專利名稱：雞馬立克氏病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雞馬立克氏病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，特別是指一種潮汐式生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)雞馬立克氏病毒的方法。
背景技術(shù)：
馬立克氏病(Marek，s disease, MD)是由皰疹病毒科的馬立克氏病毒(Marek，s disease virus,MDV)引起的雞的一種傳染性腫瘤性疾病，以淋巴組織增生和腫瘤形成為特征，在外周神經(jīng)、性腺、虹膜各種臟器、肌肉和皮膚發(fā)生單核細(xì)胞浸潤。MD在臨床上引起腫瘤和死亡的同時，更重要的是損害感染雞的免疫器官，造成免疫抑制，導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降和對接種疫苗的免疫應(yīng)答降低或不應(yīng)答，引發(fā)其他多種疾病的并發(fā)和繼發(fā)感染，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。疫苗接種仍是目前控制馬立克氏病的有效途徑之一。疫苗生產(chǎn)的關(guān)鍵點(diǎn)就是作為抗原的病毒的生產(chǎn)。目前使用的商品化雞馬立克氏病疫苗大都是用原代雞胚成纖維細(xì)胞作為制苗材料，以獲得馬立克氏病毒。產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)多采用傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，如《雞馬立克氏病二價活疫苗(CVI988/Rispens+HVT)生產(chǎn)工藝的優(yōu)化》(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，顧丙生，2007年碩士論文)一文中使用了轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)雞馬立克氏病病毒。但轉(zhuǎn)瓶方法在生產(chǎn)中細(xì)胞所能增殖的區(qū)域僅限于培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶的有限面積，培養(yǎng)的環(huán)境條件難以檢測和控制，因此細(xì)胞密度低，勞動強(qiáng)度大，批間差異大，病毒含量不高引起質(zhì)量不穩(wěn)定，操作過程易污染，疫苗產(chǎn)量及質(zhì)量受到極大限制。生物反應(yīng)器技術(shù)高密度生產(chǎn)是七十年代新開發(fā)的技術(shù)，利用此技術(shù)連續(xù)培養(yǎng)工藝生產(chǎn)具有良好的商業(yè)開發(fā)前景。利用生物反應(yīng)器規(guī)?；a(chǎn)可以克服轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的以上缺陷，它具有操作方便、占地小、節(jié)省人工、可控程度高、病毒含量高和產(chǎn)量高、易于進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化控制。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種雞馬立克氏病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法， 以解決雞馬立克氏病疫苗的產(chǎn)量及質(zhì)量不佳的問題。技術(shù)方案本發(fā)明的雞馬立克氏病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，包括如下步驟1)在生物反應(yīng)器中，接種雞胚成纖維細(xì)胞至生物反應(yīng)器內(nèi)的微載體上，進(jìn)行細(xì)胞的吸附培養(yǎng)；2)在細(xì)胞的吸附培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)；3)將雞馬立克氏病毒接種到擴(kuò)增培養(yǎng)的雞胚成纖維細(xì)胞上，進(jìn)行病毒的吸附培養(yǎng)；4)在病毒的吸附培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行病毒的增殖培養(yǎng)；5)在接種的雞胚成纖維細(xì)胞CPE達(dá)到70%以上時，收獲病毒液，保存病毒液；
