本申請(qǐng)涉及制藥領(lǐng)域，特別涉及中草藥提取物的制備及其用途。
背景技術(shù)：
缺血性心臟病(Ischemic heart disease，IHD)指由于冠狀動(dòng)脈功能性或器質(zhì)性病變，在誘發(fā)因素如過(guò)勞、情緒激動(dòng)、寒冷等刺激下導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈痙攣甚至血栓形成，冠脈血流量驟然降低，致使冠脈供血和心肌需求之間不平衡，心肌代謝產(chǎn)物增加而出現(xiàn)的臨床病理狀態(tài)。IHD是一種高發(fā)病率、高致殘率和高病死率的疾病，已成為我國(guó)第三大致死性疾病。心肌缺血時(shí)會(huì)導(dǎo)致心肌缺氧、心肌細(xì)胞代謝紊亂、心功能降低、有害產(chǎn)物難以清除而產(chǎn)生心絞痛等癥狀。因而盡早恢復(fù)冠脈血流的再灌注，降低心肌耗氧量，清除有害代謝產(chǎn)物是臨床治療心肌缺血最有效的措施。
毛郁金(Curcuma aromatica Salisb)是姜科姜黃屬植物毛郁金的干燥根莖，國(guó)內(nèi)主要分布于廣西等地區(qū)，別名廣西黃姜，目前已收載于《廣西壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》第二版[9]。該藥材氣香、味辛、微苦，具有行氣破血、通經(jīng)止痛之功效。壯醫(yī)常用于阿悶(心絞痛)，京瑟(閉經(jīng))，臘胴尹(腹痛)等病的治療，且療效顯著。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
根據(jù)本申請(qǐng)的一方面，提供了一種毛郁金(Curcuma aromatica Salisb)乙醇提取物的制備方法，包括將毛郁金根莖干燥、粉碎成粗粉，用相同體積量50％至70％乙醇浸泡過(guò)夜，用10-20倍量50％至70％乙醇回流提取2-5次，第一次提取2-4小時(shí)，其后每次提取2-3h，減壓回收提取溶劑，真空冷凍干燥。
根據(jù)本申請(qǐng)的另一方面，提供了根據(jù)上述制備方法制得的毛郁金乙醇提取物。
根據(jù)本申請(qǐng)的另一方面，提供了上述毛郁金乙醇提取物在制備用于治 療缺血性心臟病的藥物中的用途。
本申請(qǐng)的毛郁金乙醇提取物對(duì)于心率，ST段和T波的異常有較好的緩解作用，最終接近于正常值，有較強(qiáng)的抗氧化活性，對(duì)心肌缺血有較好的保護(hù)作用。
附圖說(shuō)明
圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例2中各組大鼠的CK-MB、LDH、TAC、NO、MDA和SOD水平。
具體實(shí)施方案
在以下的說(shuō)明中，包括某些具體的細(xì)節(jié)以對(duì)各個(gè)公開的實(shí)施方案提供全面的理解。然而，相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，不采用一個(gè)或多個(gè)這些具體的細(xì)節(jié)，而采用其它方法、部件、材料等的情況下可實(shí)現(xiàn)實(shí)施方案。
除非本申請(qǐng)中另外要求，在整個(gè)說(shuō)明書和權(quán)利要求書中，詞語(yǔ)“包括”和“包含”應(yīng)解釋為開放式的、含括式的意義，即“包括但不限于”。
在整個(gè)本說(shuō)明書中提到的“一實(shí)施方案”或“實(shí)施方案”或“在另一實(shí)施方案中”或“在某些實(shí)施方案中”意指在至少一實(shí)施方案中包括與該實(shí)施方案所述的相關(guān)的具體參考要素、結(jié)構(gòu)或特征。因此，在整個(gè)說(shuō)明書中不同位置出現(xiàn)的短語(yǔ)“在一實(shí)施方案中”或“在實(shí)施方案中”或“在另一實(shí)施方案中”或“在某些實(shí)施方案中”不必全部指同一實(shí)施方案。此外，具體要素、結(jié)構(gòu)或特征可以任何適當(dāng)?shù)姆绞皆谝粋€(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中結(jié)合。
應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語(yǔ)“或”通常以其包括“和/或”的含義而使用，除非文中另外明確地規(guī)定。
