本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及8-丙二酸二乙酯小檗堿的新用途。本發(fā)明還涉及相應(yīng)的藥物組合物及其應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
腫瘤是機(jī)體在各種致癌因素作用下，局部組織的某一個(gè)細(xì)胞在基因水平上失去對其生長的正常調(diào)控，導(dǎo)致其克隆性異常增生而形成的異常病變。我國的腫瘤病例數(shù)相當(dāng)龐大，有資料顯示占全世界病例數(shù)的55%。
良性腫瘤對機(jī)體的影響較小，主要表現(xiàn)為局部壓迫和阻塞癥狀。惡性腫瘤由于分化不成熟、生長較快，浸潤破壞器官的結(jié)構(gòu)和功能，并可發(fā)生轉(zhuǎn)移，因而對機(jī)體影響嚴(yán)重。惡性腫瘤除可引起與上述良性腫瘤相似的局部壓迫和阻塞癥狀外，還可有發(fā)熱、頑固性疼痛，晚期可出現(xiàn)嚴(yán)重消瘦、乏力、貧血和全身衰竭的狀態(tài)。
中醫(yī)認(rèn)為，癌癥的起因首先是人體內(nèi)陰陽平衡，組織細(xì)胞在不同的致癌因素長期作用下，細(xì)胞突變而引起的。其實(shí)癌組織也是人體的一部分，只有在人本陰陽平衡失調(diào)，五行生克乘侮發(fā)生變化的前提下，人體的免疫監(jiān)控系統(tǒng)才會對其失去監(jiān)控，任其發(fā)展。中草藥能夠以調(diào)理氣血、調(diào)整陰陽平衡、維持正常生命體征而保命；以培補(bǔ)正氣、產(chǎn)生抗體，清理"毒源"而治本。因而，中草藥提取物成為治療腫瘤一個(gè)重要方向。
8-丙二酸二乙酯小檗堿是天然產(chǎn)物，生物利用度高、性質(zhì)比較穩(wěn)定,具有臨床使用價(jià)值。隨著人們對其的化學(xué)和生物學(xué)研究的深入,其分子作用機(jī)制將逐步明確,這將進(jìn)一步推動此類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾和構(gòu)效關(guān)系研究,并有助于提高其藥用價(jià)值。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供8-丙二酸二乙酯小檗堿的新的藥物用途。
本發(fā)明的目的是提供一種抗腫瘤藥物增敏劑。
一方面，本發(fā)明提供了8-丙二酸二乙酯小檗堿在制備抗腫瘤藥物增敏劑中的應(yīng)用。其中，8-丙二酸二乙酯小檗堿的英文全稱為diethyl8-berberinylidenmalonate，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。
所述的腫瘤包括口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌或胰腺癌。
所述的抗腫瘤藥物是長春新堿、柔紅霉素、紫杉醇或者5-氟尿嘧啶。
8-丙二酸二乙酯小檗堿可以作為腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑。
另一方面，本發(fā)明提供了一種抗腫瘤藥物組合物，所述的抗腫瘤藥物組合物的有效成分是抗腫瘤藥物和8-丙二酸二乙酯小檗堿。
所述的抗腫瘤藥物是細(xì)胞周期特異性藥物或者細(xì)胞周期非特異性藥物。
所述的抗腫瘤藥物是長春新堿、柔紅霉素、紫杉醇或者5-氟尿嘧啶。
本發(fā)明還提供了一種抑制體外腫瘤細(xì)胞生長增殖的方法，即在腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入8-丙二酸二乙酯小檗堿和抗腫瘤藥物。
其中，加入8-丙二酸二乙酯小檗堿的終濃度為1-100μmol/l。
所述的腫瘤包括口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宮頸癌或者胰腺癌。
實(shí)施上述方法時(shí)，先加入8-丙二酸二乙酯小檗堿，然后加入抗腫瘤藥物。也可以同時(shí)加入8-丙二酸二乙酯小檗堿和抗腫瘤藥物。
本發(fā)明提供了8-丙二酸二乙酯小檗堿的新用途，即其在制備抗腫瘤藥物增敏劑中的應(yīng)用。8-丙二酸二乙酯小檗堿是天然產(chǎn)物，具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的作用，可以作為腫瘤多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)劑；8-丙二酸二乙酯小檗堿還具有增加腫瘤多藥耐藥細(xì)胞對抗腫瘤藥物敏感性的作用，可以作為化療增敏劑使用。本發(fā)明中的小分子化合物8-丙二酸二乙酯小檗堿作為新的抗腫瘤藥物或者其輔助成分進(jìn)行開發(fā)，抑瘤效果明顯，綠色環(huán)保，將為治療和治愈腫瘤提供了一種新的途徑和手段。
附圖說明
圖1為8-丙二酸二乙酯小檗堿的結(jié)構(gòu)。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明提供了一種抗腫瘤藥物，所述的抗腫瘤藥物的活性成分是8-丙二酸二乙酯小檗堿。所述的腫瘤可以是肝癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞或者血癌細(xì)胞。