其中，本發(fā)明的生物反應(yīng)器為潮汐式生物反應(yīng)器。優(yōu)選地，本發(fā)明的所述微載體由選自聚酯、明膠或多糖的一種或幾種制成。優(yōu)選地，本發(fā)明的所述微載體以0. 1\108 3.0\108沈118/^的終密度接種細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明的所述微載體以2. 2X108cells/g的終密度接種細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明的所述微載體的添加量為5 30g/L。優(yōu)選地，本發(fā)明的步驟2)中接種時的細(xì)胞濃度為0. 5X107 1.0X108Cells/g。優(yōu)選地，本發(fā)明的所述雞馬立克氏病毒為血清I型、血清II型和血清III型中的一種或一種以上的組合。優(yōu)選地，本發(fā)明的步驟幻中所述雞馬立克氏病毒接種的感染復(fù)數(shù)為0. 02。優(yōu)選地，本發(fā)明的步驟1)中所述的吸附培養(yǎng)和步驟2、中所述的擴(kuò)增培養(yǎng)使用含 3% 5% (V/V)牛血清的M199細(xì)胞培養(yǎng)液；步驟3)中所述的病毒吸附培養(yǎng)和步驟4)中所述的病毒增殖培養(yǎng)使用2% (V/V)牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，其中所述的牛血清為胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。優(yōu)選地，本發(fā)明的步驟1)-步驟4)中載體罐中培養(yǎng)液的液面上下行速度為0. 5 50L/分鐘，液面在載體上下端點(diǎn)停滯時間為0 150s，步驟1)和步驟幻程序運(yùn)行為60 240分鐘。優(yōu)選地，本發(fā)明在步驟1)至步驟4)的培養(yǎng)過程中控制溫度37°C，pH調(diào)節(jié)7.0 7. 5，二氧化碳濃度為3% 5%的條件下進(jìn)行。本發(fā)明的另一目的在于提供一種使用上述大規(guī)模培養(yǎng)方法獲得的雞馬立克氏病病毒液。本發(fā)明的又一個方面為由上述方法制備雞馬立克氏病毒在疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用。由上可以看出，本發(fā)明創(chuàng)造性地使用潮汐式生物反應(yīng)器生產(chǎn)雞馬立克氏病毒，而且對潮汐式培養(yǎng)方法進(jìn)行了工藝的優(yōu)化和參數(shù)的調(diào)整，使得大規(guī)模生產(chǎn)具有高質(zhì)量、免疫力強(qiáng)的雞馬立克氏病疫苗成為可能。本發(fā)明的大規(guī)模生產(chǎn)雞馬立克氏病毒的方法，克服了傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶或搖瓶培養(yǎng)，不能對培養(yǎng)液的養(yǎng)分、PH及溶氧等培養(yǎng)條件進(jìn)行實(shí)時調(diào)整，無法保證細(xì)胞處于最佳培養(yǎng)狀態(tài)的缺點(diǎn)；克服了傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶或搖瓶培養(yǎng)，操作程序繁瑣，有污染風(fēng)險的暴露點(diǎn)多，生產(chǎn)工藝難放大的缺點(diǎn)；克服了轉(zhuǎn)瓶或搖瓶培養(yǎng)，批間差異大，生產(chǎn)質(zhì)量難以控制，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。因此，本發(fā)明的大規(guī)模生產(chǎn)雞馬立克氏病毒的方法具有條件可控、操作簡便、污染風(fēng)險小、無過敏原、生產(chǎn)批間差異小等優(yōu)點(diǎn)，病毒質(zhì)量好和產(chǎn)量可以放大，能夠提供產(chǎn)品規(guī)模大、成本低、品質(zhì)高的雞馬立克氏病疫苗。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例中使用的潮汐式生物反應(yīng)器示意圖。
具體實(shí)施例方式本實(shí)施例中采用的生物反應(yīng)器是美國CESCO公司生產(chǎn)的TideCell-020型，載體罐體積為20L，培養(yǎng)基袋體積為200L。
生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)見圖1，其主要組成部分包括進(jìn)料桶、收料桶、自動饋料儀、PH/ DO監(jiān)控器、恒溫振蕩箱、培養(yǎng)液袋、電腦控制器、載體罐、載體、恒溫培養(yǎng)艙、進(jìn)/取樣管。各組成部分的主要功能如下載體罐放置于恒溫培養(yǎng)艙中，恒溫培養(yǎng)艙為載體罐提供一個恒溫的環(huán)境。載體罐是細(xì)胞培養(yǎng)與病毒增殖的場所，細(xì)胞貼附生長在載體罐內(nèi)部的載體上，當(dāng)培養(yǎng)液泵入載體罐時，載體罐內(nèi)的培養(yǎng)液液面上升并淹沒細(xì)胞，向細(xì)胞供給養(yǎng)分，并將細(xì)胞的新陳代謝產(chǎn)物從細(xì)胞上去除。當(dāng)載體罐內(nèi)的培養(yǎng)液被泵出時，載體罐中的培養(yǎng)液液面隨之下降，細(xì)胞露出，進(jìn)行通風(fēng)供氧。這個重復(fù)的運(yùn)動使載體上的細(xì)胞能夠得到足夠的營養(yǎng)和氧氣，同時產(chǎn)生的代謝廢物如(X)2能夠有效地被排出去。載體罐的蓋子上裝有數(shù)根管道，這些管道的作用包括人工手動方式向載體罐內(nèi)注入液體(如接種細(xì)胞懸液等)或排出載體罐內(nèi)的液體；由電腦控制器向載體罐注入氣體， 氣體通常是壓縮空氣、氧氣及(X)2三種的混合物，三種氣體在混合物中的比例可以自動調(diào)節(jié)控制，以適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)需要。