本發(fā)明涉及一種植物藥及其應(yīng)用，具體是以孔雀草總黃酮為活性成分的藥物提取物及其在制備抗前列腺炎藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：孔雀草孔雀草(tagetespatulal.)又名紅黃草、藤菊、法國萬壽菊、小萬壽菊，為菊科萬壽菊屬植物，為一年生草本，花期為7月～9月。我國各地均有栽培，是一種常見的觀賞花卉?？兹覆萦兴幱煤捅＝∽饔?，花葉可以入藥，有清熱化痰、補血通經(jīng)的功效。能治療百日咳、氣管炎、感冒等。從20世紀80年代開始，人們即開始對孔雀草的化學(xué)成分進行研究，分離得到萬壽菊素(patuletin)，槲皮萬壽菊素(quercetagetin)，槲皮萬壽菊甙(quercetagitrin)等黃酮類化合物(國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會；中華本草[m]；上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999年版)。目前人們多對孔雀草花卉進行研究，藥用價值研究較少。非細菌性前列腺炎為泌尿外科常見疾病。據(jù)報道，50％的男性一生中會罹患此病。由于此病發(fā)病率逐年升高，發(fā)病誘因復(fù)雜多樣，發(fā)病機制尚未完全明了。其病理改變主要是炎細胞浸潤，纖維組織增生，腺體萎縮、消失，導(dǎo)致前列腺腺管排泄不暢，炎性分泌液儲留，前列腺分泌功能下降(luzziga.chronicprostatitisandchronicpelvicpaininmen：aetiology，diagnosisandmanagement.journalofeuropeanacademydermatolandvenereol2002，16(3)：253-256)。慢性前列腺炎的病因和發(fā)病機制目前尚不完全清楚，許多問題還存在著廣泛的爭議，中西醫(yī)尚缺乏有效藥物治療。我們在對孔雀草進行抗前列腺炎有效成分篩選過程中驚喜地發(fā)現(xiàn)孔雀草總黃酮具有較好的抗前列腺炎的藥理作用?？兹覆葜锌傸S酮含量40％以上(遲玉新，竇德強.楮實子與構(gòu)樹葉中總黃酮含量測定.中國現(xiàn)代中藥，2008年第10卷第11期)，經(jīng)過醇提取，聚酰胺純化的方法可以對孔雀草總黃酮進行純化制備，使其適合開發(fā)成為抗前列腺炎的藥物。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種孔雀草總黃酮提取物用于制備抗前列腺炎藥物中的新用途。為實現(xiàn)上述目的而采用的技術(shù)方案如下：1.建立制備孔雀草總黃酮提取物的方法(1)用30-95％乙醇水(體積比)溶液對孔雀草全草(包括根及地上部分，粉碎成10目粉末)進行浸漬提取，每次溶劑用量為藥材質(zhì)量的10倍量，40℃溫浸12小時，浸提2次。合并提取液后經(jīng)濃縮得到濃縮液(約為藥材質(zhì)量的1倍量)；(2)上述濃縮液用1/2濃縮液體積的石油醚萃取三次脫脂，得到脫脂濃縮液；(3)上述脫脂濃縮液進一步經(jīng)聚酰胺分離(樹脂用量為孔雀草用量的1/3倍)，先用水洗(5倍樹脂體積)，再用60％乙醇水溶液洗脫，得到60％乙醇水洗脫液，經(jīng)減壓回收乙醇，干燥得孔雀草總黃酮提取物。2.孔雀草總黃酮用于抗前列腺炎的研究上述孔雀草總黃酮提取物用于抗前列腺藥物的藥理試驗研究。附圖說明圖1是槲皮素的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖。具體實施方式本發(fā)明中，采用下述文獻報道的比色法對總黃酮含量進行測定：遲玉新，竇德強.楮實子與構(gòu)樹葉中總黃酮的含量測定.中國現(xiàn)代中藥2008，10(11)：16-17。該方法的簡要操作過程如下：精密稱取一定量的總黃酮提取物，制備樣品溶液。加al(no3)3/nano2試液顯色，以式i所示槲皮素為對照品，于505nm處進行比色測定。根據(jù)測定的吸光度值，即可計算得到孔雀草中總黃酮的含量。(式i)實施例1制備孔雀草總黃酮溶劑提取法和樹脂吸附法制備孔雀草總黃酮：將目數(shù)為10目的孔雀草粉末1kg，乙醇的體積百分含量為80％的乙醇水溶液浸漬提取2次，每次溶劑用量為藥材質(zhì)量的10倍量，每次40℃溫浸12小時。合并提取液，回收乙醇溶液，濃縮至約為藥材質(zhì)量的1倍量(約1升)，經(jīng)每次500毫升石油醚萃取3次后，得脫脂溶液。脫脂溶液經(jīng)已預(yù)先處理過的聚酰胺柱(中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司，約500克)，依次用水(1000毫升)、60％的乙醇水溶液進行洗脫(2000毫升)，60％的乙醇洗脫液減壓回收乙醇，減壓干燥得總黃酮提取物90.1g，測得總黃酮為39.2g，占所述干燥后的總黃酮提取物的重量百分比為43.5％，占孔雀草原料藥材總重的百分比即收率為3.92％。