本發(fā)明的小分子化合物可以采用各種常規(guī)的制備方法制備。例如，采用人工化學(xué)合成的方法。
利用本發(fā)明小分子化合物，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與8-丙二酸二乙酯小檗堿發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑或拮抗劑等。
本發(fā)明及其抑制劑、拮抗劑等，在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中ph通常約為5-8，較佳地ph約為6-8，ph值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括（但并不限于）：肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
以本發(fā)明的8-丙二酸二乙酯小檗堿為例，可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的化合物和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括（但并不限于）：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的8-丙二酸二乙酯小檗堿可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的8-丙二酸二乙酯小檗堿還可與其他治療劑一起使用。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
實(shí)驗(yàn)方法：
1.細(xì)胞復(fù)蘇
1)從液氮罐中取出凍存管，直接投入37℃溫水中，并不時(shí)搖動令其盡快融化。
2)從37℃水浴中取出凍存管，用吸管吸出細(xì)胞懸液，注入離心管并加入10倍以上培養(yǎng)液，混合后低速離心，棄上清，再重復(fù)用培養(yǎng)液洗一次。
3)用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，接種培養(yǎng)瓶，放在37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)至一定濃度時(shí)進(jìn)行傳代。mcf-7細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基中，kb和kb/vcr細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、2mm谷氨酰胺和1mm丙酮酸鈉的mem培養(yǎng)基中，mcf-7/adr細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、0.01mg/ml胰島素和1mm丙酮酸鈉的mem培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中含100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素。
2.細(xì)胞傳代培養(yǎng)
每天觀察細(xì)胞生長的情況，當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中長至約90%匯合時(shí)傳代，約每隔2-4天傳代一次。一瓶傳代成三瓶，或一個(gè)25cm2傳代于一個(gè)75cm2的培養(yǎng)瓶中。方法：
1)用1×磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞一次。
2)加入2-3ml胰酶消化液消化，置于37℃培養(yǎng)箱中數(shù)分鐘。用手拍打細(xì)胞培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞分離。
3)用含10-15%的gibico胎牛血清的合適培養(yǎng)基終止胰酶消化。將細(xì)胞分裝于新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。
懸浮細(xì)胞傳代時(shí)，直接收集于離心管中離心，棄舊培養(yǎng)基。一般一瓶傳代成三瓶的比例分裝于新的培養(yǎng)瓶中，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
3.細(xì)胞凍存
1)取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的細(xì)胞胰蛋白酶消化，收集于離心管中并計(jì)數(shù)，離心。
