本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體而言，涉及鴉膽子苦醇在制備tlr4/nf-κb通路的抑制劑以及治療炎癥性腸病的藥物中的用途。

背景技術(shù)：

炎癥性腸病(ibd)是一種病因不明的慢性腸道炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(uc)和克羅恩病(cd)。炎癥性腸病的病因不清、臨床癥狀不特異，易與其他疾病混淆。炎癥性腸病已成為中國消化系統(tǒng)常見疾病和慢性腹瀉的主要原因，且患者多為青壯年，因此日益受到重視。

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis,uc)是一種以慢性炎癥和潰瘍形成為主要病理特點的結(jié)腸粘膜層的消化道疾病。該病病程冗長，病變范圍廣泛，病變部位多局限于黏膜層以及黏膜下層，主要為黏膜的大片充血、水腫、糜爛以及潰病形成。uc具有急性暴發(fā)型病死率高、慢性持續(xù)型癌變率高、易反復(fù)發(fā)作等特點，臨床表現(xiàn)為：腹痛、持續(xù)性腹瀉及血便、發(fā)熱、腹脹等癥狀，嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量，且目前無特效藥物。

克羅恩病(crohndisease,cd)，又稱局限性回腸炎、局限性腸炎、節(jié)段性腸炎和肉芽腫性腸炎，是一種原因不明的腸道炎癥性疾病?？肆_恩病在整個胃腸道的任何部位均可發(fā)生，但好發(fā)于末端回腸和右半結(jié)腸。以腹痛、腹瀉、腸梗阻為主要癥狀，且有發(fā)熱、營養(yǎng)障礙等腸外表現(xiàn)。病程多遷延，常有反復(fù)，本病尚無根本的治愈方法。

臨床研究表明，ibd在我國近年來的發(fā)病率有顯著增高趨勢。目前主要采用的傳統(tǒng)療法的療效不明顯，甚至?xí)?dǎo)致嚴(yán)重的副作用，如氨基水楊酸類藥物可導(dǎo)致嚴(yán)重過敏和高熱，糖皮質(zhì)激素類藥物可導(dǎo)致水牛背及骨質(zhì)疏松，硫唑嘌呤會導(dǎo)致嚴(yán)重肝損傷，英夫利昔可能引起大出血和感染。

鴉膽子為苦木科植物鴉膽子bruceajavanica(l.)merr.的干燥成熟果實，始載于《本草綱目拾遺》，是我國民間傳統(tǒng)常用中藥，又名老鴉膽、鴉膽、苦參子等。2010年《藥典》記錄，鴉膽子性味苦寒，有小毒，歸大腸經(jīng)、肝經(jīng)。具有清熱解毒、截瘧、止痢、腐蝕贅疣等功效，主治痢疾、瘧疾，外治用于贅疣、雞眼?，F(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)鴉膽子具有抗腫瘤作用。鴉膽子苦醇為苦木科植物鴉膽子的干燥成熟果實中分離得到的單體。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種鴉膽子苦醇在制備髓樣分化因子88介導(dǎo)的tlr4/nf-κb通路的抑制劑中的用途，為由髓樣分化因子88介導(dǎo)的tlr4/nf-κb通路的異?；罨碌募膊√峁┬碌闹委熓侄魏退悸贰?/p>

本發(fā)明的第二目的在于提供一種鴉膽子苦醇在制備治療炎癥性腸病的藥物中的用途。鴉膽子苦醇具有改善潰瘍性結(jié)腸炎進(jìn)程的功效，且療效好、作用顯著。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

一種鴉膽子苦醇在制備髓樣分化因子88介導(dǎo)的tlr4/nf-κb通路的抑制劑中的用途。

一種鴉膽子苦醇在制備治療炎癥性腸病的藥物中的用途。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

髓樣分化因子88介導(dǎo)的tlr4/nf-κb通路的異?；罨c多種疾病的發(fā)生相關(guān)，比如炎癥性腸病。發(fā)明人研究表明，鴉膽子苦醇能夠抑制髓樣分化因子88介導(dǎo)的tlr4/nf-κb通路的活化，進(jìn)而下調(diào)復(fù)雜的炎癥細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，消除氧化應(yīng)激反應(yīng)，實現(xiàn)對由tlr4/nf-κb通路的異?；罨录膊〉闹委?，比如對炎癥性腸病的治療。

鴉膽子苦醇可顯著降低炎癥性腸病患者的疾病活動指數(shù)和病理學(xué)評分，恢復(fù)結(jié)腸長度，修復(fù)組織結(jié)腸病理學(xué)變化，改善炎癥性腸病的癥狀，可用于制備治療炎癥性腸病的藥物，為炎癥性腸病的治療提供新的治療手段和思路。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，以下將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1為鴉膽子苦醇的結(jié)構(gòu)式；