根據(jù)本申請(qǐng)的一方面，提供了一種毛郁金(Curcuma aromatica Salisb)乙醇提取物的制備方法，包括將毛郁金根莖干燥、粉碎成粗粉，用相同體積量50％至70％乙醇浸泡過(guò)夜，用10-20倍量50％至70％乙醇回流提取2-5次，第一次提取2-4小時(shí)，其后每次提取2-3h，減壓回收提取溶劑，真空冷凍干燥。
在某些實(shí)施方案中，回流提取步驟中50％至70％乙醇的量為12倍量。
在另一些實(shí)施方案中，第一次提取的時(shí)間為3小時(shí)，第二次提取的時(shí)間為2.5小時(shí)。
根據(jù)本申請(qǐng)的另一方面，提供了根據(jù)上述制備方法制得的毛郁金乙醇提取物。
根據(jù)本申請(qǐng)的另一方面，提供了上述毛郁金乙醇提取物在制備用于治療缺血性心臟病的藥物中的用途。
本申請(qǐng)的毛郁金乙醇提取物對(duì)于心率，ST段和T波的異常有較好的緩解作用，最終接近于正常值，有較強(qiáng)的抗氧化活性，對(duì)心肌缺血有較好的保護(hù)作用。
下文中，本申請(qǐng)將通過(guò)如下實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)解釋以便更好地理解本申請(qǐng)的各個(gè)方面及其優(yōu)點(diǎn)。然而，應(yīng)當(dāng)理解，以下的實(shí)施例是非限制性的而且僅用于說(shuō)明本申請(qǐng)的某些實(shí)施方案。
本申請(qǐng)實(shí)施例中使用的動(dòng)物及材料來(lái)源如下。
1.動(dòng)物
SPF級(jí)健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠，體重180-220g，由廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(桂)2009-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(桂)2009-0004。
2.主要試劑
復(fù)方丹參片(CDT，河南省宛西制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)140805)；異丙腎上腺素(ISO，上海和豐制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)20120701)；福林酚試劑(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，生產(chǎn)批號(hào)20150610)以下試劑均購(gòu)自南京建成科技生物工程研究所：SOD試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)20120823)，MDA測(cè)試盒(生產(chǎn)批號(hào)20120709)，TAC試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)20121026)，CK-MB試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)20121128)，NO試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)20120921)，LDH試劑盒(酶標(biāo)法，20120921)。
3.主要儀器
TDL-5A型高速離心機(jī)(上海菲恰爾分析儀器有限公司)；721紫外分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限科技有限公司)；渦旋混勻器(Genius公司)；電熱恒溫水浴箱(北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠)；高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；心電圖儀(喜鵲牌單導(dǎo)心電圖機(jī)XD-7100，上海醫(yī)療器械高新技術(shù)公司)。
實(shí)施例1 毛郁金醇提物的制備
