發(fā)明領域
本申請涉及包含槲皮素的組合物及其用途。具體地,本申請涉及槲皮素或包含槲皮素的藥物組合物在治療或預防腎臟相關疾病中的用途。
發(fā)明背景
腎囊腫性疾病是以腎臟出現(xiàn)內(nèi)覆上皮細胞囊腫為特征的囊性疾病。囊腫可有單個或多個,內(nèi)含液體或半固體碎片,多為遺傳性,也可為后天獲得性。
腎囊腫性疾病包括多囊腎病。多囊腎病又名potterⅰ綜合征、perlmann綜合征、先天性腎囊腫瘤病、囊胞腎、雙側(cè)腎發(fā)育不全綜合征、腎臟良性多房性囊瘤、多囊病,本病臨床并不少見。多囊腎有兩種類型,常染色體隱性遺傳型(嬰兒型)多囊腎,發(fā)病于嬰兒期,臨床較罕見;常染色體顯性遺傳型(成年型)多囊腎,常于青中年時期被發(fā)現(xiàn),也可在任何年齡發(fā)病。常染色體顯性遺傳型多囊腎病(autosomaldominantpolycystickidneydisease,adpkd)是一種常見的單基因遺傳性疾病,發(fā)病率約為1/400~1/1000,多在成年以后發(fā)病且預后不良,以雙腎多發(fā)性進行性囊泡為主要特征,最終可導致終末期腎病esrd,也是國際腎臟疾病研究的熱點之一。
目前,臨床上主要采用腎移植和透析治療多囊腎病導致的終末期腎衰,所以開發(fā)新的有效治療藥物至關重要。
槲皮素(quercetin,qu)是一種廣泛存在于植物界的黃酮類化合物,其化學名為3,3’,4’,5,7-五羥基黃酮,多以苷的形式在植物界分布廣泛,廣泛存在于植物的花、葉、果實中。發(fā)明人在本申請中提供了槲皮素對腎囊腫性疾病,特別是多囊腎病的防治作用。
發(fā)明概述
第一方面,本申請?zhí)峁┝碎纹に鼗蚱渌帉W上可接受的鹽或者包含槲皮素或其藥學上可接受的鹽的組合物在制備用于治療或預防個體的腎囊腫性疾病的藥物中的用途。
在一些實施方案中,所述腎囊腫性疾病為多囊腎病。在一些實施方案中,所述多囊腎病為常染色體顯性遺傳型多囊腎病。
在一些實施方案中,所述槲皮素或其藥學上可接受的鹽和/或所述槲皮素或其藥學上可接受的鹽與藥學上可接受的載體一起被配制成藥學上可接受的劑型。在一些實施方案中,所述劑型優(yōu)選為注射劑、口服液、膠囊、片劑、顆粒劑。
在一些實施方案中,包含槲皮素或其藥學上可接受的鹽的藥物經(jīng)皮下、口服、肌肉內(nèi)或腹腔內(nèi)給藥。在一些實施方案中,以上所述藥物優(yōu)選經(jīng)皮下給藥。
在一些實施方案中,所述槲皮素或其藥學上可接受的鹽的給藥劑量為每天100-250mg/kg體重。在一些實施方案中,所述槲皮素或其藥學上可接受的鹽的給藥劑量優(yōu)選為每天200mg/kg體重。
在一些實施方案中,所述治療或預防個體的腎囊腫性疾病包括抑制個體的腎臟囊泡形成和/或生長、降低個體的腎臟囊腫程度、降低個體的腎臟體重比和/或降低個體的腎臟囊腫指數(shù)。
在一些實施方案中,所述個體為哺乳動物,其包括非靈長類和靈長類動物。
第二方面,本申請?zhí)峁┝酥委熌I囊腫性疾病的組合物,其包含抑制腎臟囊腫的活性成分以及藥學上可接受的載體,其中所述活性成分包含槲皮素或其藥學上可接受的鹽。
第三方面,本申請?zhí)峁┝酥委熁蝾A防個體腎囊腫性疾病例如多囊腎病的方法,其包括給予個體治療有效量或預防有效量的槲皮素或其藥學上可接受的鹽或者包含槲皮素或其藥學上可接受的鹽的組合物。
第四方面,本申請?zhí)峁┝碎纹に鼗蚱渌帉W上可接受的鹽或者包含槲皮素或其藥學上可接受的鹽的組合物,其用于治療或預防個體腎囊腫性疾病例如多囊腎病。
附圖簡要說明
圖1為槲皮素的化學結(jié)構式。
圖2為顯示在10μm佛司可林(forskolin)的持續(xù)刺激下,mdck囊泡形成的圖。