圖2為實驗例中鴉膽子苦醇對dss誘導(dǎo)uc小鼠體重和dai評分的影響(n＝10)。其中，a：dai評分；b：體重變化趨勢；c:小鼠結(jié)腸宏觀變化；d：小鼠結(jié)腸組織長度差異，##p<0.01與對照組比較：*p<0.05和**p<0.01與dss組比較；

圖3為實驗例中鴉膽子苦醇對dss誘導(dǎo)uc小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)分析。其中，a：he染色結(jié)腸組織；b：組織學(xué)病理損傷評分(n＝6)。##p<0.01與對照組比較：*p<0.05和**p<0.01與dss組比較；

圖4為實驗例中鴉膽子苦醇對dss誘導(dǎo)uc小鼠結(jié)腸組織中a：tnf-α.b：ifn-γ.c：il-1β.d：il-6.e：il-4.f：il-10的影響(n＝6)。##p<0.01與對照組比較：*p<0.05和**p<0.01與dss組比較；

圖5為實驗例中鴉膽子苦醇對dss誘導(dǎo)uc小鼠結(jié)腸組織中a：mpo.b：mda.c：gsh-px.d：sod的影響(n＝6)。##p<0.01與對照組比較：*p<0.05和**p<0.01與dss組比較；

圖6為實驗例中鴉膽子苦醇對dss誘導(dǎo)uc小鼠結(jié)腸組織中tlr4,myd88和nf-κbp65蛋白表達(dá)的影響(n＝3)。其中，a：結(jié)腸組織中tlr4、myd88、nf-κbp65蛋白表達(dá)圖.b：tlr4的蛋白表達(dá)變化.c：myd88的蛋白表達(dá)變化.d：nf-κbp65蛋白表達(dá)變化。##p<0.01與對照組比較：*p<0.05和**p<0.01與dss組比較。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

本實施方式第一方面提供鴉膽子苦醇在制備髓樣分化因子88介導(dǎo)的tlr4/nf-κb通路的抑制劑中的用途，為由髓樣分化因子88介導(dǎo)的tlr4/nf-κb通路的異常活化所致的疾病提供新的治療手段和思路。

本實施方式中，鴉膽子苦醇(brusatol，br)的結(jié)構(gòu)如圖1所示，鴉膽子苦醇可直接購買得到，或者采用現(xiàn)代天然產(chǎn)物化學(xué)分離方法分離得到。

發(fā)明人研究表明，鴉膽子苦醇能夠抑制髓樣分化因子88(myd88)介導(dǎo)的tlr4/nf-κb通路的活化，進(jìn)而下調(diào)復(fù)雜的炎癥細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，消除氧化應(yīng)激反應(yīng)，實現(xiàn)對由tlr4/nf-κb通路的異常活化所致疾病的治療，比如對炎癥性腸病的治療。

一方面，鴉膽子苦醇通過抑制myd88介導(dǎo)的tlr4/nf-κb通路的活化，來調(diào)節(jié)結(jié)腸組織中toll樣受體4(tlr4)、myd88和核因子-κbp65(nf-κbp65)等相關(guān)蛋白的表達(dá)。因此，鴉膽子苦醇可用于制備抑制toll樣受體4、髓樣分化因子88和核因子-κbp65中的至少一種的表達(dá)水平的藥物。

tlr4/nf-κb通路是涉及一系列蛋白質(zhì)和細(xì)胞因子在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和炎癥性腸病中發(fā)揮關(guān)鍵作用的重要途徑之一。tlr4為最近發(fā)現(xiàn)的toll樣家族蛋白的成員，其識別脂多糖并介導(dǎo)跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在與脂多糖相互作用之后，tlr4被激活，隨后結(jié)合myd88作為tlr信號傳導(dǎo)所必需的主要銜接分子。這反過來觸發(fā)信號級聯(lián)，其導(dǎo)致下游nf-κb的活化。nf-κb是免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)期間的重要轉(zhuǎn)錄因子。nf-κb的激活可以增加促炎細(xì)胞因子和生長因子的誘導(dǎo)，最終導(dǎo)致炎癥性腸病的發(fā)展，其中p65是nf-κb家族中的主要功能亞基。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，用鴉膽子苦醇治療使結(jié)腸組織中tlr4、myd88和nf-κbp65表達(dá)的顯著減弱。該結(jié)果提示，對tlr4連接的nf-κb信號通路的抑制是鴉膽子苦醇對炎癥性腸病的治療中起關(guān)鍵作用。

另一方面，鴉膽子苦醇通過抑制myd88介導(dǎo)的tlr4/nf-κb通路的活化，來下調(diào)復(fù)雜的炎癥細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而來治療由炎癥因子的異常表達(dá)所致的疾病。

