本專(zhuān)利申請(qǐng)要求于2014年6月5日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?2/008,178的優(yōu)先權(quán)，其整體通過(guò)引用并入本文。關(guān)于聯(lián)邦政府資助研究的聲明本發(fā)明在由國(guó)立食品和農(nóng)業(yè)研究院(NationalInstituteofFoodandAgriculture)授予的資助號(hào)2008-35204-04554的美國(guó)政府支持下完成。美國(guó)對(duì)本發(fā)明享有一定權(quán)利。序列表本申請(qǐng)包括以.txt格式電子提交的序列表。該.txt文件含有命名為“2015-05-29_5658-00264_ST25.txt”的序列表，創(chuàng)建于2015年5月31日，43,879字節(jié)大小。在該.txt文件中含有的序列表是說(shuō)明書(shū)的一部分，并據(jù)此通過(guò)引用以其整體并入本文。
背景技術(shù)：
：粘膜表面是廣闊的表面區(qū)域，其是廣泛范圍的病原體的主要入口。因此，在粘膜位點(diǎn)的適應(yīng)性免疫的介導(dǎo)是改善疫苗效力的關(guān)鍵目標(biāo)。需要誘導(dǎo)對(duì)疫苗接種應(yīng)答的快速粘膜免疫應(yīng)答的手段。疫苗接種具有成為遞送抗原的載體和在粘膜位點(diǎn)誘導(dǎo)抗原特異性的適應(yīng)性免疫應(yīng)答的巨大的潛力。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)直接的粘膜免疫是困難的，這由于幾個(gè)因素，包括在大容量粘液中粘膜疫苗的稀釋?zhuān)湎拗屏苏衬ど掀?duì)抗原的吸收。由于粘膜表面的復(fù)雜性，粘膜疫苗通常不能橫穿粘膜凝膠(mucosalgel)，而隨后被蛋白酶降解。幾種粘膜疫苗普遍用于家禽工業(yè)。然而，這些粘膜疫苗中的大多數(shù)僅能誘導(dǎo)局部IgA免疫應(yīng)答，并且一旦其通過(guò)循環(huán)擴(kuò)散，它們就不能對(duì)抗病原體。因此，需要能夠誘導(dǎo)局部粘膜和全身性的免疫應(yīng)答的新的疫苗制劑。任何粘膜疫苗設(shè)計(jì)的目的是增加免疫原性(有用的效應(yīng)機(jī)制)，而不導(dǎo)致反應(yīng)原性(炎癥、超敏反應(yīng)等)。在正在開(kāi)發(fā)的不同策略中，基于重組蛋白和合成肽的新型疫苗具有巨大的潛力。然而，這樣的抗原通常缺乏在傳統(tǒng)疫苗中使用的活減毒或完全殺死的病原體的免疫原性。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)具有高潛力以增強(qiáng)免疫應(yīng)答，同時(shí)具有低的潛在負(fù)面副作用的免疫佐劑。在雞中已經(jīng)報(bào)道了一些通過(guò)眼-鼻或口服途徑與活的減毒疫苗共同施用的粘膜佐劑。盡管這些佐劑中的一些確實(shí)增強(qiáng)粘膜sIgA和全身性的IgG應(yīng)答，但是它們?nèi)匀槐徽J(rèn)為是耗時(shí)和耗抗原的，因?yàn)槿匀恍枰貜?fù)注射大量的抗原。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：在此提供了佐劑、疫苗、用于制備佐劑和疫苗的構(gòu)建體以及使用佐劑和疫苗增強(qiáng)受試者中的免疫應(yīng)答的方法。尤其是，引起對(duì)疫苗的快速抗體應(yīng)答，包括IgG(在循環(huán)中)和sIgA(粘膜分泌型IgA)。佐劑和疫苗可以用于皮下或粘膜施用，使得能夠?qū)κ茉囌哌M(jìn)行低成本、有效的疫苗接種。在一個(gè)方面，佐劑組合物包含第一CD40激動(dòng)性抗體或其部分、至少一種第二抗體或其部分、至少一種標(biāo)記以及能夠以高親和力特異性結(jié)合標(biāo)記的接頭半簇(moiety)，所述第一CD40激動(dòng)性抗體或其部分包含能夠特異性結(jié)合CD40并誘導(dǎo)CD40信號(hào)傳導(dǎo)的至少兩個(gè)F(ab)區(qū)，所述第二抗體或其部分包含能夠特異性結(jié)合微生物的至少兩個(gè)F(ab)區(qū)，所述標(biāo)記附著至至少一種第一CD40激動(dòng)性抗體或其部分和至少一種第二抗體或其部分。第一CD40激動(dòng)性抗體和第二抗體與接頭半簇結(jié)合以形成復(fù)合物。第二抗體可能能夠結(jié)合可以包括病毒、細(xì)菌、疫苗載體、殺死的病原體或其部分的微生物。第二抗體可以特異于微生物表面上的表位。表位可以是保守的。CD40激動(dòng)性抗體可以特異于雞CD40，并且可以包括或由SEQIDNO：2和SEQIDNO：4或SEQIDNO：14組成?？蛇x地，CD40激動(dòng)性抗體可以包括SEQIDNO：5-10所示的CDR區(qū)或SEQIDNO：17-22所示的CDR區(qū)。殺死的病原體可以是流感或細(xì)菌或細(xì)菌細(xì)胞表面片段。佐劑組合物可以通過(guò)與第二抗體的相互作用與微生物組合以產(chǎn)生疫苗。微生物的血清型可以是未知的。微生物不需要純化以與第二抗體相互作用?？稍谂c第二抗體結(jié)合形成復(fù)合物之前殺死或滅活微生物。在另一方面，提供了包含至少一種F(ab)區(qū)的CD40激動(dòng)性抗體或其部分。CD40激動(dòng)性抗體或其部分選自以下：由SEQIDNO：2和SEQIDNO：4組成的抗體；包含SEQIDNO：14的抗體；包含重鏈可變(VH)區(qū)和輕鏈可變(VL)區(qū)的抗體或其部分，其中所述重鏈可變區(qū)包含含SEQIDNO：5所示的氨基酸序列的CDR1、含SEQIDNO：6所示的氨基酸序列的CDR2和含SEQIDNO：7所示的氨基酸序列的CDR3，以及其中所述輕鏈可變區(qū)包含含SEQIDNO：8所示的氨基酸序列的CDR1、含SEQIDNO：9所示的氨基酸序列的CDR2和含SEQIDNO：10所示的氨基酸序列的CDR3；和包含重鏈可變(VH)區(qū)和輕鏈可變(VL)區(qū)的抗體或其部分，其中所述重鏈可變區(qū)包含含SEQIDNO：20所示的氨基酸序列的CDR1、含SEQIDNO：21所示的氨基酸序列的CDR2和含SEQIDNO：22所示的氨基酸序列的CDR3，以及其中所述輕鏈可變區(qū)包含含SEQIDNO：17所示的氨基酸序列的CDR1、含SEQIDNO：18所示的氨基酸序列的CDR2和含SEQIDNO：19所示的氨基酸序列的CDR3。在另一方面，CD40激動(dòng)性抗體可用于產(chǎn)生疫苗。在疫苗中，CD40激動(dòng)性抗體通過(guò)接頭半簇與抗原連接。抗原可以是肽。疫苗可以包含在用于在食物或飲用水中施用的藻酸鹽球(alginatesphere)中。在另一方面，提供了增強(qiáng)受試者中免疫應(yīng)答的方法。所述方法包括以增強(qiáng)對(duì)抗原或微生物的免疫應(yīng)答的有效量向受試者施用在此提供的疫苗或組合物。疫苗或組合物可以通過(guò)粘膜施用，可以誘導(dǎo)IgG和IgA，尤其是sIgA，并在約7天內(nèi)誘導(dǎo)快速應(yīng)答。在另一方面，用于產(chǎn)生疫苗組合物的構(gòu)建體。所述構(gòu)建體包括第一多核苷酸，其編碼包含SEQIDNO：5、6和7或者SEQIDNO：20、21和22的抗CD40激動(dòng)性抗體重鏈，和包含SEQIDNO：8、9和10或者SEQIDNO：17、18和19的抗CD40激動(dòng)性抗體輕鏈。多核苷酸可操作地連接到啟動(dòng)子，以允許抗CD40激動(dòng)性抗體的表達(dá)。所述構(gòu)建體還可以包括編碼抗原的第二多核苷酸，并且兩個(gè)多核苷酸可以在框內(nèi)連接以在表達(dá)時(shí)形成融合蛋白。在另一方面，提供了表位制圖(mapping)多肽的方法。產(chǎn)生來(lái)自多肽的8-20個(gè)氨基酸的標(biāo)記肽，并通過(guò)接頭半簇將其附著到標(biāo)記的CD40抗體上以產(chǎn)生CD40抗體-肽復(fù)合物。將CD40抗體-肽復(fù)合物施用于受試者，并且在可以短至5-7天的一段時(shí)間后，從受試者收集血清，并測(cè)試能夠識(shí)別多肽的抗體的存在。能夠產(chǎn)生針對(duì)多肽的抗體的肽被鑒定為抗原表位。這些鑒定的抗原表位可用于開(kāi)發(fā)疫苗。附圖說(shuō)明圖1是顯示制備基于生物素-鏈霉親和素相互作用的抗體-肽復(fù)合物的示意圖。圖1A顯示生物素化限于MIg的Fc區(qū)上的碳水化合物基團(tuán)，因此不干擾抗原-抗體相互作用。圖1B顯示鏈霉親和素(SA)用于生物素化的肽與生物素化的MIg的控制的復(fù)合。2C5-SA-肽復(fù)合物中的Mab2C5保留了其生物學(xué)功能，如通過(guò)ELISA證明的。圖2是一組圖，其顯示如通過(guò)ELISA所測(cè)定的，由單次s.c.注射抗cCD40引導(dǎo)的肽復(fù)合物引起的肽特異性的循環(huán)IgG(圖2A)和在氣管中的粘膜IgA(圖2B)的水平(灰色條，與非特異性的MIgG-肽復(fù)合物相比，黑色條)。采用50μgMab2C5-肽復(fù)合物或陰性對(duì)照復(fù)合物皮下免疫8只5周齡的雄性來(lái)克亨雞的組一次。在每種情況下，誤差條表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)差，星號(hào)表示如通過(guò)Student'st檢驗(yàn)所確定的，與非特異性的MIg-肽復(fù)合物對(duì)照相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(n＝8；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，以及對(duì)兩種肽特異性的抗體同種型(IgG和IgA)，觀(guān)察到由CD40將肽負(fù)載靶向APC所引起的顯著的免疫增強(qiáng)。圖3是一組圖，其顯示通過(guò)眼-鼻(圖3A)、泄殖腔吸收(圖3B)和口服藻酸鹽懸浮液(圖3C)途徑，通過(guò)單次施用抗cCD40引導(dǎo)的肽復(fù)合物引起的，如通過(guò)ELISA所確定的肽特異性的循環(huán)IgG的水平(灰色條，與非特異性的MIgG肽復(fù)合物相比，黑色條)。通過(guò)三種不同的粘膜途徑，采用50μg抗cCD40引導(dǎo)的Mab2C5-肽復(fù)合物或陰性對(duì)照(非特異性的)MIgG-肽復(fù)合物，將8只5周齡的雄性來(lái)克亨雞的組免疫一次。在p.i.第7和第14天收集血清和氣管樣品，并通過(guò)ELISA評(píng)估肽特異性IgG應(yīng)答。在每種情況下，誤差條表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)差，星號(hào)表示如通過(guò)Student'st檢驗(yàn)所確定的，與MIg-肽復(fù)合物對(duì)照相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(n＝8；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。圖4是一組圖，其顯示了通過(guò)眼-鼻(圖4A)、泄殖腔吸收(圖4B)和藻酸鹽懸浮液(口服)(圖4C)的粘膜途徑，通過(guò)單次施用抗cCD40引導(dǎo)的肽復(fù)合物引起的，如通過(guò)ELISA測(cè)定的肽特異性的粘膜IgA的水平(灰色條，與非特異性的肽復(fù)合物相比，黑色條)。通過(guò)不同的粘膜途徑，采用50μgMab2C5-肽復(fù)合物或陰性對(duì)照復(fù)合物，將8只5周齡的雄性來(lái)克亨雞的組免疫一次，并在p.i.第7天和第14天從雞收集血清和氣管樣品。在每種情況下，誤差條表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)差，星號(hào)表示如通過(guò)Student'st檢驗(yàn)所確定的，與MIg-肽復(fù)合物對(duì)照相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(n＝8；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。圖5是一組圖，其顯示通過(guò)不同的粘膜和經(jīng)典的s.c.途徑，在施用后第7天和第14天，2C5-肽復(fù)合物對(duì)誘導(dǎo)的循環(huán)IgG(圖5A)和粘膜sIgA(圖5B)免疫應(yīng)答的凈作用。CD40靶向誘導(dǎo)的凈作用如[來(lái)自每種途徑的處理的平均(S/P)值]-[相應(yīng)的MIg對(duì)照的平均(S/P)值]計(jì)算。圖6是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖，其顯示由支架或接頭蛋白分子(生物素-鏈霉親和素)、兩個(gè)激動(dòng)性雞抗CD40抗體分子和兩個(gè)對(duì)M2e(流感上的保守抗原)特異性的抗體組成的雙特異性抗體復(fù)合物的分子結(jié)構(gòu)。圖7是一幅示意圖，其顯示了作為佐劑的圖6的雙特異性抗體復(fù)合物如何與微生物如病毒(流感)復(fù)合，所述病毒甚至來(lái)自病毒的粗來(lái)源如尿囊液或細(xì)胞裂解物。將佐劑組合物簡(jiǎn)單地與微生物的粗制品孵育以形成復(fù)合物。圖8是一幅示意圖，其顯示圖7的佐劑化的病毒如何與靶向CD40的抗原遞呈細(xì)胞相互作用，并增強(qiáng)受試者對(duì)病毒的免疫應(yīng)答。