本發(fā)明涉及一種孔雀草總酚酸提取物及其在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
孔雀草(tagetespatulal.)又名紅黃草、藤菊、法國萬壽菊、小萬壽菊，為菊科萬壽菊屬植物，為一年生草本，花期為7月～9月。我國各地均有栽培，是一種常見的觀賞花卉?？兹覆萦兴幱煤捅＝∽饔?，其根、花和莖葉均可以入藥。具有清熱解毒，利濕，止咳和止痛作用。主治風(fēng)熱感冒，咳嗽，百日咳，痢疾，肋腺炎，乳癰，癤腫，牙痛，口腔炎和目赤腫痛。(《全國中草藥匯編》編寫組，全國中草藥匯編[m]；人民衛(wèi)生出版社，1975年版)。
從20世紀(jì)80年代開始，人們即開始對孔雀草的化學(xué)成分進(jìn)行研究，分離得到萬壽菊素(patuletin)，槲皮萬壽菊素(quercetagetin)，槲皮萬壽菊甙(quercetagitrin)等黃酮類化合物(國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會；中華本草[m]；上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999年版)。目前人們多對孔雀草花卉進(jìn)行研究，藥用價值研究較少。
近年來，我們對孔雀草的化學(xué)成分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其含有較高含量的咖啡酸、綠原酸和3，5-二咖啡?；鼘幩岬瘸煞帧?/p>
由于環(huán)境污染等原因，癌癥目前已成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，已成為我國死亡率最高的疾病之一。我國抗癌臨床實踐表明西藥由于毒副作用較大，不利于長期使用，而中藥由于其毒副作用較低，較適合長期服用，已成為抗癌藥物的主力軍。
為了更好地開發(fā)和利用孔雀草資源，有必要對孔雀草進(jìn)行抗癌作用研究。我們研究表明除黃酮類化合物外，一些苯丙素類成分也具有較強(qiáng)活性。因這些物質(zhì)都含有酚羥基，呈酸性，而統(tǒng)稱為總酚酸類物質(zhì)。我們的試驗結(jié)果表明總酚酸的抗癌活性較強(qiáng)，強(qiáng)于分離得到的單體化合物。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種孔雀草總酚酸提取物、制備方法及其在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的孔雀草總酚酸提取物，按照下述(1)或(2)中的方法制備：
(1)用乙醇水溶液對孔雀草進(jìn)行提取至少一次得提取液；濃縮所述提取液得濃縮液；所述濃縮液經(jīng)正丁醇萃取后得萃取液，即為所述孔雀草總酚酸提取物；
(2)用乙醇水溶液對孔雀草進(jìn)行提取至少一次得提取液；濃縮所述提取液得濃縮液；所述濃縮液用大孔吸附樹脂分離，洗脫劑依次為水、體積百分含量為30％-70％乙醇水溶液和體積百分含量為95％乙醇水溶液洗脫；收集30％-70％乙醇水溶液的洗脫液即為所述孔雀草總酚酸提取物；所述大孔吸附樹脂為hpd100、hpd300和hpd700大孔吸附樹脂中任一種。
上述的孔雀草為全草，包括根、莖葉和花，提取前應(yīng)洗凈、干燥、粉碎成5mm左右的粉末，以利于提取。
上述的提取物中，(1)中所述乙醇水溶液中乙醇的體積百分含量可為0％-95％，優(yōu)選60％；(1)和(2)中所述提取可為回流提取；(1)和(2)中所述提取可為2次；(1)和(2)中所述提取的時間可為0.5小時-2小時，優(yōu)選1小時。
上述的提取物中，(1)和(2)中所述濃縮液與所述提取液的體積份數(shù)比可為1∶(10-20)，最佳比例為1∶10。
上述的提取物中，(1)和(2)中還可包括用石油醚對所述濃縮液進(jìn)行脫脂的步驟；所述石油醚與所述濃縮液的體積份數(shù)比可為1∶(1-2)，優(yōu)選1∶2。
上述的提取物中，(1)中所述正丁醇與所述濃縮液的體積份數(shù)比可為1∶(1-3)，優(yōu)選1∶2，所述正丁醇萃取可為1-4次，優(yōu)選3次。
上述的提取物中，(1)中還可包括將所述萃取液進(jìn)行濃縮和干燥的步驟；(2)中還可包括將所述洗脫液進(jìn)行濃縮和干燥的步驟。
