本文公開(kāi)了大腸桿菌抗原O25B的結(jié)構(gòu)以及O25B的用途、制備O25B的方法和包含O25B的生物綴合物。申請(qǐng)人已鑒定出負(fù)責(zé)產(chǎn)生O25B的大腸桿菌基因簇且充分表征O25B抗原的結(jié)構(gòu)。因此，本文提供了能夠在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生O25B的核酸。本文還提供了包含能夠產(chǎn)生O25B的核酸的宿主細(xì)胞(例如重組工程改造的宿主細(xì)胞)。此類(lèi)宿主細(xì)胞可用于生成包含連接至載體蛋白的O25B的生物綴合物，所述生物綴合物可用于例如配制治療劑(例如疫苗)。本文描述的O25B抗原也可用于生成抗體，所述抗體可用于例如治療方法(例如受試者的被動(dòng)免疫)中。本文還提供了包含O25B(單獨(dú)或與其它大腸桿菌抗原(例如O1、O2和O6和其亞血清型)組合)的組合物，其用于治療方法中，例如針對(duì)大腸桿菌(例如腸外病原性(諸如尿路病原性)大腸桿菌)感染對(duì)宿主接種疫苗。2.背景腸外病原性大腸桿菌(ExPEC)每年引起各種各樣造成顯著發(fā)病率、死亡率和成本的感染。泌尿道感染是人類(lèi)中由ExPEC引起的最常見(jiàn)病況。然而，ExPEC還引起危及生命的病況，諸如腦膜炎和敗血癥。細(xì)菌對(duì)抗生素的抗性是抵抗細(xì)菌感染中的主要問(wèn)題，且多藥物抗性(MDR)的大腸桿菌菌株正變得越來(lái)越普遍。Schito等人，2009,Int.J.Antimicrob.Agents34(5):407-413;和Pitout等人，2012,ExpertRev.Anti.Infect.Ther.10(10):1165-1176。因此，需要開(kāi)發(fā)針對(duì)ExPEC的有效疫苗。3.概述在一個(gè)方面，本文提供了包含編碼能夠產(chǎn)生本文公開(kāi)的新穎多糖大腸桿菌O25B的酶(例如糖基轉(zhuǎn)移酶)的核酸的原核宿主細(xì)胞。本文還提供了包含編碼能夠產(chǎn)生其它大腸桿菌抗原(例如O25A、O1、O2和O6和其亞血清型)的酶(例如糖基轉(zhuǎn)移酶)的核酸的宿主細(xì)胞。本文提供的宿主細(xì)胞可天然表達(dá)特異性產(chǎn)生目標(biāo)O抗原的核酸，或可使宿主細(xì)胞表達(dá)此類(lèi)核酸，即，在某些實(shí)施方案中，所述核酸對(duì)宿主細(xì)胞是異源的。在某些實(shí)施方案中，本文提供的宿主細(xì)胞包含編碼在蛋白N-糖基化中有活性的額外酶的核酸，例如，本文提供的宿主細(xì)胞還可包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸或編碼其它糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸。在某些實(shí)施方案中，本文提供的宿主細(xì)胞包含編碼載體蛋白(例如寡糖和/或多糖可附接以形成生物綴合物的蛋白)的核酸。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為大腸桿菌。參見(jiàn)部分5.3。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含大腸桿菌rfb(upec138)基因簇(SEQIDNO:12)或與大腸桿菌rfb(upec138)基因簇(SEQIDNO:12)約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的基因簇的原核宿主細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為大腸桿菌。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含大腸桿菌rfb(upec163)基因簇或與大腸桿菌rfb(upec163)基因簇約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的基因簇的原核宿主細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為大腸桿菌。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含大腸桿菌rfb(upec177)基因簇或與大腸桿菌rfb(upec177)基因簇約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的基因簇的原核宿主細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為大腸桿菌。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了經(jīng)重組工程改造以包含(例如通過(guò)將一種或多種載體/質(zhì)粒引入宿主細(xì)胞中)一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)以下基因(或與以下基因之一約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的核酸)的原核宿主細(xì)胞：rmlB(SEQIDNO:1)、rmlD(SEQIDNO:2)、rmlA(SEQIDNO:3)、rmlC(SEQIDNO:4)、wzx(SEQIDNO:5)、wekA(SEQIDNO:6)、wekB(SEQIDNO:7)、wzy(SEQIDNO:8)、wbbJ(SEQIDNO:9)、wbbK(SEQIDNO:10)和/或wbbL(SEQIDNO:11)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶(例如異源性寡糖基轉(zhuǎn)移酶)的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為大腸桿菌。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了經(jīng)重組工程改造以包含(例如通過(guò)將一種或多種載體/質(zhì)粒引入宿主細(xì)胞中)以下中的一種、兩種、三種、四種或更多種的原核宿主細(xì)胞：(i)dTDP-葡萄糖4,6-脫水酶；(ii)dTDP-6-脫氧-D-葡萄糖3,5-差向異構(gòu)酶；(iii)葡萄糖-1-磷酸胸苷基轉(zhuǎn)移酶；(iv)dTDP-4-脫氫鼠李糖3,5-差向異構(gòu)酶；(v)O抗原翻轉(zhuǎn)酶；(vi)dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPPα-1,3-鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶；(vii)UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPPα-1,3-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶；(viii)O抗原聚合酶；(ix)O-乙酰基轉(zhuǎn)移酶；(x)UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPPα-1,3-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶；和/或(xi)dTDP-Rha:GlcNAc-UPPα-1,3-鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶(例如異源性寡糖基轉(zhuǎn)移酶)的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為大腸桿菌。在某些實(shí)施方案中，本文提供的原核宿主細(xì)胞包括一個(gè)或多個(gè)基因的缺失或功能失活。參見(jiàn)5.3.1部分。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，waaL基因、gtrA基因、gtrB基因、gtrS基因或rfb基因簇(或rfb簇中的一種或多種基因)中的一個(gè)或多個(gè)從本文提供的原核宿主細(xì)胞的基因組中缺失或功能失活。由本文提供的原核宿主細(xì)胞表達(dá)的載體蛋白可選自本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何載體蛋白，例如脫毒的綠膿假單胞菌(P.aeruginosa)外毒素A(EPA；例如參見(jiàn)Ihssen等人(2010)Microbialcellfactories9,61)、CRM197、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、白喉類(lèi)毒素、破傷風(fēng)類(lèi)毒素、脫毒的金黃色葡萄球菌(S.aureus)溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、大腸桿菌FimH、大腸桿菌FimHC、大腸桿菌不耐熱腸毒素、大腸桿菌不耐熱腸毒素的脫毒變體、霍亂毒素B亞單元(CTB)、霍亂毒素、霍亂毒素的脫毒變體、大腸桿菌Sat蛋白、大腸桿菌Sat蛋白的過(guò)客(passenger)結(jié)構(gòu)域、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)肺炎球菌溶血素和其脫毒變體、空腸彎曲桿菌(C.jejuni)AcrA和空腸彎曲桿菌天然糖蛋白。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，由本文提供的原核宿主細(xì)胞表達(dá)的載體蛋白是脫毒假單胞菌外毒素(EPA)。在某些實(shí)施方案中，本文提供宿主細(xì)胞的載體蛋白包含使載體蛋白靶向入宿主細(xì)胞的周質(zhì)間隙中的信號(hào)序列。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，信號(hào)序列來(lái)自大腸桿菌DsbA、大腸桿菌外膜孔蛋白A(OmpA)、大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白(MalE)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovorans)果膠酸裂合酶(PelB)、FlgI、NikA或芽孢桿菌屬(Bacillussp.)木聚糖內(nèi)切酶(XynA)、不耐熱大腸桿菌腸毒素LTIIb、芽孢桿菌木聚糖內(nèi)切酶XynA或大腸桿菌鞭毛蛋白(FlgI)。在某些實(shí)施方案中，編碼由本文提供的宿主細(xì)胞表達(dá)的載體蛋白的核酸序列已被工程改造(例如經(jīng)由重組技術(shù))以編碼以下中的一種或多種：共有序列Asn-X-Ser(Thr)，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；和/或共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在某些實(shí)施方案中，由本文提供的宿主細(xì)胞表達(dá)的載體蛋白包含所述共有序列中的兩種、三種、四種、五種或更多種。參見(jiàn)5.3.2部分。在另一個(gè)方面，本文提供了產(chǎn)生包含N-連接至大腸桿菌O抗原(例如大腸桿菌O25B)的載體蛋白(例如EPA)的N-糖基化載體蛋白(在本文中也稱(chēng)為生物綴合物)的方法，所述方法包括：在適于產(chǎn)生蛋白的條件下培養(yǎng)本文描述的宿主細(xì)胞，并純化N-糖基化載體蛋白。使用宿主細(xì)胞(例如大腸桿菌)產(chǎn)生蛋白和分離由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。參見(jiàn)5.3部分。在另一個(gè)方面，本文提供了由本文提供的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的生物綴合物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含N-連接至大腸桿菌O25B的載體蛋白(例如EPA)的生物綴合物。參見(jiàn)5.4部分。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含連接至下文呈現(xiàn)的式O25B的化合物的載體蛋白(例如EPA)的生物綴合物：其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間的整數(shù)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，載體蛋白N-連接至式O25B的O抗原。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含連接至下文呈現(xiàn)的式O25B’的化合物的載體蛋白(例如EPA)的生物綴合物：其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間的整數(shù)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，載體蛋白N-連接至式O25B’的O抗原。在另一個(gè)方面，本文提供了來(lái)自ExPEC大腸桿菌菌株的分離O抗原，其中所述菌株產(chǎn)生O25B。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了來(lái)自大腸桿菌菌株upec138的分離O抗原。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了來(lái)自大腸桿菌菌株upec163的分離O抗原。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了來(lái)自大腸桿菌菌株upec177的分離O抗原。參見(jiàn)部分5.2。在另一個(gè)方面，本文提供了下文呈現(xiàn)的式O25B的分離大分子的群體：其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間的整數(shù)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，群體中至少80%的大分子的n在1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間。在另一個(gè)方面，本文提供了下文呈現(xiàn)的式O25B’的分離大分子的群體：其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間的整數(shù)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，群體中至少80%的大分子的n在1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間。在另一個(gè)方面，本文提供了使用O25B和/或包含O25B的生物綴合物生成抗O25B抗體的方法。本文還提供了根據(jù)此類(lèi)方法產(chǎn)生的抗體。參見(jiàn)5.5部分。在另一個(gè)方面，本文提供了包含本文提供的生物綴合物和/或本文提供的大分子(或其群體)的組合物(例如藥物組合物)。參見(jiàn)5.6部分。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含含有式O25B結(jié)構(gòu)的大分子的組合物(例如藥物組合物)：其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間的整數(shù)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含含有式O25B’結(jié)構(gòu)的大分子的組合物(例如藥物組合物)：其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間的整數(shù)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含本文描述的生物綴合物的組合物(例如藥物組合物)，其中所述生物綴合物包含連接至下文呈現(xiàn)的式O25B的化合物的載體蛋白(例如EPA)：其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間的整數(shù)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，載體蛋白N-連接至式O25B’的O抗原。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含本文描述的生物綴合物的組合物(例如藥物組合物)，其中所述生物綴合物包含連接至下文呈現(xiàn)的式O25B’的化合物的載體蛋白(例如EPA)：其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間的整數(shù)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，載體蛋白N-連接至式O25B’的O抗原。在某些實(shí)施方案中，本文提供的藥物組合物包含一種或多種額外大腸桿菌O抗原，其中所述抗原不是O25B(例如式O25B或式O25B’)，例如除來(lái)自大腸桿菌O25B血清型的抗原外的來(lái)自大腸桿菌的O抗原(例如ExPEC)；和/或一種或多種包含連接至大腸桿菌O抗原的載體蛋白的生物綴合物，其中所述抗原不是O25B(例如式O25B或式O25B’)。此類(lèi)組合物可包含一種或多種包含ExPECO抗原的額外大分子和/或一種或多種額外生物綴合物，例如O1A、O2和/或O6大分子和/或O1A、O2和/或O6生物綴合物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了除O25B大分子(例如包含式O25B或式O25B’的大分子)和/或O25B生物綴合物(例如包含連接至式O25B或式O25B’的載體蛋白的生物綴合物)外還包含一種或多種包含ExPECO抗原的額外大分子和/或一種或多種額外生物綴合物的組合物(例如藥物組合物)，其中所述額外大分子包含選自以下的結(jié)構(gòu)：a.式O25Ab.式O1Ac.式O1Bd.式O1Ce.式O6Glcf.式O6GlcNAcg.式O2。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了除O25B大分子(例如包含式O25B或式O25B’的大分子)和/或O25B生物綴合物(例如包含連接至式O25B或式O25B’的載體蛋白的生物綴合物)外還包含一種、兩種、三種、四種、五種、六種或七種大分子或包含所述大分子的生物綴合物的組合物(例如藥物組合物)，其中所述額外大分子包含選自以下的結(jié)構(gòu)：a.式O25A’b.式O1A’c.式O1B’d.式O1C’e.式O6Glc’f.式O6GlcNAc’g.式O2’。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含以下的組合物(例如藥物組合物)：(i)O25(例如O25A或O25B)大分子或包含O25(例如O25A或O25B)的生物綴合物；和(ii)O1大分子或包含O1的生物綴合物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O25大分子是O25B大分子。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O1大分子是O1A。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O1大分子是O1B。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O1大分子是O1C。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含以下的組合物(例如藥物組合物)：(i)O25(例如O25A或O25B)大分子或包含O25(例如O25A或O25B)的生物綴合物；和(ii)O2大分子或包含O2的生物綴合物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O25大分子是O25B大分子。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含以下的組合物(例如藥物組合物)：(i)O25(例如O25A或O25B)大分子或包含O25(例如O25A或O25B)的生物綴合物；和(ii)O6大分子(例如包含支鏈Glc單糖(O6Glc)或支鏈GlcNAc單糖(O6GlcNAc)的O6大分子)或包含O6的生物綴合物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O25大分子是O25B大分子。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O6大分子是包含支鏈Glc單糖(O6Glc)的O6大分子。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含以下中的至少兩種的組合物(例如藥物組合物)：(i)O25(例如O25A或O25B)大分子或包含O25(例如O25A或O25B)的生物綴合物；(ii)O1大分子或包含O1的生物綴合物；(iii)O2或包含O2的生物綴合物；和/或(iv)O6大分子(例如包含支鏈Glc單糖或支鏈GlcNAc單糖的O6大分子)或包含O6的生物綴合物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O25大分子是O25B大分子。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O1大分子是O1A。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O1大分子是O1B。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O1大分子是O1C。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O6大分子是包含支鏈Glc單糖的O6大分子(在本文中也稱(chēng)為O6Glc)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含O25B大分子、O1A大分子、O2大分子和包含支鏈Glc單糖的O6大分子的組合物(例如藥物組合物)。在某些實(shí)施方案中，所述大分子綴合至載體蛋白。在另一個(gè)方面，本文提供了預(yù)防個(gè)體(例如人類(lèi)個(gè)體)的ExPEC感染的方法，其包括向該個(gè)體施用藥學(xué)上有效量的本文描述的組合物(例如免疫原性組合物)。參見(jiàn)部分5.7。在另一個(gè)方面，本文提供了治療個(gè)體(例如人類(lèi)個(gè)體)的感染的方法，其中該個(gè)體感染ExPEC，所述方法包括向該個(gè)體施用藥學(xué)上有效量的本文描述的組合物(例如免疫原性組合物)。參見(jiàn)部分5.7。在另一個(gè)方面，本文提供了誘導(dǎo)個(gè)體(例如人類(lèi)個(gè)體)的針對(duì)ExPEC的免疫反應(yīng)的方法，其包括向該個(gè)體施用藥學(xué)上有效量的本文描述的組合物(例如免疫原性組合物)。參見(jiàn)部分5.7。在另一個(gè)方面，本文提供了誘導(dǎo)在個(gè)體(例如人類(lèi)個(gè)體)中產(chǎn)生針對(duì)ExPEC的調(diào)理吞噬抗體的方法，其包括向該個(gè)體施用藥學(xué)上有效量的本文描述的組合物(例如免疫原性組合物)。參見(jiàn)部分5.7。術(shù)語(yǔ)和縮寫(xiě)：OPS：O多糖；革蘭氏陰性細(xì)菌的O抗原。OPS在本文中也稱(chēng)為O抗原。rfb簇：編碼能夠合成O抗原骨架結(jié)構(gòu)的酶機(jī)構(gòu)的基因簇(例如大腸桿菌基因簇)。術(shù)語(yǔ)rfb簇可適用于任一O抗原生物合成簇，包括來(lái)自不屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌的那些。waaL：編碼具有位于周質(zhì)中的活性位點(diǎn)的膜結(jié)合酶的O抗原連接酶基因。所編碼酶將十一異戊二烯基磷酸酯(UPP)結(jié)合的O抗原轉(zhuǎn)移至脂質(zhì)A核心，形成脂多糖。wecA：wec簇中編碼的第一基因。所編碼蛋白催化GlcNAc磷酸酯從UDP-GlcNAc至UPP的轉(zhuǎn)移以形成UPP結(jié)合的GlcNAc。ECA：腸桿菌普通抗原。RU：重復(fù)單元。如本文所使用，RU設(shè)定為等于生物重復(fù)單元BRU。BRU描述O抗原的RU，因?yàn)樵摽乖隗w內(nèi)合成。UPP：十一異戊二烯基焦磷酸酯。LLO：脂質(zhì)連接的寡糖。2AB：2胺基苯甲酰胺。MS：質(zhì)譜。O25B：術(shù)語(yǔ)O25B是指來(lái)自本文鑒定的大腸桿菌的O25B抗原(大腸桿菌血清型O25的亞血清型)。本文提及的O25B涵蓋上文鑒定的式O25B和式O25B’。O25A：術(shù)語(yǔ)O25A是指大腸桿菌的O25A抗原(大腸桿菌血清型O25的亞血清型)。本文提及的O25A涵蓋上文鑒定的式O25A和式O25A’。O1A：術(shù)語(yǔ)O1A是指大腸桿菌的O1A抗原(大腸桿菌血清型O1的亞血清型)。本文提及的O1A涵蓋上文鑒定的式O1A和式O1A’。O1B：術(shù)語(yǔ)O1B是指大腸桿菌的O1B抗原(大腸桿菌血清型O1的亞血清型)。本文提及的O1B涵蓋上文鑒定的式O1B和式O1B’。O1C：術(shù)語(yǔ)O1C是指大腸桿菌的O1C抗原(大腸桿菌血清型O1的亞血清型)。本文提及的O1C涵蓋上文鑒定的式O1C和式O1C’。O2：術(shù)語(yǔ)O2是指大腸桿菌的O2抗原(大腸桿菌血清型O2)。本文提及的O2涵蓋上文鑒定的式O2和式O2’。O6：術(shù)語(yǔ)O6是指大腸桿菌的O6抗原(大腸桿菌血清型O6)。本文提及的O6A涵蓋上文鑒定的式O6A和式O6A’。生物綴合物：術(shù)語(yǔ)生物綴合物是指在宿主細(xì)胞背景中制備的蛋白(例如載體蛋白)和抗原(例如O抗原(例如O25B))之間的綴合物，其中宿主細(xì)胞機(jī)構(gòu)將抗原連接至蛋白(例如N-連接)。糖綴合物包括生物綴合物以及通過(guò)其它方式(例如通過(guò)蛋白和糖抗原的化學(xué)連接)制備的糖抗原(例如寡糖和多糖)-蛋白綴合物。當(dāng)結(jié)合數(shù)值使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"約"是指在所提及數(shù)值的±1、±5或±10%內(nèi)的任一數(shù)值。如本文所使用，在向個(gè)體施用治療劑(例如本文描述的組合物)的背景中，術(shù)語(yǔ)"有效量"是指具有預(yù)防和/或治療效應(yīng)的治療劑的量。在某些實(shí)施方案中，"有效量"是指足以實(shí)現(xiàn)一種、兩種、三種、四種或更多種以下效應(yīng)的治療劑的量：(i)降低或改善ExPEC感染或與其相關(guān)的癥狀的嚴(yán)重度；(ii)縮短ExPEC感染或與其相關(guān)的癥狀的持續(xù)時(shí)間；(iii)預(yù)防ExPEC感染或與其相關(guān)的癥狀的進(jìn)展；(iv)引起ExPEC感染或與其相關(guān)的癥狀的消退；(v)預(yù)防ExPEC感染或與其相關(guān)的癥狀的發(fā)生或發(fā)作；(vi)預(yù)防ExPEC感染或與其相關(guān)的癥狀的復(fù)發(fā)；(vii)減少與ExPEC感染相關(guān)的器官衰竭；(viii)減少患有ExPEC感染的個(gè)體的住院；(ix)縮短具有ExPEC感染的個(gè)體的住院長(zhǎng)度；(x)提高具有ExPEC感染的個(gè)體的存活；(xi)消除個(gè)體的ExPEC感染；(xii)抑制或減少個(gè)體中的ExPEC復(fù)制；和/或(xiii)增強(qiáng)或改善另一治療的預(yù)防或治療效應(yīng)。如本文所使用，在向個(gè)體施用兩種或更多種治療的語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)"組合"是指使用不止一種治療。術(shù)語(yǔ)"組合"的使用不限制向個(gè)體施用治療的順序。例如，第一治療(例如本文描述的組合物)可在向個(gè)體施用第二治療之前(例如5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、16小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)、與其同時(shí)或之后(例如5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、16小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之后)施用。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"個(gè)體"是指動(dòng)物(例如鳥(niǎo)類(lèi)、爬行動(dòng)物和哺乳動(dòng)物)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，個(gè)體是哺乳動(dòng)物，包括非靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(例如駱駝、驢、斑馬、牛、豬、馬、山羊、綿羊、貓、狗、大鼠和小鼠)和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(例如猴、黑猩猩和人)。在某些實(shí)施方案中，個(gè)體是非人動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，個(gè)體是農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物或?qū)櫸?例如狗、貓、馬、山羊、綿羊、豬、驢或雞)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，個(gè)體是人。在另一個(gè)實(shí)施方案中，個(gè)體是人類(lèi)嬰兒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，個(gè)體是人類(lèi)兒童。在另一個(gè)實(shí)施方案中，個(gè)體是人類(lèi)成人。在另一個(gè)實(shí)施方案中，個(gè)體是老人。在另一個(gè)實(shí)施方案中，個(gè)體是早產(chǎn)人類(lèi)嬰兒。術(shù)語(yǔ)"個(gè)體"和"患者"在本文中可互換使用。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"早產(chǎn)人類(lèi)嬰兒"是指在少于37周孕齡時(shí)出生的人類(lèi)嬰兒。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"人類(lèi)嬰兒"是指新生兒至1歲人。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"人類(lèi)幼兒"是指1歲至3歲的人。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"人類(lèi)兒童"是指1歲至18歲的人。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"人類(lèi)成人"是指18歲或以上的人。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"老人"是指65歲或以上的人。4.附圖簡(jiǎn)述圖1：用于O25A生物合成的途徑。箭頭指示個(gè)別酶轉(zhuǎn)化，指示酶名稱(chēng)。在細(xì)胞質(zhì)中通過(guò)O抗原簇中提供的酶或通過(guò)革蘭氏陰性宿主細(xì)胞的管家酶來(lái)制備核苷酸活化的糖。糖基磷酸酯轉(zhuǎn)移酶(WecA)將D-GlcNAc磷酸酯添加至十一異戊二烯基磷酸酯(UP)上，從而形成GlcNAc-UPP。特異性糖基轉(zhuǎn)移酶然后通過(guò)添加單糖來(lái)進(jìn)一步伸長(zhǎng)UPP-GlcNAc分子，從而形成生物重復(fù)單元(BRU)寡糖(WekABCWbuB)。所指示的酶的順序不是指在BRU合成期間的事件序列(通過(guò)<>指示)。BRU然后通過(guò)Wzx翻轉(zhuǎn)至周質(zhì)間隙中。Wzy線性聚合周質(zhì)BRU以形成O抗原多糖。通過(guò)Wzz控制聚合物長(zhǎng)度。許多細(xì)菌寡糖和多糖組裝于UPP上且然后轉(zhuǎn)移至其它分子，即，UPP是用于細(xì)菌中的寡糖和多糖的一般構(gòu)建平臺(tái)。在大腸桿菌和大部分其它革蘭氏陰性細(xì)菌中，O抗原通過(guò)大腸桿菌酶WaaL從UPP轉(zhuǎn)移至脂質(zhì)A核心以形成脂多糖(LPS)。圖2：通過(guò)大腸桿菌O25Arfb簇和O抗原例舉的用于wzx/wzy依賴(lài)性O(shè)抗原合成的rfb簇、結(jié)構(gòu)和途徑。A.顯示位于galF和gnd基因之間的大腸桿菌菌株E47a的rfb簇結(jié)構(gòu)。基因顯示為箭頭且根據(jù)基因產(chǎn)物的功能指示填充：黑色是用于核苷酸活化的單糖生物合成的基因，其不是大腸桿菌的管家譜(那些在基因組中的別處編碼)的一部分，黑色/白色斜條紋是負(fù)責(zé)將單一單糖單元添加至BRU、翻轉(zhuǎn)酶wzx和聚合酶wzy的糖基轉(zhuǎn)移酶。B.如呈現(xiàn)的O25AO抗原的BRU的化學(xué)結(jié)構(gòu)(參見(jiàn)Fundin等人，2003,MagneticResonanceinChemistry41,4)。圖3.A.O25A、O25B和O16BRU結(jié)構(gòu)。B.O25A、O25B和O16之間的O抗原生物合成簇(rfb簇)比較。黑色填充基因是參與核苷酸活化的單糖生物合成的基因，斜條紋是預(yù)測(cè)的糖基轉(zhuǎn)移酶基因，灰色填充指示BRU處理或轉(zhuǎn)運(yùn)基因，且垂直條紋顯示O-乙酰基轉(zhuǎn)移酶同源性?；疑蛑甘净蛑g高于25%的同源性評(píng)分；指示了詳細(xì)值。黑色和灰色細(xì)箭頭顯示用于wzy(O25A和O25B特異性)和O25B3’區(qū)域(O25B特異性)的分型PCR寡核苷酸的退火位置。圖4.來(lái)自流行病學(xué)研究的血清型分布。根據(jù)發(fā)生率對(duì)社區(qū)獲得性UTI樣品中鑒定的大腸桿菌O抗原血清型進(jìn)行分組。圖5.來(lái)自具有O25陽(yáng)性凝集表型的臨床分離物的LPS的銀染色和Western染色分析。菌株編號(hào)指示于凝膠泳道上方。生長(zhǎng)單獨(dú)的克隆且通過(guò)離心收獲OD均一化的生物質(zhì)。將沉淀溶解于SDSPAGEL?mmli緩沖液中且使用蛋白酶K處理以水解樣品中的所有蛋白。將標(biāo)準(zhǔn)銀染色應(yīng)用于A中顯示的PAGE凝膠，且在B中顯示用商業(yè)O25凝集抗血清探測(cè)來(lái)自相同運(yùn)行凝膠的含有電轉(zhuǎn)移材料的硝基纖維素膜。圖6.O25A和O25B樣品的2ABHPLC痕跡。制備來(lái)自菌株upec138(虛線)和upec436(實(shí)線)的2AB標(biāo)記的LLO樣品。收集各峰且通過(guò)箭頭指示從圖7中詳述的MS/MS片段化模式推斷的相應(yīng)BRU結(jié)構(gòu)。圖7.在母體離子m/z=1022(A；來(lái)自菌株upec138)或m/z=1021(B；來(lái)自u(píng)pec_436)的50’和62’洗脫時(shí)間下從圖6中所指示峰獲得的MS/MS片段化離子系列。相對(duì)于假設(shè)BRU的圖來(lái)顯示離子系列。圖8.源自O(shè)25B陽(yáng)性臨床分離物的2AB標(biāo)記的LLO樣品的去乙酰化。收集從具有O25B基因型的臨床分離物的2AB標(biāo)記的LLO獲得的50’洗脫時(shí)間下的O25B特異性峰，且在使用(實(shí)線)或不使用(虛線)NaOH處理用于NDCal的SpecialPatentProgramO-乙酰基的水解之后通過(guò)正相HPLC來(lái)進(jìn)行分析。圖9.O25A和O25B生物綴合物的單糖組成分析。產(chǎn)生O25生物綴合物，純化，且處理用于單糖組成分析。顯示樣品的C18HPLC痕跡。將源自O(shè)25A(實(shí)線)和O25B(虛線)的樣品與來(lái)自商業(yè)來(lái)源的單糖混合物(Glc、GlcNAc、Rha、FucNAc)進(jìn)行比較。單糖的洗脫時(shí)間由箭頭指示。圖10.O25A生物綴合物的表征。通過(guò)SDSPAGE分析4S-EPA-O25A生物綴合物的純化的最終主體(bulk)且通過(guò)直接考馬斯染色(C)和Western印跡使用抗EPA抗血清或抗O25抗血清觀察。圖11.O25B生物綴合物的表征。通過(guò)SDSPAGE分析4S-EPA-O25B生物綴合物的純化的最終主體且通過(guò)直接考馬斯染色(C)和Western印跡使用抗EPA抗血清或抗O25抗血清觀察。圖12.O1O抗原基因生物合成和化學(xué)結(jié)構(gòu)。A.顯示O1A菌株大腸桿菌G1632(登錄號(hào)：GU299791)的rfb簇和側(cè)翼基因。黑色、灰色和條紋色代碼與上文對(duì)于圖2描述的那些是相同的。B.顯示O1亞血清型的化學(xué)BRU結(jié)構(gòu)。圖13.來(lái)自含有O1陽(yáng)性凝集表型的臨床分離物的LPS的分析。A.銀染色和B.使用抗O1抗血清的Western印跡。圖14.O1臨床分離物中的O1A的鑒定。通過(guò)LLO指紋分析來(lái)分析來(lái)自O(shè)1臨床分離物的2AB標(biāo)記的LLO樣品。A.顯示從60’開(kāi)始的正相HPLC痕跡。使每一樣品的基線移位以觀察共遷移峰。