本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)影像領(lǐng)域，特別涉及一種靶向線粒體的造影劑分子作為磁共振T₂造影劑的用途，本發(fā)明還涉及一種靶向線粒體的造影劑分子，用其標(biāo)記的磁標(biāo)記細(xì)胞，和磁標(biāo)記細(xì)胞與支架材料的結(jié)合體，以及用它們進(jìn)行磁共振影像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)活體示蹤方法。

背景技術(shù)：

干細(xì)胞再生醫(yī)療是一個(gè)新興的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，其基本思路是通過誘導(dǎo)移植體內(nèi)的干細(xì)胞定向分化，實(shí)現(xiàn)對受損組織和器官的再生修復(fù)。在干細(xì)胞再生醫(yī)療過程中，需要實(shí)時(shí)跟蹤干細(xì)胞移植體內(nèi)后的存活、遷移和歸巢、定向分化等生理行為，對干細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確的組織生物學(xué)分布示蹤，并區(qū)分內(nèi)外源干細(xì)胞、自我更新產(chǎn)生的干細(xì)胞及分化產(chǎn)生的功能細(xì)胞，從而深入認(rèn)識干細(xì)胞在體內(nèi)的遷移、繁殖、分裂與分化等生理過程，而這對于干細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)研究，及在臨床上進(jìn)行療效觀察和功能恢復(fù)的評估，都具有非常重要的意義。

磁共振影像作為具有高空間分辨率和軟組織對比度且無電離輻射風(fēng)險(xiǎn)的非損傷活體影像技術(shù)，是示蹤干細(xì)胞體內(nèi)維持與分化過程的最有潛力的技術(shù)。磁共振影像是基于不同生物組織中水質(zhì)子的自旋磁矩在均勻磁場中有序排列過程形成的磁矩受到特定的微波激發(fā)后，其縱向弛豫速率(1/T₁)或橫向弛豫速率(1/T₂)可能存在差異，導(dǎo)致回波的信號強(qiáng)度不同在影像中形成的對比度差異實(shí)現(xiàn)對生物體的細(xì)胞、組織和器官的結(jié)構(gòu)和功能成像。在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，當(dāng)不同組織的影像對比度接近時(shí)，還可以通過引入磁共振造影劑來改變特定組織如腫瘤組織中的水質(zhì)子的馳豫速率，實(shí)現(xiàn)對該特定組織的成像。利用磁共振影像技術(shù)活體示蹤干細(xì)胞首先也需要對干細(xì)胞進(jìn)行磁標(biāo)記，從而將它們從其周圍的其它組織細(xì)胞中區(qū)分開來。

磁共振造影劑的引入通常會(huì)同時(shí)加快其所處組織中水質(zhì)子的縱向弛豫速率 和橫向弛豫速率，但不同的磁共振造影劑加快兩個(gè)弛豫速率的相對幅度存在較大的差異。這種差異導(dǎo)致有的磁共振造影劑適合用于MRI信號增強(qiáng)，稱為T₁造影劑，有的適合用于MRI信號減弱，稱為T₂造影劑。例如，通常情況下，釓絡(luò)合物對水質(zhì)子縱向弛豫速率的加速效應(yīng)比對其橫向弛豫速率的加速效應(yīng)顯著，有利于在T₁加權(quán)像下產(chǎn)生亮信號，增強(qiáng)T₁加權(quán)像的對比度，因此常被作為T₁造影劑使用。超順磁氧化鐵(SPIO)納米粒子對水質(zhì)子橫向弛豫速率的加速效應(yīng)比對其縱向弛豫速率的加速效應(yīng)顯著得多，在T₂加權(quán)成像模式下產(chǎn)生暗信號，增強(qiáng)T₂加權(quán)像的對比度，是理想的T₂造影劑。另外，相同的造影劑分布在不同的生物界面上，其加快兩個(gè)弛豫速率的相對幅度也可能存在較大的差異。如釓絡(luò)合物以游離態(tài)或囊泡形式分布在細(xì)胞質(zhì)中或在細(xì)胞質(zhì)中與線粒體結(jié)合時(shí)，其對細(xì)胞水質(zhì)子的縱向和橫向弛豫速率的影響存在顯著的不同。

以SPIO納米粒子為代表的T₂造影劑具有很高的橫向弛豫率，因此，在干細(xì)胞活體影像中得到了廣泛的研究和應(yīng)用。但這種基于SPIO納米粒子的細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)本質(zhì)上提供的是SPIO納米粒子在體內(nèi)的遷移信息，這種遷移是隨攜帶納米粒子的母細(xì)胞發(fā)生，還是母細(xì)胞死亡后游離的納米粒子本身遷移，抑或是被其它細(xì)胞如巨噬細(xì)胞吞噬后隨巨噬細(xì)胞發(fā)生的遷移，現(xiàn)在的影像方法無法給出明確的結(jié)論，成為影像信息分析面臨的主要挑戰(zhàn)。而且，這種細(xì)胞標(biāo)記無法直觀地告訴人們標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)后仍然是活細(xì)胞，抑或已經(jīng)死亡或者部分死亡。

