一種pla2r抗體檢測試紙條及制作、檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種PLA2R抗體檢測試紙條及制作、檢測方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 膜性腎病按發(fā)病原因可分為特發(fā)性和繼發(fā)性膜性腎病，其診斷上要依靠臨床表現(xiàn) 及腎臟穿刺術(shù)。腎臟穿刺術(shù)是一種侵入式的診斷方法，對病人有一定的傷害。國外研究發(fā) 現(xiàn)約75%的特發(fā)性膜性腎病患者可W通過血清學(xué)檢測檢出抗PLA2R抗體，國內(nèi)也有文獻顯 示在國人中檢測陽性率更高，達(dá)到82%，而繼發(fā)性膜性腎病及其他類型腎小球疾病患者的 檢出率很低，健康人群均為陰性。血清學(xué)PLA2R抗體的定量檢測可W為特發(fā)性膜性腎病的 初篩和病情監(jiān)測提供輔助作用。因此，開發(fā)非創(chuàng)傷、低風(fēng)險、安全、廉價、精確和快速的PLA2R 定量測定試劑盒有極其重要的意義。
[0003] 免疫層析技術(shù)W多種膜材組合為固定相，作為液相的樣品通過毛細(xì)流原理從加樣 一端泳流至標(biāo)記物墊上，與固定在標(biāo)記物墊上的抗原或抗體標(biāo)記物（如膠體金、巧光稀± 元素等）反應(yīng)形成免疫復(fù)合物，該帶有標(biāo)記的免疫復(fù)合物繼續(xù)通過涌流到達(dá)反應(yīng)膜上固定 的檢測線，與檢測線上的抗原或抗體發(fā)生免疫反應(yīng)從而被截留富集顯色，達(dá)到快速檢測的 目的。免疫層析技術(shù)最常見的標(biāo)記物是膠體金，應(yīng)用非常廣泛，也非常成功。由于膠體金標(biāo) 記是通過靜電吸附的原理，在流體中不穩(wěn)定，標(biāo)記的分子容易脫落，且只有膠體金顆粒富集 到一定肉眼可見的量的時候才能判讀，同時，膠體金免疫層析技術(shù)只可對被檢物定性分析。 目前，通過膠體金免疫層析技術(shù)來快速檢測磯脂酶A2受體（PLA2R)抗體的只有在公布號為 CN102159951A中提到，但如上所述，不能定量且膠體金穩(wěn)定性差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種PLA2R抗體檢測試紙條及制作、檢測方法，能夠準(zhǔn)確、 快速、靈敏、定量的檢測人血中的PLA2R抗體。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題，所采用的技術(shù)方案是提供一種PLA2R抗體檢測試紙條及 制作、檢測方法。具體的，包括一個檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括PLA2R抗體檢測卡及 樣品緩沖液，PLA2R抗體檢測卡內(nèi)裝有PLA2R抗體檢測試紙條。檢測卡可由巧光分析儀測 出PLA2R抗體濃度值。所述試紙條包括在粘性底板上依次搭接的樣本墊、結(jié)合物墊、硝酸纖 維素膜和吸水紙；所述的結(jié)合物墊上噴涂有PLA2R偶聯(lián)的量子點，所述的硝酸纖維素膜上 包被有PLA2R抗原作為檢測線，硝酸纖維素膜上還包被有PLA2R抗體作為質(zhì)控線。檢測卡 是W雙抗原夾屯、法模式檢測PLA2R抗體。
[0006] 所述PLA2R，可W是天然純化的PLA2R，也可W是基因重組獲得的PLA2R或PLA2R 片段；PLA2R抗體是由PLA2R免疫動物所得到的PLA2R抗體，可W是諸如兔源、羊源或其他 哺乳動物來源的多克隆抗體，也可W是鼠源單克隆抗體。