upec編號(hào)指示臨床菌株。B.m/z=1849.6(Na+加合物)的MS/MS片段化離子系列。該圖指示O1A的2BRU的寡糖中的片段化離子模式和可能的糖苷鍵斷裂。圖15.O1生物綴合物。通過(guò)用EPA表達(dá)質(zhì)粒(pGVXN659)和以下5種不同pglB表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞(W3110△rfbO16：：rfbO1△waaL)進(jìn)行的EPA-O1糖蛋白的小規(guī)模表達(dá)測(cè)試：A，p114：表達(dá)未密碼子優(yōu)化的含有HA標(biāo)簽的pglB；B，p939：密碼子優(yōu)化的含有HA標(biāo)簽的pglB；C，p970：密碼子優(yōu)化的去除HA標(biāo)簽的pglB；D，密碼子優(yōu)化的含有HA標(biāo)簽的去除天然糖基化位點(diǎn)N534Q的pglB；和E，密碼子優(yōu)化的去除HA標(biāo)簽、去除天然糖基化位點(diǎn)N534Q的pglB。生長(zhǎng)細(xì)胞且使用阿拉伯糖和IPTG誘導(dǎo)，在37℃下過(guò)夜溫育之后，收獲細(xì)胞且制備周質(zhì)蛋白提取物。然后通過(guò)SDSPAGE分離提取物，通過(guò)電印跡轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜，且使用抗EPA血清進(jìn)行免疫檢測(cè)。圖16.用抗O1血清檢測(cè)的圖15中描述的生物綴合物。圖17.O6基因和化學(xué)結(jié)構(gòu)。A.大腸桿菌CFT073(GenbankAE014075.1)的O抗原生物合成簇(rfb簇)和側(cè)翼基因。指示根據(jù)BLAST的假設(shè)基因功能且指示O6O抗原生物合成的特異性基因。B.報(bào)道的O6BRU結(jié)構(gòu)的化學(xué)結(jié)構(gòu)(Jann等人，Carbohydr.Res.263(1994)217-225)。圖18.具有支鏈Glc的O6的鑒定。通過(guò)LLO指紋分析來(lái)分析來(lái)自O(shè)6臨床分離物的2AB標(biāo)記LLO樣品。A.顯示從60’開(kāi)始的正相HPLC痕跡。從含有Glc和GlcNAC支鏈的參考菌株CCUG11309(細(xì)實(shí)線)和11311(虛線)制備提取物。重疊圖顯示指示BRU的洗脫時(shí)間的顯著差異。B.將如由upec編號(hào)所指示的來(lái)自臨床分離物的提取物與來(lái)自A的參考菌株進(jìn)行比較。圖19.O2O抗原基因生物合成和化學(xué)結(jié)構(gòu)。A.菌株大腸桿菌G1674(登錄號(hào)：GU299792)的O抗原生物合成簇(rfb簇)和側(cè)翼基因。黑色、灰色和條紋色代碼如先前圖(例如圖2)中所描述。B.O2抗原的化學(xué)BRU結(jié)構(gòu)。圖20.來(lái)自具有O2陽(yáng)性凝集表型的臨床分離物的LPS的分析。A.銀染色。B.使用抗O2抗血清的Western印跡。圖21.來(lái)自菌株W3110△waaL△rfbW3110：：rfbO2△wekS的OPS分析。顯示通過(guò)正相HPLC進(jìn)行的2AB標(biāo)記的LLO分析的色譜圖。圖22.通過(guò)抗O25A和抗O25BMBP抗血清在Western印跡分析中識(shí)別O25A和O25BLPS。在電轉(zhuǎn)移從upec436(O25A)和upec138(O25B)制備的LPS樣品之后獲得且通過(guò)SDS-PAGE分離的兩種硝基纖維素膜。兩種膜的上樣模式是相同的，左泳道：來(lái)自u(píng)pec438的O25ALPS，中間泳道：來(lái)自u(píng)pec138的O25BLPS。使用MBP生物綴合物用于免疫兔。左圖：抗O25B-MBP抗血清；右圖：抗O25A-MBP抗血清。圖23.O2OPSBRU的MS/MS光譜。來(lái)自菌株CCUG25的2AB標(biāo)記的LLO提取物的43.5min時(shí)的洗脫峰的具有m/z=989.4的Na+加合物的MS/MS光譜。指示O2BRU圖和相關(guān)Y離子系列，從而證實(shí)預(yù)期單糖序列。圖24.含有臨床前研究中使用的O1A、O2和O6抗原的EPA生物綴合物。產(chǎn)生OPS聚糖并純化，且通過(guò)SDSPAGE進(jìn)行分析并通過(guò)考馬斯染色進(jìn)行觀察。圖25顯示用來(lái)自用O1A-EPA(G1)、僅載體蛋白(G10)、TBS(G11)或由EPA-O1A、O2、O6Glc和O25B(G12)構(gòu)成的四價(jià)組合物免疫的大鼠的血清獲得的平均ELISA滴度，其針對(duì)使用從菌株upec032純化的O1A-LPS包被的ELISA板進(jìn)行探測(cè)。圖26顯示用來(lái)自用O2A-EPA(G4)、僅載體蛋白(G10)、TBS(G11)或由EPA-O1A、O2、O6Glc和O25B(G12)構(gòu)成的四價(jià)組合物免疫的大鼠的血清獲得的平均ELISA滴度，其針對(duì)使用從菌株CCUG25純化的O2LPS包被的ELISA板進(jìn)行探測(cè)。圖27顯示用來(lái)自用O6Glc-EPA(G7)、僅載體蛋白(G10)、TBS(G11)或由EPA-O1A、O2、O6Glc和O25B(G12)構(gòu)成的四價(jià)組合物免疫的大鼠的血清獲得的平均ELISA滴度，其針對(duì)使用從菌株CCUG11309純化的O6Glc-LPS包被的ELISA板進(jìn)行探測(cè)。圖28顯示用來(lái)自用O25B-EPA(G9)、僅載體蛋白(G10)、TBS(G11)或由O1A、O2、O6Glc和O25B(G12)構(gòu)成的四價(jià)組合物免疫的大鼠的血清獲得的平均ELISA滴度，其針對(duì)使用從菌株upec177純化的O25B-LPS包被的ELISA板進(jìn)行探測(cè)。圖29：源自免疫前(空心圓)相比于免疫后42天(實(shí)心正方形)的大鼠的血清的調(diào)理指數(shù)，其中用一個(gè)引發(fā)劑量和兩個(gè)加強(qiáng)劑量的指示劑量的單價(jià)疫苗免疫。(A)O2-EPA免疫；(B)O6-EPA免疫；(C)O25B-EPA免疫。圖30：用來(lái)自用包含大腸桿菌抗原O1A、O2、O6Glc和O25B的四價(jià)疫苗接種疫苗的人類(lèi)個(gè)體的血清獲得的ELISA滴度。僅在接種疫苗組中觀察到在注射后(在注射之后30天)和注射前(第1天)之間ELISA滴度的顯著增加(*代表統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性)。圖31：用來(lái)自用包含大腸桿菌抗原O1A、O2、O6Glc和O25B的四價(jià)疫苗接種疫苗的人類(lèi)個(gè)體的血清獲得的調(diào)理指數(shù)(OI)。描繪免疫反應(yīng)，如由在注射之前和之后針對(duì)安慰劑和四價(jià)疫苗的組分(O1A-EPA(31A)、O2-EPA(31B)、O6Glc-EPA(31C)和O25B-EPA(31D))的OI所指示。注射前(定義為第1天)由V2(拜訪2)代表，且注射后(定義為第30天)由V4(拜訪4)代表。僅在接種疫苗組中觀察到在注射后和注射前之間OI的顯著增加(由*指示，其中多個(gè)*代表增加的顯著性程度)。NS：無(wú)顯著差異。圖32：在第1天(接種疫苗前)和在30天之后(接種疫苗后)來(lái)自接種疫苗個(gè)體的血清針對(duì)O25ALPS(黑條)和O25BLPS(灰條)的ELISA滴度(表示為EC50值)。觀察到在兩種血清型：O25ALPS(黑條)和O25BLPS(灰條)中在注射后(在注射之后30天)和注射前(第1天)之間ELISA滴度的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著增加。圖33：來(lái)自接種疫苗個(gè)體的血清針對(duì)表達(dá)O25A(黑線)和O25B(灰線)的大腸桿菌菌株的反應(yīng)性。虛灰線：血清型O75菌株，陰性對(duì)照。圖33顯示，來(lái)自接種疫苗個(gè)體的疫苗誘導(dǎo)的血清IgG抗體對(duì)O25A和O25B菌株強(qiáng)烈反應(yīng)。5.詳述本文公開(kāi)了大腸桿菌抗原O25B的結(jié)構(gòu)以及O25B的用途、制備O25B的方法和包含O25B的生物綴合物。申請(qǐng)人已鑒定出負(fù)責(zé)產(chǎn)生O25B的大腸桿菌基因簇且充分表征O25B抗原的結(jié)構(gòu)。因此，本文提供了能夠在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生O25B的核酸。本文還提供了包含能夠產(chǎn)生O25B的核酸的宿主細(xì)胞(例如重組工程改造的宿主細(xì)胞)。此類(lèi)宿主細(xì)胞可用于生成包含連接至載體蛋白的O25B的生物綴合物，所述生物綴合物可用于(例如)配制治療劑(例如疫苗)。本文描述的O25B抗原也可用于生成抗體，所述抗體可用于(例如)治療方法，諸如個(gè)體的被動(dòng)免疫中。本文還提供了包含O25B(單獨(dú)或與其它大腸桿菌抗原(例如O1、O2和O6和其亞血清型)組合)的組合物，所述組合物用于治療方法中，例如對(duì)宿主接種疫苗以抵抗大腸桿菌(例如尿路病原性大腸桿菌)感染。5.1核酸和蛋白在一個(gè)方面，本文提供了與O25B產(chǎn)生相關(guān)的分離核酸，例如編碼大腸桿菌O25Brfb簇的一種或多種蛋白的核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，由于遺傳代碼的簡(jiǎn)并性，具有特異性氨基酸序列的蛋白可由多種不同核酸編碼。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本文提供的核酸可以其序列不同于本文提供的序列的方式進(jìn)行改變，而不影響由核酸編碼的蛋白的氨基酸序列。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了編碼大腸桿菌O25Brfb簇的核酸。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了編碼大腸桿菌rfb(upec138)基因簇的核酸(SEQIDNO:12)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了編碼與SEQIDNO:12約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的基因簇的核酸。Upec138是O25B血清型的大腸桿菌菌株的一個(gè)實(shí)例。技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，現(xiàn)在可容易地從臨床分離物根據(jù)本文描述的方法獲得來(lái)自該血清型的其它菌株，且此類(lèi)其它菌株的實(shí)例是upec177和upec163。因此，在本文中提及此類(lèi)O25B菌株的rfb基因簇或來(lái)自該簇的個(gè)別基因的任何地方，其旨在包括來(lái)自其它O25B菌株的相應(yīng)基因簇或基因。此外，可通過(guò)對(duì)來(lái)自此類(lèi)其它分離物的rfb基因簇或（如果需要）個(gè)別基因進(jìn)行測(cè)序來(lái)發(fā)現(xiàn)提供的序列，且提供編碼同源蛋白的同源序列作為基因簇或基因。在通過(guò)提及具有特定百分比的基因簇或基因來(lái)提及同源基因簇或基因的任何實(shí)施方案中，此類(lèi)同源序列優(yōu)選編碼具有與來(lái)自參考菌株或序列的功能相同的功能的蛋白。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了編碼大腸桿菌O25Brfb簇的核酸。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了編碼大腸桿菌rfb(upec163)基因簇的核酸。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了編碼與大腸桿菌rfb(upec163)基因簇約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的基因簇的核酸。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了編碼大腸桿菌O25Brfb簇的核酸。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了編碼大腸桿菌rfb(upec177)基因簇的核酸。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了編碼與大腸桿菌rfb(upec177)基因簇約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的基因簇的核酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供了編碼大腸桿菌O25Brfb簇的蛋白的核酸。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的編碼大腸桿菌O25Brfb簇的蛋白的核酸包含SEQIDNO:1(大腸桿菌O25Brfb簇的rmlB基因)或由其組成。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的編碼大腸桿菌O25Brfb簇的蛋白的核酸與SEQIDNO:175%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的編碼大腸桿菌O25Brfb簇的蛋白的核酸包含SEQIDNO:2(大腸桿菌O25Brfb簇的rmlD基因)或由其組成。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的編碼大腸桿菌O25Brfb簇的蛋白的核酸與SEQIDNO:275%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的編碼大腸桿菌O25Brfb簇的蛋白的核酸包含SEQIDNO:3(大腸桿菌O25Brfb簇的rmlA基因)或由其組成。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的編碼大腸桿菌O25Brfb簇的蛋白的核酸與SEQIDNO:375%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的編碼大腸桿菌O25Brfb簇的蛋白的核酸包含SEQIDNO:4(大腸桿菌O25Brfb簇的rmlC基因)或由其組成。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的編碼大腸桿菌O25Brfb簇的蛋白的核酸與SEQIDNO:475%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的編碼大腸桿菌O25Brfb簇的蛋白的核酸包含SEQIDNO:5(大腸桿菌O25Brfb簇的wzx基因)或由其組成。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的編碼大腸桿菌O25Brfb簇的蛋白的核酸與SEQIDNO:575%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的編碼大腸桿菌O25Brfb簇的蛋白的核酸包含SEQIDNO:6(大腸桿菌O25Brfb簇的wekA基因)或由其組成。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的編碼大腸桿菌O25Brfb簇的蛋白的核酸與SEQIDNO:675%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的編碼大腸桿菌O25Brfb簇的蛋白的核酸包含SEQIDNO:7(大腸桿菌O25Brfb簇的wekB基因)或由其組成。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的編碼大腸桿菌O25Brfb簇的蛋白的核酸與SEQIDNO:775%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的編碼大腸桿菌O25Brfb簇的蛋白的核酸包含SEQIDNO:8(大腸桿菌O25Brfb簇的wzy基因)或由其組成。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的編碼大腸桿菌O25Brfb簇的蛋白的核酸與SEQIDNO:875%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的編碼大腸桿菌O25Brfb簇的蛋白的核酸包含SEQIDNO:9(大腸桿菌O25Brfb簇的wbbJ基因)或由其組成。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的編碼大腸桿菌O25Brfb簇的蛋白的核酸與SEQIDNO:975%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的編碼大腸桿菌O25Brfb簇的蛋白的核酸包含SEQIDNO:10(大腸桿菌O25Brfb簇的wbbK基因)或由其組成。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的編碼大腸桿菌O25Brfb簇的蛋白的核酸與SEQIDNO:1075%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的編碼大腸桿菌O25Brfb簇的蛋白的核酸包含SEQIDNO:11(大腸桿菌O25Brfb簇的wbbL基因)或由其組成。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的編碼大腸桿菌O25Brfb簇的蛋白的核酸與SEQIDNO:1175%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在另一個(gè)方面，本文提供了由本文提供的核酸編碼的蛋白。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了由SEQIDNO:1編碼的dTDP-葡萄糖4,6-脫水酶。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了由SEQIDNO:2編碼的dTDP-6-脫氧-D-葡萄糖3,5-差向異構(gòu)酶。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了由SEQIDNO:3編碼的葡萄糖-1-磷酸胸苷基轉(zhuǎn)移酶。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了由SEQIDNO:4編碼的dTDP-4-脫氫鼠李糖3,5-差向異構(gòu)酶。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了由SEQIDNO:5編碼的O抗原翻轉(zhuǎn)酶。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了由SEQIDNO:6編碼的dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPPα-1,3-鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了由SEQIDNO:7編碼的UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPPβ-1,6-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了由SEQIDNO:8編碼的O抗原聚合酶。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了由SEQIDNO:9編碼的O-乙?；D(zhuǎn)移酶。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了由SEQIDNO:10編碼的UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPPα-1,3-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了由SEQIDNO:11編碼的dTDP-Rha:GlcNAc-UPPα-1,3-鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶。5.2大腸桿菌O抗原在一個(gè)方面，本文提供了O25、O1、O2和O6血清型的分離大腸桿菌抗原。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了來(lái)自大腸桿菌菌株upec138的分離O抗原。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了來(lái)自大腸桿菌菌株upec163的分離O抗原。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了來(lái)自大腸桿菌菌株upec177的分離O抗原。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了式O25B的分離大腸桿菌O25B抗原：。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了式O25B’的分離大腸桿菌O25B抗原：。在另一個(gè)方面，本文提供了下文呈現(xiàn)的式O25B的分離大分子的群體：,其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間的整數(shù)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，群體中至少80%的大分子的n在1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間。在另一個(gè)方面，本文提供了下文呈現(xiàn)的式O25B’的分離大分子的群體：,其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間的整數(shù)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，群體中至少80%的大分子的n在1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間?？捎糜诒疚拿枋龅慕M合物(例如治療組合物，例如疫苗；參見(jiàn)部分5.6)中的其它大腸桿菌抗原包括O25A以及O1、O2和O6抗原和其亞血清型。在一個(gè)實(shí)施方案中，將O25A抗原(例如，呈分離形式或作為生物綴合物的一部分)用于本文提供的組合物中(例如，與O25B抗原(或包含O25B抗原的生物綴合物)組合)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，O25A抗原是式O25A：在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，O25A抗原是式O25A’：。在一個(gè)實(shí)施方案中，將O1A抗原(例如，呈分離形式或作為生物綴合物的一部分)用于本文提供的組合物中(例如，與O25B抗原(或包含O25B抗原的生物綴合物)組合)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，O1A抗原是式O1A：在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，O1A抗原是式O1A’：。在一個(gè)實(shí)施方案中，將O1B抗原(例如，呈分離形式或作為生物綴合物的一部分)用于本文提供的組合物中(例如，與O25B抗原(或包含O25B抗原的生物綴合物)組合)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，O1B抗原是式O1B：在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，O1B抗原是式O1B’：。在一個(gè)實(shí)施方案中，將O1C抗原(例如，呈分離形式或作為生物綴合物的一部分)用于本文提供的組合物中(例如，與O25B抗原(或包含O25B抗原的生物綴合物)組合)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，O1C抗原是式O1C：在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，O1C抗原是式O1C’：。在一個(gè)實(shí)施方案中，將O2抗原(例如，呈分離形式或作為生物綴合物的一部分)用于本文提供的組合物中(例如，與O25B抗原(或包含O25B抗原的生物綴合物)組合)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，O2抗原是式O2：在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，O2抗原是式O2’：。在一個(gè)實(shí)施方案中，將O6抗原(例如，呈分離形式或作為生物綴合物的一部分)用于本文提供的組合物中(例如，與O25B抗原(或包含O25B抗原的生物綴合物)組合)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，O6抗原是式O6K2(在本文中也稱(chēng)為O6Glc)：在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，O6抗原是式O6K2’(在本文中也稱(chēng)為O6Glc’)：在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，O6抗原是式O6K54(在本文中也稱(chēng)為O6GlcNAc)：在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，O6抗原是式O6K54’(在本文中也稱(chēng)為O6GlcNAc’)：。5.3宿主細(xì)胞本文提供了能夠產(chǎn)生大腸桿菌O抗原和包含此類(lèi)大腸桿菌O抗原的生物綴合物的宿主細(xì)胞(例如原核宿主細(xì)胞)。在某些實(shí)施方案中，本文提供的宿主細(xì)胞包含(例如天然或經(jīng)由基因工程改造的)一種或多種本文描述的核酸。參見(jiàn)部分5.1。在某些實(shí)施方案中，本文提供的宿主細(xì)胞產(chǎn)生一種或多種本文描述的大腸桿菌O抗原，和/或產(chǎn)生包含一種或多種本文描述的大腸桿菌O抗原的生物綴合物。參見(jiàn)部分5.2。在一個(gè)方面，本文提供了包含編碼能夠產(chǎn)生本文公開(kāi)的新穎多糖大腸桿菌O25B的酶(例如糖基轉(zhuǎn)移酶)的核酸的原核宿主細(xì)胞。本文還提供了包含編碼能夠產(chǎn)生其它大腸桿菌抗原(例如O25A、O1、O2和O6和其亞血清型)的酶(例如糖基轉(zhuǎn)移酶)的核酸的宿主細(xì)胞(參見(jiàn)部分5.2)。本文提供的宿主細(xì)胞可天然表達(dá)能夠產(chǎn)生目標(biāo)O抗原的核酸，或可使宿主細(xì)胞表達(dá)此類(lèi)核酸，即，在某些實(shí)施方案中，所述核酸對(duì)宿主細(xì)胞是異源的且使用本領(lǐng)域已知的遺傳方法引入宿主細(xì)胞中。在某些實(shí)施方案中，本文提供的宿主細(xì)胞包含編碼在蛋白的N-糖基化中有活性的額外酶的核酸，例如，本文提供的宿主細(xì)胞還可包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸或編碼其它糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸。例如參見(jiàn)部分5.3.3。在某些實(shí)施方案中，本文提供的宿主細(xì)胞包含編碼載體蛋白(例如可附接至寡糖和多糖以形成生物綴合物的蛋白)的核酸。參見(jiàn)例如部分5.3.2(關(guān)于載體蛋白的描述)和部分5.4(關(guān)于生物綴合物的描述)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為大腸桿菌。Upec138是在本文中鑒定為屬于O25B血清型的大腸桿菌菌株，且該菌株(和通常O25B血清型的菌株)的rfb基因簇已在本文中首次鑒定為包含產(chǎn)生新穎大腸桿菌多糖O25B的基因。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含大腸桿菌rfb(upec138)基因簇(SEQIDNO:12)或與SEQIDNO:12約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的基因簇的原核宿主細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，通過(guò)基因操縱將大腸桿菌rfb(upec138)基因簇(SEQIDNO:12)引入宿主細(xì)胞中(例如，使基因簇表達(dá)于一種或多種質(zhì)粒上或整合至宿主細(xì)胞基因組中(參見(jiàn)例如國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朠CT/EP2013/068737))。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，rfb簇的一些或所有基因?qū)λ拗骷?xì)胞是異源的。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)宿主細(xì)胞是異源的。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述載體蛋白對(duì)宿主細(xì)胞是異源的。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。Upec163是在本文中鑒定為屬于O25B血清型的大腸桿菌菌株，且該菌株(和通常O25B血清型的菌株)的rfb基因簇已在本文中首次鑒定為包含產(chǎn)生新穎大腸桿菌多糖O25B的基因。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含大腸桿菌rfb(upec163)基因簇或與大腸桿菌rfb(upec163)基因簇約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的基因簇的原核宿主細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，通過(guò)基因操縱將大腸桿菌rfb(upec163)基因簇引入宿主細(xì)胞中(例如，使基因簇表達(dá)于一種或多種質(zhì)粒上或整合至宿主細(xì)胞基因組中(參見(jiàn)例如國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朠CT/EP2013/068737))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，rfb簇的一些或所有基因?qū)λ拗骷?xì)胞是異源的。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)宿主細(xì)胞是異源的。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述載體蛋白對(duì)宿主細(xì)胞是異源的。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。Upec177是在本文中鑒定為屬于O25B血清型的大腸桿菌菌株，且該菌株(和通常O25B血清型的菌株)的rfb基因簇已在本文中首次鑒定為包含產(chǎn)生新穎大腸桿菌多糖O25B的基因。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含大腸桿菌rfb(upec177)基因簇或與大腸桿菌rfb(upec177)基因簇約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的基因簇的原核宿主細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，通過(guò)基因操縱將大腸桿菌rfb(upec177)基因簇引入宿主細(xì)胞中(例如，使基因簇表達(dá)于一種或多種質(zhì)粒上或整合至宿主細(xì)胞基因組中(參見(jiàn)例如國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朠CT/EP2013/068737))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，rfb簇的一些或所有基因?qū)λ拗骷?xì)胞是異源的。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)宿主細(xì)胞是異源的。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述載體蛋白對(duì)宿主細(xì)胞是異源的。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了產(chǎn)生O25B的原核宿主細(xì)胞(例如，重組工程改造的原核宿主細(xì)胞)，其中所述宿主細(xì)胞包含rmlB、rmlD、rmlA、rmlC、wzx、wekA、wekB、wzy、wbbJ、wbbK和/或wbbL?？墒褂弥亟M方法工程改造此類(lèi)宿主細(xì)胞以包含一種或多種包含rmlB、rmlD、rmlA、rmlC、wzx、wekA、wekB、wzy、wbbJ、wbbK和/或wbbL基因的質(zhì)粒。在某些實(shí)施方案中，將所述一種或多種質(zhì)粒整合至宿主細(xì)胞基因組中。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述rmlB包含SEQIDNO:1或由其組成，或與SEQIDNO:175%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述rmlD包含SEQIDNO:2或由其組成，或與SEQIDNO:275%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述rmlA包含SEQIDNO:3或由其組成，或與SEQIDNO:375%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述rmlC包含SEQIDNO:4或由其組成，或與SEQIDNO:475%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述wzx包含SEQIDNO:5或由其組成，或與SEQIDNO:575%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述wekA包含SEQIDNO:6或由其組成，或與SEQIDNO:675%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述wekB包含SEQIDNO:7或由其組成，或與SEQIDNO:775%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述wzy包含SEQIDNO:8或由其組成，或與SEQIDNO:875%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述wbbJ包含SEQIDNO:9或由其組成，或與SEQIDNO:975%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述wbbK包含SEQIDNO:10或由其組成，或與SEQIDNO:1075%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述wbbL包含SEQIDNO:11或由其組成，或與SEQIDNO:1175%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，基因rmlB、rmlD、rmlA、rmlC、wzx、wekA、wekB、wzy、wbbJ、wbbK和wbbL中的一些或所有對(duì)宿主細(xì)胞是異源的。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)宿主細(xì)胞是異源的。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述載體蛋白對(duì)宿主細(xì)胞是異源的。