釓絡(luò)合物作為T₁造影劑在臨床醫(yī)學(xué)中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，目前臨床應(yīng)用的釓絡(luò)合物造影劑可以分為兩類：一類是有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DOTA及其衍生物，一類是無環(huán)結(jié)構(gòu)的DTPA及其衍生物。這種小分子造影劑由于化學(xué)結(jié)構(gòu)明確穩(wěn)定，可以通過化學(xué)方法精確控制與靶向分子偶聯(lián)的過程和結(jié)果，因此作為靶向造影劑的結(jié)構(gòu)單元具有很高的可靠性。但是，釓絡(luò)合物造影劑面臨的一個(gè)關(guān)鍵問題是其弛豫率遠(yuǎn)低于T₂型SPIO納米粒子的弛豫率，因此為了獲得足夠的組織對比度，需要較大的劑量，導(dǎo)致對金屬釓離子在體內(nèi)可能帶來毒性等安全問題的關(guān)切。

利用釓絡(luò)合物標(biāo)記干細(xì)胞進(jìn)行活體磁共振影像示蹤也是一個(gè)可選的技術(shù)方案。但是現(xiàn)有的方法中，使用小分子釓絡(luò)合物或面向細(xì)胞膜結(jié)合受體的靶向造影劑遇到的問題除了縱向弛豫率偏低外，其在細(xì)胞中滯留的時(shí)間太短也是一個(gè) 需要克服的問題；使用大分子或納米粒子負(fù)載釓絡(luò)合物時(shí)，又將遇到與SPIO納米粒子同樣的問題，包括在體內(nèi)清除速度慢及可能被其它細(xì)胞攝取導(dǎo)致對影像結(jié)果的干擾。

專利US20090214437A1和US20130142735A1公布了一種能與細(xì)胞線粒體結(jié)合的磁共振造影劑，該磁共振造影劑經(jīng)靜脈注射到體內(nèi)后，可以在線粒體活躍的腫瘤組織中富集，利用其增強(qiáng)腫瘤組織在T₁加權(quán)成像模式下的磁共振信號(呈現(xiàn)亮信號)，從而提高T₁加權(quán)像的對比度。這種造影劑作為T₁造影劑應(yīng)用于細(xì)胞移植體的活體影像時(shí)，無法明確確定出標(biāo)記細(xì)胞在體內(nèi)的存活和遷移狀況，信號增強(qiáng)效應(yīng)持續(xù)的時(shí)間也不能滿足長期觀察的需要。

綜上所述，本領(lǐng)域內(nèi)亟需這樣一種用于細(xì)胞或移植體標(biāo)記的磁共振造影劑，不僅能直觀地提供所述細(xì)胞在體內(nèi)的存活狀態(tài)以及所述細(xì)胞或移植體的遷移、歸巢和分化等信息，還能滿足長期觀察的需要，又能解決大劑量所帶來的毒性問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明基于發(fā)明人認(rèn)識到，釓絡(luò)合物分布在不同的生物界面上，其對細(xì)胞水質(zhì)子的縱向和橫向弛豫速率的影響存在顯著的不同，特別是當(dāng)釓絡(luò)合物在細(xì)胞質(zhì)中與線粒體結(jié)合后，其加速細(xì)胞水質(zhì)子的縱向弛豫速率的能力顯著降低，不利于磁共振信號增強(qiáng)，反而是有利于磁共振信號減弱，因此更適合于在T₂加權(quán)成像模式下產(chǎn)生暗信號。發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，將本發(fā)明的標(biāo)記細(xì)胞移植到體內(nèi)后，所述標(biāo)記細(xì)胞會(huì)部分釋放出造影劑分子，釋放的造影劑分子會(huì)使細(xì)胞移植體周邊的組織在磁共振T₂加權(quán)像模式下呈現(xiàn)亮信號，從而可以使細(xì)胞移植體更清楚地與其周邊組織區(qū)分開來。