圖3為顯示槲皮素對mdck囊泡形成的抑制作用的圖。
圖4為顯示不同濃度的槲皮素對囊泡生長的抑制作用的圖,其中圖4a表示僅用含10μm佛司可林的培養(yǎng)液培養(yǎng)的結(jié)果,圖4b表示用含2.5x10-6m的槲皮素和10μm佛司可林的培養(yǎng)液培養(yǎng)的結(jié)果,圖4c表示用含5x10-6m的槲皮素和10μm佛司可林的培養(yǎng)液培養(yǎng)的結(jié)果,以及圖4d表示用含1x10-5m的槲皮素和10μm佛司可林的培養(yǎng)液培養(yǎng)的結(jié)果。
圖5為不同濃度的槲皮素對囊泡生長的抑制作用曲線。
圖6顯示利用cck-8法檢測的槲皮素對mdck細胞的細胞毒性作用,其中對照為含有細胞、相同濃度化合物的溶解介質(zhì)、培養(yǎng)基、cck-8,但不包含槲皮素的對照孔。
圖7為顯示ksp-cre;pkd1f/f小鼠模擬人類adpkd疾病表型的圖,其中圖a為顯示在pkd1f/f小鼠模型中的腎臟表型的圖;圖b為顯示ksp-cre;pkd1f/f小鼠模型中的腎臟表型的圖。圖8為顯示ksp-cre;pkd1f/f小鼠基因型的pcr檢測結(jié)果的圖。
圖9為顯示對照組和治療組ksp-cre;pkd1f/f小鼠的腎臟he染色結(jié)果的圖,其中治療組小鼠從出生后第4天至出生后第10天,連續(xù)7天背部皮下注射dmso溶解的槲皮素,施用劑量為每天200mg/kg體重;對照組小鼠每天注射等體積的dmso。
圖10為顯示小鼠的腎臟囊腫指數(shù)測定結(jié)果的圖。
發(fā)明詳述
本申請的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)槲皮素或者包含槲皮素的藥物組合物能夠治療或預防腎囊腫性疾病,特別是多囊腎病。
除非另外指明,本申請中所有的術語均具有本領域技術人員通常所理解的含義。
本申請?zhí)峁┝碎纹に鼗蚱渌帉W上可接受的鹽或者包含槲皮素或其藥學上可接受的鹽的組合物在制備用于治療或預防個體的腎囊腫性疾病的藥物中的用途。
腎臟囊腫性疾病包括一組可在腎臟不同部位出現(xiàn)的單個或多個囊腫性疾病。在一些實施方案中,所述腎囊腫性疾病為多囊腎病。在具體實施方案中,所述多囊腎病為常染色體顯性遺傳型多囊腎病(adpkd)。
adpkd的發(fā)病原因是pkd1或pkd2基因發(fā)生突變,此兩種基因編碼的蛋白分別稱為多囊蛋白1(polycystin-1,pc1)和多囊蛋白2(polycystin-2,pc2)。pc1是一種上皮細胞膜受體,pc2是一種非選擇性鈣離子通道,兩者表達于腎小管上皮細胞纖毛部位,pc1和pc2可相互作用,調(diào)節(jié)細胞外ca2+的內(nèi)流。pkd1或pkd2基因發(fā)生突變導致的后果就是引起囊泡形成、囊泡上皮細胞異常增殖和囊泡液體過度分泌,繼而導致多囊腎病理學改變。
本申請發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠抑制囊泡形成和生長,明顯抑制腎囊腫程度,對腎囊腫性疾病特別是多囊腎病具有很好的治療和/或預防作用。
本文所用的“治療”包括抑制、治愈、減輕、緩解或延緩腎囊腫性疾病(例如多囊腎病)以及相關癥狀。
在一些實施方案中,槲皮素或其藥學上可接受的鹽和/或所述槲皮素或其藥學上可接受的鹽與藥學上可接受的載體一起被配制成藥學上可接受的劑型,優(yōu)選為注射劑、口服液、膠囊、片劑、顆粒劑。