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了產(chǎn)生O25B的原核宿主細(xì)胞(例如，重組工程改造的原核宿主細(xì)胞)，其中所述宿主細(xì)胞包含以下基因中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)(例如所有)(或與以下基因之一約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源且優(yōu)選編碼具有相同功能的蛋白的核酸)：rmlB(SEQIDNO:1)、rmlD(SEQIDNO:2)、rmlA(SEQIDNO:3)、rmlC(SEQIDNO:4)、wzx(SEQIDNO:5)、wekA(SEQIDNO:6)、wekB(SEQIDNO:7)、wzy(SEQIDNO:8)、wbbJ(SEQIDNO:9)、wbbK(SEQIDNO:10)和/或wbbL(SEQIDNO:11)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞(例如，重組工程改造的原核宿主細(xì)胞)，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含rmlB的核酸序列(SEQIDNO:1)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含編碼dTDP-葡萄糖4,6-脫水酶(例如，由rmlB編碼的dTDP-葡萄糖4,6-脫水酶)的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含與SEQIDNO:1約或至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞(例如，重組工程改造的原核宿主細(xì)胞)，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含rmlD的核酸序列(SEQIDNO:2)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含編碼dTDP-6-脫氧-D-葡萄糖3,5-差向異構(gòu)酶(例如，由rmlD編碼的dTDP-6-脫氧-D-葡萄糖3,5-差向異構(gòu)酶)的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含與SEQIDNO:2至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞(例如，重組工程改造的原核宿主細(xì)胞)，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含rmlA的核酸序列(SEQIDNO:3)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含編碼葡萄糖-1-磷酸胸苷基轉(zhuǎn)移酶(例如，由rmlA編碼的葡萄糖-1-磷酸胸苷基轉(zhuǎn)移酶)的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含與SEQIDNO:3至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞(例如，重組工程改造的原核宿主細(xì)胞)，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含rmlC的核酸序列(SEQIDNO:4)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含編碼dTDP-4-脫氫鼠李糖3,5-差向異構(gòu)酶(例如，由rmlC編碼的dTDP-4-脫氫鼠李糖3,5-差向異構(gòu)酶)的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含與SEQIDNO:4至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞(例如，重組工程改造的原核宿主細(xì)胞)，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含wzx的核酸序列(SEQIDNO:5)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含編碼O抗原翻轉(zhuǎn)酶(例如由wzx編碼的O抗原翻轉(zhuǎn)酶)的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含與SEQIDNO:5至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞(例如，重組工程改造的原核宿主細(xì)胞)，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含wekA的核酸序列(SEQIDNO:6)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含編碼鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，由wekA編碼的dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPPα-1,3-鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶)的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含與SEQIDNO:6至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞(例如，重組工程改造的原核宿主細(xì)胞)，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含wekB的核酸序列(SEQIDNO:7)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含編碼wekB葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，由wekB編碼的UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPPβ-1,6-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶)的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含與SEQIDNO:7至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞(例如，重組工程改造的原核宿主細(xì)胞)，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含wzy的核酸序列(SEQIDNO:8)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含編碼O抗原聚合酶(例如，由wzy編碼的O抗原聚合酶)的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含與SEQIDNO:8至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞(例如，重組工程改造的原核宿主細(xì)胞)，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含wbbJ的核酸序列(SEQIDNO:9)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含編碼O-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(例如，由wbbJ編碼的O-乙酰基轉(zhuǎn)移酶)的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含與SEQIDNO:9至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞(例如，重組工程改造的原核宿主細(xì)胞)，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含wbbK的核酸序列(SEQIDNO:10)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含編碼葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，由wbbK編碼的UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPPα-1,3-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶)的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含與SEQIDNO:10至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞(例如，重組工程改造的原核宿主細(xì)胞)，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含wbbL的核酸序列(SEQIDNO:11)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含編碼鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，由wbbL編碼的dTDP-Rha:GlcNAc-UPPα-1,3-鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶)的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含與SEQIDNO:11至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和/或O25B生物綴合物(即連接至大腸桿菌O25B抗原的載體蛋白)的原核宿主細(xì)胞(例如，重組工程改造的原核宿主細(xì)胞)，其中所述宿主細(xì)胞天然包含或經(jīng)工程改造以包含以下中的至少一種、兩種、三種、四種或更多種(例如所有)：(i)與SEQIDNO:1至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸序列；(ii)與SEQIDNO:2至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸序列；(iii)與SEQIDNO:3至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸序列；(iv)與SEQIDNO:4至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸序列；(v)與SEQIDNO:5至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸序列；(vi)與SEQIDNO:6至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸序列；(vii)與SEQIDNO:7至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸序列；(viii)與SEQIDNO:8至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸序列；(ix)與SEQIDNO:9至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸序列；(x)與SEQIDNO:10至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸序列；和/或(xi)與SEQIDNO:11至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸序列。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞已經(jīng)工程改造以包含所述序列中的每一種，即，所述序列對(duì)所述宿主細(xì)胞是異源的。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了產(chǎn)生O25B的原核宿主細(xì)胞(例如，重組工程改造的原核宿主細(xì)胞)，其中所述宿主細(xì)胞包含以下中的至少兩種：(i)wbbJ(SEQIDNO:9)或與SEQIDNO:9約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的核酸；(ii)wbbK(SEQIDNO:10)或與SEQIDNO:10約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的核酸；和/或(iii)wbbL(SEQIDNO:11)或與SEQIDNO:11約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的核酸。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了產(chǎn)生O25B的原核宿主細(xì)胞(例如，重組工程改造的原核宿主細(xì)胞)，其中所述宿主細(xì)胞包含以下中的每種：(i)wbbJ(SEQIDNO:9)或與SEQIDNO:9約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的核酸；(ii)wbbK(SEQIDNO:10)或與SEQIDNO:10約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的核酸；和(iii)wbbL(SEQIDNO:11)或與SEQIDNO:11約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的核酸。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了產(chǎn)生O25B的原核宿主細(xì)胞(例如，重組工程改造的原核宿主細(xì)胞)，其中所述宿主細(xì)胞包含：(i)dTDP-葡萄糖4,6-脫水酶；(ii)dTDP-6-脫氧-D-葡萄糖3,5-差向異構(gòu)酶；(iii)葡萄糖-1-磷酸胸苷基轉(zhuǎn)移酶；(iv)dTDP-4-脫氫鼠李糖3,5-差向異構(gòu)酶；(v)O抗原翻轉(zhuǎn)酶；(vi)dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPPα-1,3-鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶；(vii)UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPPβ-1,6-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶；(viii)O抗原聚合酶；(ix)O-乙?；D(zhuǎn)移酶；(x)UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPPα-1,3-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶和/或(xi)dTDP-Rha:GlcNAc-UPPα-1,3-鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，(i)dTDP-葡萄糖4,6-脫水酶；(ii)dTDP-6-脫氧-D-葡萄糖3,5-差向異構(gòu)酶；(iii)葡萄糖-1-磷酸胸苷基轉(zhuǎn)移酶；(iv)dTDP-4-脫氫鼠李糖3,5-差向異構(gòu)酶；(v)O抗原翻轉(zhuǎn)酶；(vi)dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPPα-1,3-鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶；(vii)UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPPβ-1,6-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶；(viii)O抗原聚合酶；(ix)O-乙?；D(zhuǎn)移酶；(x)UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPPα-1,3-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶和/或(xi)dTDP-Rha:GlcNAc-UPPα-1,3-鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶中的一些或所有對(duì)宿主細(xì)胞是異源的。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)宿主細(xì)胞是異源的。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述載體蛋白對(duì)宿主細(xì)胞是異源的。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在另一個(gè)方面，本文提供了產(chǎn)生大腸桿菌O25A的原核宿主細(xì)胞(例如，重組工程改造的原核宿主細(xì)胞)，即，所述宿主細(xì)胞包含能夠合成大腸桿菌O25A的酶(例如參見(jiàn)圖3)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在另一個(gè)方面，本文提供了產(chǎn)生大腸桿菌O1的原核宿主細(xì)胞(例如，重組工程改造的原核宿主細(xì)胞)，即，所述宿主細(xì)胞包含能夠合成大腸桿菌O1的酶(例如參見(jiàn)圖12)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了產(chǎn)生大腸桿菌O1A的宿主細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了產(chǎn)生大腸桿菌O1B的宿主細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了產(chǎn)生大腸桿菌O1C的宿主細(xì)胞。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在另一個(gè)方面，本文提供了產(chǎn)生大腸桿菌O2的原核宿主細(xì)胞(例如，重組工程改造的原核宿主細(xì)胞)，即，所述宿主細(xì)胞包含能夠合成大腸桿菌O2的酶(例如參見(jiàn)圖19)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在另一個(gè)方面，本文提供了產(chǎn)生大腸桿菌O6的原核宿主細(xì)胞(例如，重組工程改造的原核宿主細(xì)胞)，即，所述宿主細(xì)胞包含能夠合成大腸桿菌O6的酶(例如參見(jiàn)圖17)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了產(chǎn)生包含支鏈Glc單糖的大腸桿菌O6或包含支鏈GlcNAc單糖的O6抗原的宿主細(xì)胞。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。本文還提供了能夠產(chǎn)生不止一種類(lèi)型的大腸桿菌O抗原的原核宿主細(xì)胞(例如，重組工程改造的原核宿主細(xì)胞)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生以下中的至少兩種的宿主細(xì)胞：O25B、O25A、O1(例如O1A、O1B、O1C)、O2和O6。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了能夠產(chǎn)生O25B和O25A、O1(例如O1A、O1B、O1C)、O2和O6中的一種或多種的宿主細(xì)胞。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞還包含編碼以下的核酸序列：包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。5.3.1基因背景可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何宿主細(xì)胞產(chǎn)生本文描述的大腸桿菌O抗原(例如O25B)和包含本文描述的大腸桿菌O抗原(例如O25B)的生物綴合物，包括古生菌(archea)、原核宿主細(xì)胞和真核宿主細(xì)胞。用于產(chǎn)生本文描述的大腸桿菌O抗原和包含本文描述的大腸桿菌O抗原的生物綴合物的示例性原核宿主細(xì)胞包括但不限于埃希氏菌屬、志賀氏菌(Shigella)屬、克雷伯氏菌(Klebsiella)屬、黃單胞菌(Xhantomonas)屬、沙門(mén)氏菌(Salmonella)屬、耶爾森菌(Yersinia)屬、乳球菌(Lactococcus)屬、乳桿菌(Lactobacillus)屬、假單胞菌(Pseudomonas)屬、棒狀桿菌(Corynebacterium)屬、鏈霉菌(Streptomyces)屬、鏈球菌(Streptococcus)屬、葡萄球菌(Staphylococcus)屬、芽孢桿菌(Bacillus)屬和梭菌(Clostridium)屬。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生本文描述的大腸桿菌O抗原和包含本文描述的大腸桿菌O抗原的生物綴合物的宿主細(xì)胞為大腸桿菌。在某些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生本文描述的大腸桿菌O抗原和生物綴合物的宿主細(xì)胞進(jìn)行工程改造以包含異源性核酸，例如編碼一種或多種載體蛋白的異源性核酸和/或編碼一種或多種蛋白的異源性核酸(例如編碼一種或多種蛋白的基因)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，可將編碼參與糖基化途徑(例如，原核和/或真核糖基化途徑)的蛋白的異源性核酸引入本文描述的宿主細(xì)胞中。此類(lèi)核酸可編碼蛋白，包括但不限于寡糖基轉(zhuǎn)移酶和/或糖基轉(zhuǎn)移酶的?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法(例如電穿孔、通過(guò)熱休克的化學(xué)轉(zhuǎn)化、天然轉(zhuǎn)化、噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)和綴合)將異源性核酸(例如，編碼載體蛋白的核酸和/或編碼其它蛋白(例如參與糖基化的蛋白)的核酸)引入本文描述的宿主細(xì)胞中。在具體實(shí)施方案中，使用質(zhì)粒將異源性核酸引入本文描述的宿主細(xì)胞中，例如，通過(guò)質(zhì)粒(例如表達(dá)載體)使異源性核酸表達(dá)于宿主細(xì)胞中。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，使用國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朠CT/EP2013/068737中描述的插入方法將異源性核酸引入本文描述的宿主細(xì)胞中。在某些實(shí)施方案中，可將額外修飾引入(例如，使用重組技術(shù))本文描述的宿主細(xì)胞中。例如，編碼形成可能競(jìng)爭(zhēng)或干擾糖基化途徑(例如，競(jìng)爭(zhēng)或干擾一種或多種重組引入宿主細(xì)胞中的參與糖基化的異源性基因)的一部分的蛋白的宿主細(xì)胞核酸(例如基因)可在宿主細(xì)胞背景(基因組)中以使其失活/功能失調(diào)的方式缺失或修飾(即，缺失/修飾的宿主細(xì)胞核酸不編碼功能蛋白或不編碼任何蛋白)。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)核酸從本文提供的宿主細(xì)胞的基因組缺失時(shí)，其由所需序列(例如可用于糖蛋白產(chǎn)生的序列)代替?？稍谒拗骷?xì)胞中缺失(和在一些情況下被其它所需核酸序列代替)的示例性基因包括參與糖脂生物合成的宿主細(xì)胞的基因(諸如waaL)(參見(jiàn)例如Feldman等人，2005,PNASUSA102：3016-3021)、脂質(zhì)A核心生物合成簇(waa)、半乳糖簇(gal)、阿拉伯糖簇(ara)、結(jié)腸酸(colonicacid)簇(wc)、莢膜多糖簇、十一葵烯醇-p生物合成基因(例如，uppS、uppP)、und-P再循環(huán)基因、參與核苷酸活化的糖生物合成的代謝酶、腸桿菌普通抗原簇和原噬菌體O抗原修飾簇(如gtrABS簇)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，修飾本文描述的宿主細(xì)胞，使得其不產(chǎn)生除來(lái)自ExPEC的所需O抗原(例如O25B)外的任何O抗原。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，waaL基因、gtrA基因、gtrB基因、gtrS基因或rfb基因簇中的一個(gè)或多個(gè)從本文提供的原核宿主細(xì)胞的基因組中缺失或功能失活。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文使用的宿主細(xì)胞是產(chǎn)生O25B抗原的大腸桿菌，其中waaL基因、gtrA基因、gtrB基因和gtrS基因從宿主細(xì)胞的基因組中缺失或功能失活。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文使用的宿主細(xì)胞是產(chǎn)生O25B抗原的大腸桿菌，其中waaL基因和gtrS基因從宿主細(xì)胞的基因組中缺失或功能失活。在某些實(shí)施方案中，本文提供的修飾宿主細(xì)胞可用于蛋白糖基化?？稍O(shè)計(jì)蛋白糖基化以產(chǎn)生生物綴合物用于疫苗制劑，例如含有大腸桿菌多糖抗原(例如O25(例如O25B)、O1、O2和O6)的疫苗。5.3.2載體蛋白可在本文中使用適用于產(chǎn)生結(jié)合疫苗(例如用于疫苗中的生物綴合物)的任何載體蛋白，例如，可將編碼載體蛋白的核酸引入本文提供的宿主中用于產(chǎn)生包含連接至ExPEC抗原(例如O25B)的載體蛋白的生物綴合物。示例性載體蛋白包括但不限于脫毒的綠膿假單胞菌外毒素A(EPA；參見(jiàn)例如Ihssen等人(2010)Microbialcellfactories9,61)、CRM197、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、白喉類(lèi)毒素、破傷風(fēng)類(lèi)毒素、脫毒的金黃色葡萄球菌的溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、大腸桿菌FimH、大腸桿菌FimHC、大腸桿菌不耐熱腸毒素、大腸桿菌不耐熱腸毒素的脫毒變體、霍亂毒素B亞單元(CTB)、霍亂毒素、霍亂毒素的脫毒變體、大腸桿菌Sat蛋白、大腸桿菌Sat蛋白的過(guò)客結(jié)構(gòu)域、肺炎鏈球菌肺炎球菌溶血素和其脫毒變體、空腸彎曲桿菌AcrA和空腸彎曲桿菌天然糖蛋白。對(duì)于EPA，各種脫毒蛋白變體已描述于文獻(xiàn)中且可用作載體蛋白。在某些實(shí)施方案中，將用于生成本文所述的生物綴合物的載體蛋白修飾，例如以蛋白具有更小毒性和/或更易于糖基化的方式修飾。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將用于生成本文所述的生物綴合物的載體蛋白修飾，使得載體蛋白中糖基化位點(diǎn)的數(shù)目最大化，其方式允許施用更低濃度的蛋白(例如，在免疫原性組合物中，以其生物綴合物形式)。在某些實(shí)施方案中，修飾本文描述的載體蛋白使其比通常與載體蛋白相關(guān)的糖基化位點(diǎn)(例如相對(duì)于與其原始/天然(例如"野生型")狀態(tài)的載體蛋白相關(guān)的糖基化位點(diǎn)數(shù))多包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個(gè)糖基化位點(diǎn)。在具體實(shí)施方案中，通過(guò)在蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的任何地方插入糖基化共有序列(例如Asn-X-Ser(Thr)，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)(參見(jiàn)WO2006/119987))來(lái)引入糖基化位點(diǎn)?？赏ㄟ^(guò)(例如)以下方式來(lái)引入此類(lèi)糖基化位點(diǎn)：將新氨基酸添加至蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)(即，完全或部分地添加糖基化位點(diǎn))，或突變蛋白中的現(xiàn)有氨基酸以生成糖基化位點(diǎn)(即，不向蛋白添加氨基酸，但突變蛋白的所選氨基酸以形成糖基化位點(diǎn))。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，可使用本領(lǐng)域已知的方法(例如包括修飾編碼蛋白的核酸序列的重組方法)來(lái)容易地修飾蛋白的氨基酸序列。在具體實(shí)施方案中，將糖基化共有序列引入載體蛋白的特異性區(qū)域中，例如蛋白的表面結(jié)構(gòu)，蛋白的N或C末端和/或由蛋白基礎(chǔ)處的二硫橋鍵穩(wěn)定的環(huán)中。在某些實(shí)施方案中，典型5氨基酸糖基化共有序列可通過(guò)賴(lài)氨酸殘基延伸以用于更有效地糖基化，且因此插入的共有序列可編碼5、6或7個(gè)應(yīng)插入或代替受體蛋白氨基酸的氨基酸。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，載體蛋白是包含4個(gè)共有糖基化序列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr(SEQIDNO:15)的脫毒EPA，且具有如SEQIDNO:13中提供的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，用于生成本文描述的生物綴合物的載體蛋白包含"標(biāo)簽"，即允許分離和/或鑒定載體蛋白的氨基酸序列。例如，向本文描述的載體蛋白添加標(biāo)簽可用于純化該蛋白且因此純化包含標(biāo)簽化的載體蛋白的綴合物疫苗?？捎糜诒疚闹械氖纠詷?biāo)簽包括但不限于組氨酸(HIS)標(biāo)簽(例如六組氨酸標(biāo)簽或6Xhis-標(biāo)簽)、FLAG-TAG和HA標(biāo)簽。在某些實(shí)施方案中，本文使用的標(biāo)簽是可去除的，例如一旦不再需要它們(例如在純化蛋白之后)，就通過(guò)化學(xué)試劑或通過(guò)酶促方式去除。在某些實(shí)施方案中，本文描述的載體蛋白包含使載體蛋白靶向至表達(dá)載體蛋白的宿主細(xì)胞的周質(zhì)間隙的信號(hào)序列。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，信號(hào)序列來(lái)自大腸桿菌DsbA、大腸桿菌外膜孔蛋白A(OmpA)、大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白(MalE)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌果膠酸裂合酶(PelB)、FlgI、NikA或芽孢桿菌屬木聚糖內(nèi)切酶(XynA)、不耐熱大腸桿菌腸毒素LTIIb、芽孢桿菌木聚糖內(nèi)切酶XynA或大腸桿菌鞭毛蛋白(FlgI)。5.3.3糖基化機(jī)構(gòu)本文提供的宿主細(xì)胞包含和/或可修飾以包含編碼能夠產(chǎn)生來(lái)自ExPEC的O抗原(例如O25(例如O25B)、O1、O2和/或O6抗原)的基因機(jī)構(gòu)(例如糖基轉(zhuǎn)移酶)的核酸。參見(jiàn)部分5.1。糖基轉(zhuǎn)移酶本文提供的宿主細(xì)胞包含編碼能夠產(chǎn)生ExPECO抗原的糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸，所述ExPECO抗原為(例如)來(lái)自血清型O25(例如O25A或O25B，參見(jiàn)圖3B)、O1(參見(jiàn)圖12)、O2(參見(jiàn)圖19)和O6(例如，產(chǎn)生包含支鏈Glc單糖的O6抗原或包含支鏈GlcNAc單糖的O6抗原的O6血清型，參見(jiàn)圖17)的大腸桿菌的O抗原。示例性核酸描述于部分5.1中。在某些實(shí)施方案中，編碼能夠產(chǎn)生ExPECO抗原的糖基轉(zhuǎn)移酶的一些或所有核酸由本文提供的宿主細(xì)胞天然表達(dá)(例如，核酸存在于宿主細(xì)胞的"野生型"背景中)。在某些實(shí)施方案中，編碼能夠產(chǎn)生ExPECO抗原的糖基轉(zhuǎn)移酶的一些或所有核酸不由本文提供的宿主細(xì)胞天然表達(dá)，即，一些或所有核酸對(duì)宿主細(xì)胞是異源的?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的方法(例如部分5.3中描述的方法)工程改造宿主細(xì)胞以包含特異性核酸，例如部分5.1中描述的核酸。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的宿主細(xì)胞包含編碼能夠產(chǎn)生O25B血清型的大腸桿菌O抗原(即本文描述的O25B抗原)的糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述核酸編碼來(lái)自u(píng)pec138(SEQIDNO:12)的rfb簇或與SEQIDNO:12約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的基因簇。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述核酸編碼來(lái)自u(píng)pec163的rfb簇或與來(lái)自u(píng)pec163的rfb簇約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的基因簇。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述核酸編碼來(lái)自u(píng)pec177的rfb簇或與來(lái)自u(píng)pec177的rfb簇約或至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同或同源的基因簇。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述編碼能夠產(chǎn)生O25B血清型的大腸桿菌O抗原的糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸是O25B血清型的基因，其中所述基因是rmlB(SEQIDNO:1)、rmlD(SEQIDNO:2)、rmlA(SEQIDNO:3)、rmlC(SEQIDNO:4)、wzx(SEQIDNO:5)、wekA(SEQIDNO:6)、wekB(SEQIDNO:7)、wzy(SEQIDNO:8)、wbbJ(SEQIDNO:9)、wbbK(SEQIDNO:10)和wbbL(SEQIDNO:11)。參見(jiàn)表3和9。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的宿主細(xì)胞包含編碼能夠產(chǎn)生O25A血清型的大腸桿菌O抗原(即本文描述的O25A抗原)的蛋白(例如糖基轉(zhuǎn)移酶)的核酸。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述編碼能夠產(chǎn)生O25A血清型的大腸桿菌O抗原的蛋白(例如糖基轉(zhuǎn)移酶)的核酸是O25血清型的基因，其中所述基因是rmlB、rmlD、rmlA、rmlC、wzx、wekA、wekB、wekC、wzy、fnlA、fnlB、fnlC、wbuB和/或wbuC。參見(jiàn)Wang等人(2010)JClinMicrobiol48,2066-2074；GenbankGU014554；和表2。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的宿主細(xì)胞包含編碼能夠產(chǎn)生O2血清型的O抗原大腸桿菌的糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述編碼能夠產(chǎn)生O2血清型的大腸桿菌O抗原的糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸是O2血清型的基因，其中所述基因是rmlB、rmlD、rmlA、rmlC、wzx、wekP、wekQ、wekR、wzy、fdtA、fdtB和/或fdtC。SeeLi等人(2010)JMicrobiolMethods82,71-77；Fratamico等人，2010,CanadianJournalofMicrobiology56,308-316；和表5。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的宿主細(xì)胞包含編碼能夠產(chǎn)生O6血清型的O抗原大腸桿菌的糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸。參見(jiàn)Welch等人，2002,PNASUSA99(26)：17020-17024；Jann等人，Carbohydr.Res.263(1994)217-225和Jansson等人，Carbohydr.Res.131(1984)277-283。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O6血清型包含支鏈Glc單糖。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的宿主細(xì)胞包含編碼能夠產(chǎn)生O1血清型的O抗原大腸桿菌的糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O1血清型是O1A。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述編碼能夠產(chǎn)生O1血清型的大腸桿菌O抗原的糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸是O1血清型的基因，其中所述基因是rmlB、rmlD、rmlA、rmlC、wzx、mnaA、wekM、wzy、wekN和/或wekO。寡糖基轉(zhuǎn)移酶寡糖基轉(zhuǎn)移酶將脂質(zhì)-連接的寡糖轉(zhuǎn)移至包含N-糖基化共有基序(例如Asn-X-Ser(Thr)，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15))的新生多肽鏈的天冬酰胺殘基中(參見(jiàn)WO2006/119987)。