宿主的抗原遞呈細(xì)胞表達(dá)CD40，并且CD40抗體將復(fù)合物靶向抗原遞呈細(xì)胞，并通過(guò)CD40誘導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)以增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的和體液免疫應(yīng)答。圖9是顯示針對(duì)cCD40和CD205的ELISA的結(jié)果的圖，其證明由淘選(panning)程序產(chǎn)生的scFv抗CD40識(shí)別cCD40，但靶向CD205的抗體不識(shí)別cCD40。圖10是顯示純化的scFv抗cCD40DAG1的針對(duì)cCD40的ELISA的結(jié)果的圖。圖11是一組照片，其通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)顯示抗cCD40DAG1識(shí)別雞B細(xì)胞(DT40；圖11A)和巨噬細(xì)胞(HD11；圖11B)表面上的CD40。圖12是通過(guò)scFv抗cCD40DAG1顯示DT40B細(xì)胞的體外凝集的照片。圖13是顯示純化的抗cCD40scFv(DAG1)對(duì)cCD40是激動(dòng)性的，并刺激HD11巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮的圖。圖14是顯示用指定的材料疫苗接種雞后，攻擊后存活的圖。與商業(yè)疫苗相同的攻擊后，三種M2e抗體復(fù)合的CD40激動(dòng)性抗體能夠增加的存活。圖15是顯示來(lái)自一周前采用指定的疫苗接種的雞的血清抑制流感介導(dǎo)的血細(xì)胞凝集的能力的圖。圖16是顯示三種不同的抗M2e的克隆的血細(xì)胞凝集測(cè)定結(jié)果的圖，顯示了每個(gè)個(gè)體的禽的結(jié)果。圖17是一組顯示不同的組的平均血細(xì)胞凝集值的圖。圖17A顯示當(dāng)所有稀釋組合時(shí)的平均值，克隆C顯著優(yōu)于對(duì)照或其它克隆。圖17B顯示與所有對(duì)照組分開(kāi)比較，C組復(fù)合物不顯著優(yōu)于商業(yè)疫苗或殺死的病毒，但在數(shù)值上優(yōu)于任一個(gè)。圖18是顯示采用指定的肽-CD40激動(dòng)性抗體復(fù)合物免疫后7天與免疫當(dāng)日相比，產(chǎn)生的抗體的比的圖。具體實(shí)施方式在雞中，如同在哺乳動(dòng)物中，大多數(shù)感染性疾病開(kāi)始于呼吸道或消化道的粘膜表面。因此，在宿主防御中，針對(duì)侵襲和定植這些表面的病原體的局部免疫是至關(guān)重要的。采用疫苗(尤其是如果它不是活疫苗)的粘膜免疫(與在皮下或在肌肉中注射相反)可以導(dǎo)致增強(qiáng)的粘膜免疫應(yīng)答，但是這受到通過(guò)粘膜有限吸收疫苗的阻礙。覆蓋所謂的粘膜相關(guān)淋巴組織(MALT)的表面的粘液通常阻止免疫細(xì)胞附著和攝取疫苗。此外，當(dāng)口服施用時(shí)，禽(bird)的嗉(crop)和砂囊(gizzard)(或哺乳動(dòng)物的胃)也可以在疫苗到達(dá)腸免疫組織之前，機(jī)械地或酶促地分解疫苗。即使疫苗以能夠被局部免疫系統(tǒng)識(shí)別的方式到達(dá)MALT，也不是所有的疫苗都同樣良好地刺激抗原遞呈細(xì)胞(APC；免疫系統(tǒng)的“前哨(sentinel)細(xì)胞”)。因此，有效的sIgA應(yīng)答通常需要重復(fù)大劑量(20-100μg/劑量)的疫苗。使用在此公開(kāi)的技術(shù)，采用靶向CD40受體分子(其在雞APC上表達(dá))的抗體引導(dǎo)的疫苗復(fù)合物進(jìn)行單次免疫，早在疫苗接種后1周導(dǎo)致顯著的疫苗特異性的全身性的IgG和粘膜sIgA應(yīng)答。在實(shí)施例中測(cè)試的所有施用途徑(粘膜，包括口服、滴眼和泄殖腔，以及皮下應(yīng)用)導(dǎo)致具有可比性的IgA應(yīng)答，并且非常少量的疫苗足以引起顯著的(P<0.001)疫苗特異性的粘膜IgA應(yīng)答。在單次皮下注射后，抗CD40抗體-肽復(fù)合物在感染后第7天和第14天誘導(dǎo)顯著的全身性的IgG應(yīng)答。與常規(guī)佐劑相比，抗cCD40單克隆抗體-肽復(fù)合物能夠通過(guò)靶向APC(包括B細(xì)胞)模擬CD4+T細(xì)胞的生物學(xué)作用，并進(jìn)一步增強(qiáng)CD40下游信號(hào)傳導(dǎo)和隨后的免疫球蛋白類(lèi)別從IgM轉(zhuǎn)換為IgG或IgA。有趣的是，采用CD40單克隆抗體-肽復(fù)合物的單次皮下注射也早在感染后第7天誘導(dǎo)顯著的粘膜肽特異性的sIgA免疫應(yīng)答，如通過(guò)ELISA在來(lái)自氣管段的粘膜提取物中所測(cè)量的。在過(guò)去，誘導(dǎo)全身性的和粘膜免疫的最有效的策略是通過(guò)使用分別通過(guò)粘膜和全身性的途徑的引發(fā)和加強(qiáng)的組合。據(jù)我們所知，過(guò)去的文獻(xiàn)指出，單獨(dú)的胃腸外免疫不能在哺乳動(dòng)物中引發(fā)特異性的粘膜免疫應(yīng)答，因?yàn)榕c在共同粘膜免疫系統(tǒng)(CMIS)中的粘膜B細(xì)胞相比，在外周中的循環(huán)靜息B細(xì)胞表達(dá)不同的歸巢受體(Macpherson等人，2008，MucosalImmunol1：11-22；Mei等人，2009，Blood113：2461-2469；Mestecky，1987，JClinicalImmunol7：265-276；Neutra和Kozlowski，2006Nat.Rev.Immunol.6,148-158)。然而，這個(gè)概念最近受到挑戰(zhàn)，并且已經(jīng)提出類(lèi)似于CMIS的系統(tǒng)來(lái)解釋在人中胃腸外免疫也可能有助于抗體介導(dǎo)的粘膜免疫(Fernandes，2012，Correlatesofmucosalhumoralimmunityinperipheralblood.In:MedicalSciences,Vol.PhD.McMasterUniversity,McMasterUniversityLibrariesInstitutionalRepository,第163頁(yè))。最近，活化的B細(xì)胞顯示表達(dá)粘膜歸巢受體，趨化因子受體10(chemoattractantcytokinereceptor，CCR10)。循環(huán)中的CCR10+B細(xì)胞被認(rèn)為在全身性(外周)淋巴組織和粘膜效應(yīng)組織之間轉(zhuǎn)運(yùn)，其中它們被轉(zhuǎn)化為聚合IgA分泌漿細(xì)胞(Fernandes和Snider，2010，Int-immonol.22,527-540)。已報(bào)道在體外多克隆抗CD40抗體啟動(dòng)小鼠最近活化的記憶B細(xì)胞上的CCR10表達(dá)(Bernasconi等人，2002；Science298,2199-2202)。在另一方面，CCR10配體在所有粘膜效應(yīng)位點(diǎn)中表達(dá)(Mora和vonAndrian，2008；MucosalImmunol.1,96-109)。在哺乳動(dòng)物中，還報(bào)道了多克隆抗CD40抗體介導(dǎo)CXCR4在分泌IgG的B細(xì)胞上的表達(dá)。CXCR4是用于將B細(xì)胞歸巢到骨髓和次級(jí)淋巴器官的歸巢受體。不受理論限制，我們相信這提供了為什么用抗CD40單克隆抗體-肽復(fù)合物的胃腸外免疫可能實(shí)際上能夠誘導(dǎo)顯著的肽特異性的全身性IgG和粘膜sIgA免疫應(yīng)答的似乎合理的機(jī)制解釋?？傊@些結(jié)果使得這是合理的，即測(cè)試采用cCD40單克隆抗體引導(dǎo)的抗原復(fù)合物進(jìn)行的單次胃腸外或粘膜免疫是否可以不僅誘導(dǎo)快速和長(zhǎng)期的全身性的IgG免疫應(yīng)答，而且誘導(dǎo)快速局部粘膜sIgA應(yīng)答。因此，在全身性的和粘膜免疫是高度需要的情況下，這種新平臺(tái)可能具有廣泛用于通過(guò)粘膜和/或胃腸外施用于雞和其它動(dòng)物的免疫的潛力。粘膜免疫對(duì)于家禽的疫苗接種尤其重要，其中大多數(shù)病原體通過(guò)呼吸道或消化道的粘膜表面侵襲。即使存在關(guān)于A(yíng)PC和cCD40-肽復(fù)合物的相互作用的機(jī)制和微環(huán)境的未解決的問(wèn)題，在目前的研究中獲得的結(jié)果是令人鼓舞的，并且看起來(lái)具有開(kāi)發(fā)安全、有效和負(fù)擔(dān)得起的疫苗的相當(dāng)大的潛力。這種方法的主要優(yōu)勢(shì)是：(1)快速免疫應(yīng)答；(2)IgA的產(chǎn)生，其是在粘膜表面上具有保護(hù)性的唯一抗體類(lèi)別；(3)單次施用方案；(4)簡(jiǎn)單和便宜的施用途徑；(5)由于其在生理緩沖液中制劑而使注射部位無(wú)損傷(lesion-free)；和(6)長(zhǎng)期的免疫記憶。此外，在一個(gè)實(shí)施方案中，我們通過(guò)基因工程方法產(chǎn)生了這種疫苗的抗體部分，該基因工程方法允許將這種“引導(dǎo)抗體”附著到任何感興趣的蛋白抗原，并且在生產(chǎn)平臺(tái)中產(chǎn)生單一融合蛋白，其能夠低成本，大規(guī)模生產(chǎn)大量的疫苗，并且容易轉(zhuǎn)換到新系統(tǒng)或新出現(xiàn)的感染性疾病。該疫苗已經(jīng)在組織培養(yǎng)(“在體外”)中表征，并且將在藻萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)中產(chǎn)生以在活的動(dòng)物中測(cè)試，如在實(shí)施例中描述的。該疫苗也將在沒(méi)有事先從藻中提取和純化的情況下進(jìn)行測(cè)試，以使我們以甚至更低的成本生產(chǎn)。我們預(yù)期這種結(jié)構(gòu)的疫苗與實(shí)施例中使用的口服施用的藻酸鹽功能相類(lèi)似。在圖6-8中顯示的本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，CD40抗體與能夠特異性結(jié)合微生物的抗體復(fù)合。這種方法允許以關(guān)于微生物的最少信息，形成佐劑-免疫原復(fù)合物。例如，不需要已知病毒或細(xì)菌菌株的血清型，只要抗體能夠結(jié)合微生物表面上的恒定蛋白基序(“表位”)。流感病毒和沙門(mén)氏菌(Salmonella)在它們的表面上具有廣泛種類(lèi)的蛋白，它們是高度變化的并且與生物體的毒力相關(guān)，但是在本方法中使用的抗體可以選擇結(jié)合微生物表面上的恒定的或非高度變化的蛋白基序，使得可以使用簡(jiǎn)單的結(jié)合測(cè)定，將滅活的微生物與CD40復(fù)合物佐劑組合物復(fù)合以用作疫苗。這種方法避免使用任何重組技術(shù)，并因此可以在反對(duì)重組DNA技術(shù)的國(guó)家或地區(qū)更容易接受。此外，這種技術(shù)可以被快速開(kāi)發(fā)，以應(yīng)對(duì)微生物的新變體(即不同血清型或在流感病毒中的不同HN譜)的爆發(fā)，并且可以在與CD40抗體復(fù)合物結(jié)合之前不需要分離微生物而使用。包括與對(duì)微生物特異性的抗體復(fù)合的CD40抗體和滅活的微生物的疫苗的產(chǎn)生，可以在不需要潔凈室或其它技術(shù)的情況下制備，并且甚至可以在野外產(chǎn)生。復(fù)合物將被靶向宿主中的抗原遞呈細(xì)胞，并且激動(dòng)性CD40抗體將有助于誘導(dǎo)針對(duì)微生物的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。使用上述原理產(chǎn)生抗體引導(dǎo)的CD40靶向粘膜疫苗幾乎對(duì)所有病原體，甚至新出現(xiàn)的病原體是可行的，因?yàn)椴恍枰谝呙玳_(kāi)發(fā)之前或與疫苗開(kāi)發(fā)一起精確鑒定靶抗原。已經(jīng)鑒定合適靶標(biāo)(蛋白的或其它的)的疫苗的生產(chǎn)也可以流水化。這些疫苗不僅可用于雞，而且可用于其它產(chǎn)肉動(dòng)物，范圍從魚(yú)到哺乳動(dòng)物，只要CD40引導(dǎo)抗體針對(duì)宿主特異性的CD40分子。已經(jīng)在包括人、小鼠、大鼠、豬(pig)、狗、馬、牛、豬(pigs)、山羊、綿羊的幾種其它動(dòng)物以及在此公開(kāi)的雞中鑒定了激動(dòng)性CD40抗體。幾個(gè)CD40序列如SEQIDNO：54-56所提供，并且可以針對(duì)每種物種的特異性的CD40產(chǎn)生抗體。許多這些CD40抗體和尤其是CD40激動(dòng)性抗體是市售的。參見(jiàn)Linscott’sDirectoryofImmunologicalandBiologicalReagents。在此所用的雞CD40激動(dòng)性抗體之一是小鼠抗體，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可以改變抗體的Fc部分以使抗體在其使用的系統(tǒng)中更兼容。因此，在此提供的抗體如實(shí)施例中稱(chēng)為2C5的SEQIDNO：2(重鏈)和SEQIDNO：4(輕鏈)，或者在實(shí)施例中稱(chēng)為DAG-1的SEQIDNO：14(單鏈可變片段(scFv))，可以以“雞化的”形式制備，使得Fc部分和非CDR區(qū)可以被同源的宿主兼容的抗體骨架序列取代，以使對(duì)抗體骨架自身的免疫應(yīng)答最小化。