[0007] 所述量子點為包括IB、IIB、IIIA、IVA、VA、VIA族中的兩種W上元素組成的單 個晶核結(jié)構(gòu)，如CdS、CdSe、CdTe、aiSe、InP、InAs、HgCdTe等，或是核殼結(jié)構(gòu)，如CdSe/ZnS、ZnCdS/ZnS、MnSe/ZnSe/ZnS、CuInZnS/ZnS等。
[0008] 量子點由W上元素構(gòu)成外，還具有表面修飾基團，如-COOH、-畑2、-SH、-CHO等基 團，可W通過一些化學(xué)試劑如戊二醒、碳二亞胺等偶聯(lián)生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸及其他 有機分子。
[0009] 所述量子點的粒徑范圍為2~lOOOnm，激發(fā)光波長范圍為200~600nm，發(fā)射光波 長為400~800nm。
[0010] 一種PLA2R抗體檢測試紙條的制作方法，包括W下步驟：
[0011] a.用量子點偶聯(lián)PLA2R得到量子點-PLA2R復(fù)合物，并將其噴涂在結(jié)合物墊上； [001引b.分別將PLA2R包被到硝酸纖維素膜上作為檢測線，將PLA2R抗體包被到硝酸纖 維素膜上作為質(zhì)控線，檢測線和質(zhì)控線間的距離為3~10mm。
[0013]C.在粘性底板上依次搭接樣本墊、噴涂有量子點-PLA2復(fù)合物的結(jié)合物墊、設(shè)置 有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜、吸水紙，并裁切成所需寬度即為PLA2R抗體檢測試紙 條。
[0014] 檢測線和質(zhì)控線的制備方法為；分別用0. 005-0. 2M，P冊.0-pH9. 0的包被緩沖液 稀釋PLA2R和PLA2R抗體至0.l-5mg/ml，所述包被緩沖液為磯酸鹽緩沖液、棚砂、碳酸鹽緩 沖液，可含糖、醇類中的一種。用劃膜儀或噴膜儀分別將PLA2R和PLA2R抗體包被到硝酸 纖維素膜上，包被濃度為0.4-2y1/cm;噴涂完畢后，放置在環(huán)境濕度為30% W下，溫度在 16°C-45°C的環(huán)境中，烘干比W上，封存。
[0015] PLA2R偶聯(lián)量子點的方法；將PLA2R加入到量子點溶液中或是將量子點加入到 PLA2R溶液中偶聯(lián)得到量子點-PLA2R復(fù)合物；所述量子點可在適當(dāng)?shù)娜芤褐谢罨罨?劑可W為EDC、N服或戊二醒或其他交聯(lián)劑等，將量子點與活化劑結(jié)合即的量子點溶液。
[0016] 結(jié)合物墊上噴涂量子點-PLA2R復(fù)合物的條件是：將量子點-PLA2R復(fù)合物稀釋到 稀釋5-50倍，用噴膜儀按2-100 y 1/cm的量噴涂到結(jié)合物墊上，在環(huán)境濕度小于30%，溫度 在35-37°C的環(huán)境下烘烤1-化，干燥后封存。
[0017] 所述PLA2R抗體檢測卡，包括上殼體和下殼體，所述上殼體與下殼體間放置 有PLA2R抗體檢測試紙條，所述上殼體上設(shè)置有加樣孔、觀察窗和信息區(qū)，所述加樣孔與 PLA2R抗體檢測試紙條上的樣本墊對應(yīng)，觀察窗與硝酸纖維素膜上的檢測線和質(zhì)控線對應(yīng)； 所述信息區(qū)上噴涂有用于識別病人ID的二維碼、條形碼或磁卡；所述PLA2R抗體檢測卡同 樣品緩沖液一起裝在試劑盒內(nèi)，試劑盒上設(shè)置有標(biāo)定巧片。
[001引本發(fā)明還提供了一種PLA2R抗體的檢測方法；包括W下步驟：
[0019] 1)先用試劑盒上的標(biāo)定巧片標(biāo)定巧光分析儀，保存標(biāo)定數(shù)據(jù)；