參見(jiàn)例如WO2003/074687和WO2006/119987，其公開(kāi)內(nèi)容以其整體通過(guò)引用并入本文。在某些實(shí)施方案中，本文提供的宿主細(xì)胞包含編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸。編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸可對(duì)宿主細(xì)胞是天然的，或可使用遺傳方法引入宿主細(xì)胞中，如上文所描述。寡糖基轉(zhuǎn)移酶可來(lái)自本領(lǐng)域已知的任一來(lái)源。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，寡糖基轉(zhuǎn)移酶可以來(lái)自彎曲桿菌(Campylobacter)的寡糖基轉(zhuǎn)移酶。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，寡糖基轉(zhuǎn)移酶是來(lái)自空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)的寡糖基轉(zhuǎn)移酶(即pglB；參見(jiàn)例如Wacker等人，2002,Science298：1790-1793；還參見(jiàn)例如NCBI基因ID：3231775,UniProt登錄號(hào)O86154)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，寡糖基轉(zhuǎn)移酶是來(lái)自紅嘴鷗彎曲桿菌(Campylobacterlari)的寡糖基轉(zhuǎn)移酶(例如參見(jiàn)NCBI基因ID：7410986)。5.4生物綴合物在某些實(shí)施方案中，可使用本文描述的宿主細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生包含連接至載體蛋白的本文描述的大腸桿菌O抗原(例如O25B；參見(jiàn)部分5.2)的生物綴合物。本領(lǐng)域已知使用宿主細(xì)胞產(chǎn)生所述生物綴合物的方法。參見(jiàn)例如WO2003/074687和WO2006/119987?；蛘?，可通過(guò)化學(xué)合成來(lái)制備糖綴合物，即，在宿主細(xì)胞之外(在體外)制備。例如，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(包括通過(guò)使用多糖/寡糖以及蛋白載體中的活化反應(yīng)性基團(tuán))來(lái)使本文描述的大腸桿菌O抗原(例如O25B)綴合至載體蛋白。參見(jiàn)例如Pawlowski等人，2000,Vaccine18：1873-1885；和Robbins等人，2009,ProcNatlAcadSciUSA106：7974-7978)，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。此類(lèi)方法包括：從宿主細(xì)胞提取抗原性多糖/寡糖，純化多糖/寡糖，化學(xué)活化多糖/寡糖，和使多糖/寡糖綴合至載體蛋白。如本文描述的生物綴合物具有優(yōu)于糖綴合物的有利性質(zhì)，例如，生物綴合物在制造中需要更少化學(xué)物質(zhì)且在生成的最終產(chǎn)物方面更一致。因此，生物綴合物優(yōu)于化學(xué)產(chǎn)生的糖綴合物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含連接至本文描述的ExPECO抗原的載體蛋白的生物綴合物。參見(jiàn)部分5.2。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含N-連接至大腸桿菌O25B的載體蛋白(例如EPA)的生物綴合物。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含連接至下文呈現(xiàn)的式O25B的化合物的載體蛋白(例如EPA)的生物綴合物：,其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間的整數(shù)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，載體蛋白N-連接至式O25B的O抗原，即，O25B連接至這樣的載體蛋白的Asn殘基：包含序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)；或包含共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)的載體蛋白，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含連接至下文呈現(xiàn)的式O25B’的化合物的載體蛋白(例如，EPA)的生物綴合物：,其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間的整數(shù)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，載體蛋白N-連接至式O25B’的O抗原。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含連接至O25A抗原的載體蛋白(例如，EPA)的生物綴合物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O25A抗原包含式O25A：或O25A’：。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含連接至O1抗原的載體蛋白(例如，EPA)的生物綴合物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O1抗原是O1A，例如，所述抗原包含式O1A：或O1A’：在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O1抗原是O1B，例如，所述抗原包含式O1B：或O1B’：在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O1抗原是O1C，例如，所述抗原包含式O1C：或O1C’：。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含連接至O2抗原的載體蛋白(例如，EPA)的生物綴合物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O2抗原包含式O2：或O2’。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含連接至O6抗原的載體蛋白(例如，EPA)的生物綴合物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O6抗原包含式O6Glc:O6GlcNAc：O6Glc’：或O6GlcNAc’：。可通過(guò)本領(lǐng)域已知用于純化蛋白的任何方法來(lái)純化本文描述的生物綴合物，例如通過(guò)色譜(例如離子交換、陰離子交換、親和色譜和大小柱色譜)、離心、差異溶解性或通過(guò)用于純化蛋白的任何其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。參見(jiàn)例如Saraswat等人，2013,Biomed.Res.Int.ID#312709(p.1-18)；還參見(jiàn)WO2009/104074中描述的方法。另外，可使生物綴合物融合至本文描述或另外本領(lǐng)域已知的異源性多肽序列以促進(jìn)純化。用于純化特定生物綴合物的實(shí)際條件部分地取決于合成策略(例如合成產(chǎn)生相比于重組產(chǎn)生)和因素諸如生物綴合物的凈電荷、疏水性和/或親水性，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的。5.5針對(duì)O25B的抗體本文描述的O25B抗原(參見(jiàn)部分5.2)和/或包含本文描述的O25B抗原的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)可用于誘導(dǎo)針對(duì)ExPEC的中和抗體。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，可將本文描述的O25B抗原和/或包含本文描述的O25B抗原的生物綴合物施用于個(gè)體(例如，人、小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)以誘導(dǎo)包括產(chǎn)生抗體的免疫反應(yīng)。可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)(例如，免疫親和色譜、離心、沉淀等)來(lái)分離此類(lèi)抗體。此外，可使用本文描述的O25B抗原從抗體文庫(kù)篩選抗體。例如，可將分離的O25B固定至固體支持物(例如，硅膠、樹(shù)脂、衍生化塑料膜、玻璃珠、棉花、塑料珠、聚苯乙烯珠、氧化鋁凝膠或多糖、磁性珠)，并篩選以用于結(jié)合至抗體。作為替代方案，可將待篩選的抗體固定至固體支持物且篩選以用于結(jié)合至O25B?？墒褂萌魏魏Y選測(cè)定(諸如淘選測(cè)定、ELISA、表面等離振子共振或本領(lǐng)域已知的其它抗體篩選測(cè)定)來(lái)篩選結(jié)合至O25B的抗體。篩選的抗體文庫(kù)可以是市售抗體文庫(kù)、體外生成文庫(kù)或通過(guò)從感染EXPEC的個(gè)體鑒定和克隆或分離抗體而獲得的文庫(kù)?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)生成抗體文庫(kù)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，通過(guò)克隆抗體且將其用于噬菌體展示文庫(kù)或噬菌粒展示文庫(kù)中來(lái)生成抗體文庫(kù)。使用O25B和/或O25B的生物綴合物鑒定或引發(fā)的抗體可包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特異性結(jié)合至O25B的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。免疫球蛋白分子可以是任何類(lèi)型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、種類(lèi)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類(lèi)的免疫球蛋白分子?？贵w包括但不限于單克隆抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab')片段、二硫鍵連接的Fv(sdFv)和抗獨(dú)特型(抗Id)抗體(包括，例如，針對(duì)使用本文描述的方法引發(fā)或鑒定的抗體的抗Id抗體)和任何上述的表位結(jié)合片段。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，使用O25B和/或O25B的生物綴合物引發(fā)或鑒定的抗體是人或人源化單克隆抗體。使用O25B和/或O25B的生物綴合物引發(fā)或鑒定的抗體可用于監(jiān)測(cè)治療效力和/或疾病進(jìn)展?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任一免疫測(cè)定系統(tǒng)來(lái)用于該目的，包括但不限于使用下列技術(shù)的競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定系統(tǒng)：放射免疫測(cè)定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)、"夾心"免疫測(cè)定、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測(cè)定、免疫放射測(cè)定、熒光免疫測(cè)定、蛋白A免疫測(cè)定和免疫電泳測(cè)定。使用O25B和/或O25B的生物綴合物引發(fā)或鑒定的抗體可用于(例如)從多種大腸桿菌菌株檢測(cè)大腸桿菌O25B菌株和/或診斷大腸桿菌O25B菌株感染。5.6組合物5.6.1包含宿主細(xì)胞的組合物在一個(gè)方面，本文提供了包含本文描述的宿主細(xì)胞的組合物。此類(lèi)組合物可用于生成本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)的方法中，例如，可在適于產(chǎn)生蛋白的條件下培養(yǎng)組合物。隨后，可使用本領(lǐng)域已知的方法從所述組合物分離生物綴合物。包含本文提供的宿主細(xì)胞的組合物可包含其它適于本文描述的宿主細(xì)胞的維持和存活的組分，且可另外包含通過(guò)宿主細(xì)胞產(chǎn)生蛋白所需或?qū)ζ溆幸娴念~外組分，例如用于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的誘導(dǎo)劑，諸如阿拉伯糖、IPTG。5.6.2包含抗原和/或生物綴合物的組合物在另一個(gè)方面，本文提供了包含一種或多種本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)的組合物(例如藥物組合物)和包括一種或多種本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)的組合物(例如藥物組合物)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的組合物包含一種或多種本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的組合物包含一種或多種本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的組合物包含一種或多種本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)和一種或多種本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)。本文描述的組合物可用于治療和預(yù)防個(gè)體(例如人類(lèi)個(gè)體)的腸外病原性大腸桿菌(ExPEC)感染。參見(jiàn)部分5.7。在某些實(shí)施方案中，除包含本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)和/或本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)外，本文描述的組合物(例如藥物組合物)還包含藥學(xué)上可接受的載體。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的"意指已獲得聯(lián)邦或州政府管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)或列于美國(guó)藥典或其它公認(rèn)藥典中可用于動(dòng)物(且更具體而言用于人)中。在藥學(xué)上可接受的載體的背景中，如本文所使用的術(shù)語(yǔ)"載體"是指與藥物組合物一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。也可采用鹽水溶液和右旋糖和甘油水溶液作為液體載體，具體而言用于可注射溶液。合適賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。合適藥物載體的實(shí)例由E.W.Martin描述于"Remington'sPharmaceuticalSciences"中。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含連接至本文描述的抗原(例如部分5.2中描述的ExPECO抗原)的載體蛋白(例如部分5.3.2中描述的載體蛋白)的組合物。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的組合物包含連接至大腸桿菌O25B(參見(jiàn)部分5.2)的載體蛋白(例如部分5.3.2中描述的載體蛋白，例如EPA或MBP)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的組合物包含連接至大腸桿菌O25A(參見(jiàn)部分5.2)的載體蛋白(例如部分5.3.2中描述的載體蛋白，例如EPA或MBP)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的組合物包含連接至大腸桿菌O1(參見(jiàn)部分5.2)的載體蛋白(例如部分5.3.2中描述的載體蛋白，例如EPA或MBP)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O1大分子是O1A。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O1大分子是O1B。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O1大分子是O1C。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的組合物包含連接至大腸桿菌O2(參見(jiàn)部分5.2)的載體蛋白(例如部分5.3.2中描述的載體蛋白，例如EPA或MBP)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的組合物包含連接至大腸桿菌O6(參見(jiàn)部分5.2)的載體蛋白(例如部分5.3.2中描述的載體蛋白，例如EPA或MBP)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O6大分子是包含支鏈Glc單糖的O6大分子。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含以下的組合物(例如藥物組合物)：(i)O25(例如O25A或O25B)大分子或包含O25(例如O25A或O25B)的生物綴合物；和(ii)O1大分子或包含O1的生物綴合物。參見(jiàn)部分5.2。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O25大分子是O25B大分子。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O1大分子是O1A。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O1大分子是O1B。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O1大分子是O1C。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含以下的組合物(例如藥物組合物)：(i)O25(例如O25A或O25B)大分子或包含O25(例如O25A或O25B)的生物綴合物；和(ii)O2大分子或包含O2的生物綴合物。參見(jiàn)部分5.2和5.4。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O25大分子是O25B大分子。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含以下的組合物(例如藥物組合物)：(i)O25(例如O25A或O25B)大分子或包含O25(例如O25A或O25B)的生物綴合物；和(ii)O6大分子(例如包含支鏈Glc單糖或支鏈GlcNAc單糖的O6大分子)或包含O6的生物綴合物。參見(jiàn)部分5.2和5.4。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O25大分子是O25B大分子。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O6大分子是包含支鏈Glc單糖的O6大分子。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了組合物(例如藥物組合物)，其包含大腸桿菌O25B(參見(jiàn)部分5.2)或包含O25的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)和以下中的至少一種：(i)大腸桿菌O1或包含O1的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.2和5.4)；(ii)大腸桿菌O2或包含O2的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.2和5.4)；和/或(iii)大腸桿菌O6或包含O6的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.2和5.4)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O1是O1A。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O1是O1B。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O1是O1C。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O6是包含支鏈Glc單糖的O6。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了包含以下中的至少兩種的組合物(例如藥物組合物)：(i)O25(例如O25A或O25B)大分子或包含O25(例如O25A或O25B)的生物綴合物；(ii)O1大分子或包含O1的生物綴合物；(iii)O2大分子或包含O2的生物綴合物；和/或(iv)O6大分子(例如包含支鏈Glc單糖或支鏈GlcNAc單糖的O6大分子)或包含O6的生物綴合物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O25大分子是O25B大分子。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O1大分子是O1A。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O1大分子是O1B。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O1大分子是O1C。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O6大分子是包含支鏈Glc單糖的O6大分子。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了組合物(例如藥物組合物)，其包含含有大腸桿菌O25B的生物綴合物和含有大腸桿菌O1A的生物綴合物。此類(lèi)生物綴合物描述于部分5.4中。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了組合物(例如藥物組合物)，其包含含有大腸桿菌O25B的生物綴合物和含有大腸桿菌O1B的生物綴合物。此類(lèi)生物綴合物描述于部分5.4中。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了組合物(例如藥物組合物)，其包含含有大腸桿菌O25B的生物綴合物和含有大腸桿菌O1C的生物綴合物。此類(lèi)生物綴合物描述于部分5.4中。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了組合物(例如藥物組合物)，其包含含有大腸桿菌O25B的生物綴合物和含有大腸桿菌O2的生物綴合物。此類(lèi)生物綴合物描述于部分5.4中。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了組合物(例如藥物組合物)，其包含含有大腸桿菌O25B的生物綴合物和含有大腸桿菌O6的生物綴合物。此類(lèi)生物綴合物描述于部分5.4中。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的組合物包含：連接至大腸桿菌O25B(參見(jiàn)部分5.2)的載體蛋白(例如部分5.3.2中描述的載體蛋白，例如EPA或MBP)；(ii)連接至O1血清型(例如O1A)的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)的載體蛋白(例如部分5.3.2中描述的載體蛋白，例如EPA或MBP)；(iii)連接至O2血清型的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)的載體蛋白(例如部分5.1.2中描述的載體蛋白，例如EPA或MBP)；和(iv)連接至O6血清型的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)的載體蛋白(例如部分5.3.2中描述的載體蛋白，例如EPA或MBP)。在某些實(shí)施方案中，前述組合物包含連接至除O1、O2、O6或O25外的大腸桿菌血清型的大腸桿菌O抗原的載體蛋白(例如部分5.3.2中描述的載體蛋白，例如EPA或MBP)。其它有用的大腸桿菌血清型描述于(例如)下文的實(shí)施例1和表1中。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的組合物包含O25(例如O25A或O25B)大分子。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的組合物包含O1大分子(例如O1A、O1B或O1C)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的組合物包含O2大分子。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的組合物包含O6大分子(例如包含支鏈Glc單糖或支鏈GlcNAc單糖的O6大分子)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的組合物包含O25(例如O25A或O25B)大分子、O1大分子、O2大分子和O6大分子(例如包含支鏈Glc單糖或支鏈GlcNAc單糖的O6大分子)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O25大分子是O25B大分子。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O1大分子是O1A。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O6大分子是包含支鏈Glc單糖的O6大分子。本文提供的組合物可用于引發(fā)施用組合物的宿主中的免疫反應(yīng)，即是免疫原性的。因此，本文描述的組合物可用作針對(duì)ExPEC感染的疫苗，或可用于治療ExPEC感染，且可因此配制為藥物組合物。參見(jiàn)部分5.7。包含本文描述的生物綴合物和/或大分子的組合物可包含適用于藥物施用的任何額外組分。在具體實(shí)施方案中，本文描述的組合物是單價(jià)制劑。在其它實(shí)施方案中，本文描述的組合物是多價(jià)制劑，例如二價(jià)、三價(jià)和四價(jià)制劑。例如，多價(jià)制劑包含不止一種本文描述的生物綴合物或大腸桿菌O抗原。關(guān)于大腸桿菌O抗原和生物綴合物的描述，分別參見(jiàn)部分5.2和5.4。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文描述的組合物是包含大分子或生物綴合物的四價(jià)制劑，其中所述化合價(jià)來(lái)自O(shè)25B、O1A、O6和O2血清型/亞血清型的大腸桿菌O抗原。在某些實(shí)施方案中，本文描述的組合物額外包含防腐劑，例如汞衍生物硫柳汞。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文描述的藥物組合物包含0.001%至0.01%硫柳汞。在其它實(shí)施方案中，本文描述的藥物組合物不包含防腐劑。在某些實(shí)施方案中，本文描述的組合物(例如免疫原性組合物)包含佐劑，或與佐劑組合施用。與本文描述的組合物組合施用的佐劑可在施用所述組合物之前、同時(shí)或之后施用。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"佐劑"是指如下化合物：其當(dāng)與本文描述的組合物結(jié)合或作為其一部分施用時(shí)增加、增強(qiáng)和/或加強(qiáng)對(duì)生物綴合物的免疫反應(yīng)，但當(dāng)單獨(dú)施用化合物時(shí)不生成對(duì)生物綴合物的免疫反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，佐劑生成對(duì)聚生物綴合物肽的免疫反應(yīng)且不產(chǎn)生過(guò)敏或其它不良反應(yīng)。佐劑可通過(guò)幾種機(jī)制增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括，例如，淋巴細(xì)胞募集、刺激B和/或T細(xì)胞和刺激巨噬細(xì)胞。佐劑的具體實(shí)例包括但不限于鋁鹽(alum)(例如氫氧化鋁、磷酸鋁和硫酸鋁)、3去-O-?；瘑瘟柞；|(zhì)A(MPL)(參見(jiàn)英國(guó)專(zhuān)利GB2220211)、MF59(Novartis)、AS03(GlaxoSmithKline)、AS04(GlaxoSmithKline)、聚山梨醇酯80(Tween80；ICLAmericas,Inc.)、咪唑并吡啶化合物(參見(jiàn)國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2007/064857，公開(kāi)為國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO2007/109812)、咪唑并喹喔啉化合物(參見(jiàn)國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2007/064858，公開(kāi)為國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO2007/109813)和皂苷諸如QS21(參見(jiàn)Kensil等人，VaccineDesign：TheSubunitandAdjuvantApproach(Powell和Newman編輯，PlenumPress,NY,1995)；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,057,540)。在一些實(shí)施方案中，佐劑是弗氏佐劑(完全或不完全)。其它佐劑是任選地與免疫刺激劑(諸如單磷?；|(zhì)A)組合的水包油型乳液(諸如角鯊烯或花生油)(參見(jiàn)Stoute等人，N.Engl.J.Med.336,86-91(1997))。另一佐劑是CpG(BioworldToday,Nov.15,1998)。在某些實(shí)施方案中，本文描述的組合物被配制以適用于施用于個(gè)體的預(yù)期途徑。例如，本文描述的組合物可被配制以適用于皮下、腸胃外、經(jīng)口、皮內(nèi)、經(jīng)皮、結(jié)腸、腹膜內(nèi)和直腸施用。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，藥物組合物可被配制以用于靜脈內(nèi)、經(jīng)口、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、局部、皮內(nèi)、經(jīng)皮或肺部施用。在某些實(shí)施方案中，本文描述的組合物額外包含一種或多種緩沖劑，例如磷酸鹽緩沖劑和蔗糖磷酸鹽谷氨酸鹽緩沖劑。在其它實(shí)施方案中，本文描述的組合物不包含緩沖劑。在某些實(shí)施方案中，本文描述的組合物額外包含一種或多種鹽，例如氯化鈉、氯化鈣、磷酸鈉、谷氨酸單鈉和鋁鹽(例如氫氧化鋁、磷酸鋁、alum(硫酸鉀鋁)或此類(lèi)鋁鹽的混合物)。在其它實(shí)施方案中，本文描述的組合物不包含鹽。本文描述的組合物可與施用說(shuō)明一起包括于容器、包裝或分配器中?？稍谑褂弥皟?chǔ)存本文描述的組合物，例如，組合物可冷凍(例如在約-20℃下或在約-70℃下)儲(chǔ)存；儲(chǔ)存于冷藏條件下(例如在約4℃下)；或儲(chǔ)存在室溫下。5.7預(yù)防和治療用途本文提供了治療和預(yù)防個(gè)體的腸外大腸桿菌(ExPEC)感染的方法，其包括向個(gè)體施用本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，使用本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)來(lái)預(yù)防個(gè)體(例如人類(lèi)個(gè)體)的ExPEC感染，即，使用本文描述的組合物來(lái)針對(duì)ExPEC感染對(duì)個(gè)體接種疫苗。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，使用本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)來(lái)治療已經(jīng)感染ExPEC的個(gè)體。本文還提供了誘導(dǎo)個(gè)體的針對(duì)ExPEC的免疫反應(yīng)的方法，其包括向個(gè)體施用本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述個(gè)體在施用時(shí)具有ExPEC感染。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述個(gè)體在施用時(shí)未具有ExPEC感染。本文還提供了誘導(dǎo)在個(gè)體中產(chǎn)生針對(duì)ExPEC的調(diào)理吞噬抗體的方法，其包括向個(gè)體施用本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述個(gè)體在施用時(shí)具有ExPEC感染。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述個(gè)體在施用時(shí)未具有ExPEC感染。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了預(yù)防個(gè)體的大腸桿菌(例如ExPEC)感染的方法，其中所述方法包括向有需要的個(gè)體施用有效量的部分5.6.2中描述的組合物。本文提供的預(yù)防個(gè)體的ExPEC感染的方法導(dǎo)致在個(gè)體中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，其包括向個(gè)體施用部分5.6.2中描述的組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本文描述的誘導(dǎo)個(gè)體的免疫反應(yīng)的方法導(dǎo)致對(duì)個(gè)體接種疫苗以抵抗其O抗原存在于組合物中的ExPEC菌株的感染。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供了治療個(gè)體的大腸桿菌(例如ExPEC)感染的方法，其中所述方法包括向有需要的個(gè)體施用有效量的部分5.6.2中描述的組合物。在某些實(shí)施方案中，由本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)有效預(yù)防和/或治療由ExPEC的任何血清型、亞血清型或菌株引起的ExPEC感染。在某些實(shí)施方案中，由本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)有效預(yù)防和/或治療不止一種ExPEC血清型的ExPEC感染。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，由本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)有效預(yù)防和/或治療由O25血清型的大腸桿菌引起的感染。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O25血清型是O25B。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O25血清型是O25A。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，由本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)有效預(yù)防和/或治療由O1血清型的大腸桿菌引起的感染。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O1血清型是O1A。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O1血清型是O1B。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述O1血清型是O1C。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，由本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)有效預(yù)防和/或治療由O2血清型的大腸桿菌引起的感染。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，由本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)有效預(yù)防和/或治療由O6血清型的大腸桿菌引起的感染。