試物原生藥(采自廣西橫縣)經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥研究員鑒定為姜科毛郁金(Curcuma aromatica Salisb.)，憑證標(biāo)本存放于廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院。將毛郁金根莖干燥、粉碎成粗粉，分別用相同體積量的30％，50％，70％，90％乙醇浸泡過(guò)夜，用12倍量溶劑回流提取4次，第一次提取3h，第2～4次分別提取2.5h，減壓回收提取溶劑，真空冷凍干燥，得各部位粗提膏。各樣品均在4℃冰箱中密封保存?zhèn)溆谩?/p>
實(shí)施例2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物篩選
用45mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，仰位固定于鼠板，將心電圖儀針形電極插入大鼠四肢皮下，儀器設(shè)置為心電圖II導(dǎo)聯(lián)，走紙速度25mm/s。皮下注射異丙腎上腺素ISO 30mg/kg，觀察大鼠注射ISO后心電圖II導(dǎo)聯(lián)T波變化，篩選注射ISO后1min內(nèi)T波升高，ST段抬高(＞0.1mV)隨后T波低平、雙向或倒置的動(dòng)物納入ISO致大鼠急性心肌缺血實(shí)驗(yàn)組。
2.分組與給藥方法
取70只對(duì)ISO敏感的SPF級(jí)SD雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，隨機(jī)分組，每組10只：正常對(duì)照組(Sham)，模型對(duì)照組(Model)，陽(yáng)性藥對(duì)照組(CDT)，30％乙醇提取物組，50％乙醇提取物組，70％乙醇提取物組，90％乙醇提取物組。毛郁金各提取物組給藥劑量均為150mg/kg，約相當(dāng)于生藥原粉給藥量為1.5g/kg劑量；陽(yáng)性藥1對(duì)照組給予姜黃素0.4mg/kg，陽(yáng)性藥2對(duì)照組給予復(fù)方丹參片600mg/kg；正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予相同體積量的生理鹽水，每天灌胃給藥一次，連續(xù)給藥9天。
3.急性心肌缺血模型的建立
ISO模型實(shí)驗(yàn)組于最后兩天給藥的同時(shí)，除正常對(duì)照組皮下注射相同體積量生理鹽水外，各受試藥物組、陽(yáng)性對(duì)照組和模型對(duì)照組均于給藥30min后注射ISO 30mg/kg，1次/天，連續(xù)兩天。
4.觀察指標(biāo)
用45mg/kg劑量的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，仰位固定于鼠板，記錄注射前和注射后不同時(shí)間點(diǎn)(0，30s，1min，3min，5min，7min，10min，15min)大鼠心電圖(Electrocardiogram，ECG)記錄大鼠的心率、 ST段幅度及T波值；于注射ISO 45min后眼眶取血，于4℃下1000g離心分離血清，測(cè)定血清SOD、MDA、TAC、CK-MB、LDH和NO含量。
5.多酚測(cè)定
多酚含量常用福林酚法測(cè)定，其中沒食子酸常用來(lái)做標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定天然產(chǎn)物中多酚的含量。本實(shí)驗(yàn)中，多酚的含量測(cè)定采用了改進(jìn)與優(yōu)化條件的福林酚方法。
將5g毛郁金根莖分別用12倍量的30％、50％、70％和90％濃度的乙醇回流提取3次，趁熱過(guò)濾，減壓回收溶劑，分別得30％、50％、70％和90％乙醇的提取物，然后分別溶解在4個(gè)25mL容量瓶中，并用甲醇定容至25mL，作為提取物溶液。分別用移液槍移取0.1mL提取物溶液至4只10mL比色管中，然后分別用移液槍加入1.5mL福林酚試劑，混合均勻靜置30s后，分別加入2mL12％的Na2CO3溶液，搖勻后分別用蒸餾水定容至10mL，常溫下反應(yīng)1h，每份樣品平行做3次，在最大吸收波長(zhǎng)758nm處測(cè)定吸光值。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：用移液槍分別精確地移取濃度為0.2488mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于10mL比色管中，加入1.5mL的福林酚試劑，放置30s，再加入2mL 12％的Na2CO3溶液搖勻后分別用蒸餾水定容至10mL，常溫下反應(yīng)1h，每份樣品平行做3次，在最大吸收波長(zhǎng)758nm處測(cè)定吸光值。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