本發(fā)明的目的在于提供一種靶向線粒體的造影劑分子作為T₂造影劑的用途，所述靶向線粒體的造影劑分子包括靶向單元和造影單元，其中，所述靶向單元是具有-P⁺(X₁)(X₂)(X₃)結(jié)構(gòu)通式的鏻陽離子，其中X₁、X₂、X₃代表未經(jīng)取代或者經(jīng)一個(gè)或多個(gè)取代基取代的C_1-12烷基、C_1-12烯基、或C_6-10芳基，所述取代基包括1、2或3個(gè)鹵素原子、C_1-12烷基、C_6-10芳基、羥基、C_1-12烷氧基、鹵代-C_1-12烷氧基；其中X₁、X₂、X₃可以是相同的基團(tuán)，也可以是不同的基團(tuán)；所 述造影單元是超順磁金屬絡(luò)合物。所述靶向線粒體的造影劑分子與細(xì)胞中的線粒體結(jié)合后呈現(xiàn)顯著的磁共振信號減弱效用，使得所述磁標(biāo)記細(xì)胞在體外和體內(nèi)的磁共振T₂加權(quán)像模式下都呈現(xiàn)暗信號；所述靶向單元與多個(gè)磁共振造影單元結(jié)合并用于細(xì)胞標(biāo)記時(shí)，呈現(xiàn)更強(qiáng)的磁共振信號減弱效用，并能持續(xù)更長時(shí)間。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述靶向單元是三苯基鏻陽離子或其衍生物。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述超順磁金屬絡(luò)合物由超順磁金屬和絡(luò)合劑形成，其中：所述超順磁金屬是具有超順磁特性的金屬，包括但不限于鑭系金屬鐠(Pr)，釹(Nd)，钷(Pm)，釤(Sm)，銪(Eu)，釓(Gd)，鋱(Tb)，鏑(Dy)，鈥(Ho)，鉺(Er)，銩(Tm)，鐿(Yb)，镥(Lu)，及非鑭系金屬鉻(Cr)，錳(Mn)，鐵(Fe)，鈷(Co)，鎳(Ni)，銅(Cu)，釔(Y)，鈮(Nb)等；所述絡(luò)合劑選自DOTA，HP-DO3A，DO3A-butrol，DTPA-BMA，DTPA，DTPA-BMEA，BOPTA，EOB-DTPA或其衍生物及其任意組合。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述靶向單元直接或通過連接子(linker)與樹枝型或線型分子連接，所述樹枝型或線型分子直接或通過間隔子(spacer)與造影單元連接，其中所述樹枝型或線型分子的結(jié)構(gòu)單元是任何可均聚或共聚形成樹枝型或線型大分子的單體、優(yōu)選氨基酸、更優(yōu)選賴氨酸。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的連接子是直鏈狀氨基酸、優(yōu)選賴氨酸；所述間隔子是直鏈狀氨基酸，優(yōu)選為NH₂(CH₂)_pCOOH或NH₂(CH₂CH₂O)_qCH₂COOH，其中p是0～12的整數(shù)，q是0～4的整數(shù)，當(dāng)p＝0或q＝0時(shí)代表沒有間隔子。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的靶向單元通過所述樹枝型或線型分子與1-8個(gè)造影單元連接。每個(gè)所述的-P⁺(X₁)(X₂)(X₃)陽離子通過樹枝型或線型分子與多個(gè)超順磁金屬絡(luò)合物結(jié)合，其磁共振信號減弱效應(yīng)更顯著，在T₂加權(quán)模式下成像時(shí)呈現(xiàn)暗信號的時(shí)間可以更長。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，采用多個(gè)靶向單元，優(yōu)選2個(gè)靶向單元通過所述樹枝型或線型分子與1-8個(gè)造影單元連接，可以增加所述造影劑分子與線粒體結(jié)合的強(qiáng)度，進(jìn)一步延長其在T₂加權(quán)模式下成像時(shí)呈現(xiàn)暗信號的時(shí)間。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種靶向線粒體的造影劑分子，其包括靶向單元和造影單元，其中：所述靶向單元是具有-P⁺(X₁)(X₂)(X₃)結(jié)構(gòu)通式的鏻陽離子，其中X₁、X₂、X₃代表未經(jīng)取代或者經(jīng)一個(gè)或多個(gè)取代基取代的C_1-12烷基、C_1-12烯基、或C_6-10芳基，所述取代基包括1、2或3個(gè)鹵素原子、C_1-12烷基、C_6-10芳基、羥基、C_1-12烷氧基、鹵代-C_1-12烷氧基；其中X₁、X₂、X₃可以是相同的基團(tuán)，也可以是不同的基團(tuán)；所述造影單元是超順磁金屬絡(luò)合物；所述靶向單元直接或通過連接子與樹枝型或線型分子連接，所述樹枝型或線型分子直接或通過間隔子與造影單元連接，其中所述樹枝型或線型分子的結(jié)構(gòu)單元是任何可均聚或共聚形成樹枝型或線型大分子的單體、優(yōu)選氨基酸、更優(yōu)選賴氨酸。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的連接子選自直鏈狀氨基酸、優(yōu)選賴氨酸；所述間隔子選自直鏈狀氨基酸，優(yōu)選為NH₂(CH₂)_pCOOH或NH₂(CH₂CH₂O)_qCH₂COOH，其中p是0～12的整數(shù)，q是0～4的整數(shù)，當(dāng)p＝0或q＝0時(shí)代表沒有間隔子。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的靶向單元通過所述樹枝型或線型分子與1-8個(gè)造影單元連接。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，采用多個(gè)靶向單元，優(yōu)選2個(gè)靶向單元通過所述樹枝型或線型分子與1-8個(gè)造影單元連接。