具體地，鴉膽子苦醇降低結(jié)腸組織中的促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平，因此，鴉膽子苦醇可用于制備抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平的藥物。其中，促炎細(xì)胞因子包括腫瘤壞死因子-α(tnf-α)、γ-干擾素(ifn-γ)、白細(xì)胞介素-1β(il-1β)和白細(xì)胞介素-6(il-6)中的至少一種。

具體地，鴉膽子苦醇提高結(jié)腸組織中的抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平，因此，鴉膽子苦醇可用于制備提高抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平的藥物。其中，抗炎細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素-4(il-4)和/或白細(xì)胞介素-10(il-10)。

研究表明，各種細(xì)胞因子被認(rèn)為是腸道免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵信號，細(xì)胞因子控制uc中炎癥反應(yīng)的不同方面。促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子之間的不平衡破壞了炎癥的易感性，并進(jìn)一步導(dǎo)致疾病的延長。tnf-α、ifn-γ、il-1β和il-6長期以來被認(rèn)為是引起腸粘膜損傷和導(dǎo)致炎癥的關(guān)鍵促炎介質(zhì)。細(xì)胞因子如tnf-α和il-1β被釋放，導(dǎo)致pge2的合成增強(qiáng)和組織損傷的惡化。因此，阻斷這些細(xì)胞因子的產(chǎn)生可改善炎癥性腸病患者的炎癥。

抗炎細(xì)胞因子il-4和il-10，也稱為強(qiáng)免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)因子，可以有效抑制促炎細(xì)胞因子合成和抗原呈遞，引起緩解炎癥反應(yīng)。這些細(xì)胞因子中的低表達(dá)水平促進(jìn)腸粘膜的炎癥反應(yīng)并形成自發(fā)性嚴(yán)重的炎癥性腸病。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子苦醇能夠有效抑制促炎細(xì)胞因子的水平，并且顯著促進(jìn)抗炎介質(zhì)的產(chǎn)生，從而體現(xiàn)出顯著的抗炎活性，具有治療炎癥性腸病的功效。

再一方面，鴉膽子苦醇通過抑制myd88介導(dǎo)的tlr4/nf-κb通路的活化，來消除氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而來治療由氧化應(yīng)激反應(yīng)的異常所致的疾病。

具體地，鴉膽子苦醇能夠降低結(jié)腸組織中過氧化物酶(mpo)和/或丙二醛(mda)的含量。因此，鴉膽子苦醇可用來制備降低過氧化物酶和/或丙二醛的含量的藥物。

具體地，鴉膽子苦醇提高超氧化物歧化酶(sod)和/或谷胱甘肽過氧化物酶(gsg-px)的活性。因此，鴉膽子苦醇可用來制備提高超氧化物歧化酶和/或谷胱甘肽過氧化物酶的活性的藥物。

氧化應(yīng)激是炎癥性腸病的發(fā)病和炎癥過程另一個關(guān)鍵因素。氧化應(yīng)激會損傷細(xì)胞大分子，如dna、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，這可能加劇自由基鏈反應(yīng)，破壞腸粘膜屏障的完整性，并激活炎癥介質(zhì)。

mpo是一種在嗜中性粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的酶，觸發(fā)各種炎癥性疾病。同時，mda被認(rèn)為是脂質(zhì)過氧化的副產(chǎn)物，增加的mda水平引起蛋白質(zhì)和核酸分子的交聯(lián)和細(xì)胞毒性。sod和gsh-px是生物體中主要的抗氧化酶。sod是一種關(guān)鍵酶，通過將其轉(zhuǎn)化為h2o2(一種更穩(wěn)定的代謝物)而使超氧化物離子失活，并且h2o2通過過氧化氫酶或gsh-px進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為水。gsh-px是一種抗氧化酶，有助于自由基的清除和失活，從而保護(hù)身體免受氧化應(yīng)激。mda是gsh-px和sod的必需輔因子，并且通過結(jié)合gsh-px的活性位點起到顯著的抗氧化作用。因此，酶活性的測量可以解釋為用于評估急性腸炎癥的表現(xiàn)。發(fā)明人研究表明，鴉膽子苦醇能夠增強(qiáng)抗氧化酶的表達(dá)，包括sod和gsh-px，以及劑量依賴性抑制mpo和mda的活性。研究結(jié)果清楚地表明，鴉膽子苦醇可以通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物，發(fā)揮其抗炎癥性腸病的功效。

myd88介導(dǎo)的tlr4/nf-κb通路的異?；罨c多種疾病的發(fā)生相關(guān)，比如炎癥性腸病。鑒于此，鴉膽子苦醇為炎癥性腸病的治療提供新的治療手段和思路。

本實施方式還提供鴉膽子苦醇在制備治療炎癥性腸病的藥物中的用途。研究表明，鴉膽子苦醇可顯著降低炎癥性腸病患者的疾病活動指數(shù)和病理學(xué)評分，恢復(fù)結(jié)腸長度，修復(fù)組織結(jié)腸病理學(xué)變化，改善炎癥性腸病的癥狀，可用于制備治療炎癥性腸病的藥物，