7.結(jié)果
7.1毛郁金各部位對(duì)ISO誘導(dǎo)的急性心肌缺血大鼠心率的影響
結(jié)果如表1所示，與正常組比較，ISO誘導(dǎo)大鼠心動(dòng)過(guò)緩，說(shuō)明模型成功。ISO誘導(dǎo)后3min，陽(yáng)性對(duì)照組和90％部位的大鼠心率顯著提高(P＜0.05)，ISO誘導(dǎo)7min后，陽(yáng)性對(duì)照組和90％部位的大鼠心率無(wú)顯著性差異；ISO誘導(dǎo)15min，50％，70％，90％部位的大鼠心率幾乎恢復(fù)至正常水平，相反30％部位的大鼠與假手術(shù)組和模型組比較均無(wú)顯著性差 異。
表1. 毛郁金各部位對(duì)ISO誘導(dǎo)的AMI大鼠心率的影響(n＝10)
30％，50％，70％，90％分別對(duì)應(yīng)于30％、50％、70％、90％乙醇提取部位；P＜0.05表示有顯著性差異；aP＜0.05與假手術(shù)組比較，bP＜0.05與模型組比較。在表2，3，4和圖中所表述含義相同，不重復(fù)。
7.2毛郁金各提取部位對(duì)ISO誘導(dǎo)的急性心肌缺血大鼠T波和ST波的影響
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2和表3所示，ISO誘導(dǎo)15分鐘后，與假手術(shù)組比較，毛郁金各提取部位及陽(yáng)性藥CDT組大鼠的T波和ST波基本恢復(fù)正常，然而，陰性組大鼠的T波和ST波顯著提高(P＜0.05)，說(shuō)明毛郁金提取物有抑制ISO誘導(dǎo)大鼠T波和ST波上升的作用。陽(yáng)性組、50％、90％提取部位的大鼠，給藥1分鐘后，ST波明顯降低，30％和70％部位7分鐘后顯示相同的作用。另一方面，毛郁金30％，50％和70％部位的大鼠，ISO誘導(dǎo)后3分鐘，T波顯著減小(P＜0.05，和模型組比較)，陽(yáng)性組和90％部位的大鼠ISO誘導(dǎo)7分鐘后顯示相同的藥理活性。上述現(xiàn)象說(shuō)明毛郁金提取部位與CDT均可以改善ISO誘導(dǎo)大鼠的T波和ST波改變。
表2 毛郁金各提取部位對(duì)ISO誘導(dǎo)AMI大鼠ST波的影響(n＝10)
表3 毛郁金各提取部位對(duì)ISO誘導(dǎo)AMI大鼠T波的影響(n＝10)
7.3毛郁金各提取部位對(duì)ISO誘導(dǎo)的AMI大鼠心肌酶和抗氧化能力的影響
表4和圖1總結(jié)了各組大鼠CK-MB，LDH，TAC，NO，MDA和SOD水平。和假手術(shù)組比較，模型組動(dòng)物的各項(xiàng)指標(biāo)均顯示顯著性差異，說(shuō)明ISO誘導(dǎo)ISO模型成功。與陽(yáng)性組比較，毛郁金50％和70％部位大鼠的CK-MB無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，50％，70％和90％部位大鼠的LDH也無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；用CDT、毛郁金各提取物處理后的大鼠，它們的抗氧化水平幾乎恢復(fù)正常，這些提取物有效地增強(qiáng)抗氧化酶的抗氧化能力；與假手術(shù)組比較，毛郁金70％部位大鼠血清中的TAC，NO，MDA和SOD水平無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；50％和70％部位大鼠血清中的TAC，MDA和SOD水平與陽(yáng)性組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，說(shuō)明毛郁金50％和70％部位顯示良好的心肌保護(hù)ISO誘導(dǎo)的AMI大鼠作用，其中70％部位保護(hù)大鼠心肌活性最好，70％提取部位和CDT組大鼠幾乎恢復(fù)這些酶活性至正常水平。
表4毛郁金各提取部位對(duì)ISO誘導(dǎo)AMI大鼠血清中CK-MB，LDH， TAC，NO，MDA和SOD的影響(n＝10)
cP＜0.05vs.CDT.