本申請所述的“藥學上可接受的載體”指不干擾活性成分的生物活性有效性的載體,包括制藥領域常規(guī)使用的那些。本申請的藥學上可接受的載體可以為固體或液體,包括藥學上可接受的賦形劑、緩沖劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、稀釋劑、封裝劑、填充劑等。例如,藥學上可接受的緩沖劑進一步包括磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽以及碳酸鹽等。
本申請的藥物組合物可以呈現(xiàn)為單位劑量形式,并且可以通過任一制藥領域公知的方法制備。所有方法均包括將本申請的活性成分與一種或幾種藥學上可接受的載體結(jié)合的步驟。通常,通過將活性成分與液體載體、固體載體或二者結(jié)合來制備組合物,隨后根據(jù)需要來定型制備的產(chǎn)物。具體的配制方法依賴于選擇的給藥途徑。在一些實施方案中,藥物組合物可以通過常規(guī)的混合、溶解、制粒、制錠、研磨、乳化、包封、捕獲或凍干方法制造。
在一些實施方案中,所述藥物經(jīng)口、皮下、腸胃外、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、顱內(nèi)、鞘內(nèi)、腹腔內(nèi)、局部、鼻內(nèi)或肌肉內(nèi)給藥。在具體的實施方案中,所述藥物經(jīng)皮下給藥。
在一些實施方案中,本文公開的組合物可以配制成注射劑,比如皮下、靜脈內(nèi)和肌內(nèi)注射劑。制備注射制劑時,根據(jù)需要將有效成分與ph調(diào)節(jié)劑、緩沖液、助溶劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或防腐劑混合,然后按照常規(guī)方法制備成皮下、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射制劑。例如,可以將槲皮素或其藥學可接受的鹽等活性成分配制進水溶液中,優(yōu)選用生理學上可接受的緩沖液,例如hank’s溶液、林格氏液或生理鹽水或醋酸緩沖液(以減輕注射位點處的不適)來配制?;蛘撸鏊幬锝M合物可以是用于在使用前用合適的載體(例如無菌無熱源水)復原的粉末形式。
在一些實施方案中,對于經(jīng)口給藥,可以將諸如槲皮素或其藥學可接受的鹽的活性成分與藥學上可接受的載體一起配制為片劑、丸劑、錠劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿體、懸浮液等。對于口服固體配制物例如粉末、膠囊和片劑而言,合適的賦形劑包括填充劑例如糖,如乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨糖醇;纖維素制劑例如玉米淀粉、小麥淀粉、稻淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、西黃蓍膠、甲基纖維素、羧丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚維酮;制粒劑和粘合劑等。如果需要,可以添加崩解劑,例如交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或者海藻酸或其鹽,例如海藻酸鈉。如果需要,可以使用標準技術對固體劑型進行糖包裹或腸溶衣包裹。對于口服液體制劑例如懸浮液、酏劑和溶液而言,合適的載體、賦形劑或稀釋劑包括水、甘油、油、醇。另外,可以添加調(diào)味劑、防腐劑、著色劑等。
除了前述制劑外,還可以將槲皮素或其藥學上可接受的鹽配制成儲存制劑。可以通過植入(例如皮下或肌內(nèi))或通過肌內(nèi)注射來施用這類長效制劑。因此,例如可將化合物與合適的多聚體材料或疏水材料(例如配制為可接受的油中的乳劑)或離子交換樹脂配制在一起,或配制為略溶的衍生物,例如配制為略溶的鹽。