實驗證實，鴉膽子苦醇能顯著抑制促炎細(xì)胞因子(tnf-α、ifn-γ、il-1β和il-6)的水平，升高抗炎細(xì)胞因子(il-4和il-10)的生成，從炎癥角度闡述了鴉膽子苦醇治療炎癥性腸病與其能抑制結(jié)腸組織促炎因子的表達(dá)密切相關(guān)。此外，鴉膽子苦醇還能夠顯著降低結(jié)腸組織中mpo和mda的含量，提高結(jié)腸組織中sod和gsg-px的活性，從氧化應(yīng)激的角度表明了鴉膽子苦醇治療炎癥性腸病的機(jī)理。

進(jìn)一步的，炎癥性腸病包括潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病。

潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病是胃腸道的慢性炎性疾病，具有復(fù)雜的病因，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。由于目前合成藥物的不令人滿意的結(jié)果，急需一種針對該病的特效藥。目前，對鴉膽子的研究主要集中在其抗腫瘤活性，對其在治療炎癥性腸病的研究卻很少。鴉膽子苦醇為鴉膽子的主要活性成分之一，其水溶性差，因此發(fā)明人將鴉膽子苦醇溶于微乳中來進(jìn)行相關(guān)實驗。

潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病這兩類疾病的癥狀相似，且都與myd88介導(dǎo)的tlr4/nf-κb通路的異?；罨嚓P(guān)。因此，鴉膽子苦醇對潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病的療效顯著，能夠抑制myd88所介導(dǎo)的tlr4/nf-κb通路中蛋白的活化,進(jìn)而下調(diào)復(fù)雜的促炎細(xì)胞因子，消除氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕腸道炎性反應(yīng)和黏膜損傷。抑制發(fā)病期間病變部位的炎癥因子表達(dá)，減少炎癥細(xì)胞的浸潤，緩解腸道炎癥反應(yīng)，維持腸組織正常結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，改善腹痛、腹瀉、便血等不良癥狀，對潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病具有較好的治療作用，特別是對乙狀結(jié)腸性的潰瘍性結(jié)腸炎、直腸性的潰瘍性結(jié)腸炎的治療效果更佳。

本實施方式中，發(fā)明人采用小鼠由dss誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的體內(nèi)模型，其廣泛用作與人類uc極為類似的化學(xué)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的驗證模型。在發(fā)明人的研究中，觀察到dss誘導(dǎo)模型的臨床癥狀，包括體重減輕、腹瀉、糞便血、潰瘍、粒細(xì)胞浸潤和縮短的結(jié)腸。與dss組的小鼠相比，鴉膽子苦醇的治療效果明顯，能夠使模型小鼠的體重恢復(fù)以及腸出血減少；同時，疾病活動指數(shù)(dai)得分顯著減弱，并且結(jié)腸長度以劑量依賴性方式顯著恢復(fù)。此外，鴉膽子苦醇保護(hù)結(jié)腸組織免于炎癥細(xì)胞的浸潤和粘膜損傷，從而導(dǎo)致組織病理學(xué)損傷的顯著減少。

為了使該藥物快速、連續(xù)并在很長一段時間里釋放活性成分，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可以根據(jù)公開在那些本技術(shù)領(lǐng)域中的常規(guī)方法制造。本實施方式的藥物的給藥途徑可以為口服、鼻吸入、或腸胃外給藥。該藥物的制劑可以是片劑、軟膠囊、硬膠囊、口服液、丸劑、栓劑、粉末、顆粒、乳劑、糖漿、氣霧劑、滅菌注射劑、和滅菌粉等。

以下結(jié)合實驗例對本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述：

實施例1

取鴉膽子苦醇40g，加入乳糖480g、淀粉1160g混合均勻，用7％的淀粉漿300g作為粘合劑，濕法制粒，烘干，加入硬脂酸鎂20g混勻，壓制成每片含鴉膽子苦醇4mg的片劑10000片，每片凈重0.2g?？诜?，每日2次，每次1片，用于治療潰瘍性結(jié)腸炎。癥見：腹痛、持續(xù)性腹瀉及血便、發(fā)熱、腹脹等。

實施例2

取鴉膽子苦醇40g，加入淀粉3594g混合均勻，用7％的淀粉漿350g作為粘合劑，濕法制粒，烘干，加入硬脂酸鎂16g混勻，填充至1號膠囊制成10000粒，每粒凈重0.4g，每粒膠囊內(nèi)含鴉膽子苦醇4mg?？诜?，每日2次，每次1粒，用于治療潰瘍性乙狀結(jié)腸炎。癥見：腹痛、持續(xù)性腹瀉及血便、發(fā)熱等。