7.4毛郁金各提取物中多酚的含量
各部位多酚含量中，橫坐標(biāo)為沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，縱坐標(biāo)為吸光度值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝0.1355x+0.0536(r2＝0.9959)，毛郁金30％，50％，70％和90％部位多酚的含量分別是3.389±0.038，2.684±0.0381，5.629±0.037和5.307±0.041mg/g原生藥，結(jié)果顯示多酚含量最高的部位是70％乙醇提取部分。
8.討論
急性心肌缺血是由于冠狀動(dòng)脈功能性或器質(zhì)性病變，在誘發(fā)因素如過(guò)勞、情緒激動(dòng)、寒冷等刺激下導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈痙攣，冠脈血流量驟然降低，致使冠脈供血和心肌需求之間不平衡，心肌代謝產(chǎn)物增加，進(jìn)而產(chǎn)生心絞痛等臨床表現(xiàn)的一種病理狀態(tài)。目前急性心肌缺血藥物造模的動(dòng)物模型之一是給予大劑量的ISO造成短時(shí)間的心肌缺血。
CK-MB是心肌損傷的特異性分子標(biāo)志物，其血清含量高低與心肌缺血的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)；LDH是體內(nèi)能量代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一，當(dāng)心肌等組織出現(xiàn)壞死時(shí)，血清中LDH含量升高。因此，血清LDH、CK-MB含量的測(cè)定可以作為AMI模型是否成功或動(dòng)物恢復(fù)程度的判定標(biāo)準(zhǔn)之一。
TAC反應(yīng)體內(nèi)總抗氧化能力；SOD是體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)，其活性的高低可間接反應(yīng)機(jī)體清除氧自由基的能力；脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的中間產(chǎn) 物MDA反應(yīng)機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度；NO是血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)源性活性物質(zhì)，可擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，還可以抗中性粒細(xì)胞和血小板黏附聚集，其含量高低可以反應(yīng)冠狀動(dòng)脈的收縮程度及血流動(dòng)力學(xué)的變化。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予大劑量ISO后可以使模型組大鼠ECG的ST段和T波顯著升高，心率明顯下降，血清中CK-MB、MDA、LDH含量明顯增高，表明ISO成功誘導(dǎo)大鼠AMI模型。與模型組比較，30％、50％、70％、90％乙醇提取物和復(fù)方丹參片預(yù)處理的大鼠在心率，ST段和T波的異常有較好的緩解作用，最終接近于正常值，其中90％乙醇提取物和復(fù)方丹參效果最佳，其次70％和50％提取物也有較好的效果。從抗氧化指標(biāo)TAC、NO、MDA、SOD來(lái)看，30％、50％、70％、90％乙醇提取物和復(fù)方丹參片預(yù)處理的大鼠與模型組大鼠有顯著性差異，大部分指標(biāo)與正常值無(wú)顯著性差異，其中70％乙醇提取物效果最好，優(yōu)于復(fù)方丹參片，其次為50％提取物，表明毛郁金提取物有較強(qiáng)的抗氧化活性，對(duì)心肌缺血有較好的保護(hù)作用。在心肌酶指標(biāo)CK-MB、LDH方面來(lái)看，30％、50％、70％、90％乙醇提取物和復(fù)方丹參片預(yù)處理的大鼠與模型組大鼠均有顯著性差異，其中70％乙醇提取物與復(fù)方丹參片幾乎有相同的效果，其次為50％乙醇提取物，表明毛郁金乙醇提取物對(duì)心肌的較好的保護(hù)作用。綜合各指標(biāo)來(lái)看70％乙醇提取物對(duì)AMI大鼠有良好的保護(hù)作用，活性最好。
從前述中可以理解，盡管為了示例性說(shuō)明的目的描述了本申請(qǐng)的具體實(shí)施方案，但是在不偏離本申請(qǐng)的精神和范圍的條件下，本領(lǐng)域所述技術(shù)人員可以作出各種變形或改進(jìn)。這些變形或修改都應(yīng)落入本申請(qǐng)所附權(quán)利要求的范圍。