本發(fā)明涉及具有雙重膽堿酯酶抑制作用、神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用、抗炎作用的化合物，以及該化合物在治療學(xué)習(xí)記憶障礙和老年癡呆中的應(yīng)用。屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)背景

阿爾茨海默病(alzheimer’sdisease，ad)是一種以行為、認(rèn)知和記憶功能障礙為臨床特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其特征性病理變化為：神經(jīng)元丟失、神經(jīng)元纖維纏(neurofibrillarytangles，nfts)、老年斑(senileplaques，sps)。65-74歲人群的ad發(fā)病率約為3％，75-84歲人群的發(fā)病率可上升至19％，而84歲以上人群的ad發(fā)病率可高達(dá)47％。ad是老年人群中繼心血管病、腫瘤、腦血管病之后的第四大殺手，嚴(yán)重危害老年人群健康。隨著全球人口老齡化趨勢(shì)日趨嚴(yán)重，如果沒有有效的干預(yù)措施，2050年全球的ad患者將達(dá)1億，對(duì)醫(yī)療體系產(chǎn)生巨大影響。因此、研發(fā)相關(guān)治療藥物具有重要意義。

ad的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，遺傳和環(huán)境等多種因素在其進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮作用。根據(jù)ad病變進(jìn)程中的多種病理生化改變，產(chǎn)生了多種ad病理假說(shuō)，如膽堿能假說(shuō)、aβ假說(shuō)、鋁中毒假說(shuō)、膽固醇變化學(xué)說(shuō)、鈣離子通道受損假說(shuō)、炎癥反應(yīng)假說(shuō)等。根據(jù)老年癡呆的病理特征和發(fā)病機(jī)制，對(duì)于老年癡呆患者采取的治療途徑包括：(1)改善膽堿系統(tǒng)功能的藥物。(2)糾正鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)和抗氧化的藥物。(3)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。(4)干擾aβ形成和沉積的藥物。(5)抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡劑。

膽堿能系統(tǒng)在學(xué)習(xí)記憶過(guò)程中發(fā)揮重要作用。70年代以來(lái)的研究表明：ad患者腦內(nèi)存在多方面的膽堿能系統(tǒng)功能衰退，從而提出了ad病因的膽堿能假說(shuō)(cholinergichypothesis)：中樞膽堿能系統(tǒng)功能障礙導(dǎo)致ad患者的認(rèn)知減退。根據(jù)膽堿能假說(shuō)，增強(qiáng)膽堿能系統(tǒng)功能的藥物，可用于ad的治療。通過(guò)膽堿酯酶抑制劑(cholinesteraseinhibitor,chei)提高乙酰膽堿含量，增強(qiáng)膽堿能神經(jīng)元功能，是目前治療ad的主要手段。

目前臨床常用的chei多為選擇性乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,ache)抑制劑，可改善患者的認(rèn)知功能、提高患者及看護(hù)人的生活質(zhì)量。但也存在一定的不良反應(yīng)，對(duì)重癥ad的治療不理想。丁酰膽堿酯酶(butyrylcholinesterase,buche)在中樞和外周均有分布，由于buche的生理功能一直不明確，對(duì)乙酰膽堿(acetylcholine,ach)的親和力低于ache。長(zhǎng)期以為未被作為ad治療的靶點(diǎn)。但近年的研究發(fā)現(xiàn)buche不但可替代ache水解ach，在ad進(jìn)程中亦有作用，buche可視為ad治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。適當(dāng)比例地同時(shí)抑制ache和buche是更加理想的ad治療方案。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種如結(jié)構(gòu)式(i)所示的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽、其藥物組合物在制備預(yù)防和/或治療神經(jīng)退行性疾病藥物中的應(yīng)用，在制備乙、丁酰膽堿酯酶雙重抑制作用藥物中的應(yīng)用，在制備保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、改善氧化應(yīng)激藥物中的應(yīng)用，在制備調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥藥物中的應(yīng)用，在制備改善學(xué)習(xí)記憶功能藥物中的應(yīng)用。