實施例3

取鴉膽子苦醇30g，加入適量peg4000作為基質(zhì)，適量液體石蠟為冷卻劑；滴制法制成含有每丸含鴉膽子苦醇0.6mg的滴丸，每丸凈重30mg。口服，每日2次，每次5粒，用于治療用于治療直腸性的潰瘍性結(jié)腸炎。癥見：腹痛、持續(xù)性腹瀉及血便、發(fā)熱、腹脹等。

實施例4

稱取2g鴉膽子苦醇，加入增溶劑普羅莎姆，和一定比例的乙醇，充分?jǐn)噭?；然后加入適宜附加劑(如矯味劑、抑菌劑、抗氧化劑、著色劑)，溶解均勻，濾過澄清，將內(nèi)容物裝入安瓿或易拉蓋瓶中，滅菌。規(guī)格為每瓶含鴉膽子苦醇6mg的口服液，每瓶凈含量10ml?？诜?，每日1次，每次1瓶，用于治療潰瘍性結(jié)腸炎。癥見：腹痛、持續(xù)性腹瀉及血便、發(fā)熱、腹脹等。

實施例5

取鴉膽子苦醇2g，加入可可豆脂等輔料，配制成含鴉膽子苦醇2mg的栓劑。直腸給藥，用于治療直腸性的潰瘍性結(jié)腸炎。癥見：腹痛、持續(xù)性腹瀉及血便、發(fā)熱、腹脹等。

實施例6

取中鏈脂肪酸10g，聚乙二醇-15羥基硬脂酸酯40g和聚乙二醇-40020g作為油相、表面活性劑和助表面活性劑。在37℃的水浴中混合聚乙二醇-15羥基硬脂酸酯和聚乙二醇-400，再加入中鏈脂肪酸，取鴉膽子苦醇700mg，加入一定量蒸餾水，形成了透明的鴉膽子苦醇微乳的濃度為1mg/ml，每次口服2ml，每日三次，連續(xù)使用一周，用于治療潰瘍性結(jié)腸炎。癥見：腹痛、持續(xù)性腹瀉及血便。

實施例7

取中鏈脂肪酸10g，聚乙二醇-15羥基硬脂酸酯40g和聚乙二醇-40020g作為油相、表面活性劑和助表面活性劑。在37℃的水浴中混合聚乙二醇-15羥基硬脂酸酯和聚乙二醇-400，再加入中鏈脂肪酸，取鴉膽子苦醇700mg，加入一定量蒸餾水，形成了透明的鴉膽子苦醇微乳的濃度為0.5mg/ml，每次灌腸4ml，每日1次，連續(xù)使用一周，用于治療潰瘍性結(jié)腸炎。癥見：腹痛、持續(xù)性腹瀉及血便。

實施例8

取鴉膽子苦醇2g，加入適量乳糖，再與防腐劑苯甲酸鈉混勻，濃縮至每1ml含0.4mg鴉膽子苦醇，滅菌，冷卻，分裝于5ml塑料瓶中。直腸給藥，用于治療潰瘍性結(jié)腸炎。癥見：腹痛、持續(xù)性腹瀉及血便、發(fā)熱、腹脹等。

實驗例

下面結(jié)合動物試驗對本發(fā)明實施方式提供的鴉膽子苦醇對抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的療效進(jìn)行評價。

一、實驗方法：

1.1實驗動物

spf級balb/c小鼠，雄性，22-24g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。實驗動物分籠飼養(yǎng)，每2天更換一次墊料，適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，實驗期間自由飲水和進(jìn)食。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22±2℃，相對濕度為60％，每天12小時光照和12小時黑夜循環(huán)。

1.2供試藥品

模型組供試液(dss)：取中鏈脂肪酸(mct)，聚乙二醇-15羥基硬脂酸酯(hs15)和聚乙二醇-400(peg400)作為油相，表面活性劑和助表面活性劑。在37℃的水浴中混合hs15和peg400，再加入mct，在30℃溫度下用磁力攪拌器以300rpm轉(zhuǎn)速攪拌10min，比例為10:40:20(w/w/w)制成空白自乳化微乳制劑。

給藥組供試液：稱取一定量的鴉膽子苦醇(購買得到)加入空白自乳化微乳制劑中，分別配成0.1mg/ml(高劑量)、0.05mg/ml(中劑量)、0.025mg/ml(低劑量)的自微乳溶液。