本發(fā)明還提供一種制備前述靶向線粒體的造影劑分子的方法，其包括：每個(gè)所述的-P⁺(X₁)(X₂)(X₃)陽離子與鹵代羧酸或者鹵代胺反應(yīng)生成具有羧基或氨基官能團(tuán)的-P⁺(X₁)(X₂)(X₃)陽離子，所述-P⁺(X₁)(X₂)(X₃)陽離子通過獲得的羧基或氨基與樹枝型或線型分子連接；所述鹵代羧酸是氯代、溴代或碘代脂肪酸或芳香酸；所述超順磁金屬絡(luò)合物通過其羧基或氨基與樹枝型或線型分子連接；所述超順磁金屬絡(luò)合物的羧基選自乙羧基、丙羧基或丁羧基，所述超順磁金屬絡(luò)合物的氨基選自乙氨基、丙氨基或丁氨基。

在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，靶向線粒體的造影劑分子通過以下方法合成：使用交叉保護(hù)脫保護(hù)策略的固相合成方法依次合成帶有或不帶有連接子或間隔子的樹枝型或線型分子、和帶有或不帶有間隔子的造影單元，然后連接-P⁺(X₁)(X₂)(X₃)陽離子和造影單元。

在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，將所述-P⁺(X₁)(X₂)(X₃)陽離子、造影單元 和/或樹枝型或線型分子中的一個(gè)單元的羧基轉(zhuǎn)化成活潑酯或者經(jīng)過活化之后與另一單元的氨基、巰基或羥基進(jìn)行偶聯(lián)；或者通過點(diǎn)擊化學(xué)(click chemistry)連接靶向單元、樹枝型或線型分子和造影單元。

本發(fā)明還提供一種用所述的靶向線粒體的造影劑分子標(biāo)記的磁標(biāo)記細(xì)胞，所述磁標(biāo)記細(xì)胞是經(jīng)過靶向線粒體的造影劑分子標(biāo)記的任何可以用于細(xì)胞移植治療的細(xì)胞，選自間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、心肌干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。

本發(fā)明還提供一種細(xì)胞標(biāo)記的方法，將靶向線粒體的造影劑分子置入含有所述細(xì)胞的培養(yǎng)液中，利用細(xì)胞的胞吞或胞飲功能將所述靶向線粒體的造影劑分子引入細(xì)胞內(nèi)，所述的靶向線粒體的造影劑分子會(huì)與胞內(nèi)的線粒體結(jié)合，可以有效延長其在所述標(biāo)記細(xì)胞中的滯留時(shí)間。

本發(fā)明還提供另一種細(xì)胞標(biāo)記的方法，其特征在于：將靶向線粒體的造影劑分子置入含有所述細(xì)胞的培養(yǎng)液、電轉(zhuǎn)染緩沖液或生理鹽水中，利用脈沖電穿孔的方法將所述的靶向線粒體的造影劑分子引入細(xì)胞內(nèi)。

本發(fā)明還提供一種所述磁標(biāo)記細(xì)胞與支架材料的結(jié)合體，所述支架材料是任何可以與細(xì)胞形成結(jié)合體的醫(yī)用材料，選自膠原蛋白、各種合成高分子或無機(jī)支架材料；所述支架材料包含或不包含支持細(xì)胞存活和生長的各種營養(yǎng)因子。

本發(fā)明還提供一種磁共振影像活體示蹤方法，其包括：將所述磁標(biāo)記細(xì)胞或所述磁標(biāo)記細(xì)胞與支架材料的結(jié)合體通過定點(diǎn)手術(shù)移植/靜脈注射到人或動(dòng)物體內(nèi)；將上述人或動(dòng)物置于磁共振影像設(shè)備中，在磁共振T₂加權(quán)模式下成像。