上述提取物中有綠原酸、咖啡酸、槲皮素和萬壽菊素等酚酸類成分。
本發(fā)明還提供了上述提取物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用；具體可為在抗胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌和肝癌/或腫瘤藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的孔雀草總酚酸提取物的抗癌活性大于其中的主要單體成分(如綠原酸、槲皮素等)。由于酚酸具有較強(qiáng)的抗氧化和免疫增強(qiáng)作用，本發(fā)明提取物中的總酚酸將在多種機(jī)制上發(fā)揮其抗癌作用。
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
實施例1、孔雀草總酚酸提取物的制備
將粉碎至5mm左右的的孔雀草全草(含根)粉末1kg，用乙醇的體積百分含量為60％的乙醇水溶液回流提取2次，每次用10倍藥材體積量的上述乙醇水溶液回流提取2小時，合并提取液；回收乙醇水溶液，濃縮得濃縮液，濃縮液與回收的乙醇水溶液的體積份數(shù)比為1∶10；先用石油醚對上述濃縮液進(jìn)行脫脂，其中，石油醚與濃縮液的體積份數(shù)比為1∶2；然后經(jīng)水飽和的等量體積的正丁醇萃取三次(正丁醇與濃縮液的體積份數(shù)比為1∶2)，合并萃取液，減壓濃縮回收正丁醇得到浸膏；將上述浸膏經(jīng)減壓干燥得孔雀草總酚酸提取物108.5g。測得總酚酸為56.4g，在浸膏中重量百分比為52.0％。
采用比色法對上述孔雀草總酚酸提取物的總酚酸進(jìn)行含量測定，測定方法采用下述文獻(xiàn)報道的比色法對總酚酸的含量進(jìn)行測定：石玉媛，何凡，李瑩瑩，竇德強(qiáng)，康廷國，董鋒.不同產(chǎn)地亞貢葉中總酚酸的含量測定.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28(7)：1475-1477。該方法的簡要操作過程如下：精密稱取一定量的總酚酸提取物，制備樣品溶液。精密量取1ml供試品溶液，于25ml量瓶中，加甲醇5ml，加0.3％十二烷基硫酸鈉2ml后，然后加0.6％fecl3.6h2o∶0.9％k3[fe(cn)6](1∶1，體積比)混合溶液2ml，在暗處放置5min，加0.1mol/lhcl溶液至刻度，在暗處放置20min，以顯色劑為空白，以綠原酸為對品，在746nm處測定吸光度。
實施例2、孔雀草總酚酸提取物的制備
將目數(shù)為20目的孔雀草粉末1kg，乙醇的體積百分含量為60％的乙醇水溶液回流提取2次，每次用10倍體積量的上述60％乙醇水溶液提取2小時，合并提取液；回收乙醇溶液，濃縮得濃縮液，濃縮液與回收的乙醇水溶液的體積份數(shù)比為1∶10；先用石油醚對上述濃縮液進(jìn)行脫脂得脫脂液，其中，石油醚與濃縮液的體積份數(shù)比為1∶2；脫脂液經(jīng)已預(yù)先處理過的hpd700大孔吸附樹脂柱，依次用水、60％的乙醇水溶液和95％的乙醇水溶液進(jìn)行洗脫，60％的乙醇水溶液洗脫液減壓回收乙醇，干燥得總酚酸提取物97.2g，測得總酚酸為56.3g，占所述干燥后的總酚酸提取物的重量百分比為57.9％。
實施例3、孔雀草總酚酸提取物的體外抗癌活性研究
1、孔雀草抗癌活性部位及活性成分的確定。
抗癌活性研究采用體外試驗，試驗中采用的人肝癌細(xì)胞hepg-2、胃癌細(xì)胞bgc823和乳腺癌細(xì)胞mda-mb-435s均購自于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞生物學(xué)研究所，5-氟尿嘧啶(5-fu，美國amresco公司)。
活性成分：對實施例1中的石油醚層提取物、正丁醇層提取物和水層提取物(為正丁醇萃取后剩下的提取物)、實施例2制備的孔雀草總酚酸提取物以及槲皮素、萬壽菊素和綠原酸進(jìn)行體外抗癌活性研究。
2、抗癌活性評價方法：
(1)試驗用主要試劑：rmpi1640培養(yǎng)基(美國gibco公司)；胎牛血清(美國hyclone公司)；胰酶(美國sigma公司)；噻唑藍(lán)(mtt，美國sigma公司)；臺盼藍(lán)(寶泰克生物科技公司)；二甲基亞砜(dmso，美國amresco公司)；annexinv-fitc凋亡檢測試劑盒(北京寶賽生物技術(shù)有限公司)。