陽性對照組供試液1(sasp)：精密稱取1.2g柳氮磺胺吡啶(sasp)溶于60ml蒸餾水，配成濃度為20mg/ml的供試液。

陽性對照組供試液2(aza)：精密稱取78mg硫唑嘌呤(aza)溶于60ml蒸餾水，配成濃度為1.3mg/ml的供試液。

上述藥物配制后，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3動物分組及模型建立

實驗開始前取各小鼠，稱重，按體重隨機(jī)分組：正常組(control)，模型組(dss)，鴉膽子苦醇組(br低、中、高劑量組：brl、brm、brh，對應(yīng)劑量為0.25、0.5、1mg/kg)，柳氮磺胺吡啶組(sasp：200mg/kg)，硫唑嘌呤組(aza：13mg/kg)，每組20只小鼠。

分組后，標(biāo)號，再稱量各小鼠體重，記錄并計算相應(yīng)給藥體積(0.1ml/10g)。蒸餾水配制3％的葡聚糖硫酸鈉(dss)(30mg/ml)水溶液，供與除正常組(給予蒸餾水)之外的各組小鼠自由飲用7天以誘導(dǎo)急性潰瘍性結(jié)腸炎模型。

模型建立的同時，各組小鼠給予相應(yīng)的藥物進(jìn)行治療，其中control組，dss組給予治療藥物的相應(yīng)溶劑，每日一次，持續(xù)給藥7天。

1.4疾病活動指數(shù)(diseaseactivityindex，dai)評分

實驗過程中，每天記錄小鼠體重、活動狀況、糞便性狀、便血情況。dai評分按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行：

體重變化評分：體重未變化，記為0分；體重下降1-5％，記為1分；5-10％，記為2分；10-20％，記為3分；體重變化大于20％，記為4分。

大便性狀評分：正常，0分；糞便較軟，1分；糞便濕軟2分；半稀便，3分；稀便，4分。

便潛血評分：無血便，0分；便血檢測陽性，2分；明顯血便，4分。

評分后計算3部分評分并求得平均值。dai評分的范圍為0分(健康狀態(tài))-4分(嚴(yán)重結(jié)腸炎)。此外，實驗第8天，剖取結(jié)腸后，立即觀察結(jié)腸有無水腫、粘連、潰瘍、壞死等。

1.5結(jié)腸取材及結(jié)腸組織病理學(xué)觀察、組織損傷評分

實驗結(jié)束后用頸脫臼法全部處死，并馬上剖取結(jié)腸組織，測量結(jié)腸長度并拍照比較。每組隨機(jī)取6只小鼠結(jié)腸等分為2份，一份放入4％多聚甲醛中固定，用于蘇木精-伊紅(he)染色，另每組隨機(jī)取6只小鼠結(jié)腸，放入ep管中，用于后續(xù)wb測定；剩余小鼠結(jié)腸(10只)收取用于elisa及氧化試劑盒測定。收好材后，放入-80℃冰箱保存，以使用于后繼實驗。

參照文獻(xiàn)進(jìn)行結(jié)腸炎癥和損傷程度組織學(xué)病理評分(histologicalscore)：

a.炎癥程度—0分：無炎癥；1分：淺顯炎癥；2分：輕微潰瘍；3分：明顯潰瘍。

b.隱窩損傷程度—0分：形態(tài)正常；1分：少量隱窩變形；2分：中等水平隱窩變形；3分：高水平隱窩變形；4分：明顯的隱窩缺失。

c.炎癥浸潤面積—0分：無炎癥細(xì)胞浸潤；1分：10％視野呈低水平炎癥細(xì)胞浸潤；2分：10-25％視野呈中等水平炎癥細(xì)胞浸潤；3分：25-50％視野呈高水平炎癥細(xì)胞浸潤；4分：明顯炎癥細(xì)胞浸潤。

d.腸壁炎癥深度—0分：無炎癥；1分：炎癥限于黏膜層；2分：炎癥逐步深入黏膜下層：3分：炎癥深入固有層。

結(jié)腸炎癥和損傷程度組織學(xué)病理評分的總分為0分(正常)—14分(嚴(yán)重腸炎)不等。

1.6結(jié)腸組織中炎癥因子、氧化應(yīng)激變化的測定

于冰上稱取結(jié)腸組織，置于4mlep管中，冰上剪碎，立即加入9倍量的組織勻漿液(pbs)，勻漿1min，勻漿液于4℃、10,000×g離心15min，取上清，分裝。

采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定法(elisa)來測定結(jié)腸勻漿中的炎癥因子，如tnf-α、il-1β、ifn-γ、il-6、il-4、il-10等。以標(biāo)準(zhǔn)品在450nm和570nm處的吸光度的差值(od450nm-od570nm)為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并建立對應(yīng)方程，再計算各樣品的炎癥因子的表達(dá)水平。

參照試劑盒說明書(比如參照bestbio公司bca蛋白分析試劑盒說明書)，準(zhǔn)確稱定組織重量，制備組織勻漿液，來測定各組結(jié)腸組織中mpo、mda、sod和gsh-px的含量。