本發(fā)明提供的靶向線粒體的造影劑分子作為T₂造影劑的用途，可以廣泛應(yīng)用于細(xì)胞治療中活體示蹤移植到體內(nèi)的細(xì)胞的存活率及其遷移和歸巢等生理過程。這是一個(gè)首創(chuàng)性的發(fā)現(xiàn)，一方面因?yàn)槟壳斑€沒有有效的方法可以通過活體影像技術(shù)明確示蹤移植到體內(nèi)的細(xì)胞的存活率及其遷移和歸巢等生理過程，另一方面是因?yàn)殚L期以來釓絡(luò)合物造影劑的應(yīng)用只專注于其信號增強(qiáng)效應(yīng)，因此只在T₁加權(quán)模式下成像，影像對比度不理想，且呈現(xiàn)無規(guī)律變化。本發(fā)明是基于所述的靶向線粒體的造影劑分子與細(xì)胞內(nèi)的線粒體結(jié)合后，會(huì)大幅度降低所述磁標(biāo)記細(xì)胞的磁共振信號，長時(shí)間呈現(xiàn)穩(wěn)定有規(guī)律的信號減弱效應(yīng)，因此本發(fā)明是在T₂加權(quán)模式下充分利用釓絡(luò)合物與線粒體結(jié)合后呈現(xiàn)的磁共振信號減 弱效應(yīng)。更重要的是本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，使用本發(fā)明標(biāo)記的細(xì)胞移植到體內(nèi)后，所述標(biāo)記細(xì)胞會(huì)釋放出靶向線粒體的造影劑分子，釋放的靶向線粒體的造影劑分子會(huì)使細(xì)胞移植體周邊的組織在磁共振T₂加權(quán)像模式下呈現(xiàn)亮信號，從而可以使細(xì)胞移植體更清楚地與其周邊組織區(qū)分開來。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明提供的一種磁標(biāo)記細(xì)胞用于磁共振影像活體示蹤的方法的示意圖。

圖2為本發(fā)明提供的一種靶向線粒體的造影劑分子的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3為本發(fā)明提供的靶向線粒體的造影劑分子的靶向單元即鏻陽離子的結(jié)構(gòu)通式圖及本發(fā)明實(shí)施例中所使用的靶向單元三苯基鏻(TPP)陽離子及其衍生物((對甲苯基)₃P)陽離子的結(jié)構(gòu)圖。

圖4為本發(fā)明提供的可用于增強(qiáng)磁共振成像對比度的造影單元超順磁金屬絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)圖，其中M代表具有超順磁特性的金屬。

圖5為本發(fā)明提供的一種靶向線粒體的造影劑分子結(jié)構(gòu)示意圖，其中造影單元Gd-DOTA、靶向單元三苯基鏻陽離子均通過羧基與樹枝型或線型分子連接。樹枝型或線型分子的結(jié)構(gòu)單元是賴氨酸，結(jié)構(gòu)單元個(gè)數(shù)k可以是0～7的整數(shù)；造影單元DOTA的個(gè)數(shù)是m+n＝k+1。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例1提供的一種靶向線粒體的造影劑分子TPP-K(Gd-DOTA)-OH，簡寫為Gd-DOTA-TPP，造影單元為Gd-DOTA，靶向單元TPP和Gd-DOTA均通過羧基與賴氨酸(簡寫為K)的兩個(gè)氨基連接。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例2提供的一種靶向線粒體的造影劑分子[Gd-DOTA-Acp-K(Gd-DOTA)]₂-K(TPP)-OH，簡寫為(Gd-DOTA)₄-TPP，造影單元為Gd-DOTA，靶向單元TPP和Gd-DOTA均通過羧基與樹枝型分子相連，樹枝 型分子的結(jié)構(gòu)單元是賴氨酸，結(jié)構(gòu)單元個(gè)數(shù)為k＝3，連接子是賴氨酸，其中一個(gè)間隔子的長度是NH₂(CH₂)_pCOOH的p＝0的情況，另一個(gè)間隔子的結(jié)構(gòu)是NH₂(CH₂)₅COOH，即氨基己酸(Acp)，長度是NH₂(CH₂)_pCOOH的p＝5的情況。

圖8為本發(fā)明實(shí)施例3提供的一種靶向線粒體的造影劑分子[Gd-DOTA-Acp-K(Gd-DOTA)]₂-linker-K(TPP)-OH，簡寫為(Gd-DOTA)₄-linker-TPP，造影單元為Gd-DOTA，靶向單元TPP和Gd-DOTA均通過羧基與樹枝型分子相連，樹枝型分子的結(jié)構(gòu)單元是賴氨酸，結(jié)構(gòu)單元個(gè)數(shù)為k＝3，這里連接子是氨基己酰賴氨酸，其中包含間隔子氨基己酸，其中一個(gè)間隔子的長度是NH₂(CH₂)_pCOOH的p＝0的情況，另一個(gè)間隔子的結(jié)構(gòu)是NH₂(CH₂)₅COOH，長度是NH₂(CH₂)_pCOOH的p＝5的情況。

圖9為本發(fā)明實(shí)施例4提供的一種靶向線粒體的造影劑分子[Gd-DOTA-Acp-K(Gd-DOTA)]₂-linker-K(TPP)-OH，簡寫為(Gd-DOTA)₄-linker-TPP，造影單元為Gd-DOTA，靶向單元TPP和Gd-DOTA均通過羧基與線型分子相連，線型分子的結(jié)構(gòu)單元是賴氨酸，結(jié)構(gòu)單元個(gè)數(shù)為k＝3，這里連接子是氨基己酰賴氨酸，其中包含間隔子氨基己酸，其中一個(gè)間隔子的長度是NH₂(CH₂)_pCOOH所述的p＝0的情況，另一個(gè)間隔子的結(jié)構(gòu)是NH₂(CH₂)₅COOH，長度是NH₂(CH₂)_pCOOH的p＝5的情況。