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，由本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)有效預(yù)防和/或治療由下列大腸桿菌血清型中的兩種或更多種引起的感染：O25(例如O25B和O25A)、O1(例如O1A、O1B和O1C)、O2和/或O6。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，由本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)有效預(yù)防和/或治療由下列大腸桿菌血清型中的每一種引起的感染：O25(例如O25B和O25A)、O1(例如O1A、O1B和O1C)、O2和O6。為了治療具有ExPEC感染的個(gè)體或針對(duì)ExPEC感染免疫個(gè)體，可向個(gè)體施用本文描述的單一組合物，其中所述組合物包含一種、兩種、三種、四種或更多種本文描述的大腸桿菌抗原。參見(jiàn)部分5.2?；蛘?，為了治療具有ExPEC感染的個(gè)體或針對(duì)ExPEC感染免疫個(gè)體，可向個(gè)體施用多種本文描述的生物綴合物，例如，可向個(gè)體施用兩種、三種、四種或更多種部分5.4中描述的生物綴合物。或者，為了治療具有ExPEC感染的個(gè)體或針對(duì)ExPEC感染免疫個(gè)體，可向個(gè)體施用多種本文描述的組合物，例如，可向個(gè)體施用兩種、三種、四種或更多種部分5.6.2中描述的組合物。在某些實(shí)施方案中，在施用本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)后在個(gè)體中誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)有效減少由ExPEC感染導(dǎo)致的癥狀。ExPEC感染的癥狀可根據(jù)感染性質(zhì)而變化且可包括但不限于：排尿困難、增加的尿頻或尿急、膿尿、血尿、背痛、尿痛、發(fā)燒、寒冷和/或惡心(例如在具有由ExPEC引起的泌尿道感染的個(gè)體中)；高燒、頭痛、頸部僵硬、惡心、嘔吐、癲癇發(fā)作、嗜睡和/或光敏性(例如在具有由ExPEC引起的腦膜炎的個(gè)體中)；發(fā)燒、增加的心率、增加的呼吸速率、降低的尿輸出、減少的血小板計(jì)數(shù)、腹部疼痛、呼吸困難和/或異常心臟功能(例如在具有由ExPEC引起的敗血癥的個(gè)體中)。在某些實(shí)施方案中，在施用本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)后在個(gè)體中誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)有效減小患有ExPEC感染的個(gè)體的住院可能。在一些實(shí)施方案中，在施用本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)后在個(gè)體中誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)有效縮短患有ExPEC感染的個(gè)體的住院持續(xù)時(shí)間。在另一個(gè)方面，本文提供通過(guò)施用本文描述的抗體(即本文描述的抗O25B抗體)來(lái)預(yù)防和/或治療個(gè)體中由O25B血清型的大腸桿菌引起的ExPEC感染的方法。在具體實(shí)施方案中，中和抗體系單克隆抗體。5.7.1組合治療在某些實(shí)施方案中，向個(gè)體施用本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)與一種或多種其它治療劑(例如抗細(xì)菌或免疫調(diào)節(jié)治療劑)的組合。所述一種或多種其它治療劑可有益于治療或預(yù)防ExPEC感染或可改善與ExPEC感染相關(guān)的癥狀或病況。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種其它治療劑是疼痛緩解劑或抗發(fā)燒藥劑。在某些實(shí)施方案中，以下列方式施用各治療劑：間隔小于5分鐘、間隔小于30分鐘、間隔1小時(shí)、間隔約1小時(shí)、間隔約1小時(shí)至約2小時(shí)、間隔約2小時(shí)至約3小時(shí)、間隔約3小時(shí)至約4小時(shí)、間隔約4小時(shí)至約5小時(shí)、間隔約5小時(shí)至約6小時(shí)、間隔約6小時(shí)至約7小時(shí)、間隔約7小時(shí)至約8小時(shí)、間隔約8小時(shí)至約9小時(shí)、間隔約9小時(shí)至約10小時(shí)、間隔約10小時(shí)至約11小時(shí)、間隔約11小時(shí)至約12小時(shí)、間隔約12小時(shí)至18小時(shí)、間隔18小時(shí)至24小時(shí)、間隔24小時(shí)至36小時(shí)、間隔36小時(shí)至48小時(shí)、間隔48小時(shí)至52小時(shí)、間隔52小時(shí)至60小時(shí)、間隔60小時(shí)至72小時(shí)、間隔72小時(shí)至84小時(shí)、間隔84小時(shí)至96小時(shí)或間隔96小時(shí)至120小時(shí)?？山M合使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何抗細(xì)菌劑與本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)?？辜?xì)菌劑的非限制性實(shí)例包括阿米卡星、阿莫西林、阿莫西林-克拉維酸、兩性霉素-B、氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、安普霉素、阿奇霉素、氨曲南、桿菌肽、芐基青霉素、卡泊芬凈、頭孢克洛、頭孢羥胺芐、頭孢胺芐、頭孢噻吩、頭孢唑林、頭孢地尼、頭孢吡肟、頭孢克肟、頭孢甲肟、頭孢哌酮、頭孢哌酮-舒巴坦、頭孢噻肟、頭孢西丁、頭孢匹羅、頭孢泊肟、頭孢泊肟-克拉維酸、頭孢泊肟-舒巴坦、頭孢丙烯、頭孢喹肟、頭孢他啶、頭孢布烯、頭孢噻呋、頭孢托羅、頭孢曲松、頭孢呋辛、氯霉素(Chloramphenicole)、氟苯尼考(Florfenicole)、環(huán)丙沙星、克拉霉素、克林沙星、克林霉素、氯唑西林、粘菌素、Cotrimoxazol(Trimthoprim/磺胺甲噁唑)、達(dá)巴萬(wàn)星、達(dá)福普汀/Quinopristin、達(dá)托霉素、地貝卡星、雙氯西林、多利培南、多西環(huán)素、恩氟沙星、厄他培南、紅霉素、氟氯西林、氟康唑、氟胞嘧啶、磷霉素、夫西地酸、加雷沙星、加替沙星、吉米沙星、慶大霉素、亞胺培南、伊曲康唑、卡那霉素、酮康唑、左氧氟沙星、林可霉素、利奈唑胺、氯碳頭孢、Mecillnam(甲亞胺青毒素(amdinocillin))、美羅培南、甲硝唑、美洛西林、美洛西林-舒巴坦、米諾環(huán)素、莫西沙星、莫匹羅星、萘啶酸、新霉素、奈替米星、呋喃妥因、諾氟沙星、氧氟沙星、苯唑西林、培氟沙星、青霉素V、哌拉西林、哌拉西林-舒巴坦、哌拉西林-三唑巴坦、利福平、羅紅霉素、司帕沙星、壯觀霉素、螺旋霉素、鏈霉素、舒巴坦、磺胺甲噁唑、替考拉寧、特拉萬(wàn)星、泰利霉素、替莫西林、四環(huán)素、替卡西林、替卡西林-克拉維酸、替吉環(huán)素、妥布霉素、甲氧芐啶、曲伐沙星、泰洛星、萬(wàn)古霉素、維吉霉素和伏立康唑。在某些實(shí)施方案中，組合治療包括施用兩種或更多種本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)和/或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)。5.7.2患者群體在某些實(shí)施方案中，將本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)施用于未治療個(gè)體，即不具有ExPEC感染或先前未具有ExPEC感染的個(gè)體。在一個(gè)實(shí)施方案中，將本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)施用于具有獲得ExPEC感染風(fēng)險(xiǎn)的未治療個(gè)體。在某些實(shí)施方案中，將本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)施用于診斷有ExPEC感染的個(gè)體。在一些實(shí)施方案中，在癥狀顯現(xiàn)或癥狀變得嚴(yán)重前(例如在患者需要住院前)，將本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)施用于感染ExPEC的個(gè)體。在某些實(shí)施方案中，將本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)施用于診斷有UPEC感染的個(gè)體。在一些實(shí)施方案中，將本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)施用于患有復(fù)發(fā)性泌尿道感染的個(gè)體。在一些實(shí)施方案中，將本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)施用于患有復(fù)發(fā)性泌尿道感染、但在治療時(shí)健康的個(gè)體。在一些實(shí)施方案中，將本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)施用于具有菌血癥或敗血癥或具有獲得菌血癥或敗血癥風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體。在一些實(shí)施方案中，待施用本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)的個(gè)體是動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，動(dòng)物是鳥(niǎo)。在某些實(shí)施方案中，動(dòng)物是犬。在某些實(shí)施方案中，動(dòng)物是貓。在某些實(shí)施方案中，動(dòng)物是馬。在某些實(shí)施方案中，動(dòng)物是牛。在某些實(shí)施方案中，動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，例如馬、豬、小鼠或靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，個(gè)體是人。在某些實(shí)施方案中，待施用本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)的個(gè)體是人類(lèi)成人。在某些實(shí)施方案中，待施用本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)的個(gè)體是50歲以上的人類(lèi)成人。在某些實(shí)施方案中，待施用本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)的個(gè)體是老人個(gè)體。在某些實(shí)施方案中，待施用本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)的個(gè)體是人類(lèi)兒童。在某些實(shí)施方案中，待施用本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)的個(gè)體是人類(lèi)嬰兒。在某些實(shí)施方案中，待施用本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)的個(gè)體是早產(chǎn)人類(lèi)嬰兒。在一些實(shí)施方案中，待施用本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)的個(gè)體是人類(lèi)幼兒。在某些實(shí)施方案中，待施用本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)的個(gè)體不是小于6個(gè)月齡的嬰兒。在某些實(shí)施方案中，待施用本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)的個(gè)體是懷孕的個(gè)體。在某些實(shí)施方案中，待施用本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)的個(gè)體是提前1、2、3、4、5、6、7或8周生產(chǎn)的女性。在某些實(shí)施方案中，待施用本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)的個(gè)體是具有增加的ExPEC風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體(例如免疫減弱或免疫缺陷的個(gè)體)。在某些實(shí)施方案中，待施用本文描述大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)的個(gè)體是與具有ExPEC感染或具有增加的ExPEC感染風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體親密接觸的個(gè)體。在某些實(shí)施方案中，待施用本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)的個(gè)體是健康護(hù)理工作者(例如醫(yī)生或護(hù)士)。在某些實(shí)施方案中，待施用本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)的個(gè)體是免疫減弱(例如患有HIV感染)或免疫抑制的。在某些實(shí)施方案中，待施用本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)的個(gè)體患有糖尿病。在某些實(shí)施方案中，待施用本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)的個(gè)體患有多發(fā)性硬化癥。在某些實(shí)施方案中，待施用本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)的個(gè)體具有需要其使用導(dǎo)管的病況。在某些實(shí)施方案中，待施用本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)的個(gè)體具有脊柱損傷。5.7.3施用的劑量和頻率有效治療和/或預(yù)防ExPEC感染的本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)的量取決于疾病性質(zhì)，且可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)確定?？山?jīng)由臨床醫(yī)師已知的各種途徑來(lái)施用O抗原、生物綴合物和/或組合物，例如皮下、腸胃外、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、局部、經(jīng)口、皮內(nèi)、經(jīng)皮、鼻內(nèi)等。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)由肌內(nèi)注射施用。制劑中所采用的確切劑量還將取決于施用途徑和感染的嚴(yán)重程度，且應(yīng)根據(jù)從業(yè)醫(yī)師的判斷和各個(gè)體的情況來(lái)決定。例如，有效劑量還可根據(jù)以下因素而變化：施用方式、目標(biāo)位點(diǎn)、患者的生理學(xué)狀態(tài)(包括年齡、體重、健康)、患者是人還是動(dòng)物、所施用的其它藥劑和治療是預(yù)防性還是治療性的。最佳地，滴定治療劑量以?xún)?yōu)化安全性和效力。在某些實(shí)施方案中，采用體外測(cè)定以幫助鑒定最佳劑量范圍。參見(jiàn)部分5.8?？筛鶕?jù)源自體外或動(dòng)物模型測(cè)試系統(tǒng)的劑量反應(yīng)曲線來(lái)外推有效劑量。在某些實(shí)施方案中，用于基于糖綴合物的疫苗(例如包含生物綴合物的組合物)的示例性劑量范圍為約0.1μg至400μg碳水化合物/劑量。在其它實(shí)施方案中，用于基于糖綴合物的疫苗(例如包含生物綴合物的組合物)的示例性劑量范圍為約0.1μg至4000μg蛋白/劑量。在某些實(shí)施方案中，用于基于糖綴合物的疫苗(例如包含生物綴合物的組合物)的示例性劑量包含0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50μg碳水化合物/劑量。在某些實(shí)施方案中，用于基于糖綴合物的疫苗(例如包含生物綴合物的組合物)的示例性劑量包含50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μg蛋白/劑量。在某些示例性實(shí)施方案中，對(duì)于所包括的每種糖綴合物，用于施用人的劑量對(duì)應(yīng)于0.5ml含有約1-10μg(例如約2-6μg，例如約4μg)多糖。在某些實(shí)施方案中，將本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)以單一劑量的形式施用于個(gè)體一次。在某些實(shí)施方案中，將本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)以單一劑量的形式施用于個(gè)體，隨后在3至6周后施用第二劑量。根據(jù)這些實(shí)施方案，可在第二次接種后以6至12個(gè)月間隔向個(gè)體施用加強(qiáng)接種。在某些實(shí)施方案中，加強(qiáng)接種可利用不同的大腸桿菌O抗原、生物綴合物或組合物。在一些實(shí)施方案中，可重復(fù)施用相同大腸桿菌O抗原、生物綴合物或組合物且各施用可間隔至少1天、2天、3天、5天、7天、10天、15天、30天、45天、2個(gè)月、75天、3個(gè)月或至少6個(gè)月。在某些實(shí)施方案中，將本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)以單一劑量的形式每年施用于個(gè)體一次。在某些實(shí)施方案中，將本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)作為2、3、4、5或更多個(gè)劑量間隔2周、3周、4周、5周或6周施用于個(gè)體。在一些實(shí)施方案中，以0.1μg至0.5mg、0.1μg至0.4mg、0.1μg至0.3mg、0.1μg至0.2mg或0.1μg至0.1mg碳水化合物內(nèi)容物的劑量將2、3、4、5或更多個(gè)劑量的本文描述的大腸桿菌O抗原(參見(jiàn)部分5.2)、本文描述的生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4)或本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)間隔2、3、4、5或6周施用于個(gè)體。在某些實(shí)施方案中，所施用的大腸桿菌O抗原、生物綴合物或組合物每次是相同的。在某些實(shí)施方案中，所施用的大腸桿菌O抗原、生物綴合物或組合物每次是不同的。對(duì)于用抗體(例如抗O25B抗體)的被動(dòng)免疫，劑量的范圍可為約0.0001至100mg抗體/kg體重或0.01至5mg抗體/kg體重。例如，劑量可以為1mg/kg體重或10mg/kg體重或在1-10mg/kg范圍內(nèi)，或換言之，對(duì)于70kg患者，劑量分別為70mg或700mg或在70-700mg范圍內(nèi)。一個(gè)示例性治療方案需要在一年或數(shù)年的時(shí)段中每?jī)芍苁┯靡淮位蛎吭率┯靡淮位蛎?至6個(gè)月施用一次，或以數(shù)年間隔施用。間隔可以是不規(guī)則的且基于患者中抗體的血液水平而進(jìn)行改變。5.8測(cè)定評(píng)價(jià)生物綴合物誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力的測(cè)定可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或本文描述的任何方法來(lái)評(píng)價(jià)本文描述的生物綴合物/組合物在個(gè)體中生成免疫反應(yīng)的能力。在一些實(shí)施方案中，可通過(guò)以下方式來(lái)評(píng)價(jià)生物綴合物在個(gè)體中生成免疫反應(yīng)的能力：用本文描述的生物綴合物免疫個(gè)體(例如小鼠)或個(gè)體組并用對(duì)照(PBS)免疫額外個(gè)體(例如小鼠)或個(gè)體組。隨后可用ExPEC攻擊個(gè)體或個(gè)體組并可測(cè)定ExPEC在個(gè)體或個(gè)體組中引起疾病(例如UTI)的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，如果用對(duì)照免疫的個(gè)體或個(gè)體組患有隨后用ExPEC攻擊的疾病，但用本文描述的生物綴合物或其組合物免疫的個(gè)體或個(gè)體組更少患有疾病或不患有疾病，則生物綴合物能夠在個(gè)體中生成免疫反應(yīng)?？赏ㄟ^(guò)，例如，免疫測(cè)定(諸如ELISA)測(cè)試本文描述的生物綴合物或其組合物誘導(dǎo)與來(lái)自ExPEC的O抗原交叉反應(yīng)的抗血清的能力。體外殺菌測(cè)定可使用血清殺菌測(cè)定(SBA)或調(diào)理吞噬殺滅測(cè)定(OPK)評(píng)價(jià)本文描述的生物綴合物在個(gè)體中生成免疫反應(yīng)的能力，所述測(cè)定代表已用于獲得基于糖綴合物的疫苗的批準(zhǔn)的成熟的并被接受的方法。此類(lèi)測(cè)定是本領(lǐng)域眾所周知的且簡(jiǎn)而言之包括以下步驟：通過(guò)向個(gè)體(例如小鼠)施用引發(fā)針對(duì)目標(biāo)靶(例如大腸桿菌的O抗原，例如O25B)的抗體的化合物來(lái)生成和分離此類(lèi)抗體。隨后，可通過(guò)，例如，以下方式來(lái)評(píng)價(jià)抗體的殺菌能力：在所述抗體和補(bǔ)體和(根據(jù)測(cè)定)中性細(xì)胞存在的情況下培養(yǎng)所討論的細(xì)菌(例如相關(guān)血清型的大腸桿菌)并例如使用標(biāo)準(zhǔn)微生物方法測(cè)定抗體殺滅和/或中和細(xì)菌的能力。5.9藥劑盒本文提供了藥物包裝或藥劑盒，其包含一個(gè)或多個(gè)填充有本文描述的組合物(參見(jiàn)部分5.6.2)的一種或多種成分(諸如本文提供的一種或多種大腸桿菌抗原(參見(jiàn)部分5.2)和/或生物綴合物(參見(jiàn)部分5.4))的容器。任選地，此類(lèi)容器可附帶有監(jiān)管藥物或生物產(chǎn)品的制造、使用或銷(xiāo)售的政府機(jī)構(gòu)所規(guī)定形式的通知，該通知反映該機(jī)構(gòu)已批準(zhǔn)用于人施用的制造、使用或銷(xiāo)售。本文涵蓋的藥劑盒可用于個(gè)體的上述治療和免疫方法中。6.實(shí)施例方法凝集在該方法中，將細(xì)胞或裂解細(xì)胞物質(zhì)與含有對(duì)于聚合結(jié)構(gòu)(例如O抗原)特異性的抗體的抗血清混合。當(dāng)抗血清識(shí)別細(xì)胞結(jié)構(gòu)時(shí)，形成可見(jiàn)、不溶性聚集物。通常使用此方法來(lái)鑒定O、K和H血清型。參見(jiàn)DebRoy,等人,(2011)Animalhealthresearchreviews/ConferenceofResearchWorkersinAnimalDiseases12,169-185。LPS樣品制備用于SDSPAGE分析革蘭氏陰性細(xì)胞的LPS由脂質(zhì)A基質(zhì)構(gòu)成，所述脂質(zhì)A基質(zhì)用核心寡糖修飾以提供用于O抗原的附接。為了分析臨床分離物的LPS，使細(xì)胞在37℃下于標(biāo)準(zhǔn)LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)24h，且收集OD600為2的對(duì)應(yīng)于1ml培養(yǎng)物的生物質(zhì)且在1xL?mmli樣品緩沖液中裂解并在95℃下溫育10分鐘。使用1g/l蛋白酶K將提取物在65℃下進(jìn)一步處理1小時(shí)以去除任何蛋白信號(hào)。通過(guò)SDSPAGE分離處理的提取物且通過(guò)銀染色或使用適當(dāng)抗血清的Western印跡來(lái)顯現(xiàn)LPS。用于包被ELISA板的LPS制備物使用由Apicella,(2008)MethodsMolBiol431,3-13描述的方法來(lái)制備LPS，且進(jìn)一步如由Perdomo和Montero,(2006)BiotecnologíaAplicada23:124-129所描述進(jìn)行純化。2ABOPSHPLC："LLO指紋分析"使用此方法來(lái)分析UPP連接的OPS的結(jié)構(gòu)。為了提取UPP-連接的聚糖，使用0.9%NaCl洗滌大腸桿菌細(xì)胞并凍干。使用有機(jī)溶劑(甲醇：水(M：W=17：3至19：1，v/v)和/或最佳比率的氯仿：甲醇：水混合物(例如C：M：W=10：10：3；v/v/v))提取干燥細(xì)胞。在N2流下干燥提取物，且以C：M：W=3：48：47再懸浮。為了純化所提取的糖脂，使3：48：47再懸浮液通過(guò)tC18Sep-PAK筒。用10ml甲醇調(diào)節(jié)筒，隨后用10ml3：48：47(C：M：W)平衡。在樣品上樣之后，用10ml3：48：47(C：M：W)洗滌筒并用5ml甲醇和5ml10：10：3(C：M：W)洗脫。在N2下干燥合并的洗脫液。通過(guò)以下水解糖脂樣品：將干燥樣品溶解于2ml正丙醇：2M三氟乙酸(1：1)中，加熱至50℃保持15min，且然后在N2下蒸發(fā)至干燥(Glover等人，ProcNatlAcadSciUSA102(40):14255-9)。將干燥樣品再一次再懸浮于3：48：47中且通過(guò)tC18筒，且在N2下干燥流通物。使用如所述的紙盤(pán)方法進(jìn)行2-AB標(biāo)記和聚糖凈化(Bigge,等人,AnalBiochem230(2):229-38;Merry,等人,AnalBiochem304(1):91-9)。通過(guò)HPLC使用GlycoSep-N正相柱根據(jù)Royle等人(但改進(jìn)為三溶劑系統(tǒng))來(lái)分離2-AB標(biāo)記的聚糖(Royle等人，AnalBiochem304(1):70-90)。溶劑A是80%乙腈中的10mM甲酸銨(pH4.4)。溶劑B是40%乙腈中的30mM甲酸銨(pH4.4)。溶劑C是0.5%甲酸。柱溫為30℃且通過(guò)熒光(激發(fā)λex=330nm，發(fā)射λem=420nm)檢測(cè)2-AB標(biāo)記的聚糖。梯度條件是如下線性梯度：在0.4ml/min的速率下經(jīng)160min100%A至100%B，隨后為2min100%B至100%C且將速率增加至1ml/min。用100%C洗滌柱5min，經(jīng)2min返回至100%A且在100%A以1ml/min的速率運(yùn)行15min，然后使速率返回至0.4ml/min保持5min。在水中注入樣品。去乙?；瘻y(cè)定：在30℃下干燥一當(dāng)量的2-AB標(biāo)記的聚糖，使用(樣品)或不使用(模擬物)200mMNaOH(pH≈14)再懸浮于50μl水中，且在37℃下溫育25小時(shí)。然后使溶液達(dá)到室溫且通過(guò)添加200mMHCl溶液(pH≈1)而中和。在30℃下于速度真空中干燥之后，用2AB再標(biāo)記樣品且通過(guò)HPLC分析。肼解HPLC使用上述相同正相HPLC技術(shù)來(lái)分離在肼解之后從生物綴合物釋放的OPS。在肼解之前，在N2流下完全干燥對(duì)應(yīng)于1mg蛋白的生物綴合物。使用LudgerLiberate肼解聚糖釋放試劑盒(Ludger#LL-HYDRAZ-A2)根據(jù)制造商的說(shuō)明進(jìn)行多糖釋放。簡(jiǎn)而言之，在N2覆蓋層下將450μ1肼添加至干燥樣品且在85℃下溫育16小時(shí)。通過(guò)在N2和45℃下蒸發(fā)來(lái)去除肼。通過(guò)在冰上于471μl4.5%乙酸酐/1M碳酸氫鈉中溫育兩小時(shí)來(lái)進(jìn)行多糖的再-N-乙酰化。其后，添加600μl5%TFA溶液且將樣品在冰上再水解一小時(shí)。在EB20柱上使用相應(yīng)緩沖液EB20A和B進(jìn)行純化。用2-AB標(biāo)記釋放和純化的多糖且通過(guò)NP-HPLC分析，如對(duì)于LLO樣品所述。收集目標(biāo)峰且通過(guò)MS/MS鑒定。HPLC峰的MS和MS/MS為了分析目標(biāo)OPS分子上的單糖序列，進(jìn)行質(zhì)譜分析。將對(duì)應(yīng)于特定HPLC峰的干燥、收集的級(jí)分再懸浮于5ul10%乙腈(ACN)、0.1%三氟乙酸(TFA)中且以1：1與基質(zhì)溶液(50%ACN、0.1%TFA中的40mg/mlDHB)混合于目標(biāo)板上。以正離子模式在Ultraflex-IIMALDI-ToF/ToF質(zhì)譜儀(BrukerDaltonikGmbH,Bremen,Germany)上人工獲取MS和MS/MS數(shù)據(jù)。使用LIFT方法獲得MS/MS。使用標(biāo)準(zhǔn)肽混合物(BrukerDaltonikGmbH)用于外部校準(zhǔn)。使用Flex分析軟件(BrukerDaltonikGmbH)輸出光譜并人工分析。宿主細(xì)胞通過(guò)重組大腸桿菌細(xì)胞表達(dá)，經(jīng)由質(zhì)粒、載體蛋白和來(lái)自空腸彎曲桿菌(PglB)的寡糖基轉(zhuǎn)移酶和來(lái)自粘?；蛉旧w插入突變體的OPS來(lái)產(chǎn)生生物綴合物。使用基因脫毒的EPA(來(lái)自綠膿假單胞菌的含有突變L552V、△E553的外毒素A)作為載體蛋白，且進(jìn)行修飾以包含2或4個(gè)糖基化位點(diǎn)(在本文中分別稱(chēng)為2S-EPA和4S-EPA)和C末端HIS標(biāo)簽，且從源自pBR322的阿拉伯糖誘導(dǎo)型質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)(參見(jiàn)Ihssen等人(2010)Microbialcellfactories9,61)。從pGVXN579表達(dá)MBP(麥芽糖結(jié)合蛋白)，一種天然周質(zhì)、可溶性大腸桿菌蛋白。pGVXN579是修飾的pMAL-p2X(NewEnglandBiolabs)質(zhì)粒，其編碼三個(gè)連續(xù)的細(xì)菌N糖基化共有序列，隨后為C末端融合至質(zhì)粒上編碼的麥芽糖結(jié)合蛋白ORF的Myc-Tag。此設(shè)置允許親和純化MBP生物綴合物，而不依賴(lài)于HIS標(biāo)簽。表達(dá)誘導(dǎo)通過(guò)tac啟動(dòng)子控制且可使用IPTG誘導(dǎo)。從質(zhì)粒pEXT21(來(lái)自pMAF10的EcoRI/BamHI片段)表達(dá)PglB蛋白(Feldman等人，2005,PNASUSA102(8):3016-3021)且克隆至具有C末端融合的HA標(biāo)簽的pEXT21中。表達(dá)質(zhì)粒的變化型式包括密碼子優(yōu)化(pGVXN939)、缺失糖基化位點(diǎn)的密碼子優(yōu)化(pGVXN948)和去除HA-T標(biāo)簽(pGVXN970)以及密碼子優(yōu)化和缺失HA標(biāo)簽(pGVXN971)。使用凝集、Western印跡、銀染色、LLO指紋分析、PCR血清分型或允許鑒定OPS結(jié)構(gòu)特征的類(lèi)似技術(shù)分析臨床分離物合成特定OPS的能力，且還分析其抗生素抗性表型。進(jìn)一步使某些臨床分離物染色體缺失連接酶WaaL以增強(qiáng)用于蛋白糖基化或OPS分析的OPS可用性。為了進(jìn)一步分析臨床分離物，通過(guò)從臨床分離物克隆的rfb簇代替實(shí)驗(yàn)室菌株W3110的rfb簇，且分析OPS生物合成。使waaL基因缺失以增強(qiáng)生物綴合物產(chǎn)生的效率。通過(guò)同源重組使用優(yōu)化方法(參見(jiàn)國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朠CT/EP2013/068737)或公開(kāi)程序(Datsenko和Wanner,(2000)ProcNatlAcadSciUSA97,6640-6645)實(shí)現(xiàn)簇交換和waaL缺失。對(duì)于OPS簇交換，將臨床分離物的目標(biāo)rfb簇與抗生素抗性盒一起克隆至反選擇質(zhì)粒pDOC-C中，用于隨后整合至大腸桿菌菌株W3110的rfb基因座中(Kuhlman和Cox,Nucleicacidsresearch38,e92;Lee等人,2009,BMCMicrobiol9,252)。通過(guò)使用側(cè)接W3110的長(zhǎng)度為0.5至1.5千堿基的rfb簇編碼序列的DNA并使來(lái)自質(zhì)粒攜帶的rfb的插入DNA體內(nèi)線性化來(lái)同源重組目標(biāo)大rfb簇。所得菌株含有替換的rfb簇(有和沒(méi)有抗生素抗性盒)，即用從臨床大腸桿菌分離物分離的類(lèi)似段替換W3110的rfb簇成為gale和gnd基因之間的DNA分子。在某些實(shí)驗(yàn)中，使用含有編碼給定大腸桿菌血清型的rfb簇的粘粒的W3110菌株作為宿主菌株。為了產(chǎn)生基于W3110的菌株中重組表達(dá)的生物綴合物，缺失干擾重組OPS產(chǎn)生的W3110攜帶的基因。例如，為了產(chǎn)生O25B生物綴合物的宿主細(xì)胞，缺失W3110的gtrABS簇。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，根據(jù)公開(kāi)方法(BloorAE,CranenburghRM.ApplEnvironMicrobiol.2006Apr;72(4):2520-5.)使用側(cè)接gtrA基因上游和gtrS基因的下游的同源性序列進(jìn)行同源重組。為了組裝產(chǎn)生菌株，用pglB和載體表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)轉(zhuǎn)化來(lái)轉(zhuǎn)化宿主菌株。參見(jiàn)Wacker等人，2002,Science298:1790-1793。生物綴合物產(chǎn)生通過(guò)使宿主細(xì)胞生長(zhǎng)且純化在周質(zhì)間隙中產(chǎn)生的生物綴合物來(lái)進(jìn)行生物綴合物產(chǎn)生。在振蕩燒瓶中或在工業(yè)規(guī)模進(jìn)料分批發(fā)酵方法中進(jìn)行生長(zhǎng)。在37℃下使用由terrific培養(yǎng)液中的適當(dāng)抗生素構(gòu)成的培養(yǎng)基(有時(shí)補(bǔ)充有5mMMgCl2)進(jìn)行振蕩燒瓶培養(yǎng)。以0.05的OD用來(lái)自新鮮轉(zhuǎn)化的產(chǎn)生細(xì)胞的過(guò)夜培養(yǎng)物接種培養(yǎng)基，生長(zhǎng)，直至對(duì)數(shù)中期，用0.2%阿拉伯糖和1mMIPTG誘導(dǎo)，進(jìn)一步生長(zhǎng)且在生長(zhǎng)20h之后收獲。進(jìn)料分批發(fā)酵使用產(chǎn)生細(xì)胞系庫(kù)的等分試樣接種含有具有適當(dāng)抗生素的大豆LB培養(yǎng)基的振蕩燒瓶。將振蕩燒瓶在180rpm和37℃下溫育大約12小時(shí)。將不含補(bǔ)體的批料培養(yǎng)基在生物反應(yīng)器內(nèi)側(cè)直接滅菌(33min，在≥121℃下)，冷卻，且添加補(bǔ)體。將4MKOH或25%磷酸添加至發(fā)酵器中，用于pH調(diào)整且將pH調(diào)節(jié)至pH7。接種生物反應(yīng)器和來(lái)自預(yù)培養(yǎng)的分批培養(yǎng)物以得到0.005的初始OD600。通過(guò)添加4MKOH或25%磷酸來(lái)穩(wěn)定維持pH。維持溶解氧張力(DO)。將頂壓力維持于600毫巴。用L-阿拉伯糖(0.1%)和/或IPTG(1mM)誘導(dǎo)產(chǎn)物形成。在誘導(dǎo)之后，立即通過(guò)添加含有2.5%阿拉伯糖和IPTG的進(jìn)料培養(yǎng)基來(lái)開(kāi)始進(jìn)料。在誘導(dǎo)之后24±2小時(shí)，將生物反應(yīng)器冷卻至25℃，停止進(jìn)料且通過(guò)切向流過(guò)濾或離心進(jìn)行收獲。在0.5%TritonX-100中通過(guò)破裂在4個(gè)循環(huán)的高壓均質(zhì)化期間于800巴下裂解生物質(zhì)。通過(guò)柱色譜純化生物綴合物。使用各種色譜技術(shù)來(lái)制備生物綴合物，所述技術(shù)主要為IMAC、基于Q樹(shù)脂的陰離子交換色譜(AEC)和大小排阻色譜(SEC)。關(guān)于此類(lèi)方法的描述，例如參見(jiàn)Saraswat等人，2013,Biomed.Res.Int.ID#312709(p.1-18)和WO2009/104074。產(chǎn)生生物綴合物用于臨床前實(shí)驗(yàn)從預(yù)培養(yǎng)物，在35±0.2℃下，將定義量轉(zhuǎn)移至含有豐富培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中。維持pH和溶解氧張力。攪動(dòng)速率達(dá)到700rpm。在細(xì)胞密度達(dá)到OD600=40±5時(shí)，用L-阿拉伯糖(0.1%)和IPTG(1mM)誘導(dǎo)產(chǎn)物形成。在誘導(dǎo)之后24±2小時(shí)開(kāi)始進(jìn)料且冷卻生物反應(yīng)器。