此外，抗體可以重組地或通過(guò)酶消化(即木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)制備成抗體的較小部分，并且僅包括抗體的F(ab)部分，比如F(ab)2片段。已經(jīng)鑒定了實(shí)施例中使用的兩種雞CD40抗體的CDR區(qū)。對(duì)于命名為2C5并在SEQIDNO：2和SEQIDNO：4中提供的抗體，重鏈可變區(qū)包含含SEQIDNO：5所示的氨基酸序列的CDR1、含SEQIDNO:6所示的氨基酸序列的CDR2和含SEQIDNO：7所示的氨基酸序列的CDR3，以及輕鏈可變區(qū)包含含SEQIDNO：8所示的氨基酸序列的CDR1、含SEQIDNO：9所示的氨基酸序列的CDR2和含SEQIDNO：10所示的氨基酸序列的CDR3。對(duì)于命名為DAG-1并在SEQIDNO：14中提供的抗體，重鏈可變區(qū)包含含SEQIDNO：20所示的氨基酸序列的CDR1、含SEQIDNO：21所示的氨基酸序列的CDR2和含SEQIDNO：22所示的氨基酸序列的CDR3，以及其中輕鏈可變區(qū)包含含SEQIDNO：17所示的氨基酸序列的CDR1、含氨基酸SEQIDNO：18所示的氨基酸序列的CDR2和含SEQIDNO：19所示的氨基酸序列的CDR3。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用可用的方法來(lái)使抗體更兼容于在雞中的使用和活性，或產(chǎn)生本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何抗體變體，包括但不限于雙特異性抗體、雙抗體、線(xiàn)性抗體、納米抗體、Fab、Fab'、F(ab)2、Fv或scFv。因此，在此描述的方法和組合物包括抗體或其部分，所述部分是抗體的抗原結(jié)合片段。合適地，抗體的部分包括指定的CDR區(qū)并保持對(duì)其靶標(biāo)CD40的親和力，并且還保持連接CD40受體亞基的能力(這是激動(dòng)性生物活性所需的)，并且當(dāng)結(jié)合抗原遞呈細(xì)胞上的CD40時(shí)誘導(dǎo)CD40信號(hào)傳導(dǎo)。類(lèi)似地，可以產(chǎn)生針對(duì)其它動(dòng)物的CD40的抗體，并在文中描述的方法和組合物中使用。例如可以產(chǎn)生針對(duì)火雞、牛、豬、山羊、綿羊、魚(yú)、狗、貓或其它馴養(yǎng)動(dòng)物的抗CD40抗體，并在文中描述的方法和組合物中使用。參見(jiàn)SEQIDNO：54-56。這些抗體可以在動(dòng)物比如小鼠或兔中制備，然后進(jìn)行修飾以使它們更兼容在它們特異的動(dòng)物的方法中的使用，即抗體可以具有替換為靶標(biāo)動(dòng)物的那些的恒定區(qū)?？蛇x地，噬菌體展示或其它重組系統(tǒng)可以用于產(chǎn)生CD40抗體。此外，對(duì)于幾種物種，CD40抗體和激動(dòng)性CD40抗體是市售的，尤其是小鼠和人。如果抗體能夠在表達(dá)CD40的靶標(biāo)細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)，則抗體對(duì)CD40是激動(dòng)性的。通過(guò)CD40的信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致在抗原遞呈細(xì)胞的表面上CD40和TNF受體的表達(dá)增加，并誘導(dǎo)活性氧類(lèi)和一氧化氮的產(chǎn)生，以及B細(xì)胞活化導(dǎo)致同種型轉(zhuǎn)換。因此，本發(fā)明人相信在采用在此描述的CD40抗體復(fù)合物免疫后非?？焖俚禺a(chǎn)生大量的IgG和IgA，至少部分是由于CD40抗體的激動(dòng)性作用。在此提供的CD40抗體可以從雜交瘤細(xì)胞制備、從腹水或從基因工程化以表達(dá)抗體的細(xì)胞純化。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，存在廣泛種類(lèi)的可用于產(chǎn)生抗體的方法?？贵w可以通過(guò)接頭半簇直接與抗原連接，或者可以與第二抗體連接，所述第二抗體能夠特異性結(jié)合微生物，比如病毒、細(xì)菌、酵母或單細(xì)胞寄生蟲(chóng)或原生生物。微生物可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何手段滅活或殺死，但將包括熱殺死、多聚甲醛殺死、使用抗生素或乙醇。接頭可以是肽接頭(即在融合蛋白中)以將肽抗原與抗體連接，或者可以是非肽共價(jià)或非共價(jià)鍵或其它化學(xué)接頭，或者可以依賴(lài)于受體-配體相互作用。在實(shí)施例中，抗體用生物素標(biāo)記，鏈霉親和素用作接頭半簇?？梢允褂肗-羥基琥珀酰亞胺接頭或硫酯接頭。將抗體與抗原、病原體或其部分連接的其它手段是可用的。CD40激動(dòng)性抗體在佐劑組合物和疫苗中使用，如實(shí)施例和所附權(quán)利要求中描述的。在一個(gè)實(shí)施方案中，佐劑組合物包含至少一種第一CD40激動(dòng)性抗體或其部分(所述第一CD40激動(dòng)性抗體或其部分包含能夠特異性結(jié)合CD40并誘導(dǎo)CD40信號(hào)傳導(dǎo)的至少兩個(gè)Fab區(qū))、至少一種第二抗體或其部分(所述第二抗體或其部分包含能夠特異性結(jié)合微生物的至少兩個(gè)Fab區(qū))、附著于至少一種第一CD40激動(dòng)性抗體或其部分的至少一種標(biāo)記、附著于至少一種第二抗體或其部分的至少一種標(biāo)記、以及接頭半簇(所述接頭半簇能夠特異性結(jié)合附著于抗體的標(biāo)記)。第一CD40激動(dòng)性抗體和第二抗體與接頭半簇結(jié)合以形成復(fù)合物，其也稱(chēng)為CD40抗體-第二抗體復(fù)合物。在此描述的在一些佐劑中的第二抗體是能夠特異性結(jié)合微生物的抗體?？贵w可以特異性結(jié)合存在于微生物表面上的抗原或表位。微生物可以是病毒、細(xì)菌、酵母或原生生物。微生物可以是病原體比如流感或細(xì)菌病原體，或者疫苗載體比如細(xì)菌或病毒疫苗載體。細(xì)菌病原體可以是在選擇壓力下易于基因變異或易于產(chǎn)生逃逸變體的病原體，并且抗體可以針對(duì)保守的表位以允許自體病原體片段與CD40抗體組合以提供對(duì)出現(xiàn)的病原體快速應(yīng)答的疫苗接種。如果抗體特異性結(jié)合微生物的表面上可用的另一表位，則不需要已知微生物的血清型。例如，第二抗體可以特異于廣泛表達(dá)的抗原比如流感的M2e，并且抗體將結(jié)合流感病毒疫苗中滅活的流感病毒顆粒表面上表達(dá)的M2e，以通過(guò)與CD40抗體組合輔佐流感疫苗。第二抗體可以特異于其它細(xì)菌或病毒包括但不限于流感病毒、沙門(mén)氏菌(Salmonella)、梭菌(Clostridium)、彎曲菌(Campylobacter)，埃希氏菌(Escherichia)、志賀氏菌(Shigella)、螺桿菌(Helicobacter)、弧菌(Vibrio)、鄰單胞菌(Plesiomonas)、愛(ài)德華氏菌(Edwardia)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、葡萄球菌(Staphylococcus)、鏈球菌(Streptococcus)、氣單胞菌(Aeromonas)、口蹄疫病毒、豬流行性腹瀉病毒(PEDv)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)。例如，在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)8,604,198、國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO2009/059018、WO2009/059298、WO2011/091255、WO2011/156619、WO2014070709、WO2014/127185或WO2014/152508中鑒定的抗原或細(xì)菌疫苗載體。第二抗體可以特異性結(jié)合的幾種肽包括但不限于SEQIDNO：25-53或57-58中的那些。SEQIDNO：58是在實(shí)施例中使用的第二抗體的靶標(biāo)。在此提供的包含CD40抗體的佐劑可以用作疫苗或用作與已知疫苗組合使用的佐劑。在此描述的佐劑與已知疫苗的組合可以替代另一種佐劑，或者與已建立的疫苗聯(lián)合使用，以增加全身性的免疫應(yīng)答、增加免疫應(yīng)答發(fā)展的快速性或允許產(chǎn)生對(duì)疫苗的粘膜免疫應(yīng)答。也可以通過(guò)將第二抗體與微生物結(jié)合來(lái)組合佐劑組合物(包括CD40抗體-第二抗體復(fù)合物)來(lái)制備疫苗，以產(chǎn)生新的疫苗。這些新的、非重組疫苗可以在鑒定感染性暴發(fā)的原因之后快速制備，并且不需要表征或分離致病劑以產(chǎn)生有效疫苗。疫苗生產(chǎn)廉價(jià)，并且可以從感染劑的來(lái)源(微生物)比如尿囊液制備，幾乎沒(méi)有或沒(méi)有微生物的純化。微生物可以是流感病毒、在此具體所述的任何微生物或需要疫苗的任何其它微生物。對(duì)于口服施用，包括在此描述的CD40佐劑的疫苗可以包括在保護(hù)性的包衣比如藻酸鹽球中。佐劑也可以使用在此提供的基因工程構(gòu)建體產(chǎn)生，使得由細(xì)胞產(chǎn)生疫苗，并且可以給受試者服用。例如，植物、酵母或藻的細(xì)胞可以被基因工程化以產(chǎn)生可食用疫苗，其能夠在受試者的胃腸道中存活。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，CD40抗體通過(guò)接頭半簇與抗原連接，比如在實(shí)施例中使用的產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)α毒素。參見(jiàn)SEQIDNO：59-83。類(lèi)似地，可以使用已知刺激免疫應(yīng)答的任何其它抗原。抗原可以通過(guò)肽鍵連接以在抗體和抗原之間形成融合蛋白，或者可以通過(guò)如以上描述的接頭半簇共價(jià)或非共價(jià)地化學(xué)連接。在此描述的佐劑和疫苗可以用于制備藥物組合物。提供了包含以上描述的佐劑和疫苗和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。藥學(xué)上可接受的載體是任何適合在體內(nèi)施用的載體。適合在組合物中使用的藥學(xué)上可接受的載體的示例包括但不限于水、緩沖溶液、葡萄糖溶液，油基或細(xì)菌培養(yǎng)液。合適地，組合物的額外的組分可以包括例如賦形劑如穩(wěn)定劑、防腐劑、稀釋劑、乳化劑和潤(rùn)滑劑。藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的示例包括穩(wěn)定劑如碳水化合物(例如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖和葡聚糖)、蛋白質(zhì)如白蛋白或酪蛋白、含蛋白質(zhì)試劑如牛血清或脫脂乳和緩沖液(例如磷酸鹽緩沖液)。尤其是當(dāng)將這種穩(wěn)定劑加入到組合物中時(shí)，該組合物適合于冷凍干燥或噴霧干燥。組合物也可以被乳化。佐劑和疫苗可以與其它疫苗以任何順序組合施用，同時(shí)或作為單一組合物的一部分?？梢允┯媒M合物，使得一種在另一種之前施用，施用時(shí)間差為1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、16小時(shí)、20小時(shí)、1天、2天、4天、7天、2周、4周或更長(zhǎng)。如在此所用，治療受試者是指對(duì)患有疾病或處于發(fā)展疾病風(fēng)險(xiǎn)中的受試者給予益處的任何類(lèi)型的治療，包括受試者病癥的改善(例如，一種或多種癥狀)，死亡率的降低，發(fā)病率的降低包括體重減輕或食物(feed)轉(zhuǎn)化率，疾病進(jìn)展的延遲，延遲癥狀的發(fā)作或限制癥狀的嚴(yán)重性等。所述治療可以是由于在受試者中增加或增強(qiáng)對(duì)生物體的免疫應(yīng)答。對(duì)施用疫苗或佐劑反應(yīng)的免疫應(yīng)答可以是針對(duì)靶標(biāo)抗原或微生物增加的體液或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。提供了通過(guò)向受試者施用有效量的在此描述的疫苗以增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答來(lái)增強(qiáng)受試者中免疫應(yīng)答的方法。被增強(qiáng)的免疫應(yīng)答可以包括T細(xì)胞或B細(xì)胞應(yīng)答。合適地，增強(qiáng)的免疫應(yīng)答允許類(lèi)別轉(zhuǎn)換，使得產(chǎn)生針對(duì)抗原、微生物或疫苗載體的IgG和sIgA。單一劑量的疫苗可以在短的一段時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)強(qiáng)的免疫應(yīng)答。合適地，增強(qiáng)的免疫應(yīng)答在七天后是可測(cè)量的。尤其是，可以在這個(gè)短的時(shí)間跨度中產(chǎn)生強(qiáng)的IgA應(yīng)答。在此所用的有效量或治療有效量是指當(dāng)施用于受試者用于治療狀態(tài)、疾病或病癥時(shí)足以實(shí)現(xiàn)治療(比如增強(qiáng)的免疫應(yīng)答)的佐劑或疫苗的量。