電腦控制器可自動控制混合氣體向載體罐內(nèi)的注入與排出，并為潮汐提供動力。培養(yǎng)液袋用以盛裝培養(yǎng)液，并通過管道與載體罐底部相通，通過與載體罐之間的液體流動，從而完成潮汐過程。培養(yǎng)液在潮汐過程中的灌流速度可通過電腦控制器進(jìn)行調(diào)整。培養(yǎng)液的換液量是指在一次潮汐過程中，泵入或泵出載體罐的液體量，換液量的大小決定了載體罐內(nèi)液面頂部和底部所處的位置。在培養(yǎng)液袋與載體罐之間相連通的管道上設(shè)有進(jìn)/取樣管，可使用無菌注射器通過進(jìn)/取樣管對培養(yǎng)液進(jìn)行取樣，用以檢測其中的葡萄糖含量及病毒含量等指標(biāo)。恒溫振蕩箱通過加熱與振蕩，來維持培養(yǎng)液袋內(nèi)培養(yǎng)液溫度的恒定及成分的勻質(zhì)性。收料桶及進(jìn)料桶均通過自動饋料儀與培養(yǎng)液袋相連，培養(yǎng)液袋內(nèi)的培養(yǎng)液需要進(jìn)行收獲時，可通過自動饋料儀進(jìn)入收料桶，而進(jìn)料桶內(nèi)的培養(yǎng)液則可以通過自動饋料儀對培養(yǎng)液袋進(jìn)行補(bǔ)充。pH/DO監(jiān)控器可以監(jiān)測培養(yǎng)液袋內(nèi)培養(yǎng)液的酸堿度(pH)及溶氧(DO)(溶氧是指氧氣在培養(yǎng)液中的溶解飽和度)，并通過向培養(yǎng)液袋內(nèi)自動注入堿性溶液(如NaOH溶液或 NaHCO3溶液)將培養(yǎng)液的pH值控制在合適范圍內(nèi)。電腦控制器可以調(diào)節(jié)控制多種參數(shù)，如潮汐過程中載體罐內(nèi)培養(yǎng)液的潮汐速率及頻率、恒溫培養(yǎng)艙的溫度、溶氧、CO2濃度(指載體罐內(nèi)液面上方的混合氣體中CO2所占的體積百分比)等。對培養(yǎng)液中葡萄糖含量的調(diào)節(jié)是通過人工方式進(jìn)行，根據(jù)對培養(yǎng)液中剩余葡萄糖的含量測定結(jié)果及培養(yǎng)液的總體積計(jì)算出需補(bǔ)加的葡萄糖量，然后通過注射器將高濃度的葡萄糖溶液從進(jìn)/取樣管處注入培養(yǎng)液。采用的載體為該公司生產(chǎn)的BioNocII聚酯纖維，該纖維是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有親水性和生物無害性，Ig載體提供MOOcm2的貼壁面積，能夠提供約1. OX IO9細(xì)胞的生長空間，每升載體罐體積需要數(shù)量為Ilg的BioNocII聚酯纖維。本實(shí)施例中，雞馬立克氏病毒為血清I型的CVI988/Rispens株，公開于 CN100869B,保藏號為CCTCC002，為目前常見的馬立克氏病毒，具有普遍意義。其他類型的雞馬立克氏病毒也可以使用本發(fā)明的實(shí)施例方法生產(chǎn)獲得。為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)施例1雞馬立克氏病毒的大規(guī)樽培養(yǎng)使用上述潮汐式反應(yīng)器，制備步驟如下(1)制備雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)種子液，使細(xì)胞總數(shù)達(dá)到2. OX IO9個。(2)在上述潮汐式生物反應(yīng)器中，向含有載體罐中加入步驟(1)所述的CEF細(xì)胞種子液，向培養(yǎng)基袋加入500L含4% (ν/ν)牛血清的Μ199細(xì)胞生長液，同時連接載體罐與培
養(yǎng)基袋。(3)在37°C、pH 7. 2、3. 5% CO2環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞，設(shè)置培養(yǎng)參數(shù)如下，細(xì)胞吸附程序液面上升速率(up rate) ^00ml/min、液面頂部停留時間(hold time) 15s，液面下降速率(down rate06OOml/min、液面底部停留時間(hold time) IOs ；吸附程序持續(xù) 4h ；切換細(xì)胞培養(yǎng)程序液面上升速率(up rate)2000ml/min、液面頂部停留時間(hold time) 10s，液面下降速率(down rate) 2000ml/min、液面底部停留時間(hold time)2min。(4)待細(xì)胞濃度達(dá)到2. 2X108Cells/g載體，將M199細(xì)胞生長液全部抽出，換上 2% (ν/ν)牛血清的DMEM細(xì)胞維持液，接種雞馬立克氏病毒。(5)在37°C、pH 7.2,3.5% CO2環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)病毒；設(shè)置培養(yǎng)參數(shù)如下，病毒吸附程序病毒吸附程序液面上升速率(up rate) 2300ml/min、液面頂部停留時間(hold time)2min，液面下降速率(down rate)2300ml/min、液面底部停留時間(hold time) IOs ；吸附程序持續(xù) 4h ；切換細(xì)胞培養(yǎng)程序液面上升速率(up rate) 1900ml/min、液面頂部停留時間(hold time) 20s，液面下降速率(down rate) 1900ml/min、液面底部停留時間(hold time)2min。