溫度一達(dá)到25℃就停止進(jìn)料，且收集細(xì)胞。高壓均質(zhì)化將對(duì)應(yīng)于收獲時(shí)50L的生物質(zhì)在2至8℃下解凍1天。然后向容器中添加2.5L裂解和澄清緩沖液。添加TritonX-100至0.5%的最終濃度且通過(guò)4個(gè)循環(huán)的高壓均質(zhì)化在800巴下破裂完全解凍的細(xì)胞。收獲細(xì)胞且使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)洗滌。單糖組成分析：將含有大約8ug多糖的生物綴合物在99℃下于104μl3MTFA中水解6小時(shí)。通過(guò)蒸發(fā)去除TFA且使用500μl2-丙醇將樣品洗滌一次。將所得單糖懸浮于100μl含有87.1mg/ml1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、50%MeOH和150mMNaOH的標(biāo)記混合物中。在70℃下于60分鐘期間進(jìn)行標(biāo)記。通過(guò)添加50μl300mMHCl和20μl100mMTris/HCl(pH7.0)來(lái)中和樣品。通過(guò)用1ml二丁基醚萃取一次且使用1mlCHCl3萃取三次來(lái)純化PMP標(biāo)記的單糖。通過(guò)RP-HPLC(Merck-Hitachi)在配備有預(yù)置柱的C18InertsilODS-3柱(GLSciences)上來(lái)分離PMP衍生化的單糖。在35℃和1ml/min的速率下應(yīng)用以下兩步驟梯度：100%緩沖液A(13%乙腈、87%H2O(0.045%KH2PO4、0.05%三乙胺，pH7.0)經(jīng)4分鐘至50%緩沖液A/50%緩沖液B(21%乙腈、79%H2O(0.045%KH2PO4、0.05%三乙胺，pH7.0)經(jīng)47分鐘至100%緩沖液B。注射體積為50μl且通過(guò)在250nm下的在線UV檢測(cè)來(lái)監(jiān)測(cè)洗脫。通過(guò)與市售單糖標(biāo)準(zhǔn)品D-葡萄糖(Sigma-Aldrich#G7528)、L-鼠李糖(Sigma-Aldrich#R3875)、N-乙?；?D-葡萄糖胺(Sigma-Aldrich#A8625)和N-乙?；?L-巖藻糖胺(OmicronBiochemicals#FUC-006)的色譜圖的疊加來(lái)鑒定單獨(dú)的峰。實(shí)施例1：流行病學(xué)為了測(cè)定引起泌尿道感染(UTI)的大腸桿菌的血清型分布，進(jìn)行了流行病學(xué)研究。從瑞士的個(gè)體收集來(lái)自人尿樣品的超過(guò)1800份大腸桿菌分離物且使用經(jīng)典凝集技術(shù)分析來(lái)自各樣品的O抗原血清型(OPS)。參見(jiàn)圖4。分析分離的人尿樣品以測(cè)定其中的病原體的身份和其抗生素抗性模式。在分析后從樣品獲得大腸桿菌分離物。通過(guò)涉及在鉻(CPS3)和MacConkey瓊脂上生長(zhǎng)的經(jīng)典微生物排除和納入策略來(lái)鑒定大腸桿菌分離物。使用凝集測(cè)定進(jìn)一步分析大腸桿菌分離物以測(cè)定其O抗原血清型。參見(jiàn)DebRoy等人(2011)Animalhealthresearchreviews/ConferenceofResearchWorkersinAnimalDiseases12,169-185。進(jìn)一步分析來(lái)自相同O抗原血清組的分離物以測(cè)定來(lái)自各分離物的O鏈的化學(xué)結(jié)構(gòu)。參見(jiàn)表1A。某些分離的大腸桿菌菌株被測(cè)定為抗生素抗性的，包括鑒定氟喹諾酮抗性菌株和產(chǎn)生廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)的菌株。表1A：來(lái)自在2012年于瑞士收集的1841份尿樣品的集合的最常見(jiàn)UTI-相關(guān)大腸桿菌血清型的分布。顯示了來(lái)自671名個(gè)體的相關(guān)亞群體的樣品的血清型分布和來(lái)自所有**樣品的分布。不依賴(lài)于位置、分離時(shí)間、癥狀和目標(biāo)群體，而從個(gè)體分離出了血清型O1、O2、O4、O6、O7、O8、O16、O18、O25、O73和O75，表明這些是尿路病原性大腸桿菌(UPEC)的主要血清型。因此，最普遍的O抗原血清型的鑒定表明，O抗原特異性疫苗可限于血清型子集，即與疾病最相關(guān)的那些，如在本實(shí)施例中描述的研究中所鑒定。在美國(guó)過(guò)去三十年從大腸桿菌參考中心(ECRC)獲得的1323份分離物中UTI血清型的回顧性分析允許與文獻(xiàn)和來(lái)自瑞士的當(dāng)前數(shù)據(jù)進(jìn)行充分比較。不依賴(lài)于位置、分離時(shí)間、癥狀或目標(biāo)群體而發(fā)現(xiàn)了最主要20種血清型的患病率且表明其為與UPEC相關(guān)的主要血清型(參見(jiàn)表1B)。表1B：來(lái)自所選文獻(xiàn)(范圍為1987-2011)和來(lái)自2000-2011的回顧性分析美國(guó)數(shù)據(jù)(ECRC)的最常見(jiàn)UTI相關(guān)血清型的患病率。適應(yīng)癥總UTI膀胱炎腎盂腎炎US2000-2010來(lái)自1860份分離物的可用數(shù)據(jù)來(lái)自1089份分離物的可用數(shù)據(jù)來(lái)自373份分離物的可用數(shù)據(jù)315(除糞便外的所有UTI樣本，所有年齡，F(xiàn)+M)，不可分型的數(shù)目均不可用！血清型O14.8%4.1%5.4%7.0%O27.1%4.9%15.3%14.0%O47.8%6.0%3.2%3.2%O616.9%16.3%7.8%18.7%O73.3%2.4%2.4%1.9%O81.7%3.2%0.8%3.5%O150.6%1.5%0.8%1.3%O164.3%3.2%7.2%1.9%O187.0%7.1%6.7%7.0%O21nanana1.3%O220.6%0.6%0.5%0.0%O253.0%4.8%0.5%8.6%O757.5%6.0%8.6%3.8%O831.9%0.7%0.5%1.3%O201.6%O772.2%O821.9%其它和不可分型/不可用33.3%39.2%40.2%其它O-型(NT不可用)21.0%將來(lái)自所述血清型的分離物計(jì)算為基于分離物的總數(shù)的百分比(Andreu等人,1997,JInfectDis176:464-469;Blanco等人,1996,EurJEpidemiol12:191-198;Fathollahi等人,2009,IranianJournalofClinicalInfectiousDiseases4:77-81;Johnson等人,2005,JClinMicrobiol43:6064-6072;Molina-Lopez等人,2011,Journalofinfectionindevelopingcountries5:840-849;Sandberg等人,1988,JClinMicrobiol26:1471-1476;K.L.2007,TheJournalofinfection55:8-18;Terai等人,1997,IntJUrol4:289-294.)在某些情況下，特定數(shù)據(jù)不可用；因此，百分比數(shù)值僅可基于來(lái)自所述研究中的不同UTI分離物的整體血清型分布給出適應(yīng)癥且應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎考慮。還包括其它經(jīng)鑒定但較不普遍的所述血清型(O15、O20、O21、O22、O77和O82)。綜合來(lái)自流行病學(xué)分析的所有信息，假設(shè)涵蓋不可分型菌株的子部分，10種主要血清型可涵蓋估計(jì)60-80%的大腸桿菌感染。另外，當(dāng)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)和來(lái)自美國(guó)的新近數(shù)據(jù)比較時(shí)，數(shù)據(jù)顯示O25血清型在來(lái)自瑞士的流行病學(xué)研究中有著出人意料的重要性。參見(jiàn)表1A和B。大腸桿菌的O抗原血清型通常由不同但在結(jié)構(gòu)和抗原性上類(lèi)似的亞型構(gòu)成。為了鑒定收集的臨床分離物中的未知/未報(bào)道的亞型且為了鑒定最普遍的O抗原亞型，更詳細(xì)分析了來(lái)自最普遍血清型的O抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)。實(shí)施例2：大腸桿菌O25近年來(lái)，已觀察到O25陽(yáng)性菌株的發(fā)生增加(參見(jiàn)George和Manges(2010)EpidemiolInfect138,1679-1690)且通過(guò)實(shí)施例1中描述的研究證明，其中發(fā)現(xiàn)O25血清型在患病率方面的最主要4種大腸桿菌血清型之一。O25A先前已公開(kāi)大腸桿菌O25血清型的O抗原重復(fù)單元結(jié)構(gòu)(參見(jiàn)Kenne等人，Kenneetal.,1983,CarbohydrateResearch122,249-256;和Fundin等人,2003,MagneticResonanceinChemistry41,4)且呈現(xiàn)于圖2B中。與來(lái)自大腸桿菌菌株E47a的O25O抗原相關(guān)的rfb簇可公開(kāi)獲得(GenbankGU014554)且呈現(xiàn)于圖2A中。使用大腸桿菌E47a作為用于O25血清分型的參考菌株。其它rfb簇序列信息可從引起無(wú)癥狀菌尿癥的菌株大腸桿菌83972的基因組序列獲得。(參見(jiàn)Zdziarski等人，PLoSPathog6,e1001078)。盡管未證實(shí)表型O25表達(dá)，但大腸桿菌E47a和83972的rfb簇序列是99.49%相同的，強(qiáng)烈表明其編碼相同O抗原。來(lái)自大腸桿菌菌株83972和E47a的O抗原在本文中指定為"O25A"，因?yàn)槿缦滤?，新穎大腸桿菌O抗原(指定為"O25B")基于在上文實(shí)施例1中描述的流行病學(xué)研究中獲得的臨床分離物的分析來(lái)鑒定。已提出大腸桿菌菌株83972和E47a的預(yù)測(cè)基因產(chǎn)物的功能性。參見(jiàn)表2；GenBankGU014554；和Szijarto,等人(2012)FEMSMicrobiolLett332,131-136。表2.來(lái)自rfb簇的O25AO抗原基因預(yù)測(cè)，如Wang,等人(2010)JClinMicrobiol48,2066-2074所公開(kāi)；還參見(jiàn)GenBankGU014554。結(jié)構(gòu)和基因簇的比較表明，O25AOPS的組裝所需的所有功能都于galE和gnd之間的rfb簇內(nèi)編碼。rfb基因簇(參見(jiàn)圖2A)的各種酶的功能如下：RmlBDAC編碼dTDP-L-鼠李糖的生物合成所需的酶，所述dTDP-L-鼠李糖是將L-Rha支鏈添加至OPS重復(fù)單元的底物。FnlABC編碼UDP-L-FucNAc的生物合成所需的酶，所述UDP-L-FucNAc是將L-FucNAc添加至O25OPS重復(fù)的供體底物。WekABC和wbuBC是根據(jù)同源性分析的糖基轉(zhuǎn)移酶。然而，wbuC表現(xiàn)為短的并且截短的而不太可能具有功能。因此，最可能的功能注釋表明，存在四種糖基轉(zhuǎn)移酶，其生成用于組裝重復(fù)單元的四種連接。需要Wzx和Wzy以使BRU翻轉(zhuǎn)至周質(zhì)間隙中且使其在Und-PP上聚合。合成公開(kāi)的O25A重復(fù)單元結(jié)構(gòu)所需的所有功能都由大腸桿菌E47a和83972rfb簇編碼。因此得出結(jié)論，rfb簇負(fù)責(zé)編碼O25AOPS。O25B在2009年，表征來(lái)自西班牙醫(yī)院環(huán)境的臨床大腸桿菌分離物以測(cè)定克隆組。參見(jiàn)Blanco等人(2009)JAntimicrobChemother63,1135-1141。進(jìn)行以下的表征：a)ESBL類(lèi)型，b)O血清型，c)毒力基因，d)多基因座序列分型(MLST)，和e)脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型(PFGE)。結(jié)果表明，所有分離物中的約20%可歸于相同克?。貉逍秃蚆LSTO25：H4ST131，ESBL類(lèi)型CTX-M15，PhylogroupB2，其編碼特定組的毒力基因。當(dāng)與來(lái)自E47a菌株和也來(lái)自由等位基因特異性PCR分型方法鑒定的臨床分離物的分型菌株序列相比時(shí)，代表性臨床分離物的rfb簇組分的分析顯示未知的3’序列(參見(jiàn)Clermont等人,2008,JAntimicrobChemother.61(5):1024-8.;Clermont等人,Diagn.MicrobiolInfectDis.2007,57(2):129-36.;andLi,等人,2010,JMicrobiolMethods82,71-77)。在2013年，Phan等人公開(kāi)了克隆O25b：H4ST131的基因組序列，證實(shí)該克隆是與如先前所報(bào)道的其waa基因簇的結(jié)構(gòu)一致的K-12衍生物。參見(jiàn)Phan等人，2013,PLOSGenetics9(10):1-18(e1003834)?？偠灾瑪?shù)據(jù)表明，新穎O25凝集克隆已出現(xiàn)于從醫(yī)院環(huán)境分離的大腸桿菌中，且該克隆具有特異性ESBL、MLST和PFGE表型且含有改變的O抗原基因簇。PCR分型為了確定O25B血清型是否存在于實(shí)施例1中描述的流行病學(xué)研究中鑒定的分離的大腸桿菌菌株中，通過(guò)針對(duì)O25和O25B的分型PCR來(lái)分析O25凝集陽(yáng)性菌株。使用挑選自petri培養(yǎng)皿的克隆作為模板DNA來(lái)源和不同寡核苷酸引物來(lái)進(jìn)行PCR。使用基于E47aO25wzy的擴(kuò)增且描述于Li等人(2010)JMicrobiolMethods82,71-77中的O25特異性引物。還使用描述于Blanco等人(2009)JAntimicrobChemother63,1135-1141中的O25B特異性引物，其對(duì)于O25brfb簇(LNB220)的未定義3’部分是特異性的。根據(jù)Phan等人，2013，此O25B特異性寡核苷酸對(duì)在O25Brfb簇的3’部分中退火。在24份具有O25凝集陽(yáng)性表型的測(cè)試的臨床分離物中，通過(guò)PCR分型將20份指定為O25B血清型，而剩余4份通過(guò)PCR分型陽(yáng)性鑒定為屬于O25A血清型。因此，令人驚訝的是，在所分析的菌株中，O25B血清型菌株被確定為比O25A血清型的菌株更常見(jiàn)。簇測(cè)序?yàn)榱嘶蚍治鯫25Brfb簇，對(duì)O25BPCR陽(yáng)性菌株(指定為"upec138")的簇進(jìn)行測(cè)序。鑒定的基因和其最密切相關(guān)的蛋白同系物連同提出的命名列于下表3中。用星號(hào)指示特異于O25B且不存在于O25A中的基因。表3.來(lái)自rfb簇的O25BO抗原基因預(yù)測(cè)。基因名稱(chēng)假設(shè)功能最有意義的同源性/蛋白[生物體]，登錄號(hào)，最大同一性(BLAST)rmlBdTDP-葡萄糖4,6-脫水酶rffG基因產(chǎn)物[大腸桿菌NA114],YP_006139244,99%rmlDdTDP-6-脫氧-D-葡萄糖3,5-差向異構(gòu)酶dTDP-4-脫氫鼠李糖還原酶[大腸桿菌NA114],YP_006139243,100%rmlA葡萄糖-1-磷酸胸苷基轉(zhuǎn)移酶rffH2基因產(chǎn)物[大腸桿菌NA114],YP_006139242,100%rmlCdTDP-4-脫氫鼠李糖3,5-差向異構(gòu)酶dTDP-4-脫氫鼠李糖3,5-差向異構(gòu)酶[大腸桿菌NA114],YP_006139241,99%WzxWzx,O抗原翻轉(zhuǎn)酶Wzx[大腸桿菌菌株E47a],ADI43260,99%wekA糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPPα-1,3-鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶[大腸桿菌83972],ZP_04004894,93%wekB葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPPβ-1,6-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶[大腸桿菌83972],YP_006106413,93%WzyO抗原聚合酶膜蛋白[大腸桿菌83972],YP_006106412,94%wbbJ*O-乙酰基轉(zhuǎn)移酶O-乙?；D(zhuǎn)移酶[大腸桿菌83972],YP_006106411,95%wbbK*糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPPα-1,3-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶[大腸桿菌K-12],AAB88407,60%wbbL*葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)脂多糖生物合成蛋白，C-末端片段，截短蛋白[大腸桿菌DH1],YP_006129367,62%;dTDP-Rha:GlcNAc-UPPα-1,3-鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶簇組合物rfb顯示與O25A簇的組合物的顯著差異。該簇的5’部分中的基因是彼此的密切同系物(rmlD至wzy；大腸桿菌E47a和83972)。這對(duì)于rml基因是不令人驚訝的，所述rml基因在許多合成L-鼠李糖的大腸桿菌菌株中是同源的。在降至低于25%同一性的水平之前，O25A和B的基因產(chǎn)物的同源性到達(dá)wekC(O25A)基因中，表明蛋白序列的無(wú)關(guān)性。參見(jiàn)圖3B。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，O25A的UDP-N-乙?；鶐r藻糖胺生物合成基因不存在于菌株upec138(O25B)中，如同fnlABC下游的兩種糖基轉(zhuǎn)移酶。參見(jiàn)圖3B。總而言之，此數(shù)據(jù)表明，O25B菌株不能合成UDP-L-FucNAc，除了L-FucNAc生物合成基因可于rfb簇外側(cè)編碼。然而，當(dāng)L-FucNAc存在于O抗原的BRU中時(shí)，關(guān)于rfb簇外側(cè)的fnlABC基因座沒(méi)有一例報(bào)道。因此，菌株138能夠合成公開(kāi)的O25A基本重復(fù)單元(BRU)是不可能的。在O25Brfb簇中鑒定的不存在于血清型O25A的rfb簇中的基因編碼兩種糖基轉(zhuǎn)移酶和O-乙酰基轉(zhuǎn)移酶。該三種基因共享相同的組織且編碼的蛋白與發(fā)現(xiàn)且表征于O16rfb簇基因型的大腸桿菌的K-12菌株中的wbbJKL基因具有高度同源性。參見(jiàn)圖3B。根據(jù)O25B和O16血清型之間的基因相關(guān)性，O16rfb基因wbbJKL的命名適用于O25Brfb簇中鑒定的同源基因。已知O16BRU的結(jié)構(gòu)且已測(cè)定wbbJKL的基因功能。參見(jiàn)Steveneson等人(1994)JBacteriol.176(13):4144-56。WbbJKL負(fù)責(zé)L-鼠李糖的乙?；?，將D-Glc殘基轉(zhuǎn)移至L-Rha-D-Glc-UndPP，且將L-Rha轉(zhuǎn)移至D-GlcNAc-UPP(其通過(guò)來(lái)自ECA簇的wecA形成)中?；谂cO16WbbJKL的同源性和O16WbbJKL的已知功能，據(jù)推斷，O25Brfb簇合成一起含有部分O16和部分O25A元件的結(jié)構(gòu)。其原因在于非?？赡苁?，WbbJKLO25B與WbbJKLO16合成相同結(jié)構(gòu)，即α-D-Glc-1,3-α-L-Rha(2Ac)-1,3-α-D-GlcNAc。此三糖結(jié)構(gòu)與O25A的無(wú)支鏈"核心"骨架相同，唯一區(qū)別在于L-Rha(2Ac)代替L-FucNAc。該代替因此是保守代替，因?yàn)镈-FucNAc和L-RhaOAc均為具有6-脫氧基和2-乙?；δ艿膯翁?。唯一差異在于構(gòu)型，因?yàn)閹r藻糖與半乳糖相關(guān)，且鼠李糖與甘露糖相關(guān)，導(dǎo)致在3位的OH基團(tuán)和5位的甲基處的不同定向。單糖之間的連接是相同的(都是α-1,3)，表明該結(jié)構(gòu)在形狀和化學(xué)特征方面是類(lèi)似的。類(lèi)似地，編碼于O25A和Brfb簇的上游部分中的蛋白(rmlDCAB和wekAB)通過(guò)將支鏈D-Glc和L-Rha附接至任一"核心"骨架三糖上而使O25A或B的BRU支鏈化。這意味著其接受任一骨架(具有L-FucNAc或L-Rha(2Ac))作為底物。L-Rha作為來(lái)自O(shè)25BBRU的還原端的第二單糖的存在解釋了L-FucNAc生物合成為何可以不存在于O25B中。UDP-L-FucNAc是不需要的，因?yàn)槠浔淮嬖谟诖?rmlDBAC)的5’端中的dTDP-L-Rha生物合成基因代替。Phan等人，在2013年對(duì)O25B臨床分離物進(jìn)行了類(lèi)似的基因分析，但結(jié)論不同。他們也對(duì)整個(gè)基因組進(jìn)行測(cè)序以搜索UDP-FucNAc生物合成基因簇；然而，他們記載，用于菌株O25B:H4ST131EC958中的UDP-L-FucNAc的機(jī)構(gòu)不僅在O25Brfb簇中缺失，而且在整個(gè)菌株中缺失。然而，Phan得出結(jié)論，假設(shè)O25B:H4ST131EC958與E47a制備相同的O抗原結(jié)構(gòu)(即O25A)，則UDP-L-FucNAc必須以不同方式合成。相反，本文公開(kāi)了，最可能情形為，O25B菌株不能制備L-FucNAc，但反而用O-乙酰化L-鼠李糖殘基代替BRU的第二殘基，且此變化所需的基因排他性地編碼于rfb簇中。此外，在O25B簇中存在O-乙酰基轉(zhuǎn)移酶同系物表明在O25BBRU中的O-乙?；?，O25A中不存在的修飾。因此，確定來(lái)自血清型O25A和O25B的O25抗原的結(jié)構(gòu)必須是不同的。O25B結(jié)構(gòu)分析為了證實(shí)不同O25抗原結(jié)構(gòu)的假設(shè)，分析實(shí)施例1中描述的O25臨床分離物的O抗原的化學(xué)組成和排列。為了更詳細(xì)地表征O25OPS結(jié)構(gòu)，使用幾種方法。首先，通過(guò)SDSPAGE分析O抗原結(jié)構(gòu)。使用不同染色方法在SDSPAGE之后分析來(lái)自臨床分離物的脂多糖(LPS)的電泳遷移率的差異。為了顯現(xiàn)LPS量，進(jìn)行銀染色和抗O25特異性的Western印跡。參見(jiàn)圖5，其描繪10種分離物的分析結(jié)果。數(shù)據(jù)顯示，通過(guò)不同LPS制備物的銀染色獲得類(lèi)似信號(hào)強(qiáng)度。相反，用特異性抗血清的探測(cè)在10種樣品中的3種(分離物upec436、upec767、upec827)中顯示更強(qiáng)的信號(hào)強(qiáng)度。據(jù)推測(cè)，由于OPS結(jié)構(gòu)的差異而產(chǎn)生不同信號(hào)強(qiáng)度。為了詳細(xì)闡明O25B結(jié)構(gòu)，應(yīng)用不同分析方法。臨床分離物upec138通過(guò)PCR是O25B陽(yáng)性的，且O25凝集抗血清對(duì)其的識(shí)別弱于O25A菌株。參見(jiàn)圖5。此外，該菌株是ESBL，但對(duì)于FOS、IPM和TZP是敏感的，且對(duì)于AM、CXM、NOR和CIP是抗性的。另一種臨床分離物，菌株upec436，通過(guò)PCR是O25B陰性的，但通過(guò)PCR是一般O25(O25A)陽(yáng)性的。還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)通過(guò)Western印跡分析其LPS時(shí)，upec436與O25凝集抗血清是強(qiáng)烈反應(yīng)的。參見(jiàn)圖5。提取來(lái)自?xún)煞N菌株的LLO，用2AB標(biāo)記且通過(guò)正相HPLC分析。參見(jiàn)圖6；upec138和upec436的LLO，9.079和9.081)。洗脫模式顯示兩種提取物之間的顯著差異。菌株特異性峰的MS/MS分析檢測(cè)到與預(yù)期BRU結(jié)構(gòu)一致的信號(hào)。菌株upec436中的信號(hào)(9.081)：通過(guò)MS分析62’洗脫時(shí)間處的峰且發(fā)現(xiàn)含有m/z=1021Da的分子作為主要物質(zhì)，即對(duì)應(yīng)于完整O25AOPSBRU的預(yù)期物質(zhì)的分子。MS/MS產(chǎn)生與O25A的單糖序列一致的片段化模式(圖7A；m/z=1021的MS/MS)。菌株upec138中的信號(hào)：50’洗脫時(shí)間處的峰中的主要物質(zhì)是m/z1022Da，即比完整O25A重復(fù)單元多一個(gè)Da。MS/MS分析(圖7B；O25BMS/MS)顯示與O25A重復(fù)單元幾乎相同的片段化行為，且以1Da差異位于來(lái)自還原端的第2單糖(通過(guò)O25AMS/MS中的m/z=551的片段化Y離子鑒定，且通過(guò)菌株upec138中m/z=552的片段化Y離子鑒定)。60’處的額外洗脫峰顯示類(lèi)似的片段化，但母體離子物質(zhì)(m/z=980)中的42Da差異，其位于相同單糖(m/z=510)，即來(lái)自還原端的第二單糖。這些結(jié)果的解釋在下文中給出。OPS提取、水解和2AB標(biāo)記程序涉及酸處理以從OPS去除Und-PP。據(jù)顯示，處理?xiàng)l件部分地去除O-乙?；⒉蝗コ齆-乙?；Ｒ虼?，60’處的峰可能代表源自50’峰的材料的化學(xué)水解的去乙?；疊RU物質(zhì)?？偠灾藬?shù)據(jù)表明，在O25B中與O25A的L-FucNAc中存在N-乙酰化的相同單糖位置處存在O-乙?；?。為了化學(xué)證實(shí)來(lái)自還原端的第二殘基處的乙?；荗-連接的，進(jìn)行去乙?；瘻y(cè)定。從O25BPCR陽(yáng)性菌株收集在50’洗脫時(shí)間處來(lái)自2ABLLOHPLC的O25B特異性峰且用在"方法"下描述的堿進(jìn)行處理。通過(guò)HPLC的再分析導(dǎo)致含有m/z=979的主要物質(zhì)的60’洗脫時(shí)間處的峰，如來(lái)自圖6的O25B峰中所鑒定，其中MS/MS片段化離子模式與已失去O-乙?；腛25BBRU一致。N-乙?；鶎?duì)于堿處理是穩(wěn)定的，如通過(guò)相同分子中還原端D-GlcNAc中的剩余N-乙?；尽？偠灾?，據(jù)確定，O25B代表性菌株upec138在結(jié)構(gòu)上和基因上與來(lái)自大腸桿菌的O25A和O16OPS相關(guān)(圖3A和B)。O25B與O25A的不同在于在重復(fù)單元的第二單糖處具有含有O-乙?；鍺-乙酰基的重復(fù)單元結(jié)構(gòu)，其為L(zhǎng)-Rha殘基而非D-FucNAc。這些變化最可能通過(guò)由編碼兩種糖基轉(zhuǎn)移酶和O-乙酰基轉(zhuǎn)移酶的DNA段代替UDP-FucNAc生物合成機(jī)構(gòu)和D-FucNAc轉(zhuǎn)移酶所引起。基于同源性和功能性分析，這些基因與O16基因簇相關(guān)。最終結(jié)構(gòu)是不同但類(lèi)似的，闡釋了用O25凝集抗血清觀察到的交叉反應(yīng)性。如上所討論，基于其rfb簇的分析推論且提出，O25AOPS含有L-FucNAc，而該結(jié)構(gòu)不存在于O25B中。為了研究FucNAc是否不存在于O25B中，使用上述PMP標(biāo)記方法和HPLC分析方法進(jìn)行O25A和O25B菌株中產(chǎn)生的EPA生物綴合物的單糖組成分析(圖9)。為了產(chǎn)生生物綴合物，制備具有O25A和O25B表型的臨床大腸桿菌分離物，且修飾用于最佳生物綴合物產(chǎn)生。作為修飾的一部分，使來(lái)自菌株upec_436(O25A)和uepc_138(O25B)的waaL基因缺失，如先前所述(參見(jiàn)Datsenko和Wanner,(2000)ProcNatlAcadSciUSA97,6640-6645)和用于核心類(lèi)型測(cè)定的方法所知(參見(jiàn)Amor等人(2000)InfectImmun68,1116-1124)。用用于4S-EPA的表達(dá)質(zhì)粒(pGVXN659)和寡糖基轉(zhuǎn)移酶PglB的表達(dá)質(zhì)粒(pGVXN939)(用于O25A產(chǎn)生)且用pGVXN114和pGVXN539(產(chǎn)生2S-EPA)(用于產(chǎn)生O25B生物綴合物)來(lái)轉(zhuǎn)化所得菌株。在2L振蕩燒瓶中產(chǎn)生O25B生物綴合物，隨后通過(guò)IMAC從周質(zhì)提取物親和純化。通過(guò)進(jìn)料分批發(fā)酵產(chǎn)生O25A綴合物，且通過(guò)兩步驟純化程序從通過(guò)高壓均質(zhì)化(如上文方法部分中所述)生成的澄清的全細(xì)胞均質(zhì)物開(kāi)始進(jìn)行純化。如上文所述進(jìn)行單糖組成分析。結(jié)果證實(shí)不存在源自O(shè)25B的生物綴合物中的FucNAc的信號(hào)，而含有O25A的生物綴合物顯示在預(yù)期洗脫時(shí)間處的峰，如通過(guò)使單糖的混合物進(jìn)行相同樣品處理程序(作為對(duì)照)所測(cè)定。因此證實(shí)，如基于rfb簇的分析所預(yù)期，O25B的假設(shè)結(jié)構(gòu)為L(zhǎng)-FucNAc-less。在EPA載體蛋白部分的部分酶消化之后，通過(guò)生物綴合物的核磁共振測(cè)定來(lái)自大腸桿菌O25BO-抗原的O-抗原多糖(O-PS)的重復(fù)單元(RU)的完整結(jié)構(gòu)。分析證實(shí)，O25BO-PS由五糖RU構(gòu)成。通過(guò)2DNMR關(guān)聯(lián)技術(shù)指定1H和13C信號(hào)，其證實(shí)O25BO-PSRU的結(jié)構(gòu)與公開(kāi)的O25AO-PSRU結(jié)構(gòu)(Kenne,L.,等人1983.Carbohydr.Res.122:249-256;Fundin,J.,等人2003.Magn.Reson.Chem.41:202-205)的不同在于α-3-FucpNAc殘基被α-3-Rhap殘基取代，其中多于90%的此殘基在C2位處是O-乙?；摹Ｏ旅骘@示完整O25BO-PSRU(O25B’)：。生物綴合物的產(chǎn)生和表征為了進(jìn)一步分析O25A和O25B多糖抗原，產(chǎn)生更多生物綴合物材料。對(duì)于O25A，來(lái)自上文的O25A-EPA的純化批料用于其它表征實(shí)驗(yàn)。對(duì)于O25B-EPA產(chǎn)生，用質(zhì)粒pGVXN1076和pGVXN970構(gòu)建具有基因組整合的O25B簇的菌株：W3110ΔwaaLΔgtrABSΔrfbO16::rfb(upec138)。從W3110開(kāi)始通過(guò)Datsenko和Wanner的方法和用于將較大插入物定向整合至細(xì)菌染色體中的同源重組技術(shù)來(lái)構(gòu)建此菌株(參見(jiàn)國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朠CT/EP2013/071328)。使用標(biāo)準(zhǔn)釋放和表征測(cè)定來(lái)表征所得O25B生物綴合物。使用兩個(gè)連續(xù)陰離子交換和大小排阻色譜步驟來(lái)純化生物綴合物，分別得到97.2%和98.1%純O25A和O25B生物綴合物制劑。使用SDSPAGE定量用于純度分析。參見(jiàn)圖10(O25A)和圖11(O25B)?；谔嵌客ㄟ^(guò)蒽酮測(cè)定(參見(jiàn)Laurentin和Edwards,(2003)AnalBiochem315,143-145)和針對(duì)蛋白濃度的BCA測(cè)定來(lái)計(jì)算糖/蛋白比率，得到O25A和O25B生物綴合物的40.2%和26.6%的比率。分析型大小排阻色譜顯示與具有附接聚糖鏈的EPA的預(yù)期流體動(dòng)力學(xué)半徑一致的顆粒的單體狀態(tài)。應(yīng)用為了探究O25B結(jié)構(gòu)的免疫原性潛能，使用O25B和O25A生物綴合物進(jìn)行幾種臨床前實(shí)驗(yàn)。如圖5中所示，實(shí)施例1中鑒定為O25陽(yáng)性的所有臨床分離物(即O25A和O25B分離物兩者)對(duì)Western印跡中常用于檢測(cè)O25血清型(對(duì)來(lái)自O(shè)25A菌株E47a的血清進(jìn)行分型)的O25A抗血清是陽(yáng)性的。因此，抗O25A抗血清似乎與來(lái)自O(shè)25B菌株的LPS是交叉反應(yīng)的。為了詳細(xì)分析抗體反應(yīng)和交叉反應(yīng)性，產(chǎn)生O25生物綴合物。使用麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)作為載體蛋白，且使載體蛋白連接至O25A或O25B。表4描繪用于蛋白產(chǎn)生的菌株。通過(guò)PCR針對(duì)其O25A或B基因型鑒定所用菌株。在TB培養(yǎng)基中進(jìn)行表達(dá)且從周質(zhì)提取物純化蛋白產(chǎn)物。表4：生物綴合物菌株pglB質(zhì)粒載體治療純化程序MBP-O25Aupec436ΔwaaL::kanRpGVXN939pGVXN659Q,AMBP-O25Bupec350ΔwaaL::clmRpGVXN939pGVXN659Q,A,SQ：ResourceQ純化；A：直鏈淀粉樹(shù)脂；S：大小排阻色譜。使用標(biāo)準(zhǔn)兔免疫方案(eurogentech28天快速方案)用獲得的生物綴合物進(jìn)行免疫。在第0、7、8和18天注射50μg結(jié)合至MBP的多糖與專(zhuān)屬弗氏游離免疫刺激性化合物。測(cè)試在第一次免疫之后第28天獲得的所得最終血液抗血清對(duì)于O25A或O25BLPS的特異性。圖22顯示對(duì)各個(gè)LPS(O25A或O25B)的抗血清反應(yīng)性的比較。從upec436和upec138通過(guò)在SDS-PAGEL?mmli緩沖液中蛋白酶K消化全細(xì)胞樣品來(lái)制備LPS。將相同量的LPS上樣至兩個(gè)SDS-PAGE凝膠中，隨后電轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜且使用O25A和O25B抗血清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，O25A抗血清比O25BLPS更好地識(shí)別O25ALPS，而O25B抗血清比O25ALPS更好地識(shí)別O25BLPS。此結(jié)果指示，自體抗原產(chǎn)生更好的抗原。因此，將O25B抗原包括入疫苗中比O25A抗原提供針對(duì)O25組的主要O25B臨床菌株的更好保護(hù)。實(shí)施例3：大腸桿菌O1結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)列出大腸桿菌O1的不同亞血清型結(jié)構(gòu)。具體而言，為O1A、O1A1、O1B、O1C。O1A和O1A1在結(jié)構(gòu)上相同且據(jù)信與疾病相關(guān)，但并沒(méi)有報(bào)道O1B和O1C是病原性的(參見(jiàn)Gupta等人(1992)JBacteriol174,7963-7970)，且其代表O1分離物中的少數(shù)。O1A/O1A1、O1B和O1C的結(jié)構(gòu)顯示于圖12B中。為了分析實(shí)施例1的UPEC流行病學(xué)研究中的O1亞血清型分布，詳細(xì)分析來(lái)自該研究的幾種臨床分離物的O抗原結(jié)構(gòu)。首先，通過(guò)SDSPAGE分析通過(guò)凝集分析確定為O1陽(yáng)性的12種菌株的LPS結(jié)構(gòu)。參見(jiàn)圖13：O1銀染色和Western印跡。銀染色顯示所有含有來(lái)自O(shè)1臨床分離物的提取物的泳道中的典型LPS信號(hào)。在約10-15kDa的電泳遷移率的強(qiáng)染色顯示脂質(zhì)A核心，而更慢遷移率的梯狀信號(hào)代表用由不同數(shù)量的O抗原重復(fù)單元構(gòu)成的碳水化合物聚合物修飾的脂質(zhì)A核心。當(dāng)比較來(lái)自不同分離物的LPS時(shí)，差異出現(xiàn)于模式長(zhǎng)度分布、個(gè)別帶的電泳遷移率和梯狀模式?；谶@些觀察，可鑒定三個(gè)組：(i)大部分分離物(upec002、upec010、upec032、upec140、upec108、upec143、upec276、upec399和upec425)展現(xiàn)單獨(dú)帶的不可區(qū)分的電泳遷移率，不同僅在于信號(hào)強(qiáng)度和平均鏈長(zhǎng)度(模式長(zhǎng)度分布)；(ii)兩種分離物(upec119和upec256)顯示在每一重復(fù)單元LPS帶中具有稍微更快的遷移率，表明不同的結(jié)構(gòu)，例如脂質(zhì)A核心的不同修飾；和(iii)從分離物upec1096獲得的信號(hào)顯示為模糊狀(smear)而非梯狀，表明不同的OPS結(jié)構(gòu)。參見(jiàn)圖13A。