以得到深紅色提取物。通過制備型反相HPLC使用60％甲醇水溶液作為流動相以2mL/min的流速對提取物進行分級，然后進行HPLC-ESI-MS分析。

在Waters/Micromass Quattro micro MS界面上記錄使用ACQUITY UPLC BEH C18柱(50×2.1mm，1.7μm；Waters)的HPLC-ESI-MS/MS光譜，其由直接連接到Micromass Quattro微型MS的Waters 2695分離模塊組成。

通過在多反應監(jiān)測模式下操作的MS/MS進行追蹤，其中選擇對于所選分析物特異性的質量對，以檢測從母離子例如銨加合物到產物離子的轉變。

為了將級分分離成兩個亞級分，還以2mL/min的流速和50％乙腈水溶液作為流動相進行半制備型反相HPLC。在相同柱和HPLC條件下純化亞級分的結果是獲得無定形白色粉末(7.4mg，t_R 90分鐘)。

(3)數(shù)據測量方法

使用Jasco P-1010旋光計，使用具有0.1dm路徑長度的池測量旋光度。

用Scinco S-3100分光光度計記錄UV光譜，并在Varian FTS-800FTIR光譜儀上獲得IR光譜。

使用在500MHz操作的Varian INOVA 500譜儀(¹³C，125MHz)記錄NMR波譜1小時。使用四甲基硅烷(TMS)作為內標，以ppm表示化學位移。將Mnova軟件(Mestrelab Research S.L.)用于處理所有NMR數(shù)據。通過將純化合物溶解在250μL的CDCl₃(Sigma)中，然后將溶液置于對應于溶劑的5mm Shigemi Advanced NMR微管(Sigma)中，從而制備用于NMR分析的樣品。

使用與UPLC聯(lián)接的Waters SYNAPT G2質譜儀收集HR-ESI-MS數(shù)據。在Acme 9000HPLC系統(tǒng)(YL Instrument Co.Ltd.，韓國)上使用半分離Watchers 120ODS-BP(250×10mm，5μm)進行HPLC純化，所述HPLC系統(tǒng)由與UV 730D UV檢測器組(205nm)連接的SP930D梯度泵和CTS 30柱溫箱組(50℃)組成。用于實驗的HPLC級溶劑購自J.T.Baker。

實施例2：觀察實施例1的結果

無定形白色固體分析的結果如下。

(1)HPLC-ESI-MS

圖1是ΔfkbD_框內菌株的培養(yǎng)物提取物的HPLC-ESI-MS分析的結果，其中銨加合物離子峰于13分鐘在m/z 793.1處和于28分鐘在m/z 807.1處洗脫。因此，基于776.1、758.1、740.1和547.9處的碎片離子，預測于13分鐘在m/z 793.1洗脫的峰為9-脫氧-脯氨酰-FK506，如圖2中所示。9-脫氧-脯氨酰-FK506的斷裂模式類似于9-脫氧-FK506的斷裂模式在于每個碎片離子之間的距離為14Da。特征C-1-C-24碎片離子出現(xiàn)在9-脫氧-FK506中的m/z 561.9處，而本發(fā)明的9-脫氧-脯氨酰-FK506的離子峰用m/z 547.9處的離子峰表示。這意味著9-脫氧-脯氨酰-FK506在特征C-1-C-24碎片中比9-脫氧-FK506和其它9-脫氧-FK506衍生物少一個亞甲基。

因此，假定無定形白色固體(即9-脫氧-脯氨酰-FK506)含有脯氨酸。

(2)1D-和2D-NMR

[表1]

1D和2D-NMR數(shù)據

如上表1和圖3a中所示，¹H NMR波譜分析的結果是觀察到FK506骨架的特征信號：對應于甲基的三個雙峰(δ_H 0.95/H₃-38、0.90/H₃-41和0.75/H₃-39)；兩個甲基單峰(δ_H1.67/H3-40和1.66/H3-42)；三個甲氧基單峰(δ_H 3.40/H3-45、3.37/H3-43和3.36/H3-44)；和烯烴質子的多重峰(δ_H 5.70/H-36)。

此外，如圖3b中所示，¹³C NMR波譜分析的結果是考慮到來自¹³C NMR波譜的42個碳信號和來自HMBC波譜的一個羰基碳，預期化合物總共具有43個碳。然而，仔細比較化合物(9-脫氧-脯氨酰-FK506)的NMR數(shù)據與9-脫氧-FK506的NMR數(shù)據表明，對應于9-脫氧-FK506的哌啶酸酯部分(C-2-C-6)的化合物的信號轉移。