為解決本發(fā)明的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明技術(shù)方案如下：

一種如結(jié)構(gòu)式(i)所示的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽在制備預(yù)防和/或治療神經(jīng)退行性疾病藥物中的應(yīng)用，在制備乙、丁酰膽堿酯酶雙重抑制作用藥物中的應(yīng)用，在制備保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、改善氧化應(yīng)激藥物中的應(yīng)用，在制備調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥藥物中的應(yīng)用，在制備改善學(xué)習(xí)記憶功能藥物中的應(yīng)用，

其中，hx選自有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸，有機(jī)酸選自馬來(lái)酸、咖啡酸、阿魏酸、沒食子酸，甲磺酸，無(wú)機(jī)酸選自鹽酸、硫酸；其中，所述的神經(jīng)退行性疾病是以學(xué)習(xí)記憶障礙為特征的；其中，所述的神經(jīng)退行性疾病包括老年癡呆癥，帕金森病，亨廷頓氏病。

一種藥物組合物在制備預(yù)防和/或治療神經(jīng)退行性疾病藥物中的應(yīng)用，在制備乙、丁酰膽堿酯酶雙重抑制作用藥物中的應(yīng)用，在制備保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、改善氧化應(yīng)激藥物中的應(yīng)用，在制備調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥藥物中的應(yīng)用，在制備改善學(xué)習(xí)記憶功能藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物組合物包括如結(jié)構(gòu)式(i)所示的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，

其中，hx選自有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸，有機(jī)酸選自馬來(lái)酸、咖啡酸、阿魏酸、沒食子酸，甲磺酸，無(wú)機(jī)酸選自鹽酸、硫酸；

其中，所述的神經(jīng)退行性疾病是以學(xué)習(xí)記憶障礙為特征的；

其中，所述的神經(jīng)退行性疾病包括老年癡呆癥，帕金森病，亨廷頓氏病。

上述式(i)所示的化合物(即j37941)的制備：

合成路線：

a)brch2ch2br，k2co3，acetone；b)k2co3，dmf,n(ch2ch2)；

制備：

在50ml單口瓶中，加入3-(4-甲氧基苯基)-7-羥基-4h-色原-4-酮(268.3mg，1.0mmol)、研細(xì)的無(wú)水碳酸鉀粉末(414.6mg，3.0mmol)、15ml丙酮，再加入1,2-二溴乙烷(866.0μl，10.0mmol)，加熱回流反應(yīng)過(guò)夜，將反應(yīng)混合物減壓濃縮，殘余物加水，攪拌，抽濾，濾餅用水洗滌，干燥，得白色固體354mg，收率：94.4％。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ:7.88(s,1h),7.46(d,j＝8.8hz,2h),6.98(d,j＝8.8hz,2h),6.40(dd,j＝2.0,15.2hz,2h),4.36(t,j＝6.0hz,2h),3.85(s,3h),3.66(t,j＝6.0hz,2h)；¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ:181.0,164.0,163.1,160.0,158.0,152.9,130.2,123.9,123.0,114.3,106.8,98.7,93.2,68.3,55.5,28.4.esi-ms(m/z):391.38[m+h]⁺

在一個(gè)100ml單口瓶中，加入502.0mg(1.34mmol)7-(2-溴乙氧基)-3-(4-甲氧基苯基)-7-羥基-4h-色原-4-酮，再加入30mldmf溶解，加入926.0mgk2co3粉末和0.142g(2.0mmol)吡咯烷，加熱下于100℃攪拌反應(yīng)3h，tlc檢測(cè)，反應(yīng)完畢，將反應(yīng)液倒入200ml水中，析出白色固體，抽濾，濾餅用100ml水洗滌，得白色固體365.0mg，tlc顯示為單一斑點(diǎn)，收率82％。mp：143℃-145℃；esi-ms:(m/z):367.18(m+1)。¹h-nmr(dmso-d6):8.40(s，1h)，8.02(d，1h)，7.52(d，2h)，7.15(s，1h)，7.08(d，1h)，6.96(d，1h)，4.22(t，2h)，3.77(s，3h)，2.80(t，2h)，2.49(m，4h)，1.67(m，4h)。附圖：36-1和36-2。