[0020] 2)取10微升血清或血漿樣品，或15微升全血樣品加入樣品緩沖液，混合后10秒 鐘，加入檢測卡加樣孔；
[0021] 3)將檢測卡插入巧光分析儀的檢測孔，放置3-4分鐘，巧光分析儀即可讀出PLA2R 抗體的濃度值。
[0022] 有益效果；將量子點和免疫層析技術(shù)相結(jié)合，可使試紙條既具有穩(wěn)定性高的優(yōu)點， 同時，又可對PLA2R抗體進行定量檢測，且檢測又靈敏度高；該檢測方法還具有檢測時間 短，效率高的特點。相對于傳統(tǒng)的膠體金和有機巧光染料，量子點具有穩(wěn)定、可定量的優(yōu)點， 因此，可W很好的檢測出PLA2R抗體的存量。本發(fā)明利用量子點免疫層析法，非創(chuàng)傷、低風(fēng) 險、安全、廉價、精確和快速的定量檢測血清、血漿和全血中的PLA2R抗體含量，可W為特發(fā) 性膜性腎病的初篩和病情監(jiān)測提供輔助作用。
【具體實施方式】
[0023] 一種檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括PLA2R抗體檢測卡及樣品緩沖液，PLA2R抗 體檢測卡內(nèi)裝有PLA2R抗體檢測試紙條。所述試紙條包括在粘性底板上依次搭接的樣本 墊、結(jié)合物墊、硝酸纖維素膜和吸水紙。所述的結(jié)合物墊上噴涂有PLA2R偶聯(lián)的量子點，所 述的硝酸纖維素膜上包被有PLA2R抗原作為檢測線，硝酸纖維素膜上還包被有PLA2R抗體 作為質(zhì)控線。檢測卡是W雙抗原夾屯、法模式檢測PLA2R抗體。
[0024] 所述PLA2R，可W是天然純化的PLA2R，也可W是基因重組獲得的PLA2R或PLA2R 片段，在本文中均WPLA2R代替；PLA2R抗體是由PLA2R免疫動物所得到的PLA2R抗體，可 W是諸如兔源、羊源或其他哺乳動物來源的多克隆抗體，也可W是鼠源單克隆抗體。
[0025] 所述量子點為包括IB、IIB、IIIA、IVA、VA、VIA族中的兩種W上元素組成的單 個晶核結(jié)構(gòu)，如CdS、CdSe、CdTe、aiSe、InP、InAs、HgCdTe等，或是核殼結(jié)構(gòu)，如CdSe/ZnS、 ZnCdS/ZnS、MnSe/ZnSe/ZnS、CuInZnS/ZnS等。
[0026] 量子點由W上元素構(gòu)成外，還具有表面修飾基團，如-COOH、-畑2、-SH、-C冊等基 團，可W通過一些化學(xué)試劑如戊二醒、碳二亞胺等偶聯(lián)生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸及其他 有機分子。
[0027] 所述量子點的粒徑范圍為2~lOOOnm，激發(fā)光波長范圍為200~600nm，發(fā)射光波 長為400~800nm。
[0028] 所述PLA2R抗體檢測卡，包括上殼體和下殼體，所述上殼體與下殼體間放置 有PLA2R抗體檢測試紙條，所述上殼體上設(shè)置有加樣孔、觀察窗和信息區(qū)，所述加樣孔與 PLA2R抗體檢測試紙條上的樣本墊對應(yīng)，觀察窗與硝酸纖維素膜上的檢測線和質(zhì)控線對應(yīng)； 所述信息區(qū)上噴涂有用于識別病人ID的二維碼、條形碼或磁卡；所述PLA2R抗體檢測卡同 樣品緩沖液一起裝在試劑盒內(nèi)，試劑盒上設(shè)置有標(biāo)定巧片。
[0029] 本發(fā)明還提供了一種PLA2R抗體的檢測方法；包括W下步驟：
[0030] 1)先用試劑盒上的標(biāo)定巧片標(biāo)定巧光分析儀，保存標(biāo)定數(shù)據(jù)；
[0031] 2)取10微升血清