本領域已知,治療或預防腎囊腫性疾病例如多囊腎病所用的槲皮素的給藥劑量取決于被治療的受試者、受試者的體重、疾病的嚴重性、給藥方式等。醫(yī)生可以根據(jù)具體情況確定給藥劑量。本文中所用的“治療有效量”或“預防有效量”可以根據(jù)具體情況而定,本領域普通技術人員根據(jù)實際所需藥量可以很容易地掌握,如可根據(jù)患者體重、年齡和病癥情況等來確定。
本申請使用的槲皮素或其藥學上可接受的鹽能夠提供治療益處而沒有明顯的毒性。例如,可以通過cck-8方法來測定槲皮素的細胞毒性。毒性效應和治療效應的劑量比例是治療指數(shù)。實驗證實本申請施用的槲皮素無明顯的細胞毒性。
在一些實施方案中,本申請所述的槲皮素或其藥學上可接受的鹽的給藥劑量為每天給予100-250mg/kg體重。在一些實施方案中,所述槲皮素或其藥學上可接受的鹽的給藥劑量為每天給予100mg/kg體重、110mg/kg體重、120mg/kg體重、130mg/kg體重、140mg/kg體重、150mg/kg體重、160mg/kg體重、170mg/kg體重、180mg/kg體重、190mg/kg體重、200mg/kg體重、210mg/kg體重、220mg/kg體重、230mg/kg體重、240mg/kg體重、250mg/kg體重或者上述任意兩值之間的劑量。在一些實施方案中,所述槲皮素或其藥學上可接受的鹽的給藥劑量優(yōu)選為每天200mg/kg體重。
在一些實施方案中,上述治療或預防個體的腎囊腫性疾病包括抑制個體的腎臟囊泡形成和/或生長、降低個體的腎臟囊腫程度、降低個體的腎臟體重比或者降低個體的腎臟囊腫指數(shù)。
在一些實施方案中,本申請的槲皮素或其藥學上可接受的鹽或者包含槲皮素或其藥學上可接受的鹽的藥物組合物能夠用于抑制細胞形成囊泡和/或抑制囊泡生長。在具體實施方案中,細胞為哺乳動物細胞,例如為犬腎細胞或人腎細胞。在一些具體的實施方案中,槲皮素明顯抑制犬腎細胞(mdck)囊泡形成和生長,且呈劑量效應關系。實驗表明,槲皮素無細胞毒性作用,其抑制囊泡形成和生長的作用與其細胞毒性無關。
在一些實施方案中,本申請的槲皮素或其藥學上可接受的鹽或者包含槲皮素或其藥學上可接受的鹽的藥物組合物能夠用于降低個體的腎臟囊腫程度。在具體實施方案中,所述個體患有多囊腎病,例如adpkd。
在一些實施方案中,本申請的槲皮素或其藥學上可接受的鹽或者包含槲皮素或其藥學上可接受的鹽的藥物組合物能夠用于降低個體的腎臟體重比。在具體實施方案中,所述個體患有多囊腎病,例如adpkd。在具體的實施方案中,腎臟體重比的計算公式為:雙側(cè)腎臟重量(g)/體重(g)。
在一些實施方案中,本申請的槲皮素或其藥學上可接受的鹽或者包含槲皮素或其藥學上可接受的鹽的藥物組合物能夠用于降低個體的腎臟囊腫指數(shù)。在具體實施方案中,所述個體患有多囊腎病,例如adpkd。在具體的實施方案中,腎臟囊腫指數(shù)為腎臟囊腫區(qū)域面積的總和與腎臟面積的比值。
本申請所述的“個體”,是指包含鳥類、爬行類和哺乳類的動物。在一些實施方案中,所述動物是哺乳動物,包括靈長類和非靈長類動物,例如人、黑猩猩、牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓,以及諸如大鼠和小鼠的嚙齒類動物。
本說明書和權利要求書中,詞語“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”,且并非意圖排除其他部分、添加物、組分、或步驟。
應當理解,以上詳細描述僅為了使本領域技術人員更清楚地了解本申請的內(nèi)容,而并非意圖在任何方面加以限制。本領域技術人員能夠?qū)λ鰧嵤┓桨高M行各種改動和改變。