有效量將取決于確切的組合物及其制劑，疫苗靶向的疾病或病原體及其嚴(yán)重性，以及待治療的受試者的年齡、體重、身體狀況和反應(yīng)性而變化。在此描述的組合物可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何手段施用，包括但不限于粘膜、口服、局部、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、胃腸外、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)、透皮、鼻咽、泄殖腔、眼或透粘膜吸收。因此，組合物可以配制為可攝取、可注射、局部或栓劑制劑。通過(guò)粘膜途徑的施用包括通過(guò)飲用水、通過(guò)噴霧禽、或通過(guò)包含在食物中或食物上口服。還包括泄殖腔、鼻或口服管飼。組合物還可以在脂質(zhì)體或延時(shí)釋放(time-release)載體中或包裹在藻酸鹽球中遞送。根據(jù)本發(fā)明，向受試者施用組合物似乎以劑量依賴(lài)性的方式表現(xiàn)出有益作用。因此，在廣泛的限制內(nèi)，預(yù)期施用更大量的組合物來(lái)實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)的免疫應(yīng)答性，直至最佳劑量。一般而言，一旦實(shí)現(xiàn)最佳劑量，進(jìn)一步增加施用在應(yīng)答方面不產(chǎn)生益處。此外，還預(yù)期效力在低于看到毒性或不良應(yīng)答的水平的劑量下。應(yīng)當(dāng)理解，在任何給定的情況下，施用的具體的劑量將根據(jù)所施用的組合物、受試者的病癥和可以改變組合物的活性或受試者的應(yīng)答的其它相關(guān)醫(yī)學(xué)因素來(lái)調(diào)整，如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，特定受試者的具體劑量取決于年齡、體重、一般健康狀況、飲食、施用的時(shí)間和方式、排泄速率和組合使用的藥物。給定患者的劑量可以使用常規(guī)考量來(lái)確定，例如，比如通過(guò)合適的常規(guī)藥理學(xué)或預(yù)防規(guī)程的手段，通過(guò)習(xí)慣性的比較本發(fā)明組合物和已知試劑(比如不與在此描述的基于抗CD40的佐劑組合的疫苗)的差別活性。受試者的最大劑量是不引起不期望的或不耐受的副作用的最高劑量。關(guān)于個(gè)體方案的變量的數(shù)量是大的，并且期望相當(dāng)大的劑量范圍。施用途徑也將影響劑量需求。尤其預(yù)期的是，藥物制劑和組合物可以減輕或緩解疾病的癥狀，即導(dǎo)致如果暴露于病原體降低的嚴(yán)重性，或暴露后降低的發(fā)病率或死亡率，或可以防止受試者在隨后暴露于疫苗或抗原所特異的病原體之后感染(contracting)疾病。用于施用組合物的合適的有效劑量的量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定，但典型地為每千克體重或每劑量約1微克至約1,000微克，盡管它們典型地為每千克體重或每劑量約10至100微克或更少的。一般而言，施用單一劑量并且有效誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。在一些情況中，初始劑量之后是加強(qiáng)，其可以在第一次施用后至少兩周提供相同或不同的組合物。加強(qiáng)可以在初始劑量后2至6、2至4或任選2至3周施用。雖然雞從哺乳動(dòng)物的爬行動(dòng)物祖先的系統(tǒng)發(fā)育分離的結(jié)果是在約3億年前，雞也被賦予了復(fù)雜的粘膜免疫系統(tǒng)，其包括一系列冗余的保護(hù)性機(jī)制。雞缺少如在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的包封的(encapsulated)淋巴結(jié)，而是具有彌漫性淋巴組織。在實(shí)施例中，雞用作模型系統(tǒng)，但是在雞中使用的方法預(yù)期在哺乳動(dòng)物中，尤其是在其它馴養(yǎng)的動(dòng)物和人中引起類(lèi)似的免疫應(yīng)答。當(dāng)抗原通過(guò)粘膜途徑直接遞送到粘膜位點(diǎn)時(shí)，粘膜免疫應(yīng)答被最有效地誘導(dǎo)。粘膜免疫位點(diǎn)通過(guò)共同粘膜免疫系統(tǒng)(CMIS)連通，借此刺激誘導(dǎo)位點(diǎn)(其中免疫應(yīng)答起始)，所得免疫應(yīng)答被傳播到粘膜的遠(yuǎn)端效應(yīng)位點(diǎn)。在此還提供了用于產(chǎn)生疫苗組合物的構(gòu)建體，其包含與啟動(dòng)子可操作連接的編碼抗CD40激動(dòng)性抗體的第一多核苷酸，以允許抗CD40激動(dòng)性抗體的表達(dá)?？笴D40抗體包含重鏈和輕鏈，所述重鏈包括CDR1(SEQIDNO：5或20)、CDR2(SEQIDNO：6或21)和CDR3(SEQIDNO：7或22)，所述輕鏈包括CDR1(SEQIDNO：8或17)、CDR2(SEQIDNO：9或18)和CDR3(SEQIDNO：10或19)?？贵w的其余部分可以是SEQIDNO：2和SEQIDNO：4的那些，或者可以被工程化以與宿主(即雞)更兼容，使得佐劑和疫苗的施用不引起靶向針對(duì)抗體的小鼠部分的免疫應(yīng)答?？蛇x地，可以制備其它構(gòu)建體，比如如SEQIDNO：14所示的單鏈可變片段(scFv)。工程化抗體的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是可用的，并且包括在此描述的基于以上提供的CDR區(qū)的抗體的其它抗原結(jié)合衍生物，包括但不限于scFV、單結(jié)構(gòu)域抗體、納米抗體、嵌合抗原受體、雙抗體和其它雙特異性或多特異性抗體?？贵w可進(jìn)一步工程化以使構(gòu)建體更有用。啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，以在小的時(shí)間范圍內(nèi)產(chǎn)生大量的抗體?？梢詫⒌谝欢嗪塑账峁こ袒癁楹蟹置谛盘?hào)，使得由該多核苷酸編碼的多肽從細(xì)胞中分泌。第一多核苷酸可以用可檢測(cè)的標(biāo)記或使得多肽直接分離或純化的標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記包括熒光標(biāo)記或蛋白標(biāo)簽，比如His標(biāo)簽。參見(jiàn)SEQIDNO：23-24。構(gòu)建體可以含有多克隆位點(diǎn)，用以進(jìn)行進(jìn)一步的基因工程或直接添加編碼抗原的第二多核苷酸。第二多核苷酸可以與第一多核苷酸在框內(nèi)連接以產(chǎn)生含有CD40抗體和抗原的融合蛋白。如上所述，用于并入構(gòu)建體中的抗原包括但不限于在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)8,604,198，國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO2009/059018、WO2009/059298、WO2011/091255、WO2011/156619、WO2014070709、WO2014/127185或WO2014/152508公開(kāi)的那些，以及在SEQIDNO：25-53和57-83中提供的那些。還提供了包含構(gòu)建體的細(xì)胞。細(xì)胞可以是能夠表達(dá)產(chǎn)生在此描述的多肽和組合物的多核苷酸的細(xì)菌、酵母，藻、植物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在此還提供了表位制圖的方法。在此提供的方法允許快速鑒定感興趣的多肽/蛋白內(nèi)的潛在線(xiàn)性B細(xì)胞表位，并且可以應(yīng)用于任何蛋白的靶標(biāo)。所述方法依賴(lài)于來(lái)自多肽的8至20個(gè)氨基酸的肽與CD40抗體的連接。合適地，合成制備肽并通過(guò)接頭半簇連接到CD40抗體以產(chǎn)生CD40抗體-肽復(fù)合物。該步驟避免了對(duì)任何產(chǎn)生抗原的重組生物學(xué)的需要。合成的肽可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備，并且可以由商業(yè)供應(yīng)商制備。合成肽可以被標(biāo)記以提供將肽與CD40抗體復(fù)合的簡(jiǎn)單手段。例如，可以將CD40抗體和肽生物素化，然后可以使用鏈霉親和素或親和素將CD40抗體連接到肽。以上提供了通過(guò)接頭半簇將肽附著到CD40抗體的其它手段?？梢援a(chǎn)生肽，使得它們跨越整個(gè)多肽，或者可以選擇聚焦于多肽內(nèi)可能含有B細(xì)胞表位的區(qū)域。參見(jiàn)實(shí)施例和SEQIDNO：59-83。這些肽一般可溶于水和極性。用于預(yù)測(cè)多肽中B細(xì)胞表位的計(jì)算機(jī)程序是可用的，并且可以與在此描述的方法聯(lián)合使用。一旦產(chǎn)生CD40抗體-肽復(fù)合物，然后將其向受試者施用，并且可以在短至5-7天的一段時(shí)間后，從受試者收集血清，并測(cè)試能夠識(shí)別全長(zhǎng)天然多肽或其部分的抗體的存在。能夠產(chǎn)生針對(duì)多肽的抗體的肽被鑒定為抗原表位?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員可用的任何方法測(cè)試血清，包括但不限于ELISA測(cè)定、Western印跡、免疫熒光、FACS分析或功能性蛋白質(zhì)測(cè)定。功能性蛋白測(cè)定包括中和或激動(dòng)性測(cè)定。中和測(cè)定測(cè)試血清封閉天然蛋白功能的能力。激動(dòng)性測(cè)定測(cè)試在血清中的抗體結(jié)合并活化蛋白功能的能力。能夠在測(cè)定中結(jié)合或進(jìn)行的血清和抗體，指定抗原表位。這些鑒定的抗原表位可用于開(kāi)發(fā)疫苗或開(kāi)發(fā)對(duì)完整多肽特異性的抗體。使用這種技術(shù)可以在幾周內(nèi)對(duì)蛋白進(jìn)行表位制圖，并且這可以在測(cè)試受試者中而不是在小鼠中完成。例如，可以使用雞作為受試者。傳統(tǒng)上，該過(guò)程花費(fèi)超過(guò)一個(gè)月，并重復(fù)加強(qiáng)以產(chǎn)生用于在體外測(cè)試的強(qiáng)的免疫應(yīng)答。本公開(kāi)不限于在此闡述的構(gòu)建、成分的排列、或方法步驟的具體細(xì)節(jié)。在以下的公開(kāi)的啟示下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見(jiàn)在此公開(kāi)的組合物和方法能夠以不同的方式被制備、實(shí)踐、使用、實(shí)施和/或形成。在此所使用的措辭和術(shù)語(yǔ)僅用于描述的目的，不應(yīng)被視為對(duì)權(quán)利要求的范圍的限制。如在說(shuō)明書(shū)中和權(quán)利要求中所使用的，指不同的結(jié)構(gòu)或方法步驟的序數(shù)指示，比如第一、第二和第三，不應(yīng)該被解釋為指示任何具體的結(jié)構(gòu)或步驟、或者這種結(jié)構(gòu)或步驟的任何特定順序或構(gòu)型。在此描述的所有方法可以以任何合適的順序進(jìn)行，除在此另有指示，或者明顯與上下文矛盾。在此提供了任何和全部實(shí)施例的使用、或示例性語(yǔ)言?xún)H旨在促進(jìn)公開(kāi)，并不必然意味著任何對(duì)本公開(kāi)的范圍的限制，除非另有要求。說(shuō)明書(shū)中的語(yǔ)言以及附圖中顯示的結(jié)構(gòu)不應(yīng)理解為指示任何未要求的元件是實(shí)踐本公開(kāi)的主題所必需的。在此所使用的術(shù)語(yǔ)“包括”、“包含”、或“具有”以及其變體指包括列于其后的元件或其等價(jià)物，以及額外的元件。實(shí)施方案中所述的如“包括”、“包含”、或“具有”某些元件還被理解為“基本上由那些某些元件組成”和“由那些某些元件組成”。除非在此另有指定，在此所述的值范圍僅旨在充當(dāng)對(duì)落在范圍內(nèi)每個(gè)分別的值的分別提及的速記方法，并且每個(gè)分別的值并入本說(shuō)明書(shū)，如同其在此被單獨(dú)地提及。例如，如果記載了濃度范圍為1％至50％，意指比如2％至40％、10％至30％、或1％至3％等值被明確列舉在本說(shuō)明書(shū)中。僅存在具體意指的實(shí)施例，并且在列舉的最小值和最大值之間、包括最小值和最大值的數(shù)值的所有可能的組合被認(rèn)為是在本公開(kāi)中明確記載的。使用詞語(yǔ)“約”以描述所述的特定的量或量的范圍，意思是指很接近所述的量的值被包括在該量中，比如由于在形成測(cè)量中的制造公差、設(shè)備和人為誤差等能夠或理所當(dāng)然考慮的值。除非另有指示，所有的百分?jǐn)?shù)指以重量計(jì)的量。不承認(rèn)在本說(shuō)明書(shū)中引用的任何參考，包括任何非專(zhuān)利或?qū)＠募?gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。尤其是應(yīng)理解，除非另有所述，在此參考的任何文件不構(gòu)成承認(rèn)任何這些文件形成在美國(guó)或任何其它國(guó)家的本領(lǐng)域公知常識(shí)的一部分。任何參考的討論記載了它們的作者的觀(guān)點(diǎn)，并且申請(qǐng)人保留質(zhì)疑在此引用的任何文件的準(zhǔn)確性和針對(duì)性的權(quán)利。