1.7westernblotting檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

1.7.1總蛋白提取

組織塊用冷pbs洗滌2-3次，去除血污，剪成小塊置于勻漿器。加入10倍組織體積本試劑(使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑)冰上徹底勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，振蕩。冰浴30min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保細(xì)胞完全裂解。12000g離心10min，收集上清，即為總蛋白溶液。

1.7.2細(xì)胞漿蛋白提取

把組織盡可能切成非常細(xì)小的碎片。按照20:1的比例混合適當(dāng)量的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑a和b。并加入pmsf至最終濃度為1mm配制成組織勻漿液。按照每60mg組織加入200μl組織勻漿液的比例混合組織和組織勻漿液，并在玻璃勻漿器內(nèi)充分勻漿。勻漿需在冰浴或4℃進(jìn)行。勻漿后把勻漿液轉(zhuǎn)移到塑料離心管內(nèi)，冰浴放置15分鐘。4℃1,500g離心5分鐘。把上清轉(zhuǎn)移至一預(yù)冷的塑料管中，為抽提得到的部分細(xì)胞漿蛋白。

1.7.3westernblotting檢測蛋白表達(dá)

(1)配制10％的sds-page凝膠；上樣并電泳，上樣完成先75v電壓電泳，再以120電壓電泳；

(2)轉(zhuǎn)膜，pvdf轉(zhuǎn)移目的蛋白，快轉(zhuǎn)，300ma恒流轉(zhuǎn)膜半小時；慢轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)膜過夜，25v恒壓轉(zhuǎn)膜過夜；

(3)5％的脫脂奶粉(0.5％tbst配制)封閉1h；稀釋一抗,4℃孵育過夜(快轉(zhuǎn))，或者4℃孵育抗體3小時(慢轉(zhuǎn))。用tbst洗膜，每次5min，洗三次；將對應(yīng)的二抗抗體(1:3000)，水平搖床低轉(zhuǎn)速搖晃30min，用tbst洗膜，每次5min，洗三次。

(4)用相應(yīng)的顯色液顯色，化學(xué)發(fā)光檢測。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析

各數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±sd)表示，應(yīng)用graphpadprism6軟件制圖，spss23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，各組間差異比較，采用單因素方差分析(one-wayanova)，方差齊時，組間兩兩多重比較采用lsd法；方差不齊時，組間兩兩多重比較采dunnett’st3法，以p<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，表示有顯著性差異。此外與control組比較，#p<0.05，##p<0.01；與dss組比較，*p<0.05，**p<0.01。

二、實驗結(jié)果：

1.2.1鴉膽子苦醇對uc模型小鼠一般癥狀的影響

研究證實dss誘導(dǎo)的小鼠腸炎模型與人類潰瘍性結(jié)腸炎(uc)的臨床特征相似，如體重減輕、腹瀉、便血等。發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，正常小鼠體重保持上升趨勢；而用dss造模后，各組小鼠前3天體重均呈下降趨勢，第4天后，dss組小鼠體重明顯下降且呈持續(xù)下降狀態(tài)；給藥各組體重呈增長趨勢，其中brh(1mg/kg)組小鼠體重增長明顯，brl(0.25mg/kg)、brm(0.5mg/kg)組及aza、sasp組體重增長趨勢相似。各組體重變化如圖2-b所示。

同時，在造模期間發(fā)現(xiàn)，dss組小鼠便血情況嚴(yán)重，而給藥后明顯緩解血便的癥狀。上述觀察到的現(xiàn)象，結(jié)合小鼠體重變化及排便癥狀進(jìn)行疾病活動指數(shù)評分，dai評分結(jié)果如圖2-a所示，dss組小鼠較control組dai評分明顯要高(p<0.01)，而給藥后，各給藥組dai評分明顯降低(均有顯著性差異，p<0.01)，鴉膽子苦醇給藥組dai評分具有劑量依賴關(guān)系。

此外，如圖2-c和2-d所示，造模后，dss組小鼠結(jié)腸顯著縮短(與control組相比，p<0.01)；而給藥治療后情況有所恢復(fù)，且給藥各組小鼠結(jié)腸長度均較dss組顯著增長。綜上，可知鴉膽子苦醇，尤其是高劑量組，可改善dss誘導(dǎo)的uc模型小鼠的宏觀表現(xiàn)，具有明顯抗uc的作用。

1.2.2鴉膽子苦醇對uc模型小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用

由結(jié)腸組織病理切片he染色結(jié)果(如圖3-a所示)可見，control組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，粘膜無明顯缺損，腺體排列整齊、無萎縮，粘膜固有層無明顯的炎細(xì)胞浸潤。dss組結(jié)腸組織顯示有明顯的壞死灶侵及結(jié)腸粘膜的上皮層、黏膜層、黏膜下層，部分腸組織出現(xiàn)壞死。大量炎性細(xì)胞浸潤粘膜下層，腸壁潰瘍面覆蓋有壞死的組織，粘膜、腺體排列紊亂，粘膜固有層中的腺體萎縮甚至消失，取而代之的是大量的炎性細(xì)胞。其組織病理學(xué)評分(histologicalscore)，顯著高于control組(p<0.01)。