圖10為本發(fā)明實(shí)施例5提供的一種靶向線粒體的造影劑分子[Dy-DOTA-Acp-K(Gd-DOTA)]₂-linker-K(TPP)-OH，簡寫為(Dy-DOTA)₄-linker-TPP，造影單元為Dy-DOTA，靶向單元TPP和Dy-DOTA均通過羧基與樹枝型分子相連，樹枝型分子的結(jié)構(gòu)單元是賴氨酸，結(jié)構(gòu)單元個(gè)數(shù)為k＝3，這里連接子是氨基己酰賴氨酸，其中包含間隔子氨基己酸，其中一個(gè)間隔子的長度是NH₂(CH₂)_pCOOH的p＝0的情況，另一個(gè)間隔子的結(jié)構(gòu)是NH₂(CH₂)₅COOH，長度是NH₂(CH₂)_pCOOH的p＝5的情況。

圖11為本發(fā)明實(shí)施例6提供的一種靶向線粒體的造影劑分子[Gd-DTPA-Acp-K(Gd-DTPA)]₂-linker-K(TPP)-OH，簡寫為(Gd-DTPA)₄-linker-TPP，造影單元為Gd-DTPA，靶向單元TPP和Gd-DTPA均通過羧基與樹枝型分子相連，樹枝型分子的結(jié)構(gòu)單元是賴氨酸，結(jié)構(gòu)單元個(gè)數(shù)為k＝3，這里連接子是氨基己酰賴氨酸，其中包含間隔子氨基己酸，其中一個(gè)間隔子的長度是NH₂(CH₂)_pCOOH的p＝0的情況，另一個(gè)間隔子的結(jié)構(gòu)是NH₂(CH₂)₅COOH，長 度是NH₂(CH₂)_pCOOH的p＝5的情況。

圖12為本發(fā)明實(shí)施例7提供的一種靶向線粒體的造影劑分子[Gd-DOTA-Acp-K(Gd-DOTA)]₂-linker-K((對甲苯基)₃P)-OH，簡寫為(Gd-DOTA)₄-linker-(對甲苯基)₃P，造影單元為Gd-DOTA，靶向單元(對甲苯基)₃P和Gd-DOTA均通過羧基與樹枝型分子相連，樹枝型分子的結(jié)構(gòu)單元是賴氨酸，結(jié)構(gòu)單元個(gè)數(shù)為k＝3，這里連接子是氨基己酰賴氨酸，其中包含間隔子氨基己酸，其中一個(gè)間隔子的長度是NH₂(CH₂)_pCOOH的p＝0的情況，另一個(gè)間隔子的結(jié)構(gòu)是NH₂(CH₂)₅COOH，長度是NH₂(CH₂)_pCOOH的p＝5的情況。

圖13為本發(fā)明實(shí)施例8提供的一種靶向線粒體的造影劑分子TPP-Lys(TPP)-Lys[DOTA-Acp-Lys(DOTA)-Acp-Lys(DOTA)-Acp-Lys(DOTA)]-NH₂，簡寫為(Gd-DOTA)₄-linker-TPP₂，造影單元為4個(gè)Gd-DOTA分子，4個(gè)DOTA接在線性多肽Lys的ε-氨基(側(cè)鏈)上和多肽N端的氨基上成線性排列；靶向單元為兩個(gè)TPP分子接在線型分子的同一端，這一端的Lys的羧基被酰胺化；線型分子的結(jié)構(gòu)單元是賴氨酸，結(jié)構(gòu)單元個(gè)數(shù)為k＝3，這里連接子是氨基己酰賴氨酸，其中包含間隔子氨基己酸，其中一個(gè)間隔子的長度是NH₂(CH₂)_pCOOH所述的p＝0的情況，另一個(gè)間隔子的結(jié)構(gòu)是NH₂(CH₂)₅COOH，長度是NH₂(CH₂)_pCOOH的p＝5的情況。

圖14是本發(fā)明實(shí)施例10使用(Gd-DOTA)_1,4-TPP作為靶向線粒體的造影劑分子標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞的體外磁共振T₁加權(quán)和T₂加權(quán)影像效果圖。第一排圖像是Gd-DOTA標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞在不同細(xì)胞繁殖時(shí)間節(jié)點(diǎn)的T₁和T₂加權(quán)圖像。第二、三、四排圖像分別是5，10，20mM Gd-DOTA-TPP標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞在不同細(xì)胞繁殖時(shí)間節(jié)點(diǎn)的T₁和T₂加權(quán)圖像。第五排圖像是20mM(Gd-DOTA)₄-TPP標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞在不同細(xì)胞繁殖時(shí)間節(jié)點(diǎn)的T₁和T₂加權(quán)圖像。圖像下面的數(shù)字是細(xì)胞標(biāo)記后繼續(xù)孵育的過程中，采集影像的時(shí)間節(jié)點(diǎn)(天)。