除非另有明確指示，在此所引用所有參考通過(guò)參考完全并入。本公開(kāi)應(yīng)該控制這樣的事件，即在引用的參考中發(fā)現(xiàn)的任何定義和/或說(shuō)明間存在任何差異。以下實(shí)施例僅意在示例性的，不意在作為本發(fā)明或所附權(quán)利要求的范圍的限制。實(shí)施例實(shí)施例1：產(chǎn)生和使用雞CD40抗體以誘導(dǎo)針對(duì)肽的IgA材料和方法抗cCD40單克隆抗體(命名為2C5)我們的實(shí)驗(yàn)室先前已報(bào)道命名為2C5的激動(dòng)性抗cCD40Mab的開(kāi)發(fā)(Chen等人，2010bDevelopmentandComparativeImmunology34：1139-1143)。Mab2C5針對(duì)重組的cCD40胞外結(jié)構(gòu)域(cCD40ED)(從CVM-VTPB獲得的重組cCD40)制備。這種Mab識(shí)別并結(jié)合CD40，如在原代雞B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、DT40B細(xì)胞和HD11巨噬細(xì)胞上表達(dá)的。Mab2C5還誘導(dǎo)HD11巨噬細(xì)胞中的NO產(chǎn)生，并且刺激DT40B細(xì)胞增殖(Chen等人，2010b)。這些結(jié)果證明2C5在結(jié)合CD40后誘導(dǎo)下游CD40信號(hào)傳導(dǎo)，并因此是激動(dòng)性的。Mab2C5至少部分模擬了雞的天然CD40配體CD154的功能。Chen等人(2012，JImmunolMethods378：116-120)還報(bào)道了將抗原靶向雞CD40+APC可以顯著增強(qiáng)抗原特異性循環(huán)IgG應(yīng)答，因此誘導(dǎo)快速的免疫球蛋白同種型轉(zhuǎn)換(Chen等人，2012)。鏈霉親和素介導(dǎo)的肽與小鼠抗體的復(fù)合基本上如先前描述的制備抗CD40Mab-肽復(fù)合物(命名為“Mab2C5-肽復(fù)合物”)和對(duì)照復(fù)合物(其中非特異性MIgG取代抗cCD40Mab2C5)(Chen等，2012)。簡(jiǎn)言之，通過(guò)Fc片段上的碳水化合物半簇的衍生化，將抗雞CD40Mab2C5(SEQIDNO：2和4)和非特異性的對(duì)照小鼠免疫球蛋白(MIg)定向生物素化。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA；結(jié)果未顯示)證實(shí)生物素化和cCD40結(jié)合能力的保留。在生物素化的肽與生物素化的2C5(或MIg)的化學(xué)計(jì)量控制的復(fù)合反應(yīng)中，以1個(gè)SA分子對(duì)2個(gè)肽分子和2個(gè)免疫球蛋白分子的比，使用合成的氨基末端生物素化的肽(b-NAWSKEYARGFAKTGK；SEQIDNO：57)和鏈霉親和素(SA)(圖1)。然而，由于免疫球蛋白-肽復(fù)合物可能易受胃腸道的酶和酸性pH環(huán)境的影響，當(dāng)需要口服施用時(shí)，免疫球蛋白-肽復(fù)合物在藻酸鹽基質(zhì)中的保護(hù)性包封被認(rèn)為是合乎邏輯的預(yù)防措施。藻酸鹽包封是用于口服遞送抗原的可行方法，并且，盡管在可能降解任何非保護(hù)的蛋白的惡劣的胃腸環(huán)境中，在優(yōu)良的藻酸鹽球中包埋的功能性免疫球蛋白-肽復(fù)合物可以被安全地遞送到合適的位點(diǎn)(比如派爾集合淋巴結(jié)(Peyer’spatches))(Desai和Schwendeman，2013，JofControlledRelease165：62-74)。對(duì)于這項(xiàng)研究，基本上如Park和同事(Bowersock等人，1999，Vaccine17：1804-1811)報(bào)道的，以小的修改進(jìn)行Mab2C5-肽復(fù)合物和MIg-肽復(fù)合物在藻酸鹽球中的包封。為了制備藻酸鹽保護(hù)的顆粒形式的Mab2C5-肽或非特異性MIg-肽復(fù)合物，新鮮產(chǎn)生分子復(fù)合物，然后與3％(w/v)藻酸鈉(Sigma-Aldrich，StLouis，MO)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(pH7.4)輕輕地混合，以獲得均勻的溶液。然后將所得溶液通過(guò)連接到1mL塑料注射器的23號(hào)針頭，逐滴擠出到3％(w/v)CaCl2溶液中，在室溫下輕輕攪拌30分鐘。通過(guò)在4℃下以3,000g離心10分鐘，從CaCl2溶液中分離凝膠化的藻酸鹽球，并用采PBS(pH7.4)進(jìn)一步洗滌三次。為了減少藻酸鹽球的多孔性，通過(guò)在室溫下在0.3％(w/v)聚-L-賴(lài)氨酸溶液中輕輕攪拌30分鐘將它們包衣而將它們穩(wěn)定。然后采用PBS(pH7.4)洗滌聚-L-賴(lài)氨酸包被的藻酸鹽球三次。這些藻酸鹽球可以?xún)?chǔ)存在4℃直至使用。在使用的當(dāng)天，在口服施用懸浮液之前，使用T10basicultraturrax均化器(Sigma-Aldrich)將藻酸鹽球機(jī)械碎裂以形成較小微球的懸浮液。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器在顯微鏡上證實(shí)藻酸鹽球的形態(tài)學(xué)特征。碎裂前的藻酸鹽球的平均尺寸為直徑約1.5mm，懸浮液中藻酸鹽微球(碎裂的)的直徑為10至100μm。采用在溶液中的Mab2C5-肽復(fù)合物或以藻酸鹽包封的Mab2C5-肽復(fù)合物微球懸浮液免疫雞將四周齡的雄性來(lái)克亨雞(Leghorns)隨機(jī)分配到不同的組(n＝16只/組)。在PBS(pH＝7.4)中的未包封的Mab2C5-肽復(fù)合物(或“盲”，非特異性的MIg-肽復(fù)合物，用作陰性對(duì)照)溶液通過(guò)皮下(s.c.)注射、通過(guò)泄殖腔吸收(囊途徑)和通過(guò)眼內(nèi)滴劑(眼-鼻途徑)施用用于免疫。對(duì)于s.c.注射，在0.5mL體積的乳化PBS(含有5％(v/v)鯊烯和0.4％(v/v)吐溫80(Sigma-Aldrich)，pH＝7.4)中的50μgMab2C5-肽/MIg-肽復(fù)合物被注射到每只雞的頸部的頸背中。對(duì)于泄殖腔吸收，通過(guò)使用P200移液管將免疫原溶液滴在雞的泄殖腔唇上，施用在體積為150μL的PBS中的50μgMab2C5-肽/MIg-肽復(fù)合物。對(duì)于眼內(nèi)免疫，在雞的兩只眼中以滴眼劑，施用在體積為40μL的PBS中的50μg2C5-肽/MIg-肽復(fù)合物。對(duì)于采用藻酸鹽球懸浮液的口服免疫，將免疫原輕輕地滴入受限制的雞的口腔中直到它們自發(fā)地將它吞咽。使用巴斯德移液管將在體積為2mL的PBS(pH7.4)中含有50μg2C5-肽復(fù)合物的藻酸鹽懸浮液施用于16只雞中的每只。通過(guò)泄殖腔或口服施用接受免疫原的雞在免疫前24小時(shí)禁食，以防止免疫原被反芻或排出。根據(jù)美國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)協(xié)會(huì)(AmericanAssociationforLaboratoryAnimalScience)的指南，在本研究中使用的動(dòng)物條件由德克薩斯A&M大學(xué)的機(jī)構(gòu)動(dòng)物關(guān)懷和使用委員會(huì)(InstitutionalAnimalCareandUseCommitteeofTexasA&MUniversity)批準(zhǔn)。通過(guò)ELISA定量肽特異性的血清IgG基本上如先前描述的，通過(guò)ELISA確定在循環(huán)中肽特異性的IgG的水平(Chen等人，2012)。簡(jiǎn)言之，首先將生物素化的肽與山羊抗生物素抗體(ThermoScientific)以等摩爾比在37℃的旋轉(zhuǎn)器(rotator)上復(fù)合1小時(shí)。接下來(lái)，在4℃，將肽-山羊抗體復(fù)合物(5μg/mL)在平底96孔微量滴定板(ThermoScientific)上，在0.05M碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中過(guò)夜包被。通過(guò)沖洗板除去過(guò)量的未吸附的肽-山羊抗體復(fù)合物，然后采用含有5％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)(RocklandImmunochemicalsInc.，Gilbertsville，PA)的PBS在37℃，將它們封閉1小時(shí)。采用含有0.2％(v/v)吐溫20(SIGMA)的PBS(PBST)洗滌肽包被的孔，然后在4℃，與在含有3％(w/v)BSA的PBST中稀釋(1:100)的雞血清樣品孵育過(guò)夜。然后如以上描述的洗滌板，并且，在室溫，與在含有3％(w/v)BSA的PBST中稀釋(1:12,000)的辣根過(guò)氧化物酶綴合的兔抗雞IgY(H+L)(ThermoScientific)孵育1小時(shí)。同種型特異性兔抗雞IgY用于避免與IgM的潛在交叉反應(yīng)。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，使用OptEIATMTMB底物(BD)進(jìn)行顯色反應(yīng)。通過(guò)加入1N硫酸終止反應(yīng)。在Wallac酶標(biāo)儀(platereader)(PerkinElmerInc.，Waltham，MA)中測(cè)量在450nm處的吸光度(A450)。通過(guò)將每個(gè)血清樣品的平均A450值與在所有平板上用作內(nèi)標(biāo)的陽(yáng)性對(duì)照血清樣品(以1:100稀釋)的平均A450值相關(guān)聯(lián)來(lái)確定肽特異性IgG的存在，以允許在板和實(shí)驗(yàn)間、但在同種型內(nèi)的滴度的比較。確定所有血清樣品中肽特異性IgG的相對(duì)水平，通過(guò)如下計(jì)算樣品與陽(yáng)性(S/P)的比進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化：S/P值＝(樣品平均值-陰性對(duì)照平均值)/(陽(yáng)性對(duì)照血清平均值-陰性對(duì)照平均值)。通過(guò)使用以下計(jì)算來(lái)估算肽特異性靶向cCD40的作用(與將其并入非特異性抗體復(fù)合物相反)：Mab2C5(S/P)減去MIg(S/P)。使用Student’st檢驗(yàn)來(lái)確定所有組間處理之間的S/P值的平均值的顯著差異，并且使用MIg-肽復(fù)合物組的S/P值作為基線(xiàn)。使用版本9軟件(SASInstituteInc.，Cary，NC)分析和產(chǎn)生所有數(shù)據(jù)。在P<0.05時(shí)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。通過(guò)ELISA定量肽特異性氣管sIgA通過(guò)ELISA確定氣管粘膜樣品中肽特異性sIgA的水平。在免疫后(p.i.)第7天或第14天處死來(lái)自每組的8只雞，并通過(guò)如下制備氣管灌洗液收集來(lái)自每只雞的氣管粘膜樣品。為了避免氣管的血液污染，使用CO2室對(duì)每只雞進(jìn)行安樂(lè)死。在咽部區(qū)域，將氣管無(wú)菌暴露，收集1cm的氣管段，稱(chēng)重，然后轉(zhuǎn)移至2mL微量離心管中。將氣管懸浮在含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑(ThermoFisherScientificInc.，Barrington，IL)、0.1％(w/v)硫柳汞和3％(w/v)BSA的冷的PBST[137mMNaCl、2.7mMKCl、10mMNa2HPO4、2mMKH2PO4和0.5％吐溫20(v/v)]中。為了最大化氣管IgA的提取效率，每100mg氣管樣品重量加入1mLPBST。通過(guò)劇烈渦旋30秒使氣管粘膜從氣管的內(nèi)襯脫離。在4℃，將管以5,000×g離心30分鐘，收集上清液并在-20℃冷凍直至使用。在粘膜提取物中sIgA的檢測(cè)如下進(jìn)行。將生物素化的肽(b-NAWSKEYARGFAKTGK；SEQIDNO：57)與山羊抗生物素抗體(ThermoFisherScientificInc.)在旋轉(zhuǎn)器上在37℃孵育1小時(shí)。在4℃，在0.05M碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)(SIGMA)中，采用肽-山羊抗體復(fù)合物(5μg/mL)包被平底96孔微量滴定板(ThermoFisherScientificInc.)過(guò)夜。除去過(guò)量的肽-山羊抗體復(fù)合物，并將板用含有5％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)(RocklandImmunochemicalsInc.，Gilbertsville，PA)的PBS(pH7.4)在4℃封閉過(guò)夜。用PBST洗滌肽包被的孔，然后在4℃，與在含有3％(w/v)BSA的PBST中的雞氣管IgA樣品(稀釋至1:100)孵育過(guò)夜。然后如以上描述的洗滌板，并與在含有3％(w/v)BSA的PBST中稀釋(1:10,000)的辣根過(guò)氧化物酶綴合的山羊抗雞IgA(ThermoFisherScientificInc.)在室溫下溫育1小時(shí)。