有益技術(shù)效果：

本發(fā)明顯示j37941具有良好的乙、丁酰膽堿酯酶雙重抑制作用，神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷保護(hù)作用，神經(jīng)炎癥調(diào)節(jié)作用，在整體動(dòng)物水平可有效改善學(xué)習(xí)記憶功能。

小鼠口服急毒結(jié)果表明，化合物j37941的口服ld50＝550mg/kg，毒性遠(yuǎn)低于陽(yáng)性藥艾斯能的毒性(ld50＝21.75mg/kg)。因此，化合物j37941的毒性小，安全性高。

附圖說(shuō)明

圖1、j37941抑制ache、buche的量效曲線

圖2、j37941對(duì)sy5y細(xì)胞活力的影響

圖3、j37941對(duì)sy5y細(xì)胞ache活性的影響

圖4、j37941對(duì)appsw-sy5y細(xì)胞活力的影響

圖5、j37941對(duì)appsw-sy5y細(xì)胞ache活性的影響

圖6、j37941對(duì)cu²⁺誘導(dǎo)的appsw-sy5y細(xì)胞損傷模型細(xì)胞活力的影響

圖7、j37941對(duì)cu²⁺誘導(dǎo)的appsw-sy5y細(xì)胞損傷模型細(xì)胞內(nèi)ros水平的影響

圖8、j37941對(duì)活化小膠質(zhì)細(xì)胞il-1β分泌的影響

圖9、j37941對(duì)活化小膠質(zhì)細(xì)胞il-6分泌的影響

圖10、j37941在跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響(n＝13～16).(#vscontrol,p<0.5；*vsmodel,p<0.5；**vsmodel,p<0.01)

圖11、j37941在避暗實(shí)驗(yàn)中對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響(n＝13～16)(##vscontrol,p<0.01；*vsmodel,p<0.5；***vsmodel,p<0.001)

圖12、j37941在水迷宮實(shí)驗(yàn)中對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響(n＝13～16)

圖13、j37941，即ws0902036的1hnmr圖譜(300mhz)

圖14、j37941，即ws0902036的esi質(zhì)譜

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1、j37941在體外水平對(duì)ache、buche活性的抑制作用研究

j37941為其鹽酸鹽。

方法：利用dtnb法建立ache抑制劑篩選模型和buche抑制劑篩選模型，對(duì)j37941在0.08-50μmol/l時(shí)對(duì)ache、buche的抑制活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并計(jì)算ic50。重復(fù)三次，計(jì)算均值及sd值。

結(jié)果：j37941對(duì)ache、buche均有抑制作用，對(duì)ache的ic50在1.24μmol/l，對(duì)buche的抑制活性略高于多奈哌齊，見表1。

表1、j37941抑制ache和buche活性的ic50

注：iso-ompa的中文名為四異丙基焦磷酸亞胺，是buche的工具藥，在這里作為陽(yáng)性對(duì)照藥。

實(shí)施例2、j37941對(duì)神經(jīng)細(xì)胞ache活性的抑制作用研究

(1)對(duì)sy5y神經(jīng)細(xì)胞ache活性的抑制作用研究

方法1：sy5y細(xì)胞以含10％胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，按5*10⁴個(gè)/ml，100ul/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中。24h后換以無(wú)血清dmem/f12培養(yǎng)基培養(yǎng)，12h后換以不同濃度j37941(0.3-10μmol/l)的無(wú)血清dmem/f12培養(yǎng)基，多奈哌齊及艾斯能(終濃度為10μmol/l)處理相同，24h后mts法測(cè)定細(xì)胞活力，dtnb法檢測(cè)細(xì)胞上清中ache活性。