2)棄除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入配置好的凍存培養(yǎng)液(含10%dmso，40%dmem和50%gibico胎牛血清)，凍存液中細(xì)胞的最終濃度為0.5-1×107/ml。用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，然后分裝入無菌凍存管中，每管加1-1.5ml。
3)將凍存管放入凍存盒置-80℃速凍，5小時(shí)后移入液氮罐中保存。
4.實(shí)驗(yàn)材料
藥物準(zhǔn)備：
8-丙二酸二乙酯小檗堿溶于dmso(二甲基亞砜),配制成100mm或50mm的母液備用。
長春新堿(vcr)和阿霉素(adr)購自羅氏化學(xué)公司，純度都大于99%。
細(xì)胞來源:
人口腔癌細(xì)胞株kb及其耐藥細(xì)胞株kb/vcr由中科院藥物所提供，人乳腺癌細(xì)胞株mcf-7及其耐藥細(xì)胞株mcf-7/adr購自南京凱基生物公司。
試劑盒:
cck-8試劑盒購自同仁公司。
cck-8實(shí)驗(yàn)
kb和kb/vcr細(xì)胞以及mcf-7和mcf-7/adr細(xì)胞都按照3500/孔的密度接種到96孔板中，24h后不同濃度的adr，vcr，8-丙二酸二乙酯小檗堿以及vcr和8-丙二酸二乙酯小檗堿一起用含10%胎牛血清的α-mem配好后被加到各個(gè)孔中。培養(yǎng)48h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入90μl不含血清的培養(yǎng)基和10μlcck-8試劑。37℃反應(yīng)2h后，酶標(biāo)儀讀取450nm波長的吸光值（od450）。通過計(jì)算得到用藥組相對于對照組的細(xì)胞增殖比率。空白組為不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基，對照組為加入與藥物同體積的dmso，細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組od450-空白組od450）/（對照組od450-空白組od450）。通過ic50值再計(jì)算耐藥倍數(shù)（resistancefold，rf）。
rf=耐藥細(xì)胞株的ic50值/親本細(xì)胞株的ic50值。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
所有耐藥細(xì)胞系在生長抑制實(shí)驗(yàn)之前在無藥物培養(yǎng)基中生長3天。每個(gè)數(shù)值是3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果，ic50以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式表示。vcr，長春新堿；adr，柔紅霉素；rf，耐藥倍數(shù)。
實(shí)施例1
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
kb/vcr和mcf-7/adr是兩種常用的多藥耐藥細(xì)胞株，在本實(shí)施例中，這兩種細(xì)胞也表現(xiàn)出多藥耐藥的特性。如表1所示，kb/vcr細(xì)胞相對于kb細(xì)胞對vcr和adr的耐藥倍數(shù)分別為81.9倍和94.4倍，而mcf-7/adr細(xì)胞跟mcf-7細(xì)胞相比對vcr和adr的耐藥倍數(shù)分別是38.1倍和20.9倍。
結(jié)論：
實(shí)驗(yàn)所用耐藥細(xì)胞具有多藥耐藥性，且mdr活性類似于文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果。
實(shí)施例2：cck-8方法檢測8-丙二酸二乙酯小檗堿對腫瘤細(xì)胞多藥耐藥活性的逆轉(zhuǎn)作用
kb/vcr,mcf-7/adr和hct-8/vcr細(xì)胞按照3500/孔的密度接種到96孔板中，24h后不同濃度的vcr，以及不同濃度的vcr和8-丙二酸二乙酯小檗堿一起用含10%胎牛血清的α-mem配好后被加到各個(gè)孔中。培養(yǎng)48h后，棄去培養(yǎng)液，同實(shí)施實(shí)例1中方法，用cck-8試劑盒測耐藥細(xì)胞株及其親本細(xì)胞對vcr和vcr+8-丙二酸二乙酯小檗堿的活性，繪成曲線。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
mcf-7/adr對adr的耐藥倍數(shù)為20.9倍。當(dāng)加入20μm的8-丙二酸二乙酯小檗堿后，使adr對耐藥細(xì)胞mcf-7/adr的敏感性增加了3.13倍。8-丙二酸二乙酯小檗堿能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥細(xì)胞對化療藥物的耐藥性。
結(jié)論：
8-丙二酸二乙酯小檗堿可以逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥細(xì)胞mcf-7/adr的耐藥性，可以作為抗腫瘤藥物的增敏劑，或者與抗腫瘤藥物制成藥物組合物。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。