藥物治療后，鴉膽子苦醇各劑量組較dss組情況有所好轉(zhuǎn)，黏膜上皮脫落減少；固有層腺窩排列均相對整齊，此外黏膜層及下層炎癥細(xì)胞減少；肌層及漿膜較完整，且鴉膽子苦醇修復(fù)腸組織的能力呈劑量依賴性。此外，經(jīng)sasp及aza治療后，壞死灶、潰瘍與模型組比較有所減少，粘膜上皮和固有層腺體破壞有所減輕，淋巴細(xì)胞浸潤粘膜層及粘膜下層與模型組有明顯減少，炎癥明顯的減輕，炎性細(xì)胞浸潤到粘膜層、粘膜下層有所減輕，潰瘍面有所縮小。再者，給藥各組病理學(xué)評分較dss組明顯降低，且有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.01)。結(jié)合病理結(jié)構(gòu)變化和病理學(xué)評分差異結(jié)果可知，鴉膽子苦醇、sasp和aza能有效改善dss所致的結(jié)腸組織損傷，以進(jìn)一步緩解uc發(fā)病。

1.2.3鴉膽子苦醇對uc模型小鼠結(jié)腸組織中各細(xì)胞因子的影響

如圖4(a-f)所示，dss組小鼠結(jié)腸組織中促炎因子(tnf-α、il-1β、ifn-γ、il-6)均顯著升高而抗炎因子(il-4、il-10)顯著降低(p<0.01，與對照組比較)。鴉膽子苦醇各劑量治療后，促炎因子濃度顯著下降而抗炎因子濃度顯著上升(p<0.01與模型組比較)，且鴉膽子苦醇高劑量組(1mg/kg)效果最強(qiáng)。

上述結(jié)果表明dss誘導(dǎo)的uc模型小鼠結(jié)腸出現(xiàn)明顯的炎癥癥狀，而鴉膽子苦醇能有效減輕炎癥癥狀，且效果較sasp和aza更好，表明其具有抗uc的作用。

1.2.4鴉膽子苦醇對uc模型小鼠結(jié)腸組織中氧化應(yīng)激的影響

如圖5所示，與對照組比較，dss組結(jié)腸組織中髓過氧化物酶(mpo)和丙二醛(mda)水平顯著升高，而超氧化物歧化酶(sod)和谷胱甘肽過氧化物酶(gsh-px)的水平顯著下降(p<0.01)。而與dss組相比，用鴉膽子苦醇給藥治療后可以明顯減少結(jié)腸中的mpo和mda含量以及增強(qiáng)sod和gsh-px水平(p<0.01)，其治療作用呈劑量依賴性方式。給予sasp和aza也有一定的治療作用，但效果不及鴉膽子苦醇。

1.2.5鴉膽子苦醇對uc模型小鼠結(jié)腸組織中tlr4,myd88和nf-κbp65蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，dss組的結(jié)腸組織中tlr4、myd88和nf-κbp65總蛋白的表達(dá)顯著升高(p<0.01，與對照組比較)。然而用鴉膽子苦醇不同劑量的治療后導(dǎo)致tlr4的表達(dá)以劑量依賴性方式顯著減弱(p<0.01)。低劑量鴉膽子苦醇(0.25mg/kg)和sasp治療后myd88和nf-κbp65蛋白沒有明顯的改變(p>0.05)，高劑量鴉膽子苦醇(1mg/kg)的導(dǎo)致結(jié)腸炎的小鼠中三種蛋白質(zhì)的表達(dá)明顯減少(p<0.01-0.05)。由此可知，鴉膽子苦醇是通過抑制myd88介導(dǎo)的tlr4/nf-κb信號傳導(dǎo)通路的激活，從而減輕結(jié)腸炎癥，體現(xiàn)出抗uc活性。

綜上所述，鴉膽子苦醇具有抗炎癥性腸病的活性，且其在保護(hù)腸組織免受dss誘導(dǎo)的炎癥或損傷的過程中，其作用機(jī)制與抑制nf-κb通路的活化，進(jìn)而下調(diào)復(fù)雜的促炎細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，減輕腸道炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激和黏膜損傷有關(guān)。鴉膽子苦醇能夠抑制發(fā)病期間病變部位的炎癥因子表達(dá)，減少炎癥細(xì)胞的浸潤，緩解腸道炎癥反應(yīng)，維持腸組織正常結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，改善腹痛、腹瀉、便血等不良癥狀，對炎癥性腸病具有較好的治療作用。

盡管已用具體實施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。