結(jié)果：與正常組相比，j37941在給藥濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞活力無(wú)顯著影響，而陽(yáng)性對(duì)照多奈哌齊給藥組細(xì)胞活力顯著降低(p＜0.05)，見表2。j37941可劑量依賴性的抑制sy5y細(xì)胞的ache活性，見表3。

表2、j37941對(duì)sy5y細(xì)胞活力的影響

表3、j37941對(duì)sy5y細(xì)胞ache活性的影響

^#與正常組比較p<0.05,^##與正常組比較p<0.01

(2)對(duì)野生型appsw轉(zhuǎn)基因sy5y(appsw-sy5y)神經(jīng)細(xì)胞ache活性的抑制作用研究

方法2：野生型appsw轉(zhuǎn)基因sy5y(appsw-sy5y)細(xì)胞以含10％胎牛血清，400ug/mlg418的dmem/f12培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，按5*10⁴個(gè)/ml，100ul/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中。24h后換以無(wú)血清dmem/f12培養(yǎng)基培養(yǎng)，12h后換以不同濃度j37941(0.3-10μmol/l)的無(wú)血清dmem/f12培養(yǎng)基，多奈哌齊及艾斯能(終濃度為10μmol/l)處理相同，24h后mts法測(cè)定細(xì)胞活力，dtnb法檢測(cè)細(xì)胞上清中ache活性。

結(jié)果：與正常組相比，j37941在給藥濃度范圍內(nèi)對(duì)野生型appsw轉(zhuǎn)基因sy5y(appsw-sy5y)細(xì)胞的活力無(wú)顯著影響，可劑量依賴性的抑制app-swsy5y細(xì)胞的ache活性。見表4，表5。

表4、j37941對(duì)app-swsy5y細(xì)胞活力的影響

表5、j37941對(duì)app-swsy5y細(xì)胞ache活性的影響

^#與正常組比較p<0.05,^##與正常組比較p<0.01

(3)j37941在ad細(xì)胞模型上的作用研究

方法：appsw-sy5y細(xì)胞以含10％胎牛血清、400ug/mlg418的dmem/f12培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，按5*10⁴個(gè)/ml，100ul/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中。24h后換以無(wú)血清dmem/f12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h，加入終濃度為10、3μmol/l的j37941和10μmol/l的多奈哌齊、艾斯能預(yù)孵育2h后，加入終濃度為200μmol/l的cu²⁺處理細(xì)胞，24h后分別以mts法測(cè)定細(xì)胞活力、dcfh2-da熒光探針法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ros含量。

結(jié)果：

1)與正常組相比，cu²⁺處理24h后，模型組細(xì)胞存活率顯著降低(p＜0.01)。與模型組相比，j37941各劑量組細(xì)胞存活率均有提高，10μmol/lj37941給藥組的細(xì)胞存活率高于陽(yáng)性對(duì)照多奈哌齊、艾斯能組。見表6。

表6、j37941對(duì)cu²⁺誘導(dǎo)的appsw-sy5y細(xì)胞損傷模型細(xì)胞活力的影響

^##與正常組比較p<0.01

2)與正常組相比，cu²⁺處理24h后，模型組細(xì)胞內(nèi)ros熒光強(qiáng)度顯著升高(p＜0.01)。與模型組相比，j37941各劑量組細(xì)胞ros熒光強(qiáng)度顯著降低(10μmol/l組p＜0.01，3μmol/l組p＜0.05)，說(shuō)明j37941可降低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。見表7。

表7、j37941對(duì)cu²⁺誘導(dǎo)的appsw-sy5y細(xì)胞損傷細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的影響