通過(guò)Western印跡分析和使用抗O1抗血清檢測(cè)顯示，通過(guò)特異性O(shè)1抗體檢測(cè)到來(lái)自除upec1096外的所有分離物的LPS，表明交叉反應(yīng)性LPS分子。這意味著分離物中的11種是O1，且upec1096最可能不是O1分離物(即，其通過(guò)凝集分析是假陽(yáng)性的)。為了詳細(xì)分析O1抗原的結(jié)構(gòu)類(lèi)似性，如上所述使用LLO的2AB標(biāo)記和高分辨率正相HPLC技術(shù)。圖14A顯示從11種臨床分離物中的5種獲得的色譜圖的重疊圖(overlay)。OPS的指紋分析區(qū)出現(xiàn)于110分鐘至150分鐘的保留時(shí)間。所述概況表明所有樣品都具有出現(xiàn)于相同保留時(shí)間的信號(hào)，表明相同的分子結(jié)構(gòu)。觀察到的差異是強(qiáng)度分布(即平均最大信號(hào)的洗脫時(shí)間)和一般信號(hào)強(qiáng)度。剩余6種提取物導(dǎo)致在相同洗脫時(shí)間具有強(qiáng)度差異的峰。僅樣品upec1096就峰模式而言是不同的，證實(shí)上述結(jié)構(gòu)差異。使用個(gè)別峰的通過(guò)MALDI-TOF/TOF分析的MS/MS分析來(lái)鑒定O1樣品中單糖的序列(參見(jiàn)圖14B)。對(duì)并非從臨床分離物提取、但從含有具有upec032rfb簇的粘粒的W3110△waaL菌株提取的樣品進(jìn)行MS分析。在50、80、96和108分鐘洗脫時(shí)間處洗脫的峰含有m/z=1021.4、1849.6、2693.9、3540.4的主要物質(zhì)。在MS/MS之后獲得的片段化離子系列與HexNAc、三種脫氧己糖和支鏈HexNAc的1、2、3和4個(gè)重復(fù)單元一致。此數(shù)據(jù)僅可由O1A亞血清型結(jié)構(gòu)進(jìn)行解釋。描述的峰系列代表臨床分離物中附接至UPP的O1OPS，且每一連續(xù)峰與前一峰差異在于一個(gè)重復(fù)單元。此數(shù)據(jù)證實(shí)了來(lái)自文獻(xiàn)的陳述，即來(lái)自實(shí)施例1中描述的研究的臨床UTI分離物中大腸桿菌的O1O血清型的代表性結(jié)構(gòu)是亞型O1A。為了產(chǎn)生攜帶O1A多糖的生物綴合物，將W3110大腸桿菌菌株工程改造以表達(dá)O1AOPS。所得菌株為W3110△rfbO16：：rfbO1△waaL，其含有O1陽(yáng)性臨床分離物的rfb簇(GU299791*，范圍為rmlB-wekO的簇)。通過(guò)同源重組構(gòu)建表達(dá)O1AOPS的宿主菌株。使用在側(cè)接rfb簇的DNA中的PCR寡核苷酸退火來(lái)擴(kuò)增O1A臨床分離物的rfb簇。然后通過(guò)國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朠CT/EP2013/071328中描述的同源重組使用擴(kuò)增的DNA來(lái)代替充分表征的實(shí)驗(yàn)室菌株W3110的內(nèi)源性O(shè)抗原簇。通過(guò)轉(zhuǎn)化插入用于載體蛋白的表達(dá)質(zhì)粒pGVXN659和PglB的表達(dá)質(zhì)粒(pGVXN114、939、970、971)且證實(shí)O1表達(dá)(參見(jiàn)圖15和圖16)。在單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中，將臨床O1分離物upec032工程改造以產(chǎn)生生物綴合物。工程改造需要考慮臨床分離物的抗生素敏感表型。構(gòu)建upec032△waaL且用用于生物綴合物產(chǎn)生的pGVXN939和pGVXN579使用MBP作為載體蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)化。使用MBP和EPA作為載體蛋白的優(yōu)點(diǎn)是用兩者產(chǎn)生抗血清、導(dǎo)致產(chǎn)生對(duì)多糖組分而非載體交叉反應(yīng)的抗血清。此類(lèi)抗血清是用于評(píng)估臨床前實(shí)驗(yàn)的有用工具，例如用作開(kāi)發(fā)多糖特異性ELISA測(cè)定的包被劑。實(shí)施例4：大腸桿菌O6大腸桿菌O6血清型是迄今為止的報(bào)道的最常見(jiàn)ExPEC(George,D.B.,和Manges,A.R.(2010)EpidemiolInfect138,1679-1690)。不僅實(shí)施例1中描述的研究、而且取自文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)證實(shí)，O6血清型屬于許多ExPEC引起的表現(xiàn)中的最主要4種血清型(參見(jiàn)圖4)。文獻(xiàn)中已報(bào)道了O6OPS的兩種結(jié)構(gòu)(參見(jiàn)Jann等人,Carbohydr.Res.263(1994)217-225,和Jansson等人,Carbohydr.Res.131(1984)277-283)。報(bào)道的O6抗原的結(jié)構(gòu)顯示于圖17B中。它們是相同的，除了各自的支鏈單糖是Glc或GlcNAc。然而，文獻(xiàn)尚未鑒定出臨床分離物中參與UTI的主要O6結(jié)構(gòu)。為了選擇用于疫苗目的的O6抗原的最具代表性的結(jié)構(gòu)，使用與上文針對(duì)O1血清型所述相同的方法研究來(lái)自實(shí)施例1研究的O6凝集陽(yáng)性臨床大腸桿菌分離物的OPS結(jié)構(gòu)。使用抗O6抗血清的銀染色和Western印跡鑒定出12種臨床分離物中之一對(duì)于抗O6血清不反應(yīng)，盡管LPS在所有樣品中都被銀染色(未顯示)，表明假陽(yáng)性凝集結(jié)果。然而，可能Glc或GlcNAc差異無(wú)法通過(guò)凝膠上的電泳遷移率位移進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于詳述的結(jié)構(gòu)分析，使用LLO指紋分析。作為用于兩種報(bào)道的結(jié)構(gòu)中的任一者的參考，分析中包括來(lái)自具有報(bào)道的支鏈Glc(CCUG11309)和GlcNAc(CCUG11311)的菌株的提取物。兩種HPLC痕跡的比較顯示CCUG11309衍生樣品在70.8、103.3和122.2’處洗脫的峰系列和CCUG11311樣品在68.8、100.3和118.3’處洗脫的峰系列。參見(jiàn)圖18A。通過(guò)MS針對(duì)存在于峰中的主要物質(zhì)且通過(guò)MS/MS針對(duì)這些主要物質(zhì)的單糖序列分析峰。數(shù)據(jù)證實(shí)CCUG11311提取物衍生峰系列m/z=1094.4、2027.6和2962(MSO154)，其如所預(yù)期對(duì)應(yīng)于GlcNAc分枝的1、2和3BRU聚合物。先前在來(lái)自表達(dá)CFTO6臨床分離物的克隆的rfb簇的W3110菌株的提取物中鑒定出具有分枝Glc的m/z=1053.4、1945.7和2836.9，其與CCUG11309(MSO138)具有相同2AB指紋分析峰洗脫時(shí)間。當(dāng)比較從12種臨床分離物獲得的色譜圖與參考菌株時(shí)，11種信號(hào)含有指示表明分枝Glc殘基的O6OPS的峰系列。這11種色譜圖中的5種顯示于圖18B中。一種在O6特異性洗脫時(shí)間處不生成信號(hào)的樣品不是O6，即最可能是來(lái)自凝集測(cè)試的假陽(yáng)性物。因此，具有Glc支鏈的O6OPS(圖17B，頂部)是從實(shí)施例1中描述的流行病學(xué)分離的O6血清型中的最具代表性的結(jié)構(gòu)。為了產(chǎn)生攜帶O6Glc多糖的生物綴合物，通過(guò)用來(lái)自菌株CCUG11309的rfb簇代替W3110rfb簇來(lái)工程改造W3110大腸桿菌菌株以表達(dá)O6OPS。參見(jiàn)表7和13。所得菌株是W3110△rfbO16：：rfbCCUG11309△waaL，其含有在BRU中具有報(bào)道的Glc支鏈的O6陽(yáng)性大腸桿菌菌株的rfb簇(參見(jiàn)上文)。通過(guò)同源重組構(gòu)建表達(dá)O6GlcOPS的宿主菌株。使用側(cè)接rfb簇的DNA中的PCR寡核苷酸退火擴(kuò)增rfb簇。然后通過(guò)國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朠CT/EP2013/071328中描述的同源重組使用擴(kuò)增的DNA代替充分表征的實(shí)驗(yàn)室菌株W3110的內(nèi)源性O(shè)抗原簇。通過(guò)轉(zhuǎn)化插入用于載體蛋白和PglB的表達(dá)質(zhì)粒且通過(guò)Western印跡證實(shí)預(yù)期OPS在EPA上的表達(dá)。實(shí)施例5：大腸桿菌O2自1987年已知O2多糖的重復(fù)單元結(jié)構(gòu)(Jansson,等人,(1987)Carbohydrateresearch161,273-279)。其顯示于圖19B中。兩種O2O抗原基因簇序列可得自公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBankEU549863和GU299792)。已進(jìn)行對(duì)比分析且已提示糖基轉(zhuǎn)移酶活性(表5；Fratamico等人，2010,Canadianjournalofmicrobiology56,308-316;和Li,等人.,(2010)JMicrobiolMethods82,71-77)。表5.括號(hào)中指示如由Li,等人和Fratamico,等人公開(kāi)的來(lái)自rfb簇的O2O抗原簇基因預(yù)測(cè)。結(jié)構(gòu)和基因同源性的比較表明，存在用于生物合成聚合物的所有功能：rmlBDAC編碼dTDP-L-鼠李糖的生物合成所需的酶，所述dTDP-L-鼠李糖是用于通過(guò)糖基轉(zhuǎn)移酶wekPOR將L-Rha添加至骨架的底物；fdtABC提供用于支鏈糖基轉(zhuǎn)移酶的dTDP-D-Fuc3Nac；wzy和wzx同系物負(fù)責(zé)將Und-PP結(jié)合的重復(fù)單元從細(xì)胞質(zhì)翻轉(zhuǎn)至周質(zhì)；且wekPOR是預(yù)測(cè)的糖基轉(zhuǎn)移酶，且被預(yù)測(cè)形成O2BRU的糖苷連接(三個(gè)L-Rha和一個(gè)L-FucNAc)。公開(kāi)的O2rfb簇序列中發(fā)現(xiàn)的wekS基因是預(yù)測(cè)的膜結(jié)合的硫酸酯酶，且因此最可能不參與BRU形成。這意味著-如果假設(shè)一種酶對(duì)應(yīng)一種連接的規(guī)則成立-則wekPOR組中的一種酶必須是雙功能性的，以提供所述4個(gè)糖苷連接。多個(gè)實(shí)施例中顯示一種酶-一個(gè)連接的規(guī)則不是絕對(duì)的，在所述實(shí)施例中已知糖基轉(zhuǎn)移酶少于連接，例如在福氏志賀氏菌Y(ShigellaflexneriY)、福氏志賀氏菌6(S.flexneri6)、空腸彎曲桿菌和大腸桿菌O1A中。在這些實(shí)施例中，多功能糖基轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)形成多于一個(gè)糖苷連接，它們是"雙功能的"或"多功能的"。其總是是多次添加的同一單糖。重復(fù)鼠李糖殘基-如在血清型O2中所發(fā)現(xiàn)-通常與此類(lèi)多功能酶相關(guān)。由于側(cè)接wekS序列的截短轉(zhuǎn)位子元件的存在，已推測(cè)，通過(guò)DNA重組事件將wekS基因座插入rfb簇中(參見(jiàn)Fratamico等人,2010,Canadianjournalofmicrobiology56,308-316)。wekS基因座的轉(zhuǎn)位子介導(dǎo)的插入表明，O2OPS生物合成的確存在，且之前不存在wekS，且因此O2OPS聚合物的合成不需要wekS。為了證實(shí)此假設(shè)，在重組表達(dá)系統(tǒng)(含有缺乏wekS基因的O2rfb簇的"清潔"基因組背景)中重構(gòu)O2OPS形成。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，通過(guò)來(lái)自缺乏wekSDNA的O2陽(yáng)性菌株upec116的rfb簇代替來(lái)自菌株W3110的O抗原簇。通過(guò)同源重組進(jìn)行染色體代替，如國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朠CT/EP2013/071328中所述。所得菌株是W3110△waaL△rfbW3110：：rfbO2△wekS。制備OPS且通過(guò)2AB標(biāo)記和正相HPLC以及熒光檢測(cè)進(jìn)行分析，如針對(duì)O1A和O6OPS所進(jìn)行(參見(jiàn)上文)，且通過(guò)正相HPLC進(jìn)行分析(圖21)并與來(lái)自野生型菌株CCUG25的信號(hào)進(jìn)行比較。分析導(dǎo)致產(chǎn)生40分鐘和140分鐘洗脫時(shí)間之間的一系列重疊峰。rfbO2簇獨(dú)立的峰系列的MS分析顯示在連續(xù)峰間具有相同差異(即單一O2RU)的主要物質(zhì)。進(jìn)行在各個(gè)峰中收集的分子的MS分析以分析OPS的結(jié)構(gòu)。收集從野生型菌株CCUG25獲得的在43.5、73.1、81.4和90’處獲得的峰且通過(guò)MS和MS/MS進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)與預(yù)期1、2和3重復(fù)單元O2OPS分子一致的物質(zhì)和Y片段離子系列(m/z=989.4(圖23)、1817.8、2646.1，都是Na+加合物)。為了確認(rèn)來(lái)自臨床分離物的O2OPS，分析了12種克隆的OPS結(jié)構(gòu)，如上文針對(duì)O1血清型所述。首先，制備LPS以通過(guò)銀染色和Western印跡進(jìn)行分析。結(jié)果描繪于圖20中。所有樣品都顯示具有兩種表觀不同平均梯長(zhǎng)度的梯狀帶模式?？筄2抗血清檢測(cè)到所有LPS樣品，表明凝集準(zhǔn)確地將所有分離物都鑒定為O2血清型。為了產(chǎn)生攜帶O2多糖的生物綴合物，使用W3110△waaL△rfbW3110：：rfbO2△wekS。通過(guò)轉(zhuǎn)化插入用于載體蛋白和用于PglB的表達(dá)質(zhì)粒且通過(guò)Western印跡證實(shí)預(yù)期OPS在EPA上的表達(dá)。參見(jiàn)表7和13和上文。實(shí)施例6：不同O抗原的免疫學(xué)分析為了評(píng)估含有所選抗原性多糖的生物綴合物的免疫學(xué)潛力，進(jìn)行了臨床前研究。產(chǎn)生O1A-EPA、O2-EPA、O6Glc-EPA和O25B-EPA生物綴合物，純化，且如上文和方法部分中所述進(jìn)行表征。使用純化的生物綴合物免疫9周齡雌性SpragueDawley大鼠。在第1、22和43天將100μl相同劑量溶液肌內(nèi)(i.m.)注射至大鼠中，對(duì)大鼠進(jìn)行末端放血且在第56天處死。不同組的大鼠接受以下不同的疫苗：總是未配制、包含單獨(dú)或組合的生物綴合物，如表6中所示。在第一注射之后56天的末端放血時(shí)間點(diǎn)，使用以waaL陽(yáng)性菌株中產(chǎn)生的同源LPS包被的ELISA板以大鼠血清的ELISA滴度形式來(lái)測(cè)量免疫原性(圖25-28)。總而言之，對(duì)于針對(duì)對(duì)照(未糖基化的EPA或TBS緩沖液)測(cè)量的所有接種疫苗組都觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的免疫原性。因此，選擇和產(chǎn)生的生物綴合物代表有用的疫苗候選化合物。對(duì)于測(cè)試的所有O抗原-EPA綴合物，對(duì)于針對(duì)對(duì)照(未糖基化的EPA或TBS緩沖液)測(cè)量的所有接種疫苗組都觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的免疫原性。因此，選擇和產(chǎn)生的生物綴合物代表用于誘導(dǎo)O抗原特異性抗體的有用疫苗候選化合物。實(shí)施例7：生物綴合物的物理化學(xué)表征將上述實(shí)施例中描述的四種生物綴合物(分別綴合至作為載體蛋白的EPA的O25B、O1A、O2和O6的O抗原)制備為單價(jià)批料(活性醫(yī)藥成分，API)或作為針對(duì)ExPEC的多價(jià)疫苗組合于單一制劑中。產(chǎn)生各種批料：臨床前批料、毒性研究批料和臨床批料。表7表明用于產(chǎn)生綴合物的宿主菌株。表7：用于產(chǎn)生臨床前、毒理學(xué)研究和臨床批料的宿主菌株產(chǎn)物菌株EPA表達(dá)質(zhì)粒PglB表達(dá)質(zhì)粒EPA-O1AW3110?rfb::rfb(upec032)?waaLpGVXN1076pGVXN970EPA-O2W3110?rfb::rfb(upec116)?waaLpGVXN1076pGVXN971EPA-O6GlcW3110?rfb::rfb(CCUG11309)?waaLpGVXN659pGVXN114EPA-O25BW3110?rfb::rfb(upec138)?waaL?gtrABSpGVXN1076pGVXN970因此通過(guò)具有多角度光散射的大小排阻色譜(SEC-MALS)分析四種單價(jià)GMP前批料和未糖基化的EPA參考標(biāo)準(zhǔn)品以定量個(gè)別生物綴合物的單-和二糖基化水平且測(cè)定蛋白載體和與之附接的O-PS的分子量(MW)。在TSKgel-G3000SWx1柱上于磷酸鹽緩沖液(pH7.0；50mMNaCl、150mM磷酸鈉)中分離樣品且通過(guò)UV(214和280nm)、折射指數(shù)(RI)和多角度光散射(MALS)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。對(duì)于未糖基化的EPA載體蛋白，測(cè)定63-67kDa的MW(基于氨基酸序列，70.5kDa的理論MW)。在生物綴合物中，僅在280nm檢測(cè)到EPA，允許從通過(guò)RI和MALS測(cè)量的總MW提取其MW：在生物綴合物中，EPA部分的測(cè)量的MW為65-71kDa。GMP前API產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品的分析顯示于表8中，表明單糖基化和二糖基化綴合物的存在，其中MW分別在75-79kDa和87-91kDa的范圍內(nèi)。O-PS部分的特征分別在于16-24kDa的MW(對(duì)于二糖基化的物質(zhì))和8-14kDa的MW(對(duì)于單糖基化的物質(zhì))。考慮每一血清型的RU的MW，測(cè)定每多糖鏈的10-16個(gè)RU的平均數(shù)，這與肼解和MS數(shù)據(jù)良好一致。表8：?jiǎn)蝺r(jià)GMP前API產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品的SEC-MALS分析峰1：二糖基化的形式。峰2：?jiǎn)翁腔男问?。在Tris緩沖鹽水(TBS)中配制的O25B生物綴合物批料的圓二色性(CD)分析顯示，制劑在pH6.8至7.4具有類(lèi)似于未糖基化的EPA載體蛋白的光譜且具有α螺旋和β折疊結(jié)構(gòu)的混合物，如基于EPA的公開(kāi)晶體結(jié)構(gòu)所預(yù)期。因此，基于這些CD分析，用O25BO-PS鏈的糖基化似乎不影響EPA載體蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。pH6.8至7.4的TBS和pH7.1至7.8的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的O25B生物綴合物批料制劑的差示掃描量熱法(DSC)分析顯示與未糖基化EPA相當(dāng)?shù)娜劢馇€，具有大約52℃的熔點(diǎn)。此結(jié)果表明，EPA載體蛋白的生物物理學(xué)特征在用O25BO-PS鏈修飾后不改變。實(shí)施例8：?jiǎn)蝺r(jià)主體和四價(jià)疫苗制劑的穩(wěn)定性在大規(guī)模產(chǎn)生之前，以小規(guī)模評(píng)價(jià)制造方法的一致性。在包括加速和應(yīng)力儲(chǔ)存條件的深度穩(wěn)定性研究中評(píng)估一致性批料以鑒定降解途徑。經(jīng)3個(gè)月時(shí)段測(cè)試四種單價(jià)疫苗組分(API)的穩(wěn)定性。臨床前API的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)的分析表明當(dāng)儲(chǔ)存于-75±15℃(正常儲(chǔ)存條件)時(shí)經(jīng)至少3個(gè)月的穩(wěn)定性。在預(yù)期儲(chǔ)存條件下通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)線性消退分析觀察到?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的趨勢(shì)。同樣在加速(+5±3℃)和應(yīng)力儲(chǔ)存條件(+25±5℃)下，產(chǎn)物經(jīng)至少3個(gè)月是穩(wěn)定的，如通過(guò)穩(wěn)定性指示參數(shù)的低變化性所證明。O1A臨床前API的數(shù)據(jù)顯示于表9中。三種其它血清型(O2、O6、O25B)表明類(lèi)似的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。表9：O1A臨床前API批料的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)S/P：糖/蛋白比率，如分別通過(guò)蒽酮和BCA測(cè)定法所測(cè)定。純度：如通過(guò)反相高分辨率液相色譜(RP-HPLC)所測(cè)定。在3個(gè)月時(shí)段期間測(cè)試四價(jià)疫苗組合物(O25B、O1A、O2和O6生物綴合物)的穩(wěn)定性。研究包括加速和應(yīng)力儲(chǔ)存條件以鑒定降解途徑。所得數(shù)據(jù)可視為對(duì)于初始證實(shí)GMPIMP(研究性醫(yī)學(xué)產(chǎn)物，四價(jià)ExPEC疫苗組合物)保質(zhì)期是相關(guān)的。四價(jià)ExPEC疫苗臨床前批料的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)的分析指示當(dāng)儲(chǔ)存于+5±3℃(正常儲(chǔ)存條件)下時(shí)經(jīng)至少3個(gè)月的穩(wěn)定性，如表10中所顯示。在預(yù)期儲(chǔ)存條件下通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)線性消退分析觀察到無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著趨勢(shì)。同樣在加速儲(chǔ)存條件(+25±5℃)下，產(chǎn)物穩(wěn)定，如通過(guò)穩(wěn)定性指示參數(shù)的低變化性所證明。表10：臨床前四價(jià)疫苗批料的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)MW(分子大小分布)：兩種主要產(chǎn)物峰(即單糖基化和二糖基化物質(zhì))，如通過(guò)大小排阻高分辨率液相色譜(SE-HPLC)所測(cè)定。純度：如通過(guò)反相高分辨率液相色譜(RP-HPLC)所測(cè)定?？偠灾?，這些研究顯示，API和四價(jià)ExPEC疫苗組合物持續(xù)至少三個(gè)月是穩(wěn)定的，因此就穩(wěn)定性而言是合適的疫苗組合物。實(shí)施例9：對(duì)四價(jià)疫苗制劑的毒性研究在第1和14天于SpragueDawley大鼠中兩次肌內(nèi)施用(使用股四頭肌用于治療)四價(jià)疫苗制劑(O25B、O1A、O2和O6生物綴合物)后評(píng)價(jià)其毒性和局部耐受性。在14天恢復(fù)期之后于第28天評(píng)價(jià)任何變化的可逆性、持久性或延遲發(fā)生。在第17天對(duì)主要組(對(duì)于接種疫苗組和對(duì)照組兩者而言，10只雄性和10只雌性)中的動(dòng)物進(jìn)行尸檢，且在第28天(在14天恢復(fù)期之后)對(duì)恢復(fù)組(對(duì)于接種疫苗組和對(duì)照組兩者而言，5只雄性和只5雌性)進(jìn)行尸檢。這與可歸因于治療的被視為不良的任何效應(yīng)并不相關(guān)。所施用劑量(即等效于4μg/O抗原(對(duì)于四價(jià)疫苗而言，16μg總O抗原)的全人劑量，如在第1和14天所施用)視為在該研究條件下用于四價(jià)ExPEC疫苗的未觀察到的不良效應(yīng)值(NOAEL)。此外，在評(píng)價(jià)血清樣品后，在第17天和第28天證實(shí)四價(jià)ExPEC疫苗的免疫原性。與僅接受制劑緩沖液(25mMTris、130mMNaCl、2.7mMKCl，pH7.4)相比，在接種疫苗組中誘導(dǎo)抗O1A、抗O2、抗O6和抗O25BIgG抗體的更高滴度。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，四價(jià)ExPEC疫苗具有用于作為疫苗施用的合適的毒性概況，且誘導(dǎo)針對(duì)來(lái)自存在于疫苗中的O抗原的至少所有4種大腸桿菌血清型(即O25B、O1A、O2和O6)的抗體。實(shí)施例10：與菌血癥相關(guān)的O-血清型的流行病學(xué)為了測(cè)定引起老年人菌血癥的腸外大腸桿菌中的O-血清型分布，對(duì)一組從60歲以上患者收集的大腸桿菌血液分離物進(jìn)行流行病學(xué)研究。從美國(guó)、英國(guó)、德國(guó)、西班牙和荷蘭的個(gè)體總共收集860份來(lái)自時(shí)段2011-2013的血液分離物，且通過(guò)經(jīng)典O凝集進(jìn)行分析。如表11中所顯示，菌血癥分離物的O-血清型分布類(lèi)似于在患有泌尿道感染(UTI，參見(jiàn)表1A)的患者中發(fā)現(xiàn)的O-血清型分布。血清型O25最常見(jiàn)于研究的菌血癥群體中；通過(guò)PCR對(duì)57種分離物的亞分型顯示，56種(98%)O25血清型可分型為O25B。在兩個(gè)目標(biāo)群體(UTI和菌血癥)中，血清型O1、O2、O6和O25可鑒定為4種最普遍血清型?？偠灾?，這些數(shù)據(jù)證實(shí)，泌尿道感染和菌血癥分離物兩者中的血清型分布高度類(lèi)似且與地理位置、分離時(shí)間和適應(yīng)癥無(wú)關(guān)。表11：來(lái)自在2011-2013時(shí)段于美國(guó)和歐盟收集的860份血液分離物的集合的最常見(jiàn)菌血癥-相關(guān)大腸桿菌O-血清型的分布。指示樣品的相對(duì)O-血清型分布。O-血清型≥60歲中的菌血癥，美國(guó)/歐盟，2011-2013(n=860)2519.228.868.317.8753.342.8162.7182.7152.382.01531.6731.6實(shí)施例11：功能抗體反應(yīng)的誘導(dǎo)用體外調(diào)理吞噬殺滅(OPK)測(cè)定研究在用上述單價(jià)和四價(jià)疫苗制劑接種疫苗之后產(chǎn)生的抗體功能性。此類(lèi)測(cè)定已被接受作為抵抗肺炎鏈球菌的綴合物疫苗(Prevenar?)的保護(hù)相關(guān)性。OPK測(cè)定測(cè)量血清促進(jìn)不同大腸桿菌血清型的調(diào)理吞噬和殺滅的能力。在96孔板中，在每一孔中將樣品血清的定義稀釋液與以下物質(zhì)一起溫育：來(lái)自4種疫苗特異性大腸桿菌血清型之一的細(xì)菌、定義量的HL60細(xì)胞和幼兔補(bǔ)體。在溫育之后，將一定比例的混合物點(diǎn)樣于胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)上且對(duì)細(xì)菌克隆的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。將抗體結(jié)合細(xì)菌細(xì)胞且活化補(bǔ)體沉積以及通過(guò)HL60細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)菌的攝取和殺滅的能力表示為調(diào)理滴度。調(diào)理滴度或調(diào)理指數(shù)(OI)對(duì)應(yīng)于血清殺滅50%的細(xì)菌細(xì)胞的稀釋度。提供免疫前和免疫后血清的調(diào)理指數(shù)。OI從免疫前至免疫后>4倍的增加可視為顯著的。確立三種血清型O2、O6Glc和O25B的OPK測(cè)定。通過(guò)單價(jià)疫苗誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)的功能性為了評(píng)價(jià)O25B、O1A、O2和O6Glc生物綴合物的疫苗誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)的功能活性，使用調(diào)理吞噬殺滅(OPK)測(cè)定來(lái)分析來(lái)自接種疫苗大鼠的血清，所述測(cè)定測(cè)量細(xì)菌(例如大腸桿菌)的體外補(bǔ)體-和抗體依賴(lài)性吞噬和殺滅。使用來(lái)自接種疫苗大鼠的血清稀釋液預(yù)調(diào)理大腸桿菌，與補(bǔ)體和吞噬細(xì)胞(分化的HL60細(xì)胞)一起溫育，且測(cè)定菌落形成單位(CFU)。隨后，計(jì)算最大殺滅%和調(diào)理指數(shù)(OI：殺滅50%的大腸桿菌的血清稀釋度)。選擇用于OPK測(cè)試的大腸桿菌是OC24453(血清型O2)、OC24781(血清型O6Glc)和OC24176(血清型O25B)。如圖29中所顯示，觀察到對(duì)O2-EPA(圖29A)、O6Glc-EPA(圖29B)和O25B-EPA(圖29C)的穩(wěn)健功能免疫反應(yīng)。數(shù)據(jù)表明，本文描述的疫苗組分誘導(dǎo)針對(duì)其O抗原包括于疫苗中的大腸桿菌血清型的抗體反應(yīng)，且此類(lèi)抗體反應(yīng)可用于殺滅來(lái)自這些血清型的大腸桿菌。通過(guò)四價(jià)疫苗誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)的功能性表12顯示來(lái)自用含有0.4或4μg/O抗原的四價(jià)疫苗免疫的動(dòng)物的O抗原O2、O6Glc和O25B的總OI滴度。在兩個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中測(cè)定滴度。0.4μg劑量在所有動(dòng)物中針對(duì)O2和O6Glc血清型都誘導(dǎo)顯著OI。對(duì)于O25B，3/8的動(dòng)物顯示OI在用0.4μg劑量免疫后的顯著增加。與0.4μg劑量相比，4μg劑量在所有動(dòng)物中都針對(duì)O2誘導(dǎo)較低的OI增加。當(dāng)針對(duì)O25B大腸桿菌測(cè)試來(lái)自4μg劑量組的血清時(shí)，3/8的動(dòng)物顯示OI增加。數(shù)據(jù)證實(shí)，四價(jià)疫苗能夠引發(fā)針對(duì)O2、O6Glc和O25BO的抗原特異性調(diào)理抗體。數(shù)據(jù)顯示，本文描述的疫苗組分誘導(dǎo)針對(duì)其O抗原包括于疫苗中的大腸桿菌血清型的抗體反應(yīng)，且此類(lèi)抗體反應(yīng)在殺滅來(lái)自這些血清型的大腸桿菌中是有功能的。表12：針對(duì)大腸桿菌O2、O6和O25的OI。顯示所有動(dòng)物的來(lái)自?xún)纱螁为?dú)實(shí)驗(yàn)的個(gè)別接種疫苗前和接種疫苗后3天血清的OI。計(jì)算最大殺滅%和調(diào)理指數(shù)(OI：殺滅50%的大腸桿菌的血清稀釋度)。選擇用于OPK測(cè)試的大腸桿菌是OC24453(血清型O2)、OC24781(血清型O6Glc)和OC24176(血清型O25B)。觀察到針對(duì)O2-EPA、O6Glc-EPA和O25B-EPA的穩(wěn)健功能免疫反應(yīng)。實(shí)施例12：在具有復(fù)發(fā)性泌尿道感染(RUTI)臨床史的女性中評(píng)價(jià)針對(duì)尿路病原性大腸桿菌的候選疫苗在階段I臨床研究中使用大腸桿菌生物綴合物疫苗。疫苗包含鹽水緩沖溶液中的4種生物綴合物。4種生物綴合物是：(i)綴合至EPA載體蛋白的大腸桿菌O1A、(ii)綴合至EPA載體蛋白的大腸桿菌O2、(iii)綴合至EPA載體蛋白的大腸桿菌O6Glc和(iv)綴合至EPA載體蛋白的大腸桿菌O25B。研究群體包括194名健康女性，其年齡≥18至70歲且具有復(fù)發(fā)性泌尿道感染(RUTI)病史(定義為在先前12個(gè)月中≥3次獨(dú)立發(fā)作或在最近6個(gè)月中≥2次發(fā)作)。至少一次泌尿道感染(UTI)發(fā)作由大腸桿菌(作為單一病原或多種微生物感染的一部分)引起且培養(yǎng)證實(shí)并記載病因。出于研究目的，UTI定義為存在至少一種指定UTI癥狀(排尿困難、尿急、尿頻、側(cè)腹疼痛、膀胱觸痛、恥骨上疼痛、發(fā)燒、惡心、嘔吐)且細(xì)菌計(jì)數(shù)(CFU)≥103CFU/ml中段尿中的尿路病原。該研究包含兩個(gè)組：(i)候選疫苗和(ii)安慰劑。該研究是在具有RUTI病史的健康女性中的交錯(cuò)、隨機(jī)、單盲、安慰劑對(duì)照多中心研究。用于研究的估計(jì)登記時(shí)段為4個(gè)月，其中每一個(gè)體的隨訪時(shí)間段為9個(gè)月。研究目標(biāo)是評(píng)價(jià)大腸桿菌生物綴合物疫苗的安全性、免疫原性和效力。研究設(shè)計(jì)在注射之后追蹤個(gè)體9個(gè)月，且在整個(gè)研究時(shí)段中僅追蹤注射個(gè)體。個(gè)體參加總共5個(gè)安排拜訪：篩選(第一拜訪)、第1天(第二拜訪)、第7天、第30天和第270天。個(gè)體在第2天、第90天、第150天和第210天接受4次電話隨訪。由發(fā)生UTI導(dǎo)致的任何未安排拜訪包括使用協(xié)調(diào)治療選擇進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理。收集尿和血液(如果可能)以用于診斷和血清分型目的。隨研究持續(xù)時(shí)間記錄非誘導(dǎo)不良事件(AE)和嚴(yán)重不良事件(SAE)，而在注射之后記錄誘導(dǎo)的AE7天。在每一拜訪時(shí)，給予個(gè)體新日記卡且討論前一日記卡。給藥和施用在第一拜訪時(shí)，篩選已提供知情同意的合格個(gè)體且證實(shí)對(duì)于納入/安排標(biāo)準(zhǔn)的順從性。抽血且采尿。在拜訪2(第1天)時(shí)，每一個(gè)體在三角肌中接受一次0.5ml溶液的肌內(nèi)注射(候選疫苗或安慰劑)。減小劑量的候選疫苗含有1μg每一多糖(總共4μg多糖)。候選疫苗的目標(biāo)劑量含有4μg每一多糖(總共16μg多糖)。目標(biāo)主要目標(biāo)是評(píng)價(jià)在注射候選疫苗后在整個(gè)研究時(shí)段中與安慰劑組相比誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)不良事件(AE)和嚴(yán)重不良事件(SAE)的發(fā)生、強(qiáng)度、關(guān)系和持續(xù)時(shí)間。次要目標(biāo)是：(i)比較在注射候選疫苗之前(在初始篩選時(shí)和第1天)和在注射后(在第7天和第30天)與安慰劑組相比血液學(xué)和生物化學(xué)安全性終點(diǎn)的變化；(ii)評(píng)估基線(第1天)和注射后(第30天和第270天)之間候選疫苗的免疫反應(yīng)；(iii)比較在兩個(gè)注射候選疫苗或安慰劑的組之間在整個(gè)研究時(shí)段期間由大腸桿菌疫苗-血清型引起的癥狀性泌尿道感染(UTI)發(fā)作的數(shù)量作為最相關(guān)效力終點(diǎn)；(iv)評(píng)價(jià)在疫苗組中與安慰劑組相比隨研究持續(xù)時(shí)間疫苗-血清型特異性大腸桿菌UTI的發(fā)生率；和(v)評(píng)價(jià)在疫苗組中與安慰劑組相比隨研究持續(xù)時(shí)間疫苗-血清型特異性大腸桿菌UTI的臨床癥狀的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。探索目標(biāo)是：(i)比較在疫苗組中與安慰劑組相比在整個(gè)研究時(shí)段中由任一大腸桿菌血清型引起的UTI發(fā)生率；和(ii)比較在疫苗組中與安慰劑組相比在整個(gè)研究時(shí)段中由任一病原引起的UTI發(fā)生率。收錄標(biāo)準(zhǔn)用于研究的收錄標(biāo)準(zhǔn)如下：(i)女性個(gè)體具有復(fù)發(fā)性UTI病史，其定義為：在先前12個(gè)月中≥3次UTI獨(dú)立發(fā)作或在最近6個(gè)月中≥2次UTI發(fā)作；在最近5年期間的至少一次UTI由大腸桿菌(作為單一病原或多種微生物感染的一部分)引起且進(jìn)行培養(yǎng)證實(shí)并記載；(ii)年齡≥18歲且≤70歲；(iii)個(gè)體在篩選拜訪時(shí)和在注射日(拜訪2)處于無(wú)進(jìn)行性或懷疑癥狀性UTI的健康狀態(tài)；(iv)一般良好健康，根據(jù)研究者的臨床判斷無(wú)臨床顯著醫(yī)學(xué)史、身體檢查發(fā)現(xiàn)或臨床實(shí)驗(yàn)室異常；和(v)在已解釋所有方案方面且完全理解之后愿意參與研究，且獲得書(shū)面知情同意形式。