實施例
提供以下實施例僅是對本申請的一些實施方案進行舉例說明,沒有任何限制的目的或性質(zhì)。
下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明,均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業(yè)途徑得到。
實施例1:槲皮素對囊泡形成和生長的抑制作用
1.囊泡形成抑制實驗
犬腎細胞(mdck)在含有佛司可林(forskolin)的三維基質(zhì)膠中培養(yǎng)可形成囊泡,并可持續(xù)生長,其囊泡特性與多囊腎病囊泡的特性相似,是篩選治療腎囊腫性疾病的有效化合物并進行藥理學活性評價的最佳體外模型。
首先將對數(shù)生長期的mdck細胞(購自中國科學院上海生命科學研究院,商品目錄號gno23)制成細胞混懸液,在24孔板中每孔給予0.4ml含1000個左右細胞的混懸液,混懸液成分包括2.655×的mem培養(yǎng)液、3.2mg/ml基質(zhì)膠(purecol,advancedbiomatrix)、1mhepes、5%nahco3、1nnaoh、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素。30分鐘后,含基質(zhì)膠的混懸液凝固,每孔給予0.75ml含10μm佛司可林(購自sigma公司,貨號f6886)或者含10μm佛司可林和槲皮素(購自sigma公司,貨號q4951)的dmem與f-12混合培養(yǎng)液(1:1)(購自hyclone公司,貨號sh30023.013),培養(yǎng)12天。每天更換新鮮培養(yǎng)液以維持藥物活性,每組設3個復孔。在培養(yǎng)第12天計數(shù)圓形囊泡和非囊泡細胞集落,計算囊泡數(shù)占總細胞集落(囊泡和非囊泡集落)數(shù)的百分率,以此評價待測藥物對囊泡形成的抑制作用。囊泡的形成如圖2所示,在佛司可林的持續(xù)刺激下,囊泡不斷增大。槲皮素對mdck囊泡形成的抑制作用如圖3所示,結(jié)果顯示槲皮素可以明顯減少佛司可林誘導的mdck的囊泡數(shù)目,說明槲皮素對mdck囊泡形成具有明顯的抑制作用。
2.囊泡生長抑制實驗
mdck細胞在三維基質(zhì)膠中可形成細胞集落,若給予佛司可林刺激可形成圓形囊泡,且囊泡不斷增大。在給予佛司可林刺激的同時分別給予2.5x10-6m、5x10-6m和1x10-5m的槲皮素,共同培養(yǎng)細胞。每天更換新鮮培養(yǎng)液以維持藥物活性。分別在培養(yǎng)第4天、第6天、第8天、第10天對囊泡進行原位跟蹤照相并測量囊泡直徑以評價槲皮素抑制囊泡生長的效果。每組設3個復孔,每孔計數(shù)10個以上囊泡并作囊泡生長曲線。槲皮素對囊泡生長的抑制作用如圖4所示。圖4a表示僅用含10μm佛司可林的培養(yǎng)液培養(yǎng)的結(jié)果,圖4b表示用含2.5x10-6m的槲皮素和10μm佛司可林的培養(yǎng)液培養(yǎng)的結(jié)果,圖4c表示用含5x10-6m的槲皮素和10μm佛司可林的培養(yǎng)液培養(yǎng)的結(jié)果,圖4d表示用含1x10-5m的槲皮素和10μm佛司可林的培養(yǎng)液培養(yǎng)的結(jié)果。槲皮素對囊泡生長的抑制作用曲線如圖5所示,以上結(jié)果表明,槲皮素能夠明顯抑制囊泡的生長。
實施例2:槲皮素的細胞毒性作用測定
通過cck-8法確定槲皮素對細胞有無毒性作用。