(6)細(xì)胞病變率(CPE)達(dá)70%以上時收獲病毒。雞馬立克氏病毒種毒的檢驗(yàn)按照《中華人民共和國藥典》2005版第三部附錄15 頁、19頁、20頁進(jìn)行檢驗(yàn)，無細(xì)菌和霉菌、支原體、外源病毒污染，另外無雞傳染性貧血病毒污染。安全性和免疫原性均符合《中華人民共和國獸藥生物制品規(guī)程》。測定病毒含量方法如下將CEF接種于細(xì)胞方瓶，待到細(xì)胞長成單層，按常規(guī)方法制備次代CEF，接種于M孔板，每板細(xì)胞含量為1.2 X IO7個，培養(yǎng)8 1 備用；10倍系列稀釋病毒液取10_2、IO-3,10_4、10_5、10_6、IO-7稀釋度各接種上述制備好的M孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 每孔0.1ml，每個稀釋度設(shè)置4個重復(fù)。觀察細(xì)胞病變率，計(jì)算蝕斑數(shù)。制苗毒液每1.0ml 病毒含量1. OXIO7PFUo實(shí)施例2不同培養(yǎng)系統(tǒng)增殖雞馬立克氏病毒的相關(guān)比較將上述潮汐式生物反應(yīng)器與3000mL轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)雞馬立克氏病毒進(jìn)行了比較，其中轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)中使用的條件和方法為37°C恒溫溫室，轉(zhuǎn)瓶機(jī)8r/h培養(yǎng)。1)在3000ml轉(zhuǎn)瓶中生產(chǎn)雞馬立克氏病毒，先制備雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，以終濃度1. 5X106cells/ml接種至3000ml轉(zhuǎn)瓶，加細(xì)胞生長液至300ml。置37°C溫室中于轉(zhuǎn)瓶機(jī)上5r/h培養(yǎng)，以此方式培養(yǎng)細(xì)胞至24h接種雞馬立克氏病毒，接毒前先把3000ml轉(zhuǎn)瓶中的細(xì)胞生長液倒掉，按感染復(fù)數(shù)0. 02進(jìn)行接毒，補(bǔ)加細(xì)胞維持液至300ml，置37°C溫室中于轉(zhuǎn)瓶機(jī)上8r/h培養(yǎng)，此過程為病毒吸附Ih后。自接毒之時起算培養(yǎng)至72h，收獲細(xì)胞，1500r/min離心IOmin棄上清并用30ml凍存保護(hù)液懸浮，分裝安瓿瓶，密封后置程序降溫儀再轉(zhuǎn)入液氮中保存，測定蝕斑含量PFU。2)在20L的生物反應(yīng)器中生產(chǎn)雞馬立克氏病毒，方法步驟同實(shí)施例1。3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果3000ml轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)雞馬立克氏病毒平均蝕斑數(shù)為2. OX 106PFU/ml， 而20L反應(yīng)器中培養(yǎng)雞馬立克氏病毒的平均蝕斑數(shù)為1.0X107PFU/ml。各項(xiàng)參數(shù)比較具體
見下表。
權(quán)利要求
1.一種雞馬立克氏病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，包括如下步驟1)在生物反應(yīng)器中，接種雞胚成纖維細(xì)胞至生物反應(yīng)器內(nèi)的微載體上，進(jìn)行細(xì)胞的吸附培養(yǎng)；2)在細(xì)胞的吸附培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)；3)將雞馬立克氏病毒接種到擴(kuò)增培養(yǎng)的雞胚成纖維細(xì)胞上，進(jìn)行病毒的吸附培養(yǎng)；4)在病毒的吸附培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行病毒的增殖培養(yǎng)；5)在接種的雞胚成纖維細(xì)胞CPE達(dá)到70%以上時，收獲病毒液，保存病毒液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞馬立克氏病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，所述微載體由選自聚酯、明膠或多糖的一種或幾種制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞馬立克氏病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，所述微載體以0. IXlO8- 3. OX 108cells/g的終密度接種細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞馬立克氏病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，所述微載體以2. 