同種型特異性的山羊抗雞IgA用于避免與其它抗體同種型的交叉反應(yīng)。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，使用OptEIATMTMB底物(BD，Lakes，NJ)進(jìn)行顯色反應(yīng)，并通過(guò)加入1N硫酸終止。在Wallac酶標(biāo)儀(PerkinElmerInc.，Waltham，MA)中測(cè)量在450nm處的吸光度(A450)。肽特異性的IgA的存在通過(guò)將每個(gè)氣管IgA樣品的(A450)平均值與用作內(nèi)標(biāo)的陽(yáng)性對(duì)照IgA樣品(1:100)的平均(A450)值相關(guān)聯(lián)來(lái)確定。如以上對(duì)IgG解釋的，確定所有氣管樣品中肽特異性的IgA的相對(duì)水平，并通過(guò)計(jì)算樣品與陽(yáng)性(S/P)的比進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。使用Student’st檢驗(yàn)來(lái)確定所有組間處理之間的S/P值的平均值的顯著差異，并且使用MIg-肽復(fù)合物組的S/P值作為基線(xiàn)。使用版本9軟件(SASInstituteInc.，Cary，NC)分析和產(chǎn)生所有數(shù)據(jù)。在P<0.05時(shí)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。結(jié)果采用抗CD40引導(dǎo)的肽復(fù)合物與非特異性“盲”肽復(fù)合物的單次胃腸外(s.c.)免疫后的抗體應(yīng)答為了評(píng)價(jià)抗CD40引導(dǎo)的Mab2C5-肽復(fù)合物的胃腸外免疫對(duì)特異性的全身性和粘膜抗體應(yīng)答的作用，5周齡雄性來(lái)克亨雞的組接受采用50μgMab2C5-肽復(fù)合物的單次s.c.免疫，并將它們的應(yīng)答與用作為陰性對(duì)照的“盲”非特異性MIg-肽復(fù)合物獲得的應(yīng)答進(jìn)行比較。在p.i.第7天和第14天從所有免疫的雞中收集氣管和血漿樣品，通過(guò)ELISA評(píng)估肽特異性的IgA和IgG免疫應(yīng)答。如圖2A所示，Mab2C5-肽復(fù)合物的單次s.c.注射誘導(dǎo)肽特異性循環(huán)IgG抗體應(yīng)答，其顯著高于采用非特異性MIg-肽對(duì)照在p.i.第7天(P<0.001)和第14天(P<0.001)獲得的那些。通過(guò)將免疫原靶向在雞APC上表達(dá)的CD40，肽特異性sIgA免疫應(yīng)答在p.i.第7天(P<0.001)和第14天(P<0.05)也顯著增強(qiáng)(圖2B)。盡管我們?cè)趐.i.第14天時(shí)與對(duì)照相比觀(guān)察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著增加的IgG和sIgA免疫應(yīng)答，但在p.i.第7天明顯觀(guān)察到主要的免疫增強(qiáng)。在圖4和圖5中顯示的所有抗體應(yīng)答的概況圖上也可以觀(guān)察到相同的作用。采用抗CD40引導(dǎo)的肽復(fù)合物與非特異性MIgG肽復(fù)合物的單次粘膜免疫之后的抗體應(yīng)答還通過(guò)對(duì)禽的三個(gè)不同的粘膜誘導(dǎo)位點(diǎn)施用免疫原來(lái)評(píng)價(jià)抗CD40Mab2C5-肽復(fù)合物的潛在免疫增強(qiáng)作用，每次使用“盲”非特異性MIg-肽復(fù)合物作為陰性對(duì)照。通過(guò)以下粘膜途徑之一向5周齡的雄性來(lái)克亨雞的組施用單一Mab2C5-肽復(fù)合物劑量(50μg)：眼-鼻(滴眼劑)、泄殖腔吸收(滴于出口(thelipsofthevent)上)和口服施用。口服途徑不是通過(guò)管飼施用到胃中(其將繞過(guò)食道和嗉)，而是主動(dòng)飲用免疫原溶液。在p.i.第7天和第14天收集氣管和血漿樣品，并如先前對(duì)于s.c.施用途徑描述的測(cè)量抗體應(yīng)答。從不同粘膜施用途徑獲得的結(jié)果顯示，2C5-肽復(fù)合物對(duì)每種不同途徑誘導(dǎo)類(lèi)似的IgG(圖3)和sIgA(圖4)的抗體應(yīng)答模式。通過(guò)所有三種粘膜途徑直接遞送至粘膜誘導(dǎo)位點(diǎn)的抗原，與MIg-肽對(duì)照相比，從p.i.第7天起至(P<0.001)p.i.第14天(眼-鼻：P<0.001；口服：P<0.01；泄殖腔吸收：P<0.05)，誘導(dǎo)顯著的肽特異性的全身性IgG免疫應(yīng)答(圖3)。圖4顯示，與MIg-肽復(fù)合物相比，抗CD40引導(dǎo)的Mab2C5-肽復(fù)合物也能夠在p.i.第7天時(shí)通過(guò)所有三種測(cè)試的粘膜途徑誘導(dǎo)顯著的肽特異性sIgA應(yīng)答(眼-鼻：P<0.001；口服：P<0.01；泄殖腔吸收：P<0.01)，但是那些IgA應(yīng)答在p.i第14天明顯下降(眼-鼻：不顯著；口服：P<0.01；泄殖腔吸收：P<0.01)。尤其是，通過(guò)不同途徑的“盲”MIg-肽復(fù)合物的粘膜施用也似乎略微在數(shù)值上增加肽特異性的全身性IgG應(yīng)答和粘膜sIgA應(yīng)答，但僅在眼-鼻施用后。計(jì)算通過(guò)不同施用途徑的抗CD40靶向的凈免疫增強(qiáng)作用以上結(jié)果允許我們?cè)u(píng)估將肽靶向CD40+APC的凈免疫增強(qiáng)作用，與在非特異性“盲”蛋白復(fù)合物中并入相同的肽相反。為此目的，免疫增強(qiáng)作用定義為：從[抗CD40引導(dǎo)的復(fù)合物的平均(S/P)值]減去[施用“盲”復(fù)合物的平均(S/P)值]。在施用途徑(4)和時(shí)間點(diǎn)(2)之間比較了該佐劑的作用。如在圖5A中顯示的，在p.i.第7天，s.c.施用2C5-肽復(fù)合物產(chǎn)生通過(guò)CD40靶向?qū)崿F(xiàn)的最強(qiáng)的全身性IgG免疫應(yīng)答。然而，這種增強(qiáng)的量級(jí)水平不是持續(xù)的，并且在p.i.第14天下降到小于初始值的一半(1.371對(duì)0.497)。雖然通過(guò)s.c.施用的CD40靶向的凈IgG作用在p.i.第14天下降，對(duì)全身性肽特異性IgG水平的凈作用仍高于在任何其它時(shí)間用任何其它粘膜途徑獲得的作用。在p.i.第7天，三種粘膜施用途徑對(duì)全身性IgG應(yīng)答具有類(lèi)似但低的凈作用，并到p.i第14天適度地增加(圖5A)。令人驚訝的是，采用2C5-肽復(fù)合物s.c.免疫誘導(dǎo)CD40靶向?qū)﹄奶禺愋訧gA分泌的凈作用。在p.i.第7天，s.c.施用對(duì)特異性IgA水平的作用在量級(jí)上與三種不同粘膜途徑的作用類(lèi)似(圖5B)。在所有施用途徑中，CD40靶向肽特異性IgA產(chǎn)生的凈作用在p.i.第14天時(shí)顯著下降。這可能部分由于以下事實(shí)：在p.i.第14天，盲MIg-肽復(fù)合物緩慢地開(kāi)始誘導(dǎo)一些肽特異性sIgA免疫應(yīng)答，這有降低了2C5的凈CD40靶向作用。實(shí)施例2：抗雞CD40scFv的產(chǎn)生通過(guò)噬菌體展示構(gòu)建針對(duì)雞CD40(chCD40)的單鏈抗體文庫(kù)(scFv)。簡(jiǎn)言之，用雞CD40免疫小鼠，并收集脾細(xì)胞。提取RNA并合成cDNA。使用PCR擴(kuò)增可變輕鏈和重鏈，并使用PCR擴(kuò)增scFv。將產(chǎn)物連接到載體中并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E.coli.)中。輔助噬菌體拯救(rescue)后，沉淀噬菌體。獲得3×106個(gè)轉(zhuǎn)化體大小的scFv文庫(kù)。將噬菌體文庫(kù)加入CD40包被的ELISA，允許結(jié)合并洗滌以除去非特異性結(jié)合的噬菌體。加入大腸桿菌以允許結(jié)合的噬菌體的擴(kuò)增，并重復(fù)該過(guò)程。針對(duì)雞CD40的三個(gè)循環(huán)的淘選導(dǎo)致陽(yáng)性克隆的40％富集，在文庫(kù)中占優(yōu)勢(shì)群的那些如下表1所示。表1：淘選以富集抗CD40scFv循環(huán)投入產(chǎn)出結(jié)合百分比(×10-4)富集17.2x10115.7x1040.0826.2x10118.8x1040.141.7531.2x10126.8x1065.740.747x10121.5x1072.14噬菌體結(jié)合百分比＝(產(chǎn)出/投入)×100。富集＝與前一循環(huán)相比噬菌體結(jié)合百分比的增加倍數(shù)。然后在針對(duì)cCD40和CD205的ELISA中測(cè)試展示DAG1的噬菌體，結(jié)果在圖9中顯示。參見(jiàn)SEQIDNO：14。scFv特異性結(jié)合cCD40。因此，在針對(duì)cCD40的三個(gè)循環(huán)的淘選后，獲得了特異性的、高親和力的抗體。命名為DAG1(～35KDa)的可溶性抗cCD40scFv通過(guò)鎳親和色譜法純化，并通過(guò)免疫印跡表征。如圖10中顯示的，這種scFv在ELISA中識(shí)別cCD40。使用PBS中4％的多聚甲醛將細(xì)胞(DT40B細(xì)胞或HD11巨噬細(xì)胞)固定在聚-L-賴(lài)氨酸包被的玻片上，并用抗cCD40scFvDAG1染色。DAG1scFv能夠特異性結(jié)合雞DT40B細(xì)胞(圖11A)和雞HD11巨噬細(xì)胞(圖11B)上表達(dá)的雞CD40。還測(cè)試了DAG1scFv在體外凝集DT40B細(xì)胞的能力。將細(xì)胞(2×105)接種在V底板中，并與10μl的含有抗cCD40scFv的細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物(圖12A)或PBS(圖12B)孵育過(guò)夜。與DAG1孵育的細(xì)胞凝集并在孔底部和側(cè)面形成網(wǎng)絡(luò)。如在圖12中顯示的，采用PBS孵育的細(xì)胞收集到V底。評(píng)估采用純化的抗cCD40scFv(DAG1)(實(shí)心方形)、小鼠IgG1(實(shí)心圓形)或LPS(實(shí)心三角形)的三倍系列稀釋物刺激的HD11巨噬細(xì)胞的一氧化氮產(chǎn)生。如在圖13中顯示的，當(dāng)采用DAG1的稀釋物刺激時(shí)，在HD11雞巨噬細(xì)胞中以線(xiàn)性方式刺激一氧化氮產(chǎn)生。這些活性表明抗cCD40DAG1模擬CD40L(CD154)的作用的能力，提供在體外誘導(dǎo)雞APC活化所需的信號(hào)。因此，這種激動(dòng)性抗cCD40scFv可以構(gòu)成研究CD40在雞免疫系統(tǒng)中的作用或與抗原相連以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的有力工具。實(shí)施例3：禽流感佐劑復(fù)合物測(cè)試材料與方法針對(duì)AIV保守的M2e離子通道結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生單克隆抗體?；谙惹肮嫉男蛄?，合成M2e保守的肽序列CEVETPTRN(SEQIDNO：58)，并用于在RIBI緩沖液中以50μg/小鼠皮下免疫Balb/c小鼠。以三周的間隔進(jìn)行皮下25μg/小鼠的三次加強(qiáng)。在每次免疫后1周收集血漿，以基于ELISA篩選肽特異性IgG應(yīng)答。一旦小鼠被超免疫(hyper-immunized)(抗體滴度穩(wěn)定于高水平(plateau))，小鼠被安樂(lè)死并收獲脾細(xì)胞。脾細(xì)胞用于與小鼠Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞電融合以產(chǎn)生B細(xì)胞雜交瘤。將雜交瘤培養(yǎng)物維持在37℃，5％CO2，并在補(bǔ)充有15％FBS的DMEM介質(zhì)中培養(yǎng)。通過(guò)ELISA篩選雜交瘤上清液的肽特異性的M2e抗體的產(chǎn)生，以及結(jié)合完整禽流感病毒的能力。選擇親本雜交瘤，隨后通過(guò)有限稀釋進(jìn)行亞克隆。根據(jù)相同的方法再次篩選亞克隆的單克隆雜交瘤，然后選擇最終亞克隆用于腹水產(chǎn)生和低溫儲(chǔ)存。三個(gè)雜交瘤對(duì)于完整禽流感病毒(AIV)識(shí)別是陽(yáng)性的(強(qiáng)陽(yáng)性)，命名為克隆A、克隆B和克隆C。這三個(gè)亞克隆用于佐劑復(fù)合物形成和針對(duì)AIV的免疫原性測(cè)試。在腹水產(chǎn)生后，選擇的三種抗M2e單克隆抗體的每種通過(guò)蛋白G親和色譜法純化，并根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，使用來(lái)自ThermoScientific的EZLinkHydrazideLCBiotin試劑盒進(jìn)行生物素化。使用鏈霉親和素作為支架，以?xún)蓚€(gè)第一單克隆抗體對(duì)一個(gè)鏈霉親和素對(duì)兩個(gè)第二單克隆抗體的比，將生物素化的抗M2e抗體與生物素化的抗CD40單克隆抗體復(fù)合。將這種抗CD40/M2e復(fù)合物與預(yù)先在胚胎雞卵中繁殖的化學(xué)滅活的完整禽流感病毒混合，以允許病毒與佐劑復(fù)合物的結(jié)合。將完整的復(fù)合物用于在印度尼西亞萬(wàn)隆的MedionVaccine公司的雞中的體內(nèi)免疫原性研究中。