首先將對數(shù)生長期的mdck細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板(8x103個細胞/孔),每孔給予100μldmem/f12(1:1)培養(yǎng)液,置于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。用含0.4%fbs的混合培養(yǎng)基同步化12小時。棄去舊培養(yǎng)液,然后在96孔板中加入分別含0、2.5x10-6m、5x10-6m、1x10-5m以及2x10-5m濃度的槲皮素的新鮮培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24小時,每孔給予10μlcck-8檢測液,并于37℃避光孵育60分鐘。酶標儀檢測各孔的od值(檢測波長為450nm)。設置調(diào)零孔(包含培養(yǎng)基和cck-8)和對照孔(包含細胞、相同濃度化合物的溶解介質(zhì)、培養(yǎng)基和cck-8),每組設定6個復孔,實驗重復三次。槲皮素的細胞毒性的測定結(jié)果如圖6所示,結(jié)果表明,1x10-5m及其以下濃度的槲皮素對mdck細胞無細胞毒性作用,說明槲皮素對囊泡的形成和生長的抑制與其細胞毒性無關。
實施例3:槲皮素對體內(nèi)多囊腎發(fā)展的抑制作用
利用ksp-cre;pkd1f/f小鼠模型確定槲皮素對多囊腎發(fā)展的抑制作用。
ksp-cre;pkd1f/f小鼠是利用cre-loxp系統(tǒng)建立的條件性腎臟敲除pkd1的小鼠模型,其可產(chǎn)生與人類常染色體顯性遺傳型多囊腎病類似的臨床癥狀,ksp-cre;pkd1f/f小鼠早期在出生后20天前死于腎衰竭,而同窩的pkd1f/f小鼠則表型正常,結(jié)果如圖7所示。因此ksp-cre;pkd1f/f小鼠可作為adpkd動物模型。
1.ksp-cre;pkd1f/f小鼠模型的基因鑒定
ksp-cre;pkd1f/+小鼠由北京大學基礎醫(yī)學院藥理學系贈與。
提取小鼠腳趾基因組,以其為模板,分別對pkd1基因和cre基因進行pcr鑒定,其中針對pkd1基因的pcr所用引物序列如下:
5’-ccgctgtgtgtctcagtgtctg-3’(seqidno.:1);
5’-caagagggcttttcttgctg-3’(seqidno.:2),
針對cre基因的pcr所用引物序列如下:
5’-ccgggctgccacgaccaa-3’(seqidno.:3);
5’-ggcgcggcaacaccattttt-3’(seqidno.:4)
當用針對pkd1基因的兩條引物進行pcr擴增時,如果得到大小為400bp和200bp的兩個條帶,則對應的子代小鼠的pkd1-loxp基因雜合(pkd1f/+),如果得到大小400bp的單一條帶,則對應的子代小鼠的pkd1-loxp基因純合(pkd1f/f);當用針對cre基因的兩條引物進行pcr擴增時,如果得到大小為400bp條帶,則對應的子代小鼠表達ksp-cre,如果沒有400bp的條帶,則對應的子代小鼠不表達ksp-cre。結(jié)果如圖8所示,圖a中的pkd1f/f為pkd1-loxp基因純合,圖b中的ksp-cre為小鼠可表達ksp-cre。經(jīng)過以上鑒定,子代小鼠中得到的pkd1-loxp基因純合,同時可表達ksp-cre,即為ksp-cre;pkd1f/f小鼠。
2.槲皮素對ksp-cre;pkd1f/f小鼠的處理和作用效果
以ksp-cre;pkd1f/f小鼠作為adpkd動物模型,來研究槲皮素對多囊腎病的作用。
實驗方法
1.實驗分組及處理
槲皮素溶液:用dmso溶解槲皮素,終濃度為100mg/ml。