(2)試驗用主要儀器：日本sanyoco2培養(yǎng)箱、日本olympus倒置顯微鏡ckx31、haier藥品保存箱，酶標(biāo)儀。
(3)mtt檢測
待細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，貼壁細(xì)胞用0.25％的胰酶消化液消化約5min，加入10％胎牛血清rmpi1640培養(yǎng)基終止消化，吹打成細(xì)胞懸液，移入15ml離心管，1000轉(zhuǎn)/min，離心5min(懸浮生長細(xì)胞無需消化，直接將細(xì)胞懸液移入15ml離心管，1000轉(zhuǎn)，離心5min)棄上清，加入10％胎牛血清dmem培養(yǎng)基，吹打混勻，制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5.0×104個/ml，將上述細(xì)胞懸液鋪于96孔板中，每孔200μl，每組設(shè)3個孔；另留3個孔，各加入10％胎牛血清rmpi1640培養(yǎng)基200μl作為空白對照孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，實驗組各組加入不同濃度的受試藥物2ul，陰性對照組加入dmso2μl，陽性對照組加入對應(yīng)的陽性藥物2ul；繼續(xù)培養(yǎng)24h，結(jié)束培養(yǎng)前4h取出培養(yǎng)板，每孔加入6mg/ml的mtt15ul(避光)，繼續(xù)培養(yǎng)，結(jié)束后，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入dmso200μl，震蕩搖勻，在酶標(biāo)儀上以570nm的波長測定吸光度值。重復(fù)3次。計算生長抑制率，繪制量效曲線。
(4)數(shù)據(jù)處理：細(xì)胞生長抑制率計算公式
量效曲線繪制：取各組n(n≥3)次試驗刺激指數(shù)的平均值
(5)結(jié)果：結(jié)果如下表1和表2所示，表明黃酮類成分和木脂素類成分都是抗癌活性成分，并且木脂素類成分活性較強(qiáng)。
表1不同提取物為10μg/ml的癌細(xì)胞增殖抑制率(％)
表2單體化合物抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用的ic50研究結(jié)果(μg/ml)
實施例4、孔雀草總酚酸提取物的體內(nèi)抗癌活性研究
用實施例2制備的孔雀草總酚酸提取物對活性部位進(jìn)一步采用s-180小鼠實驗?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行了抗癌藥效試驗。
1、供試品溶液的制備：按照實施例2制備所得孔雀草總酚酸提取物。
2、陽性對照藥物：5-氟尿嘧啶(購自sigma公司，f6627-1g)，其配制方法為：50℃水浴助溶，加滅菌蒸餾水至濃度即為4mg/ml。
3、試驗動物：6-8周齡健康昆明系小鼠，體重20～25g，雌性，由大連醫(yī)科大學(xué)動物室提供。清潔級環(huán)境下進(jìn)行飼養(yǎng)及試驗操作，試驗動物不限食水。試驗室溫度20～25℃，相對濕度40～70％，晝夜明暗交替時間12h/12h(執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)試驗動物環(huán)境及設(shè)施(gb14925-2001)。
4、試驗用主要試劑：rpmi-1640培養(yǎng)液、生理鹽水等。
5、小鼠s180肉瘤細(xì)胞的培養(yǎng)和制備：取小鼠s180肉瘤細(xì)胞，應(yīng)用rpmi-1640培養(yǎng)基在37℃恒溫條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用0.25％胰酶消化，制成細(xì)胞濃度為1×106個/ml的細(xì)胞懸液，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為0.2％的臺盼藍(lán)染色，細(xì)胞存活率＞95％。