2X108cells/g的終密度接種細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞馬立克氏病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，所述微載體的添加量為5 30g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞馬立克氏病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟2)中接種時的細(xì)胞濃度為0. 5X IO7 1. OX 108cells/g。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞馬立克氏病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，所述雞馬立克氏病病毒為血清I型、血清II和血清III中的一種或一種以上的組合。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞馬立克氏病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟3)中所述雞馬立克氏病病毒接種的感染復(fù)數(shù)為0. 0001 1. 5。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞馬立克氏病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟1)中所述的吸附培養(yǎng)和步驟2)中所述的擴(kuò)增培養(yǎng)使用含3% 5% (V/V)牛血清的M199細(xì)胞培< 養(yǎng)液；步驟幻中所述的病毒吸附培養(yǎng)和步驟4)中所述的病毒增殖培養(yǎng)使用2% (V/V)牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，其中所述的牛血清為胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。
10.根據(jù)權(quán)利要求1中任一項(xiàng)所述的馬立克氏病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟1)-步驟4)中載體罐中培養(yǎng)液的液面上下行速度為0. 5 50L/分鐘，液面在載體上下端點(diǎn)停滯時間為0 150s，步驟1)和步驟幻程序運(yùn)行為60 240分鐘。
11.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的雞馬立克氏病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，在步驟 1)至步驟4)的培養(yǎng)過程中控制溫度37°C，pH調(diào)節(jié)7.0 7. 5，二氧化碳濃度為3% 5% 的條件下進(jìn)行。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法獲得的雞馬立克氏病病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大規(guī)模生產(chǎn)雞馬立克氏病毒的方法，利用生物反應(yīng)器，以細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)雞馬立克氏病病毒，將制備病毒用雞胚成纖維細(xì)胞接種到含有培養(yǎng)液與微載體的載體罐，并將上述細(xì)胞與微載體混合均勻，使細(xì)胞貼附在微載體上；在適當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境下，提供上述細(xì)胞足夠的養(yǎng)分和適宜的氣體環(huán)境，使細(xì)胞在上述微載體上生長至接種濃度的5～10倍；換用細(xì)胞維持液，將雞馬立克氏病毒制成病毒懸液，使其吸附到上述細(xì)胞上；在適當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)病毒；連續(xù)培養(yǎng)3～4天后，收獲細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液；分裝安瓿瓶，密封后置于程序降溫儀，然后轉(zhuǎn)入液氮保存。該方法生產(chǎn)規(guī)模大、單批次產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本相對較低。
文檔編號C12R1/93GK102260650SQ20111019601
公開日2011年11月30日 申請日期2011年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月13日
發(fā)明者孫進(jìn)忠, 張?jiān)S科, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司