此外，圖4中對所得化合物的上述¹H和¹³C波譜和HSQC波譜的分析示出了在δ_C58.9/C-2(δ_H 4.35/H-2)、47.4/C-6(δ_H 3.63/H-6a，3.54/H-6b)、29.2/C-3(δ_H 2.19/H-3a，1.98/H-3b)和24.7/C-4(δ_H 1.96/H2-4)處的四個碳信號，證實了化合物中脯氨酸部分的存在，而不是哌啶酸酯。

通過COZY和HMBC分析證實了化合物的脯氨酸部分的存在，如圖5a至5c中所示。在δ_H 4.35至δ_H 3.54的范圍內的COSY交叉峰提供H-2/H-3/H-4/H-6連通性。此外，觀察到δ_H4.35/H-2、2.19/H-3a和1.98/H-3b處的質子信號與δ_C 169.9/C-1處的羰基酯碳信號之間以及δ_H 3.63/H-6a和3.54/H-6b處的質子信號與δ_C 58.9/C-2和29.2/C-3處的碳信號之間的關鍵HMBC相關性。

圖4中的HSQC光譜顯示δ_H 2.64(d，J＝15Hz)和2.56(d，J＝15Hz)處的質子信號與δ_C39.2處的碳信號相關。這些質子信號顯示了與C-8(δ_C 171.8)和C-10(δ_C 98.6)的HMBC相關性(圖5a和5c)，表明該化合物是類似于9-脫氧-FK506的9-脫氧-FK506衍生物。

同時，化合物的COSY波譜顯示剩余的4個自旋系統(tǒng)，其基于HMBC相關性連接(圖5a至5c)?；谙鄬MBC相關性確定甲基和甲氧基的位置，如圖5a中所示。

因此，確定該化合物為9-脫氧-脯氨酰-FK506，本發(fā)明人首次揭示了含有脯氨酸部分而不是普通哌啶酸酯環(huán)的9-脫氧-FK506衍生物。此外，該化合物的立體化學與母體化合物FK506的立體化學相同。

(3)HR-ESI-MS

無定形白色固體的HR-ESI-MS分析的結果是：在m/z 776.4940處獲得[M+H]⁺離子，其與分子式C₄₃H₇₀NO₁₁(計算的m/z 776.4949)一致。

(+)-ESI-MS

m/z 793.1[M+NH₄]⁺；(+)-MS/MS：m/z 776.1，758.1，740.1，547.9

(+)-HR-ESI-MS

m/z 776.4940[M+H]⁺(對C₄₃H₇₀NO₁₁的計算值：776.4949)。

基于上述結果，在通過鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)KCTC11604BP的fkbD基因的框內缺失而失活的菌株的培養(yǎng)肉湯中分離的無定形白色粉末具有如下的化學物理特性，并因此已經鑒定為9-脫氧-脯氨酰-FK506。

(a)無定形白色粉末；

(b)旋光率：[α]²³_D＝1.64(c＝0.1，甲醇)；

(c)UV吸收光譜(甲醇)：λ_max(log e)227nm(2.0)；

(d)IR吸收光譜(膜)：ν_max 3450，2960，1750，1640，1170，1050cm^-1；

(e)¹H和¹³C-NMR波譜(參見表1)；

(f)(+)-ESI-MS：m/z 793.1[M+NH₄]⁺；

(+)-MS/MS：m/z 776.1，758.1，740.1，547.9；

(+)-HR-ESI-MS：m/z 776.4940[M+H]⁺；

(g)分子式和分子量：C₄₃H₇₀NO₁₁，776.4949。

實施例3. 9-脫氧-脯氨酰-FK506活性的分析

(1)體外T細胞活性的分析

如Mo,S.J.等人(J.Am.Chem.Soc.2011,133,976-985)中描述那樣，使用T淋巴細胞測定化合物與真實FK506相比的相對免疫抑制性質。簡單地，在用CD3/CD28激活的人T細胞處理該化合物(0.1nM)后，用該化合物定量白細胞介素-2分泌物16-20小時。

結果如圖6中所示，當用FK506處理CD3/CD28激活的人T細胞時，白介素-2分泌減少與CD3/CD28失活的人T細胞一樣多的數(shù)目，從而增加免疫抑制活性。相反地，當用根據本發(fā)明的9-脫氧-脯氨酰-FK506(標記為1)處理CD3/CD28激活的人T細胞時，白細胞介素-2分泌顯著增加以到達正常組的分泌，表現(xiàn)出與母離子FK506及其衍生物的免疫抑制活性相反的結果。