結(jié)果如在圖14中顯示的，與Medion商業(yè)疫苗對(duì)照相比，實(shí)驗(yàn)佐劑(來(lái)自單克隆M2e抗體克隆A、B和C)，同樣地延遲由HPAI攻擊(challenge)引起的死亡(平均1天)。所有實(shí)驗(yàn)組具有384HA單位的滅活病毒。實(shí)驗(yàn)組具有不同量的實(shí)驗(yàn)佐劑復(fù)合物，以每病毒顆粒的復(fù)合物的量列出。例如，250X是每病毒顆粒250個(gè)復(fù)合物。在疫苗接種1周后，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行攻擊，并且，H5禽流感病毒以2×105個(gè)病毒/禽進(jìn)行攻擊。如在圖14中的圖顯示的，未疫苗接種的組是未疫苗接種-攻擊的對(duì)照組。僅病毒的組在疫苗接種期間接受沒(méi)有佐劑的滅活的病毒。在疫苗接種后1周收集血清，并用于HI測(cè)試(基于血細(xì)胞凝集抑制的病毒中和)。將從禽收集的血清與AIV孵育以允許病毒的結(jié)合和中和。加入完整紅細(xì)胞以驗(yàn)證在血清中的抗體是否能夠中和病毒使紅細(xì)胞血細(xì)胞凝集的能力。每個(gè)實(shí)驗(yàn)佐劑克隆的平均HI值在圖15中顯示，并且表示用HPAI攻擊前的疫苗效力。HI評(píng)分被廣泛建立為疫苗效力的準(zhǔn)確預(yù)測(cè)。雖然基于佐劑與病毒顆粒的比/劑量，在每組中沒(méi)有觀(guān)察到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是每種M2e靶向的復(fù)合物誘導(dǎo)血細(xì)胞凝集的顯著抑制。將實(shí)驗(yàn)組的HI完全組合(忽略比/劑量)，并與對(duì)照相比較，如在圖16中顯示。如在圖16中顯示的平均HI值的分布，其中每只禽的應(yīng)答是在圖中的個(gè)體點(diǎn)，證明所有實(shí)驗(yàn)佐劑比對(duì)照誘導(dǎo)更高的HI值。與克隆A或克隆B相比，克隆C顯示最高的HI能力。如在圖17A中顯示的，統(tǒng)計(jì)學(xué)上，克隆C的HI值顯著高于其它組(克隆A、克隆B或組合的對(duì)照)。如果對(duì)照分開(kāi)的(如在圖17B中)，克隆C的評(píng)分不是統(tǒng)計(jì)學(xué)上的，而是僅在數(shù)值上高于對(duì)照。重要的是要記住，Medion疫苗是商業(yè)疫苗對(duì)照，并因此任何性能的提高是高度相關(guān)的。在分開(kāi)對(duì)照組后，克隆C保留了在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于其它克隆?？偟膩?lái)說(shuō)，我們發(fā)現(xiàn)克隆C明顯比克隆A或B作為疫苗佐劑更有效。佐劑復(fù)合物與病毒顆粒的比似乎不是誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的主要因素(如克隆C的HI數(shù)據(jù)中所見(jiàn))。佐劑復(fù)合物同樣能夠延遲HPAI感染發(fā)作后的死亡，并且具有比商業(yè)疫苗更好的HI滴度。結(jié)論來(lái)自該試驗(yàn)的最重要的結(jié)論是，它為試驗(yàn)的理論原則提供了不可否認(rèn)的(統(tǒng)計(jì)學(xué))證據(jù)，即我們的佐劑復(fù)合物可以將在一端的雞的抗原遞呈細(xì)胞與在另一端的滅活的AI病毒顆粒物理連接，并在該過(guò)程中引發(fā)了令人難以置信的快速免疫應(yīng)答。直到體內(nèi)試驗(yàn)，使用阿伏伽德羅常數(shù)(Avogadro’snumber)來(lái)計(jì)算每常規(guī)劑量的滅活病毒的佐劑復(fù)合物的量來(lái)假設(shè)我們的初始概念?？贵w引導(dǎo)方法擊敗Medion商業(yè)疫苗。實(shí)施例4：抗體引導(dǎo)的產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringens)α毒素表位制圖材料與方法分析產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域以鑒定毒素溶血活性的抗體中和的可能區(qū)域。基于作為B細(xì)胞表位的潛力，選擇每個(gè)長(zhǎng)度為8-15個(gè)氨基酸的線(xiàn)性肽的文庫(kù)，并合成。參見(jiàn)表2和SEQIDNO：59-83。將每個(gè)生物素化的來(lái)自表位文庫(kù)的肽并入CD40靶向復(fù)合物(通過(guò)鏈霉親和素將生物素化的肽與生物素化的CD40抗體連接)，并皮下注射到禽中，以誘導(dǎo)肽特異性的IgG抗體應(yīng)答。使用商業(yè)生物素化試劑盒(來(lái)自ThermoScientific的EZLinkHydrazideLCBiotin)將CD40抗體生物素化，并購(gòu)買(mǎi)已生物素化的肽。在免疫后1周從每只禽收集抗血清。血清收集后，將樣品離心以除去碎片和沉淀。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化的ELISA規(guī)程測(cè)量肽特異性的免疫原性。測(cè)試針對(duì)每個(gè)靶標(biāo)產(chǎn)生的抗血清中和溶血活性的能力。產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素獲自USDA。在平底96孔板上，將50微升在無(wú)菌PBS中以1:80稀釋的毒素(USDA建議的用于中和測(cè)定的毒素稀釋)與50μL的血清(從1:10開(kāi)始的2倍系列稀釋的血清)混合，并在37℃孵育1小時(shí)以允許毒素的結(jié)合/中和。初始孵育后，向所有孔中加入100μLPBS中的5％(v/v)綿羊紅細(xì)胞，并在37℃再孵育1小時(shí)。孵育后，在孔中觀(guān)察到溶血活性的中和。表2：疫苗接種后7天的肽特異性IgY應(yīng)答(使用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA規(guī)程)以圖形式顯示的抗體應(yīng)答的數(shù)據(jù)在圖18中示出?？贵w應(yīng)答被分成三組。具有免疫后7天與免疫當(dāng)天的肽特異性免疫球蛋白的比超過(guò)10的那些被認(rèn)為是高度免疫原性的。具有的比在6至10的肽復(fù)合物被認(rèn)為是中度免疫原性的，具有的比小于6的那些被認(rèn)為是輕度免疫原性的。這些區(qū)別在圖18中以穿過(guò)圖的線(xiàn)的圖形化顯示。然后完成病毒中和測(cè)定以確定抗體是否能夠中和產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的溶血活性。簡(jiǎn)言之，在生理鹽水中制備兩倍系列稀釋的血清，每孔加入50μL。在無(wú)菌PBS中制備1:80稀釋的從USDA獲得的產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素，并以每孔50μL加入。將測(cè)定在37℃孵育1小時(shí)。然后向每個(gè)孔中加入100μL的5％綿羊紅細(xì)胞懸浮液，輕輕混合并允許在37℃下孵育1小時(shí)。測(cè)量在490nm處的吸光度以確定紅細(xì)胞的溶血水平。溶血陽(yáng)性的孔是被認(rèn)為是中和陰性的血清，反之亦然。如在下表3中顯示，幾種血清能夠中和毒素并防止溶血。在表中報(bào)道的中和是仍然能夠中和產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的最高稀釋因子。因此，“160”意指血清以1：160稀釋?zhuān)灾泻投舅?。?duì)照肽(使用的非引導(dǎo)系統(tǒng))對(duì)溶血中和是陰性的。表3：溶血活性中和結(jié)果(能夠完全中和報(bào)道的毒素溶血活性的最高血清稀釋)在采用CD40靶向的抗體引導(dǎo)的抗原單次注射后一周產(chǎn)生的抗體，導(dǎo)致α毒素溶血活性的一定程度的減少。采用抗體引導(dǎo)的抗原的這種疫苗接種技術(shù)，導(dǎo)致在9/23抗原中的顯著免疫應(yīng)答(測(cè)量為IgY水平)。此外，通過(guò)該抗原選擇過(guò)程，表位20、21和23都是高度免疫原性的并且高度中和溶血活性，表明它們作為疫苗候選物的潛力。因此，我們開(kāi)發(fā)了一種快速方法來(lái)制圖表位，并鑒定用于重組疫苗產(chǎn)生的潛在抗原表位。序列表<110>阿肯色大學(xué)評(píng)議會(huì)德克薩斯AM大學(xué)體系L·貝里曼L·比爾科B·哈吉斯D·阿比-加南C-H·陳W-K·周C·王S·沃拉W·姆旺吉<120>抗體引導(dǎo)的疫苗和用于產(chǎn)生快速成熟的免疫應(yīng)答的方法<130>5658-00264<150>US62/008,178<151>2014-06-05<160>83<170>PatentInversion3.5<210>1<211>417<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的：重鏈DNA序列<400>1atggctgtcctggcactactcctctgcctggtggctttcccaagctgtaccctgtcccag60gtgcaactgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctatccattacc120tgcactgtctctggattctcattaaccacctatgatataaactggattcgccagccacca180ggaaagggtctggagtggcttggaataatatggactggtggaggcacaaattataattca240gctttcatgtccagactgagcatcagcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaa300atgaacagtctgcaaactgatgacacagccatatattactgtgtaagagatcggggttac360tacgtttactattctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca417<210>2<211>139<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的：重鏈氨基酸序列<400>2MetAlaValLeuAlaLeuLeuLeuCysLeuValAlaPheProSerCys151015ThrLeuSerGlnValGlnLeuLysGluSerGlyProGlyLeuValAla202530ProSerGlnSerLeuSerIleThrCysThrValSerGlyPheSerLeu354045ThrThrTyrAspIleAsnTrpIleArgGlnProProGlyLysGlyLeu505560GluTrpLeuGlyIleIleTrpThrGlyGlyGlyThrAsnTyrAsnSer65707580AlaPheMetSerArgLeuSerIleSerLysAspAsnSerLysSerGln859095ValPheLeuLysMetAsnSerLeuGlnThrAspAspThrAlaIleTyr100105110TyrCysValArgAspArgGlyTyrTyrValTyrTyrSerMetAspTyr115120125TrpGlyGlnGlyThrSerValThrValSerSer130135<210>3<211>381<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的：輕鏈DNA序列<400>3atgatgtcctctgctcagttccttggtctcctgttgctctgttttcaaggtaccagatgt60gatatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcacc120atcagttgcagggcaagtcaggacattagcaattatttaaactggtatcagcagaaacca180gatggaactgttaaactcctgatctactacacatcaagattacactcaggagtcccatca240aggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaa300gaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatatgtttccgtggacgttcggtgga360ggcaccaagctggaaatcaaa381<210>4<211>127<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的：輕鏈氨基酸序列<400>4MetMetSerSerAlaGlnPheLeuGlyLeuLeuLeuLeuCysPheGln151015GlyThrArgCysAspIleGlnMetThrGlnThrThrSerSerLeuSer202530AlaSerLeuGlyAspArgValThrIleSerCysArgAlaSerGlnAsp354045IleSerAsnTyrLeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProAspGlyThrVal505560LysLeuLeuIleTyrTyrThrSerArgLeuHisSerGlyValProSer65707580ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspTyrSerLeuThrIleSer859095AsnLeuGluGlnGluAspIleAlaThrTyrPheCysGlnGlnGlyAsn100105110MetPheProTrpThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLys115120125<210>5<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的：重鏈CDR1<400>5GlyPheSerLeuThrThrTyrAspIleAsn1510<210>6<211>16<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的：重鏈CDR2<400>6IleIleTrpThrGlyGlyGlyThrAsnTyrAsnSerAlaPheMetSer151015<210>7<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的：重鏈CDR3<400>7AspArgGlyTyrTyrValTyrTyrSerMetAspTyr1510<210>8<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的：輕鏈CDR1<400>8ArgAlaSerGlnAspIleSerAsnTyrLeuAsn1510<210>9<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的：輕鏈CDR2<400>9TyrThrSerArgLeuHisSer15<210>10<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的：輕鏈CDR3<400>10GlnGlnGlyAsnMetPheProTrpThr15<210>11<211>546<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的：CPa的截短的C末端,ORF<400>11tcaaaagaatatgcaagaggttttgctaaaacaggaaaatcaatatactatagtcatgct60agcatgagtcatagttgggatgattgggactatgcagcaaaggtaactttagctaactct120caaaaaggaacagcaggatatatttatagattcttacacgatgtatcagagggtaatgat180ccatcagttggaaagaatgtaaaagaactagtagcttacatatcaactagtggtgaaaaa240gatgctggaacagatgactacatgtattttggaatcaaaacaaaggatggaaaaactcaa300gaatgggaaatggacaacccaggaaatgattttatgactggaagtaaagatacttatact360ttcaaattaaaagatgaaaatctaaaaattgatgatatacaaaatatgtggattagaaaa420agaaaatatacagcattcccagatgcttataagccagaaaacataaaggtaatagcaaat480ggaaaagttgtagtggacaaggatataaatgagtggatttcaggaaattcaacttataat540ataaaa546<210>12<211>182<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的：翻譯<400>12SerLysGluTyrAlaArgGlyPheAlaLysThrGlyLysSerIleTyr151015TyrSerHisAlaSerMetSerHisSerTrpAspAspTrpAspTyrAla202530AlaLysValThrLeuAlaAsnSerGlnLysGlyThrAlaGlyTyrIle354045TyrArgPheLeuHisAspValSerGluGlyAsnAspProSerValGly505560LysAsnValLysGluLeuValAlaTyrIleSerThrSerGlyGluLys65707580AspAlaGlyThrAspAspTyrMetTyrPheGlyIleLysThrLysAsp859095GlyLysThrGlnGluTrpGluMetAspAsnProGlyAsnAspPheMet100105110ThrGlySerLysAspThrTyrThrPheLysLeuLysAspGluAsnLeu115120125LysIleAspAspIleGlnAsnMetTrpIleArgLysArgLysTyrThr130135140AlaPheProAspAlaTyrLysProGluAsnIleLysValIleAlaAsn145150155160GlyLysValValValAspLysAspIleAsnGluTrpIleSerGlyAsn165170175SerThrTyrAsnIleLys180<210>13<211>792<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的：DAG1,ORF<400>13atgacacagtctcaaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgc60aaggccagtcagaatgtgggtactaatgtagcctggtatcaacagaaaccagggcaatct120cctaaagcactgatttactcggcatcctaccggtacagtggagtccctgatcgcttcaca180ggcagtggatctgggacagatttcactctcaccattagcaatgtgcagtctgaagacttg240gcagattatttctgtcagcaatatagcagctatcctctcacgttcggaggggggaccaag300ctggaaataaaaggtggttcctctagatcttccctcgaggttcagctgcagcagtctggg360gctgaactggtgaagcctgggacttcagtgaggatatcctgcaaggcttctggctacacc420ttcacaaactactatatatactgggtgaagcagaggcctggacagggacttgagtggatt480ggatggatttatcctggaaatgttaatactaagtacaatgagaagttcaagggcaaggcc540acactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcagcctgacctct600gaggactctgcggtctatttctgtgcaagaagggggactgggacggtcgtttttgactac660tggggccacggcaccactcttacagtctcctcagccaaaacaacacccccatctgtcact720agtggccaggccggccagcaccatcaccatcaccatggcgcatacccgtacgacgttccg780gactacgcttct792<210>14<211>264<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的：翻譯<400>14MetThrGlnSerGlnLysPheMetSerThrSerValGlyAspArgVal151015SerValThrCysLysAlaSerGlnAsnValGlyThrAsnValAlaTrp202530TyrGlnGlnLysProGlyGlnSerProLysAlaLeuIleTyrSerAla354045SerTyrArgTyrSerGlyValProAspArgPheThrGlySerGlySer505560GlyThrAspPheThrLeuThrIleSerAsnValGlnSerGluAspLeu65707580AlaAspTyrPheCysGlnGlnTyrSerSerTyrProLeuThrPheGly859095GlyGlyThrLysLeuGluIleLysGlyGlySerSerArgSerSerLeu100105110GluValGlnLeuGlnGlnSerGlyAlaGluLeuValLysProGlyThr115120125SerValArgIleSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr130135140TyrIleTyrTrpValLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpIle145150155160GlyTrpIleTyrProGlyAsnValAsnThrLysTyrAsnGluLysPhe165170175LysGlyLysAlaThrLeuThrValAspLysSerSerSerThrAlaTyr180185190MetGlnLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrPheCys195200205AlaArgArgGlyThrGlyThrValValPheAspTyrTrpGlyHisGly210215220ThrThrLeuThrValSerSerAlaLysThrThrProProSerValThr225230235240SerGlyGlnAlaGlyGlnHisHisHisHisHisHisGlyAlaTyrPro245250255TyrAspValProAspTyrAlaSer260<210>15<211>1383<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的：DAG1-Cpa<400>15atgacacagtctcaaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgc60aaggccagtcagaatgtgggtactaatgtagcctggtatcaacagaaaccagggcaatct120cctaaagcactgatttactcggcatcctaccggtacagtggagtccctgatcgcttcaca180ggcagtggatctgggacagatttcactctcaccattagcaatgtgcagtctgaagacttg240gcagattatttctgtcagcaatatagcagctatcctctcacgttcggaggggggaccaag300ctggaaataaaaggtggttcctctagatcttccctcgaggttcagctgcagcagtctggg360gctgaactggtgaagcctgggacttcagtgaggatatcctgcaaggcttctggctacacc420ttcacaaactactatatatactgggtgaagcagaggcctggacagggacttgagtggatt480ggatggatttatcctggaaatgttaatactaagtacaatgagaagttcaagggcaaggcc540acactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcagcctgacctct600gaggactctgcggtctatttctgtgcaagaagggggactgggacggtcgtttttgactac660tggggccacggcaccactcttacagtctcctcagccaaaacaacacccccatctgtcact720agtggccaggccggccagcaccatcaccatcaccatggcgcatacccgtacgacgttccg780gactacgcttctggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcatca840aaagaatatgcaagaggttttgctaaaacaggaaaatcaatatactatagtcatgctagc900atgagtcatagttgggatgattgggactatgcagcaaaggtaactttagctaactctcaa960aaaggaacagcaggatatatttatagattcttacacgatgtatcagagggtaatgatcca1020tcagttggaaagaatgtaaaagaactagtagcttacatatcaactagtggtgaaaaagat1080gctggaacagatgactacatgtattttggaatcaaaacaaaggatggaaaaactcaagaa1140tgggaaatggacaacccaggaaatgattttatgactggaagtaaagatacttatactttc1200aaattaaaagatgaaaatctaaaaattgatgatatacaaaatatgtggattagaaaaaga1260aaatatacagcattcccagatgcttataagccagaaaacataaaggtaatagcaaatgga1320aaagttgtagtggacaaggatataaatgagtggatttcaggaaattcaacttataatata1380aaa1383<210>16<211>461<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的：翻譯的(461aa)-DAG1,(G4S)3,Cpa的C末端<400>16MetThrGlnSerGlnLysPheMetSerThrSerValGlyAspArgVal151015SerValThrCysLysAlaSerGlnAsnValGlyThrAsnValAlaTrp202530TyrGlnGlnLysProGlyGlnSerProLysAlaLeuIleTyrSerAla354045SerTyrArgTyrSerGlyValProAsp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