^##與正常組比較p<0.01，^*與模型組比較p<0.05，^**與模型組比較p<0.01

(4)j37941對(duì)神經(jīng)炎癥的作用研究

方法：終濃度為10、2μmol/l的j37941，終濃度為10μmol/l的艾斯能、煙堿與大鼠大腦皮層小膠質(zhì)細(xì)胞共同孵育2h后，除空白對(duì)照組外，模型組和給藥組均加入終濃度為1μg/mllps，繼續(xù)孵育24h后收集細(xì)胞上清，elisa法測(cè)定細(xì)胞上清液內(nèi)il-1β、il-6含量。

結(jié)果：與正常組相比，lps刺激24h后，模型組細(xì)胞上清液中il-1β、il-6含量顯著升高(p＜0.05)。j37941可降低細(xì)胞上清中il-1β、il-6的含量，給藥量為10μmol/l時(shí)，細(xì)胞上清中il-1β、il-6含量與模型組相比顯著降低(p＜0.01，p＜0.05)。見表8。

表8、j37941對(duì)活化小膠質(zhì)細(xì)胞胞il-1β、il-6分泌的影響

^##與正常組比較p<0.01,^*與模型組比較p<0.05，^**與模型組比較p<0.01

實(shí)施例3、j37941在ad動(dòng)物模型上的研究

方法：以東莨菪堿建造小鼠學(xué)習(xí)、記憶障礙模型，以艾斯能(rivastigmine)為陽(yáng)性對(duì)照藥物，觀察化合物j37941的作用。小鼠學(xué)習(xí)記憶功能以跳臺(tái)、避暗、水迷宮行為學(xué)指標(biāo)評(píng)價(jià)，比較正常對(duì)照組、模型組和藥物組之間的差異。

化合物藥效學(xué)評(píng)價(jià)的用藥劑量是根據(jù)藥物的常規(guī)用量計(jì)算方法結(jié)合急性毒性試驗(yàn)結(jié)果確定的?；衔飆37941藥效學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)選用了10mg/kg劑量(高劑量)、3mg/kg劑量(中劑量)和1mg/kg劑量(小劑量)，陽(yáng)性藥艾斯能組為3mg/kg。

實(shí)驗(yàn)用icr小鼠，用于癡呆動(dòng)物模型藥效學(xué)評(píng)價(jià)，將小鼠隨機(jī)分為6組，正常組、模型組、艾斯能組(3mg/kg)、化合物j37941高劑量組、中劑量組和小劑量組，每組小鼠13-15只。

化合物j37941對(duì)東莨菪堿模型小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的影響：東莨菪堿模型組小鼠訓(xùn)練24h后，在跳臺(tái)上的時(shí)間(潛伏期)很短，潛伏期與空白組比較，差異顯著(p<0.05)。化合物j37941高、小劑量均可明顯延長(zhǎng)潛伏期，與模型組比較，差異顯著(p<0.05)。結(jié)果見表9。

表9、j37941在跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響(mean±sem)

^#與正常組比較p<0.05,^*與模型組比較p<0.05，^**與模型組比較p<0.01

化合物j37941對(duì)東莨菪堿模型小鼠避暗實(shí)驗(yàn)的影響：東莨菪堿模型組訓(xùn)練24h后，進(jìn)入暗室的時(shí)間(潛伏期)很長(zhǎng)，潛伏期與空白組比較，差異顯著(p<0.05)?；衔飆37941高劑量均可延長(zhǎng)潛伏期。

表10、j37941在避暗實(shí)驗(yàn)中對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響(mean±sem)

^##與正常組比較p<0.01,^*與模型組比較p<0.05，^**與模型組比較p<0.01

化合物j37941對(duì)東莨菪堿模型小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)影響：小鼠注射東莨菪堿后，模型組與空白組比較，小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間明顯增加(p<0.05)，化合物j37941的中、小劑量均可對(duì)抗東莨菪堿引起的學(xué)習(xí)記憶障礙，與模型組比較，差異顯著(p<0.05)。

表11、j37941在水迷宮實(shí)驗(yàn)中對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響(mean±sem)

^##與正常組比較p<0.01,^*與模型組比較p<0.05，^**與模型組比較p<0.01