(2)神經再生活性的分析

通過Mo,S.J.等人描述的方法(J.Am.Chem.Soc.2011,133,976-985)，使用大鼠嗜鉻細胞瘤細胞(PC12)測定化合物與真正的FK506相比的相對神經再生活性。PC12細胞用誘導神經突增生的神經生長因子(NGF；KOMA Biotech；10ng/mL)處理96小時。將10nM的FK506或9-脫氧-脯氨酰-FK506一起處理或排除。通過Revill,W.P.等人描述的方法(J.Pharmacol.Exp.Ther.2002,302,1278-1285)在照片上測量神經突長度。

結果如圖7a和7b中所示，根據本發(fā)明的9-脫氧-脯氨酰-FK506(標記為1)顯示出對神經突增生促進的優(yōu)異效果。在圖7b中，A是指未處理的細胞，B是指僅用神經生長因子處理的細胞，C是指在FK506存在下用神經生長因子處理的細胞，并且D是指在9-脫氧脯氨酰-FK506存在下用神經生長因子處理的細胞。

免疫抑制和神經再生活性通過不同的機制產生，即通過FKBP12或FKBP52的復合物(Gold,B.G.Expert Opin.Invest.Drugs 2000,9,2331-42)。因此，由于與FKBP12形成二元復合物的能力降低而引起的免疫抑制活性的喪失不抑制FKBP52復合物的形成，因此可以維持神經再生活性。這同樣適用于下面的31-O-脫甲基-FK506和9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506。

實施例4. 31-O-脫甲基-FK506活性的分析

(1)T細胞的體外活性分析

使用與實施例3.(1)相同的方法測定31-O-脫甲基-FK506與真實FK506相比的相對免疫抑制性質。

結果如圖8中所示，當用FK506處理CD3/CD28激活的人T細胞時，白細胞介素-2分泌減少與CD3/CD28失活的人T細胞一樣多的數(shù)目，從而增加免疫抑制活性。相反地，當用根據本發(fā)明的31-O-脫甲基-FK506(標記為2)處理CD3/CD28激活的人T細胞時，白細胞介素-2分泌的水平顯著增加以達到正常組的分泌，表現(xiàn)出與母體分子FK506及其衍生物的免疫抑制活性相反的結果。

(2)神經再生活性的分析

使用與實施例3.(2)相同的方法測定31-O-脫甲基-FK506與真實FK506相比的相對神經再生性質。

結果如圖9a和9b中所示，根據本發(fā)明的31-O-脫甲基-FK506(標記為2)顯示出對神經突增生促進的優(yōu)異效果。圖9b中，A是指未處理的細胞，B是指僅用神經生長因子處理的細胞，C是指在FK506存在下用神經生長因子處理的細胞，并且D是指在31-O-脫甲基-FK506存在下用神經生長因子處理的細胞。

實施例5. 9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506活性的分析

(1)T細胞的體外活性分析

使用與實施例3.(1)相同的方法測定31-O-脫甲基-FK506與真實FK506相比的相對免疫抑制性質。

結果如圖10中所示，當用FK506處理CD3/CD28激活的人T細胞時，白細胞介素-2分泌減少與CD3/CD28失活的人T細胞一樣多的數(shù)目，從而增加免疫抑制活性。相反地，當用根據本發(fā)明的9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506(標記為3)處理CD3/CD28激活的人T細胞時，白細胞介素-2分泌的水平顯著增加以到達正常組的分泌，表現(xiàn)出與母體分子FK506及其衍生物的免疫抑制活性相反的結果。

(2)神經再生活性的分析

使用與實施例3.(2)相同的方法測定9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506與真實FK506相比的相對神經再生性質。

結果如圖11a和11b中所示，根據本發(fā)明的9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506顯示出對神經突增生促進的優(yōu)異效果。在圖11中，A是指未處理的細胞，B是指僅用神經生長因子處理的細胞，C是指在FK506存在下用神經生長因子處理的細胞，并且D是指在9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506存在下用神經生長因子處理的細胞。

因此，根據本發(fā)明的包含9-脫氧-脯氨酰-FK506、31-O-脫甲基-FK506或9-脫氧-31-O-脫甲基-FK506的組合物具有降低的免疫抑制活性，可以促進神經再生并減少治療神經系統(tǒng)疾病中的副作用。

根據前述內容，本發(fā)明所屬領域的技術人員將能夠理解，在不改變本發(fā)明的技術概念或本質特征的情況下，本發(fā)明可以以其它具體形式實施。在這點上，本文中公開的示例性實施方式僅用于說明性目的，而不應被解釋為限制本發(fā)明的范圍。相反地，本發(fā)明旨在不僅涵蓋示例性實施方式，而且涵蓋由所附權利要求限定的本發(fā)明的精神和范圍內可以包括的各種替代、修改、等同物和其它實施方式。

[工業(yè)實用性]

根據本發(fā)明的組合物具有降低的免疫抑制活性，可以促進神經再生并且可以用于治療神經系統(tǒng)疾病。