實驗例2孔雀草總黃酮的抗前列腺炎作用研究(一)對角叉菜膠致大鼠急性前列腺炎作用1.實驗材料sd大鼠，清潔級，雄性，350～400g，購于購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，[合格證號：scxk(遼)2010-0001]?？兹覆菘傸S酮是按照實驗例1方法自制。角叉菜膠購自sigma公司。舍尼通(snt)購自南京美瑞制藥有限公司。2.動物分組將50只sd大鼠隨機分為5組：空白組、模型組、陽性藥組(舍尼通)和孔雀草總黃酮高、低劑量組，每組10只。3.造模及給藥方法按體重預(yù)先連續(xù)灌胃給藥7d，每天給藥一次，空白組和模型組給予等量生理鹽水。第6天給藥后30min，將大鼠麻醉，下腹部正中切口，暴露前列腺，在前列腺側(cè)葉上的精液囊注入0.1％無菌角叉菜膠生理鹽水溶液，然后縫合腹壁。24h后稱重，處死大鼠，剖取前列腺稱濕重，計算前列腺指數(shù)；取前列腺按摩液10μl放入白細胞稀釋液中，光學(xué)顯微鏡下觀察，計數(shù)白細胞總數(shù)(wbc)；另取一滴前列腺液涂片，鏡下觀察卵磷脂小體密度，評分標準為：卵磷脂小體滿視野(+++)為4分，1/2視野(++)為3分，1/4視野(+)為2分，低倍鏡下僅見數(shù)個為1分。4.統(tǒng)計學(xué)處理采用spss統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差多組間比較采用單因素方差分析，p＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。5.實驗結(jié)果孔雀草總黃酮60mg/kg劑量組與模型組比較，光學(xué)顯微鏡下見腺腔內(nèi)炎癥細胞浸潤程度明顯減輕，前列腺液中卵磷脂小體密度明顯增加，提示孔雀草總黃酮具有良好的控制前列腺急性炎癥的作用(表1)。表1孔雀草總黃酮對交叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠急性前列腺炎的影響注：△與空白組比較有差異(p＜0.05)，△△與空白組比較有顯著差異(p＜0.01)；*與模型組比較，有差異(p＜0.05)，**與模型組比較，有顯著差異(p＜0.01)。(二)消痔靈致大鼠慢性前列腺炎1.實驗材料sd大鼠，清潔級，雄性，350～400g，購于購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，[合格證號：scxk(遼)2010-0001]?？兹覆菘傸S酮是按照實驗例1方法自制。消痔靈注射液購自北京雙鶴高科天然藥物有限責(zé)任公司。舍尼通(snt)購自南京美瑞制藥有限公司。2.動物分組將50只sd大鼠隨機分為5組：空白組、模型組、陽性藥組(舍尼通)和孔雀草總黃酮高、低劑量組，每組10只。3.造模及給藥方法將大鼠麻醉后剪除下腹部被毛，在無菌條件下腹部切口深入腹腔，暴露前列腺，以25％消痔靈注射液注射至兩個前列腺側(cè)葉，縫合腹壁。術(shù)后第7天將大鼠隨機分成5組，即空白組、模型組、陽性藥組、總黃酮低劑量組和總黃酮高劑量組。按體重連續(xù)灌胃給藥30d，每天給藥一次，空白組和模型組給予等量生理鹽水。末次給藥后稱重，處死大鼠，剖取前列腺組織，肉眼觀察前列腺病變狀態(tài)并稱濕重，計算前列腺指數(shù)；取前列腺按摩液10μl放入白細胞稀釋液中，光學(xué)顯微鏡下觀察，計數(shù)白細胞總數(shù)；另取一滴前列腺液涂片，鏡下觀察卵磷脂小體密度，評分標準同(一)。4.統(tǒng)計學(xué)處理采用spss統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差多組間比較采用單因素方差分析，p＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。5.實驗結(jié)果肉眼所見前列腺組織外觀：空白組大鼠前列腺組織柔軟、有光澤，與周圍組織無粘連；模型組大鼠前列腺腺體普遍與周圍組織粘連，腺體呈暗紅色或棕黃色，質(zhì)硬，有明顯的硬結(jié)，并有水腫；舍尼通治療組前列腺腺體與周圍組織粘連較輕，部分腺體質(zhì)硬，有結(jié)節(jié)，色棕黃；總黃酮低、高劑量組前列腺腺體與周圍組織粘連輕，硬結(jié)小，部分腺體呈棕黃色，有輕度水腫，個別腺體柔軟、紅潤、有光澤，外觀與正常前列腺組織相似?？寡字笜说臏y定結(jié)果表明，模型組與空白組比較，前列腺液中白細胞計數(shù)(wbc)增加、卵磷脂小體密度減少，呈現(xiàn)慢性前列腺炎的病理變化，說明明造模成功?？