圖15是本發(fā)明實(shí)施例10提供的標(biāo)記細(xì)胞經(jīng)不同時(shí)間繁殖后得到的體外T₁加權(quán)MRI影像信號強(qiáng)度隨細(xì)胞繁殖時(shí)間的變化。

圖16是本發(fā)明實(shí)施例10提供的標(biāo)記細(xì)胞經(jīng)不同時(shí)間繁殖后得到的體外T₂加權(quán)MRI影像信號強(qiáng)度隨細(xì)胞繁殖時(shí)間的變化。

圖17本發(fā)明實(shí)施例11使用20mM(Gd-DOTA)₄-TPP為靶向線粒體的造影劑分子標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞，通過定點(diǎn)手術(shù)注射移植到小鼠顱內(nèi)，在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)采集的11.7T磁共振T₂加權(quán)影像效果圖。

圖18本發(fā)明實(shí)施例12使用20mM(Gd-DOTA)₄-TPP為靶向線粒體的造影劑分子標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞，通過定點(diǎn)注射移植大鼠前腿肌肉中采集的3T磁共振T₂加權(quán)影像效果圖。

圖19是本發(fā)明實(shí)施例13使用(Gd-DOTA)₄-TPP₂作為靶向線粒體的造影劑分子標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)不同時(shí)間繁殖后得到的體外T₂加權(quán)MRI影像信號強(qiáng)度隨細(xì)胞繁殖時(shí)間的變化與實(shí)施例10部分結(jié)果的對比。

圖20是本發(fā)明實(shí)施例10和13提供的標(biāo)記細(xì)胞經(jīng)不同時(shí)間繁殖后得到的體外T₂加權(quán)MRI影像信號強(qiáng)度與細(xì)胞中Gd含量的變化關(guān)系。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明提供一種靶向線粒體的造影劑分子作為T₂造影劑的用途，所述靶向線粒體的造影劑分子包括靶向單元和造影單元，其中，所述靶向單元是具有-P⁺(X₁)(X₂)(X₃)結(jié)構(gòu)通式的鏻陽離子，其中X₁、X₂、X₃代表未經(jīng)取代或者經(jīng)一個(gè)或多個(gè)取代基取代的C_1-12烷基、C_1-12烯基、或C_6-10芳基，所述取代基包括1、2或3個(gè)鹵素原子、C_1-12烷基、C_6-10芳基、羥基、C_1-12烷氧基、鹵代-C_1-12烷氧基；其中X₁、X₂、X₃可以是相同的基團(tuán)，也可以是不同的基團(tuán)；所述造影單元是超順磁金屬絡(luò)合物。

本發(fā)明實(shí)施例中，所述的靶向單元三苯基鏻或其衍生物分子的結(jié)構(gòu)可以是圖3中所示的任一種，也可以是具有圖3中所示結(jié)構(gòu)通式的其它結(jié)構(gòu)衍生物。

本發(fā)明實(shí)施例中，所述的造影單元超順磁金屬絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)可以是圖4中所示的任一種絡(luò)合物，也可以是圖4中所示任一種絡(luò)合物的衍生物，例如將超順磁 金屬絡(luò)合物的絡(luò)合配體中與樹枝型或線型分子連接的乙?；鎿Q為丙酰基或丁?；部梢园岩音驶鎿Q為乙氨基、丙氨基、丁氨基等得到的衍生物。