分組及處理:實驗分為對照組和治療組,每組7只ksp-cre;pkd1f/f小鼠。從小鼠出生后第4天開始到出生后第10天,連續(xù)7天給藥,給藥方式為背部皮下給藥,治療組每只小鼠每天給藥劑量為200mg/kg體重,對照組小鼠每天注射等體積的dmso。
2.各組小鼠治療情況分析
(1)he染色分析兩組小鼠的腎囊腫表型
在小鼠出生后第10天,處死小鼠并摘除雙側(cè)腎臟。用電子天平精確稱重,計算腎臟體重比(g/g),即雙側(cè)腎臟重量(g)/體重(g)。隨后用10%中性福爾馬林溶液固定48小時,然后梯度乙醇脫水,用石蠟包埋機常規(guī)包埋,隨后將蠟塊切片并進行he染色。
上述脫水、包埋、切片及he染色的具體操作步驟如下所述。
a.脫水和包埋的具體步驟為:
①70%乙醇中脫水1h→75%乙醇中靜置1h→80%乙醇中靜置1h→85%乙醇中靜置1h→90%乙醇中靜置1h→95%乙醇中靜置1h→100%乙醇中靜置1h→二甲苯中靜置15min×2;
②包埋:石蠟包埋機進行包埋。
b.切片的具體步驟為:
將腎臟蠟塊在輪轉(zhuǎn)式切片機上切成3μm厚度的連續(xù)腎組織切片,用毛筆輕輕扶起,在42℃溫水中將其充分展開,再用病理級粘附玻片撈起腎組織切片,60℃恒溫烘烤2小時,以使組織切片與玻片緊密粘連,置于盒中備用。
c.he染色的原理以及具體步驟
he染色的原理:蘇木素染液為堿性,主要使細胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍色;伊紅為酸性染料,主要使細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)中的成分著粉色。
he染色的步驟:二甲苯ⅰ(65℃)中靜置2分鐘→二甲苯ⅱ(65℃)中靜置2分鐘→二甲苯ⅲ(室溫)中靜置2分鐘→無水乙醇中靜置1分鐘→95%乙醇ⅰ中靜置1分鐘→95%乙醇ⅱ中靜置1分鐘→水洗→蘇木素中靜置2分鐘→水洗→1%hcl分化→水洗→li2co3飽和溶液藍化→水洗→85%乙醇中靜置1分鐘→伊紅中靜置2分鐘→80%乙醇中靜置1分鐘→90%乙醇中靜置1分鐘→95%乙醇中靜置1分鐘→無水乙醇ⅰ中靜置2分鐘→無水乙醇ⅱ中靜置2分鐘→二甲苯ⅰ中靜置1分鐘→二甲苯ⅱ中靜置1分鐘→二甲苯ⅲ中靜置1分鐘。
中性樹膠封片,用數(shù)字切片掃描系統(tǒng)(olympusvs120)進行掃描,分析結(jié)果。
(2)兩組小鼠的腎囊腫指數(shù)的分析
將對照組和治療組兩組小鼠he染色的腎臟切片掃描后,應用image-proplus軟件計算腎臟囊腫區(qū)域的面積總和與腎臟面積,并計算兩者的比值,計算結(jié)果即為腎臟囊腫指數(shù)。
實驗結(jié)果
1.兩組小鼠的腎囊腫表型
he染色結(jié)果如圖9所示,從圖中可以看出,治療組小鼠與對照組小鼠相比具有更多的腎實質(zhì)。
2.兩組小鼠的腎臟囊腫指數(shù)
兩組小鼠的腎臟囊腫指數(shù)測定結(jié)果如圖10所示,相比對照組小鼠,治療組小鼠的腎臟囊腫指數(shù)顯著降低(p=0.008),具有明顯的統(tǒng)計學差異。
本實施例的實驗結(jié)果表明,槲皮素顯著抑制了腎臟囊腫的發(fā)展,能夠用于治療多囊腎病,如常染色體顯性遺傳型多囊腎病。
在不偏離本申請公開的實質(zhì)和范圍的情況下,可對本申請公開的各實施方案進行多種改變和等同替換。除非上下文中另有說明,否則本公開的實施方案的任何特征、步驟或?qū)嵤┓桨付伎梢耘c任何其他特征或?qū)嵤┓桨附M合使用。
序列表
<110>印小星
孫瑩
朱楊楊
楊寶學
滕田
<120>包含槲皮素的藥物組合物及其用途
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