6、s180皮下移植瘤小鼠模型的建立：小鼠腹腔接種s180肉瘤細(xì)胞一周后，無菌條件下抽取小鼠腹水(乳白色)中的s180細(xì)胞，用無菌生理鹽水按體積比1∶4的比例進(jìn)行稀釋，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個/ml的瘤細(xì)胞懸液，于小鼠右前肢腋下行無菌皮下接種，按常規(guī)每只小鼠接種0.2ml細(xì)胞懸液，細(xì)胞總數(shù)為2×106個，以制備s180皮下移植瘤小鼠模型。
7、試驗動物分組及處理：于接種當(dāng)天將s180皮下移植瘤小鼠分為5組，每組8只。分別為：模型組、陽性對照組、孔雀草總酚酸提取物高、中、低劑量組。模型組接種后第二天開始給予相同劑量0.5％cmc溶液，陽性對照組于接種第二天灌胃給予40mg/kg的5-氟尿嘧啶。實驗組于接種第二天開始分別灌胃給予30、60、120mg/kg孔雀草提取物。
8、s180皮下移植瘤小鼠瘤體積、瘤重及瘤重抑瘤率的計算方法：停藥次日處死小鼠，分別取出腫瘤瘤體，剝離干凈后，以濾紙拭凈血污，用游標(biāo)卡尺測量各組腫瘤體積，腫瘤體積公式為：v＝1/2×a×b2(a：長徑，b：短徑)。電子天平稱取瘤重，計算腫瘤瘤重生長抑制率(瘤重抑瘤率)，抑瘤率(％)＝(1-治療組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100％。
9、統(tǒng)計分析與結(jié)果評價：試驗數(shù)據(jù)采用spss16.0統(tǒng)計分析軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，組間比較采用單因素方差分析(one-wayanova)，兩兩比較采用student-newman-keuls法；設(shè)定α＝0.05為檢驗水準(zhǔn)，p＞0.05差異無顯著性，p＜0.05差異具有顯著性。比較各組間腫瘤體積、相對腫瘤體積和相對腫瘤增值率，分析評價牛蒡苷元及牛蒡苷抑制腫瘤生長作用及量效關(guān)系。
10、結(jié)果：由表3可見，與模型組比，各組小鼠的體重增長速度未見明顯的差異；除低劑量組外，5-氟尿嘧啶陽性對照組、孔雀草提取物的中、高劑量組對s180皮下移植瘤小鼠的平均瘤體積、瘤重有明顯的抑制作用，顯示出較高的瘤重抑瘤率(p＜0.05或p＜0.01)，且提取物對s180皮下移植瘤小鼠的平均瘤體積、瘤重的抑制作用顯示出一定的劑量依賴關(guān)系；孔雀草提取物高劑量組對s180皮下移植瘤小鼠的瘤重抑瘤率略高于5-氟尿嘧啶陽性對照組，但無顯著性差異；提取物低劑量組盡管對s180皮下移植瘤小鼠的平均瘤體積、瘤重的抑制作用無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)，但從數(shù)值上看，提取物中、高劑量組比對移植瘤小鼠的瘤重抑瘤率影響差異不顯著。
表3牛蒡苷元及牛蒡苷對s180皮下移植瘤小鼠抑瘤率的影響
注：與模型組比：*p＜0.05，**p＜0.01方法與結(jié)果。
實施例5、孔雀草總酚酸抗癌制劑的研究
1、儀器和試劑：儀器有tdp-5t單沖壓片機(jī)(上海冠聯(lián)制藥裝備有限公司)；fa-1004型電子天平(上海精科天平廠)；水浴鍋(鞏義市予化儀器有限責(zé)任公司)；dhg-9146a型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。試驗中所用試劑均為分析純，購于禹王試劑公司。
2、片劑制備：按照實施例2所得孔雀草總酚酸提取物2g，cms-na1g，乳糖和淀粉(1∶2，質(zhì)量比)17g共計20g，用60％乙醇制軟材，以捏之成團(tuán)，搓之即散做為成型標(biāo)準(zhǔn)，將制好的顆粒于60℃烘干，10目篩整粒，備用；
將制好的顆粒按照稱重好的質(zhì)量加入0.5％的硬脂酸鎂，以不同規(guī)格的壓片機(jī)壓片，分別制備片重為400毫克/片、200毫克/片和100毫克/片的片劑，壓力在16～18kg/片。片劑中每400毫克含提取物40毫克。結(jié)合癥狀，每次2-3片(400毫克片)，每日3次。
3、膠囊劑的制備若以上述制備好的顆粒采用膠囊機(jī)裝膠囊，可制備400毫克/囊的膠囊劑。結(jié)合癥狀，每次2-3片，每日3次。
4、口服液的制備：以上述孔雀草總酚酸提取物20克，加水300毫升溶解，加橙皮苷4毫升，加單糖漿至1000毫升得糖漿劑。結(jié)合癥狀，每次6毫升，每日3次。