排除標(biāo)準(zhǔn)用于研究的排除標(biāo)準(zhǔn)如下：(i)在篩選拜訪前一年具有多于10次復(fù)發(fā)性UTI病史；(ii)在篩選之前7天內(nèi)使用任何短期尿管；(iii)在篩選之前30天內(nèi)使用任何永久性導(dǎo)管；(iv)具有任何未解決泌尿道疾病/異常病史；(v)具有受損免疫功能的證據(jù)；(vi)顯著的心血管、肝、腎臟疾病和/或機(jī)能不全；(vii)不受控糖尿病；(viii)在血液學(xué)、血清化學(xué)或尿分析的篩選結(jié)果中具有顯著異常；(ix)HIV陽(yáng)性測(cè)試和/或HBV或HCV的證據(jù)；(x)BMI>34；(xi)在最近3個(gè)月中進(jìn)行用于UTI預(yù)防的先前免疫刺激治療(例如Urovaxom?、Strovac?或Urovac?)，或計(jì)劃在研究時(shí)段期間使用；(xii)當(dāng)前使用任一已知影響免疫功能的藥劑(例如皮質(zhì)類(lèi)固醇≥0.5mg/kgBW/天)；(xiii)在注射之前小于6個(gè)月新開(kāi)始使用UTI相關(guān)陰道雌激素治療且在研究期間繼續(xù)使用或在積極研究時(shí)段期間計(jì)劃開(kāi)始；(xiv)在注射前1周內(nèi)使用任何抗生素治療；(xv)在研究時(shí)段期間計(jì)劃使用性交后抗生素用于UTI預(yù)防；(xvi)在注射之前30天和在注射之后30天內(nèi)使用任何計(jì)劃的接種疫苗；(xvii)在登記前60天和研究持續(xù)時(shí)間內(nèi)參與其它臨床試驗(yàn)；(xviii)先前在注射前3個(gè)月內(nèi)使用免疫球蛋白或血液產(chǎn)物進(jìn)行治療；(xix)對(duì)疫苗的任一組分具有已知超敏性；(xx)存在在研究者的觀點(diǎn)中妨礙參與研究的顯著醫(yī)學(xué)或精神病學(xué)病況；(xxi)在注射時(shí)具有急性病況；(xxii)具有陽(yáng)性妊娠測(cè)試或拒絕使用有效避孕措施的可能懷孕的女性；(xxiii)在整個(gè)研究時(shí)段中的任一時(shí)間處于哺乳期的女性；(xxiv)計(jì)劃在研究時(shí)段期間使用可選手術(shù)干預(yù)的個(gè)體；和(xxv)在研究者的觀點(diǎn)中從參與研究會(huì)增加具有不良結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)的任何其它顯著發(fā)現(xiàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法和分析如果適應(yīng)，則由治療組和/或拜訪提供描述性統(tǒng)計(jì)學(xué)(n、平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、連續(xù)變量的中值和范圍、類(lèi)別變量的頻率和百分比)。所有數(shù)據(jù)都通過(guò)個(gè)體、治療組和(如果適用)拜訪來(lái)列出。組合所有組B的接受安慰劑的個(gè)體以形成安慰劑治療組。實(shí)施例13：階段I臨床研究結(jié)果本實(shí)施例呈現(xiàn)實(shí)施例12中描述的階段I臨床研究的期中分析的某些結(jié)果。12.1：安全性不良事件和嚴(yán)重不良事件的發(fā)生率在安慰劑組和接種疫苗組之間是相當(dāng)?shù)?。?bào)告了10個(gè)嚴(yán)重不良事件，且無(wú)一與研究藥物相關(guān)。12.2：免疫原性為了評(píng)估疫苗組分的免疫原性，獲得來(lái)自參與臨床研究的女性的血清且通過(guò)ELISA分析以定量針對(duì)四價(jià)疫苗中包括的4種不同O抗原(大腸桿菌O1、大腸桿菌O2、大腸桿菌O6和大腸桿菌O25B)的IgG。在包被有O1A、O2、O6Glc和O25B-LPS和EPA的板中溫育來(lái)自接種疫苗女性的血清。隨后，將板與HRP標(biāo)記的二級(jí)抗體(抗人IgG)一起溫育。使用TMB底物檢測(cè)結(jié)合抗體且測(cè)量吸光度。通過(guò)4PL擬合計(jì)算EC50值。如圖30中所顯示，在大部分接種疫苗女性中出現(xiàn)對(duì)O1A-EPA、O2-EPA、O6Glc-EPA和O25B-EPA的穩(wěn)健免疫反應(yīng)。這些數(shù)據(jù)顯示四價(jià)疫苗的每一組分的免疫原性。12.3：功能抗體反應(yīng)使用OPK分析(其測(cè)量大腸桿菌細(xì)菌的體外補(bǔ)體-和抗體依賴(lài)性吞噬和殺滅)來(lái)評(píng)價(jià)參與臨床研究的女性的功能抗體反應(yīng)。從研究參與者收集血清。用來(lái)自接種疫苗女性的血清稀釋液預(yù)調(diào)理大腸桿菌，與補(bǔ)體和吞噬細(xì)胞(分化的HL60細(xì)胞)一起溫育，且測(cè)定剩余菌落形成單位(CFU)。隨后，計(jì)算最大殺滅百分比和調(diào)理指數(shù)(OI：殺滅50%的大腸桿菌的血清稀釋度)。選擇用于OPK測(cè)試的大腸桿菌是OC24452(血清型O1A)、OC24453(血清型O2)、OC24454(血清型O6Glc)和OC24176(血清型O25B)。如圖31中所顯示，觀察到對(duì)O1A-EPA(圖31A)、O2-EPA(圖31B)、O6Glc-EPA(圖31C)和O25B-EPA(圖31D)的穩(wěn)健功能免疫反應(yīng)。這些數(shù)據(jù)顯示，四價(jià)疫苗的每一組分誘導(dǎo)血清型特異性抗體反應(yīng)，且此類(lèi)抗體反應(yīng)在殺滅來(lái)自這些血清型的大腸桿菌中是有功能的。因此，本文描述的疫苗組合物在人是有功能的。12.4：用包含O25B-EPA的四價(jià)O抗原綴合物免疫在人中引發(fā)O25A/O25B交叉反應(yīng)性IgG抗體為了測(cè)定疫苗誘導(dǎo)的血清IgG抗體針對(duì)兩種已知大腸桿菌O25血清亞型O25A和O25B的交叉反應(yīng)性水平，將源自接種疫苗個(gè)體的血清的連續(xù)稀釋液與純化O25ALPS、O25BLPS或完整細(xì)菌細(xì)胞一起溫育，且通過(guò)ELISA進(jìn)行測(cè)試。如圖32中所顯示，當(dāng)測(cè)試接種疫苗后30天針對(duì)O25ALPS(黑條)和O25BLPS(灰條)的反應(yīng)性時(shí)，觀察到類(lèi)似的EC50值?？偠灾?，數(shù)據(jù)表明，O25B生物綴合物充分地作用于O25B和O25A，但在大部分情況/測(cè)試個(gè)體中，O25B在針對(duì)O25B的抗體反應(yīng)方面的作用略好于O25A。該結(jié)果表明，在發(fā)生一些天然變化的情況下，四價(jià)疫苗誘導(dǎo)識(shí)別O25A和O25BLPS兩者的抗體。為了測(cè)試是否同樣適用于全部細(xì)菌細(xì)胞和多種O25A/O25B菌株，還測(cè)試針對(duì)一組源自血液或尿的臨床O25A或O25B分離物的反應(yīng)性。在該情況下，使用血清型O75菌株(不是四價(jià)疫苗中的代表性血清型)作為陰性對(duì)照(圖33中的灰色虛線)。如圖33中所顯示，疫苗誘導(dǎo)的血清IgG抗體針對(duì)個(gè)別O25菌株中的每一種都顯示強(qiáng)反應(yīng)。盡管菌株-菌株變化明顯，但觀察到針對(duì)O25A(黑線)和O25B菌株(灰線)的反應(yīng)性。這些數(shù)據(jù)顯示，四價(jià)疫苗的O25B疫苗組分引發(fā)識(shí)別O25A和O25B純化LPS和大腸桿菌O25A和O25B菌株的抗體。下表13和14分別提供前述實(shí)施例中使用的某些菌株和質(zhì)粒的細(xì)節(jié)。表13：菌株名稱(chēng)基因型描述upec032wt來(lái)自GVXN流行病學(xué)研究的O1A臨床分離物upec436wt來(lái)自GVXN流行病學(xué)研究的O25A臨床分離物upec138wt來(lái)自GVXN流行病學(xué)研究的O25B臨床分離物upec116wt來(lái)自GVXN流行病學(xué)研究的O2臨床分離物upec163wt來(lái)自GVXN流行病學(xué)研究的O25B臨床分離物upec177wt來(lái)自GVXN流行病學(xué)研究的O25B臨床分離物W3110F-,λ-,IN(rrnD-rrnE)1,rph-1用于產(chǎn)生菌株合成的K-12實(shí)驗(yàn)室菌株，CGSC#:4474CCUG25wt從培養(yǎng)物保藏中心，UniversityofG?teborg(CCUG),Sweden獲得的O2分離物(參見(jiàn)Jansson,等人,(1987)Carbohydrateresearch161,273-27)CCUG11309wt來(lái)自CCUG的O6分離物，具有支鏈Glc的OPS(參見(jiàn)Jann,等人,(1994)Carbohydrateresearch263,217-225)CCUG11311wt來(lái)自CCUG的O6分離物，具有支鏈GlcNAc的OPS(參見(jiàn)Jann,等人,(1994)Carbohydrateresearch263,217-225)表14：質(zhì)粒名稱(chēng)描述評(píng)注pGVXN150編碼2個(gè)糖基化位點(diǎn)的遺傳脫毒的EPA-his6的基于pBR322的表達(dá)質(zhì)粒參見(jiàn)Ihssen,等人,(2010)Microbialcellfactories9,61pGVXN659編碼4個(gè)糖基化位點(diǎn)的遺傳脫毒的EPA的基于pBR322的表達(dá)質(zhì)粒修飾pGVXN150以編碼額外的N和C末端糖基化位點(diǎn)pGVXN1076pGVXN659ΔampR::kanRpGVXN579用于表達(dá)具有C末端柔性接頭、隨后3個(gè)糖基化位點(diǎn)序列和myc表位的基于pMAL-p2X的載體允許快速生物綴合物純化以避免his標(biāo)簽pGVXN114用于具有HA標(biāo)簽的PglB的基于pEXT21的表達(dá)質(zhì)粒參見(jiàn)Ihssen,等人,(2010)Microbialcellfactories9,61pGVXN939用于具有HA標(biāo)簽、密碼子優(yōu)化的PglB的基于pEXT21的表達(dá)質(zhì)粒pGVXN970用于無(wú)HA標(biāo)簽、密碼子優(yōu)化的PglB的基于pEXT21的表達(dá)質(zhì)粒pGVXN539用于編碼2個(gè)糖基化位點(diǎn)(如pGVXN150)的遺傳脫毒的、密碼子使用優(yōu)化的、his標(biāo)簽化的EPA的基于pACT3的表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)來(lái)自pGVXN161(寡核苷酸:#1399/#1400)的卡那霉素代替氯霉素抗性pGVXN161pKD4參見(jiàn)DatsenkoandWanner,(2000)ProcNatlAcadSciUSA97,6640-6645pGVXN112用于具有HA標(biāo)簽的PglB的基于pACT3的表達(dá)質(zhì)粒表15：序列本文描述的實(shí)施例僅意欲為示例性的，且本領(lǐng)域技術(shù)人員僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)即可認(rèn)識(shí)到或能夠確定本文描述的特定程序的多種等效形式。所有此類(lèi)等效形式都被認(rèn)為在本發(fā)明范圍內(nèi)且由以下權(quán)利要求所涵蓋。本文引用的所有參考文獻(xiàn)(包含專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利和出版物)以其整體且出于所有目的通過(guò)引用并入本文，其并入程度如同每一個(gè)別出版物或?qū)＠驅(qū)＠暾?qǐng)都具體且個(gè)別地指出以其整體出于所有目的通過(guò)引用并入一樣。7.實(shí)施方案實(shí)施方案1：1.原核宿主細(xì)胞，其包含：a.rfb(upec138)基因簇(SEQIDNO:12)、rfb(upec163)基因簇或rfb(upec177)基因簇；b.編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列；和c.編碼包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白的核苷酸序列，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)。2.原核宿主細(xì)胞，其包含：a.rmlB、rmlD、rmlA、rmlC、wzx、wekA、wekB、wzy、wbbJ、wbbK和wbbL；b.編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列；c.編碼包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白的核苷酸序列，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)。3.原核宿主細(xì)胞，其包含：a.編碼以下的核苷酸序列：i.dTDP-葡萄糖4,6-脫水酶；ii.dTDP-6-脫氧-D-葡萄糖3,5-差向異構(gòu)酶；iii.葡萄糖-1-磷酸胸苷基轉(zhuǎn)移酶；iv.dTDP-4-脫氫鼠李糖3,5-差向異構(gòu)酶；v.O抗原翻轉(zhuǎn)酶；vi.dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPPα-1,3-鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶；vii.UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPPβ-1,6-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶；viii.O抗原聚合酶；ix.O-乙?；D(zhuǎn)移酶；x.UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPPα-1,3-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶；和xi.dTDP-Rha:GlcNAc-UPPα-1,3-鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶；b.編碼寡糖基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列；c.編碼包含共有序列Asn-X-Ser(Thr)的載體蛋白的核苷酸序列，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)。4.權(quán)利要求3的宿主細(xì)胞，其中：a.所述dTDP-葡萄糖4,6-脫水酶包含與由SEQIDNO:1編碼的dTDP-葡萄糖4,6-脫水酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列；b.所述dTDP-6-脫氧-D-葡萄糖3,5-差向異構(gòu)酶包含與由SEQIDNO:2編碼的dTDP-6-脫氧-D-葡萄糖3,5-差向異構(gòu)酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列；c.所述葡萄糖-1-磷酸胸苷基轉(zhuǎn)移酶包含與由SEQIDNO:3編碼的葡萄糖-1-磷酸胸苷基轉(zhuǎn)移酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列；d.所述dTDP-4-脫氫鼠李糖3,5-差向異構(gòu)酶包含與由SEQIDNO:4編碼的dTDP-4-脫氫鼠李糖3,5-差向異構(gòu)酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列；e.所述O抗原翻轉(zhuǎn)酶包含與由SEQIDNO:5編碼的O抗原翻轉(zhuǎn)酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列；f.(xi)的鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶包含與由SEQIDNO:6編碼的鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列；g.(xii)的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶包含與由SEQIDNO:7編碼的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列；h.所述O抗原聚合酶包含與由SEQIDNO:8編碼的O抗原聚合酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列；i.所述O-乙?；D(zhuǎn)移酶包含與由SEQIDNO:9編碼的O-乙酰基轉(zhuǎn)移酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列；j.(x)的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶包含與由SEQIDNO:10編碼的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列；且k.(xi)的鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶包含與由SEQIDNO:11編碼的鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。6.權(quán)利要求5的宿主細(xì)胞，其中waaL基因、gtrA基因、gtrB基因、gtrS基因和rfb簇中的至少一個(gè)從所述宿主細(xì)胞的基因組中缺失或功能失活。7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述載體蛋白選自：脫毒的綠膿假單胞菌外毒素A(EPA)、CRM197、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、白喉類(lèi)毒素、破傷風(fēng)類(lèi)毒素、脫毒的金黃色葡萄球菌溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、大腸桿菌FimH、大腸桿菌FimHC、大腸桿菌不耐熱腸毒素、大腸桿菌不耐熱腸毒素的脫毒變體、霍亂毒素B亞單元(CTB)、霍亂毒素、霍亂毒素的脫毒變體、大腸桿菌Sat蛋白、大腸桿菌Sat蛋白的過(guò)客結(jié)構(gòu)域、肺炎鏈球菌肺炎球菌溶血素和其脫毒變體、空腸彎曲桿菌AcrA和空腸彎曲桿菌天然糖蛋白。8.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述載體蛋白包含優(yōu)化的N-糖基化共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)。9.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述載體蛋白包含一個(gè)或多個(gè)重組引入的共有序列。10.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述載體蛋白包含用于將載體蛋白靶向于所述宿主細(xì)胞的周質(zhì)間隙中的信號(hào)序列。11.權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞，其中所述信號(hào)序列選自：大腸桿菌DsbA、大腸桿菌外膜孔蛋白A(OmpA)、大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白(MalE)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌果膠酸裂合酶(PelB)、FlgI、NikA或芽孢桿菌屬木聚糖內(nèi)切酶(XynA)、不耐熱大腸桿菌腸毒素LTIIb、芽孢桿菌木聚糖內(nèi)切酶XynA或大腸桿菌鞭毛蛋白(FlgI)。12.制備N(xiāo)-糖基化的載體蛋白的方法，所述方法包括：a.培養(yǎng)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞；和b.純化所述N-糖基化的載體蛋白。13.N-糖基化的載體蛋白，其通過(guò)權(quán)利要求12的方法產(chǎn)生。14.權(quán)利要求13的N-糖基化的載體蛋白，其包含式O25B的化合物：其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間的整數(shù)。15.權(quán)利要求13的N-糖基化的載體蛋白，其包含式O25B’的化合物：其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間的整數(shù)。16.分離的O抗原，其來(lái)自O(shè)25B菌株諸如upec138、upec163或upec177。17.載體蛋白，其N(xiāo)-連接至權(quán)利要求15的O抗原。18.分離大分子的群體，所述分離大分子包含式O25B的結(jié)構(gòu)：其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間的整數(shù)。19.分離大分子的群體，所述分離大分子包含式O25B’的結(jié)構(gòu)：其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間的整數(shù)。20.藥物組合物，其包含含有式O25B的結(jié)構(gòu)的大分子：其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間的整數(shù)。21.藥物組合物，其包含含有式O25B’的結(jié)構(gòu)的大分子：其中n是1至30、1至20、1至15、1至10、1至5、10至30、15至30、20至30、25至30、5至25、10至25、15至25、20至25、10至20或15至20之間的整數(shù)。22.權(quán)利要求20的藥物組合物，其中所述式O25B的結(jié)構(gòu)共價(jià)結(jié)合至載體蛋白中的Asn殘基。23.權(quán)利要求21的藥物組合物，其中所述式O25B’的結(jié)構(gòu)共價(jià)結(jié)合至載體蛋白中的Asn殘基。24.權(quán)利要求20或21的藥物組合物，其中所述Asn殘基位于共有序列Asn-X-Ser(Thr)中，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸(SEQIDNO:14)。25.權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的原核宿主細(xì)胞，其中所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)所述宿主細(xì)胞是異源的。26.權(quán)利要求1至11的原核宿主細(xì)胞，其中所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶是空腸彎曲桿菌寡糖基轉(zhuǎn)移酶pglB。27.權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的原核宿主細(xì)胞，其中所述載體蛋白對(duì)所述宿主細(xì)胞是異源的。28.權(quán)利要求1至11、25、26或27中任一項(xiàng)的原核宿主細(xì)胞，其中所述載體蛋白不是大腸桿菌蛋白。29.生成包含L-Rha(2Ac)的寡糖的方法，其包括將糖或寡糖與包含SEQIDNO:11的鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶一起溫育，其中所述糖或寡糖包含末端D-GlcNAc。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述L-Rha(2Ac)和D-GlcNAc經(jīng)由α1,3鍵連接。31.權(quán)利要求29的方法，其中所述溫育在體外發(fā)生。32.權(quán)利要求29的方法，其中所述寡糖在重組表達(dá)包含SEQIDNO:11的鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶的宿主細(xì)胞中生成。實(shí)施方案2：1.組合物，其包含：(i)O25B生物綴合物，其包含共價(jià)結(jié)合至載體蛋白的Asn殘基的大腸桿菌O25B抗原；(ii)O1A生物綴合物，其包含共價(jià)結(jié)合至載體蛋白的Asn殘基的大腸桿菌O1A抗原；(iii)O2生物綴合物，其包含共價(jià)結(jié)合至載體蛋白的Asn殘基的大腸桿菌O2抗原；和(iv)O6生物綴合物，其包含共價(jià)結(jié)合至載體蛋白的Asn殘基的大腸桿菌O6抗原。2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述O25B抗原、O1A抗原、O6抗原和O2抗原分別包含下式：a.式O25B’b.式O1A’c.式O6Glc’d.式O2’。3.權(quán)利要求1或2的組合物，其中所述載體蛋白選自：脫毒的綠膿假單胞菌外毒素A(EPA)、CRM197、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、白喉類(lèi)毒素、破傷風(fēng)類(lèi)毒素、脫毒的金黃色葡萄球菌溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、大腸桿菌FimH、大腸桿菌FimHC、大腸桿菌不耐熱腸毒素、大腸桿菌不耐熱腸毒素的脫毒變體、霍亂毒素B亞單元(CTB)、霍亂毒素、霍亂毒素的脫毒變體、大腸桿菌Sat蛋白、大腸桿菌Sat蛋白的過(guò)客結(jié)構(gòu)域、肺炎鏈球菌肺炎球菌溶血素和其脫毒變體、空腸彎曲桿菌AcrA和空腸彎曲桿菌天然糖蛋白。4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述載體蛋白是脫毒的EPA、CRM197或MBP。5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的組合物，其中所述載體蛋白的Asn殘基位于共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)中，其中X和Z獨(dú)立地選自除Pro外的任何天然氨基酸(SEQIDNO:15)。6.治療具有腸外病原性大腸桿菌的個(gè)體的感染的方法，其中所述方法包括向所述個(gè)體施用有效量的權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的組合物。7.預(yù)防具有腸外病原性大腸桿菌的個(gè)體的感染的方法，其中所述方法包括向所述個(gè)體施用有效量的權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的組合物。8.在個(gè)體中誘導(dǎo)針對(duì)腸外病原性大腸桿菌的免疫反應(yīng)的方法，其中所述方法包括向所述個(gè)體施用有效量的權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的組合物。9.在個(gè)體中誘導(dǎo)產(chǎn)生特異于腸外病原性大腸桿菌的調(diào)理吞噬抗體的方法，其中所述方法包括向所述個(gè)體施用有效量的權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的組合物。10.權(quán)利要求6、8或9的方法，其中所述個(gè)體已診斷出患有泌尿道感染。11.權(quán)利要求7、8或9的方法，其中所述個(gè)體具有發(fā)生泌尿道感染的風(fēng)險(xiǎn)。12.權(quán)利要求6、8或9的方法，其中所述個(gè)體已診斷出患有菌血癥。13.權(quán)利要求7、8或9的方法，其中所述個(gè)體具有發(fā)生菌血癥的風(fēng)險(xiǎn)。14.權(quán)利要求6、8或9的方法，其中所述個(gè)體已診斷出患有敗血癥。15.權(quán)利要求7、8或9的方法，其中所述個(gè)體具有發(fā)生敗血癥的風(fēng)險(xiǎn)。16.權(quán)利要求6至16中任一項(xiàng)的方法，其中所述個(gè)體是人。序列表<110>GlycoVaxynAG<120>新穎多糖及其用途<130>13064-042<140>TBA<141>與之同一日<150>61/943,710<151>2014-02-24<160>15<170>PatentInversion3.5<210>1<211>1086<212>DNA<213>大腸桿菌<220><223>rmlB(upec138)<400>1gtgaagatacttgttactggtggcgcaggatttattggttctgctgttgttcgtcacata60ataaataatacgcaagatagtgttgttaatgtcgataaattaacatacgccggaaacctg120gaatcacttgcagatgtttctgattctgaacgctatttctttgaacatgcggatatttgt180gatgcagctgcaatggcacggatttttgctcagcatcagccggatgcagtgatgcacctg240gcagctgaaagccatgttgaccgttcaattacaggccctgcggcatttattgaaaccaat300attgtgggtacttatgtccttttagaagcggctcggaattattggtctggtctggatgat360gaaaagaaaaaaaacttccgttttcatcatatttctactgatgaggtgtatggtgactta420ccccatccggatgaagtaaatagcaatgaaacgttgccgctatttacggaaacgacagca480tacgcgccaagtagtccatattctgcttctaaagcttccagcgatcatttggttcgcgca540tggaaacgtacttatggtttaccgaccattgtgactaattgctcgaacaactatggtcct600tatcatttcccggaaaagcttattccactggttattcttaattcactggaaggtaaggca660ttacctatttatggcaaaggagatcagatccgcgactggttgtatgtagaggatcatgct720cgagcgttatataccgtcgtaaccgaaggtaaagcgggcgaaacttataacattggtgga780cacaacgaaaagaaaaacatcgacgtagtgttcactatttgtgatttgttggatgagata840gtcccgaaagagaaatcttaccgcgagcaaattacttatgttaccgatcgtccgggacac900gatcgccgttatgcgattgatgctgagaagattggtcgcgaattgggatggaaaccacag960gaaacgtttgagagtgggattcgtaaaacggtggaatggtacctgtccaatacaaaatgg1020gttgataatgtgaaaagtggtgcctatcaatcgtggattgaacagaactatgagggccgc1080cagtaa1086<210>2<211>900<212>DNA<213>大腸桿菌<220><223>rmlD(upec138)<400>2atgaatatcctcctttttggcaaaacagggcaggtaggttgggaactacagcgtgctctg60gcacctctgggtaatttgattgctcttgatgttcactccactgattactgtggtgatttt120agtaatcctgaaggtgtagctgaaaccgtaagaagcattcggcctgatattattgtcaac180gcagccgctcacaccgcagtagacaaagcagaatcagaaccgaagtttgcacaattactg240aacgcgacgagtgtcgaagcgatcgcgaaagcagccaatgaagtcggcgcctgggttatt300cactactctactgactacgtatttccggggaccggtgaaataccatggcaggaggaggat360gcaaccgcaccgctaaatgtttacggtgaaaccaagttagcgggagaaaaagcattacaa420gagcattgtgcgaagcaccttattttccggaccagctgggtctatgcaggtaaaggaaat480aacttcgccaaaacaatgttgcgtctggcaaaagagcgtgaagaattagccgttattaat540gatcagtttggtgcgccaactggcgcagagttactggctgattgtacggcacatgctatt600cgtgtggcactgaataaaccggaagtcgcaggcttgtaccatctggtagctagtggtacc660acaacgtggcacgattatgctgcgctggtttttgaagaggcgcgcaaagcaggcattccc720cttgcactcaacaagctcaacgcagtaccaacaacagcctatcctacaccagctcgtcgt780ccacataactctcgccttaatacagaaaaatttcagcagaactttgcgcttgtcttgcct840gactggcaggttggcgtgaaacgaatgcttaacgaattatttacgactacagcaatttaa900<210>3<211>879<212>DNA<213>大腸桿菌<220><223>rmlA(upec138)<400>3atgaaaacgcgtaaaggtattattttggcgggtggttctggtactcgtctttatcctgtg60acgatggccgtcagtaaacagctgttaccgatttatgataaaccgatgatctattacccg120ctctctacactgatgttagcgggtattcgcgatattctgattatcagtacaccacaggat180actcctcgttttcaacaactgctgggtgacgggagccagtggggcctgaatcttcagtac240aaagtgcaaccgagtccggatggtcttgcgcaggcgtttattatcggtgaagagtttatt300ggtggtgatgattgtgctttggtacttggtgataatatcttctacggccacgacctgccg360aagttaatggacgtagctgttaacaaagaaagtggtgcaacggtatttgcctatcacgtt420aatgatcctgaacgttatggtgtcgtggagtttgataataacggtactgcaattagcctg480gaagaaaaaccgctggaaccaaaaagtaactatgcggttactgggctttatttctatgac540aatgacgttgtggaaatggcgaaaaaccttaagccttctgcccgaggtgaactggaaatt600accgatattaaccgtatttatatggaacaaggacgtttgtctgtcgctatgatggggcgt660ggctatgcatggctggatacagggacgcatcaaagtcttattgaagcaagcaacttcatt720gccaccattgaagagcgccagggactaaaggtttcctgtccggaagaaattgcttatcgt780aaagggtttattgatgctgagcaggtaaaagtattagccgaaccgttgaagaaaaatgct840tatggtcagtatctgctcaaaatgattaaaggttattaa879<210>4<211>543<212>DNA<213>大腸桿菌<220><223>rmlC(upec138)<400>4atgaacgtaattaaaactgaaattcctgatgtgctgatttttgaaccaaaagtttttggg60gatgaacgtggcttcttttttgagagttttaatcagaggatttttgaagaagcagtaggt120cgtaaggttgagtttgttcaggataaccattctaagtccagtaaaggtgttttacgtggt180cttcattatcagttagaaccttatgctcaaggaaaactggtgcgctgtgttgttggcgag240gtttttgatgttgcggttgatattcgtaaatcgtcacctacatttgggaaatgggttggg300gtgaatttgtctgctgagaataagcgtcagttgtggattcctgagggatttgcacatggt360tttttggtgctgagtgatttagcagaagttttatataaaacgaatcaatattatgctcca420tcacatgaaaaaaatattatatggaatgacctcttgcttaatattaaatggccgagcaca480gcactgatcactctgtctgataaggatgcaaatggggaaagatttgaactaagtgagttt540tga543<210>5<211>1260<212>DNA<213>大腸桿菌<220><223>wzx(upec138)<400>5atgtctctcttaaaacatagtatatggaatgttgcgggctactttataccaacattaatt60gcaattcccgcctttggattaattgcgaggaaaattggtgtagaactatttggtttgtat120acgttagcaatgatttttatagggtatgcaagtatatttgatgctgggttaacaagagct180gttgtgcgtgaaatagcattactaaaaaacagagtggacgattgtaatacgataatagta240acttctattatcgctgtgatatttttagggtttatcggaggcgggggagtgtttctgctt300aaaggcgatattattgaactgttaaatatct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