傸S酮各劑量組與模型組比較，wbc減少、卵磷脂小體密度增加，表明該藥對消痔靈誘導(dǎo)的慢性前列腺炎有一定的抗炎作用(表2)。表2孔雀草總黃酮對小指令誘導(dǎo)的大鼠慢性前列腺炎的影響組別劑量(mg/kg)前列腺指數(shù)(g/kg)卵磷脂密度wbc(×106個/ml)空白組--0.23±0.044.5±0.710.1±1.6模型組--0.26±0.041.8±0.8△△32.2±8.3△△舍尼通組400.27±0.032.8±0.7**15.2±2.9**總黃酮組600.25±0.032.5±0.8*17.1±4.5**總黃酮組1200.25±0.043.4±0.8**17.3±5.8**注：△與空白組比較有差異(p＜0.05)，△△與空白組比較有顯著差異(p＜0.01)；*與模型組比較，有差異(p＜0.05)，**與模型組比較，有顯著差異(p＜0.01)。(三)巴豆油致小鼠耳腫脹影響1.實驗材料km小鼠，清潔級，雄性，體重18～22g，購于購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，[合格證號：scxk(遼)2010-0001]?？兹覆菘傸S酮是按照實驗例1方法自制。阿司匹林(aspirin)購自江蘇恩華藥業(yè)集團有限公司。舍尼通(snt)購自南京美瑞制藥有限公司。2.動物分組將50只km小鼠隨機分為5組模型組、阿司匹林組、舍尼通組和孔雀草總黃酮高、低劑量組，每組10只。3.造模及給藥方法km小鼠每天給藥1次，連續(xù)7天，模型組給予等量的生理鹽水，末次藥后30分鐘，小鼠右耳涂二甲苯0.05ml/只，至炎1h后將小鼠處死，沿耳廓剪下左、右兩耳片，用8mm打孔器分別在同一部位打下圓耳片，稱重，以左右耳片重量之差，作為腫脹度，計算抑制率，并與對照組比較，判斷療效。腫脹度(mg)＝致炎右耳重量(mg)-未致炎左耳重量(mg)4.統(tǒng)計學(xué)處理采用spss統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差，多組間比較采用單因素方差分析，p＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。5.實驗結(jié)果結(jié)果表明總黃酮高、中劑量組與空白組比較，對巴豆油導(dǎo)致的炎癥有明顯的抑制作用。表3孔雀草總黃酮對巴豆油致耳腫脹影響組別劑量(mg/kg)腫脹度(mg)腫脹抑制率(％)模型組--12.9±3.57--舍尼通組4011.9±2.657.8阿司匹林組2007.82±4.10*39.4總黃酮組609.18±5.2828.8總黃酮組1208.16±4.10*36.7注：*與模型組比較，有差異(p＜0.05)(四)水負荷大鼠排尿量影響1.實驗材料sd大鼠，清潔級，雄性，180～220g，購于購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，[合格證號：scxk(遼)2010-0001]。孔雀草總黃酮是按照實驗例1方法自制。氫氯噻嗪片：天津立生制藥有限公司。2.模型制作實驗前，禁食不禁水24h。每組均按40ml/kg生理鹽水灌胃，形成鹽水負荷模型。3.實驗動物的篩選采用aston方法對大鼠進行篩選，即將大鼠置于代謝籠中適應(yīng)3d，禁食不禁水18h后，灌胃給予去離子水25ml/kg，收集2h尿液，排尿質(zhì)量大于灌胃質(zhì)量40％的大鼠，即為合格。4.分組及給藥取篩選合格大鼠，按尿量+體重均勻分組，40只大鼠隨機分為4組，每組10只，分別為正常組、陽性藥組和總黃酮低、高劑量組.5.實驗方法各組大鼠灌胃給藥6天，每天1次。正常組每天給予等量的生理鹽水。于末次給藥后禁食不禁水18小時。然后灌胃生理鹽水，形成鹽水負荷模型。20min后，各組大鼠按規(guī)定的劑量口服給藥，對照組給予同體積的水。給藥后，將大鼠置代謝籠內(nèi)，禁食禁水，每隔1個小時收集每只動物的尿液1次，收集并記錄給藥后6個小時內(nèi)的尿量。6.統(tǒng)計學(xué)處理采用spss統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(±s)，多組間比較采用單因素方差分析，p＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。7.研究結(jié)果研究結(jié)果表明孔雀草總黃酮低、高劑量組都具有一定的利尿作用。表4孔雀草總黃酮對消化道水負荷大鼠尿量的影響注：*表示與空白組相比p＜0.05；**表示與空白組相比p＜0.01上述僅為本發(fā)明的具體實施例，但本發(fā)明的設(shè)計構(gòu)思并不局限于此，凡利用此構(gòu)思對本發(fā)明進行非實質(zhì)性的改動，均應(yīng)屬于侵犯本發(fā)明保護范圍的行為。當前第1頁12