本發(fā)明實(shí)施例中，所述靶向線粒體的造影劑分子可以通過多肽固相合成技術(shù)直接制備；也可以分別合成各個(gè)單元，然后將某一單元的羧基轉(zhuǎn)化成NHS活潑酯或者活化之后與另一單元進(jìn)行連接，或者通過點(diǎn)擊化學(xué)連接。比如先合成所述的造影單元超順磁金屬絡(luò)合物的絡(luò)合配體(帶保護(hù)基)、所述的三苯基鏻陽離子或其衍生物陽離子和帶有氨基的樹枝型或線型分子，把造影單元的絡(luò)合配體的羧基和三苯基鏻或其衍生物陽離子的羧基轉(zhuǎn)化成NHS活潑酯與其樹枝型或線型分子的氨基進(jìn)行連接，脫去保護(hù)基之后與超順磁金屬離子絡(luò)合得到所述的靶向線粒體的造影劑分子。所述的樹枝型或線型分子可以提供氨基、巰基、羥基等等連接，也可以提供羧基連接；相應(yīng)地，所述的超順磁金屬絡(luò)合物和三苯基鏻或其衍生物陽離子可以通過羧基與樹枝型或線型分子連接，也可以通過氨基、巰基、羥基等等與樹枝型或線型分子連接；或者是點(diǎn)擊化學(xué)的疊氮-炔基的環(huán)加成反應(yīng)。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，利用Gd-DOTA作為造影單元，靶向單元三苯基鏻分子與Gd-DOTA都通過羧基與樹枝型或線型分子相連，樹枝型或線型分子的結(jié)構(gòu)單元采用賴氨酸，合成的三苯基鏻磁共振靶向線粒體的造影劑分子的結(jié)構(gòu)如圖5所示。樹枝型或線型分子的結(jié)構(gòu)單元個(gè)數(shù)k可以是0～7的整數(shù)；造影單元DOTA的個(gè)數(shù)是m+n＝k+1，連接子是賴氨酸，間隔子分子結(jié)構(gòu)采用NH₂(CH₂)_pCOOH，其中p是0～12的整數(shù)。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，利用Gd-DOTA作為造影單元，靶向單元三苯基鏻分子和Gd-DOTA均通過羧基與賴氨酸的兩個(gè)氨基相連，合成的三苯基鏻靶向線粒體的造影劑分子的結(jié)構(gòu)如圖6所示，對應(yīng)探針分子Gd-DOTA-TPP。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，利用Gd-DOTA作為造影單元，靶向單元三苯基鏻分子和Gd-DOTA均通過羧基與樹枝型分子相連，樹枝型分子的結(jié)構(gòu)單元采用賴氨酸，結(jié)構(gòu)單元個(gè)數(shù)k＝3，n＝2，m＝2時(shí)，連接子是賴氨酸，其中一個(gè)間隔子的長度是0，另一個(gè)間隔子的結(jié)構(gòu)是NH₂(CH₂)₅COOH，合成的三苯基鏻靶向線粒體的造影劑分子的結(jié)構(gòu)如圖7所示，對應(yīng)探針分子(Gd-DOTA)₄-TPP。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，利用Gd-DOTA作為造影單元，靶向單元三苯基 鏻分子和Gd-DOTA均通過羧基與樹枝型分子相連，樹枝型分子的結(jié)構(gòu)單元采用賴氨酸，結(jié)構(gòu)單元個(gè)數(shù)k＝3，n＝2，m＝2時(shí)，連接子是氨基己酰賴氨酸，其中包含間隔子氨基己酸，其中一個(gè)間隔子的長度是0，另一個(gè)間隔子的結(jié)構(gòu)是NH₂(CH₂)₅COOH，合成的三苯基鏻靶向線粒體的造影劑分子的結(jié)構(gòu)如圖8所示，對應(yīng)探針分子(Gd-DOTA)₄-linker-TPP。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，利用Gd-DOTA作為造影單元，靶向單元三苯基鏻分子和Gd-DOTA均通過羧基與線型分子相連，線型分子的結(jié)構(gòu)單元采用賴氨酸，結(jié)構(gòu)單元個(gè)數(shù)k＝3，m＝1，n＝3時(shí)，連接子是氨基己酰賴氨酸，其中包含間隔子氨基己酸，其中一個(gè)間隔子的長度是0，另一個(gè)間隔子的結(jié)構(gòu)是NH₂(CH₂)₅COOH，合成的三苯基鏻靶向線粒體的造影劑分子的結(jié)構(gòu)如圖9所示，對應(yīng)探針分子(Gd-DOTA)₄-linker-TPP。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，利用Dy-DOTA作為造影單元，靶向單元三苯基鏻陽離子和Dy-DOTA均通過羧基與樹枝型分子相連，樹枝型分子的結(jié)構(gòu)單元采用賴氨酸，結(jié)構(gòu)單元個(gè)數(shù)k＝3，n＝2，m＝2時(shí)，連接子是氨基己酰賴氨酸，其中包含間隔子氨基己酸，其中一個(gè)間隔子的長度是0，另一個(gè)間隔子的結(jié)構(gòu)是NH₂(CH₂)₅COOH，合成的三苯基鏻靶向線粒體的造影劑分子的結(jié)構(gòu)如圖10所示，對應(yīng)探針分子(Dy-DOTA)₄-TPP。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，利用Gd-DTPA作為造影單元，靶向單元三苯基鏻分子和Gd-DTPA均通過羧基與樹枝型分子相連，樹枝型分子的結(jié)構(gòu)單元采用賴氨酸，結(jié)構(gòu)單元個(gè)數(shù)k＝3，n＝2，m＝2時(shí)，連接子是氨基己酰賴氨酸，其中包含間隔子氨基己酸，其中一個(gè)間隔子的長度是0，另一個(gè)間隔子的結(jié)構(gòu)是NH₂(CH₂)₅COOH，合成的三苯基鏻靶向線粒體的造影劑分子的結(jié)構(gòu)如圖11所示，對應(yīng)探針分子(Gd-DTPA)₄-linker-TPP。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，利用Gd-DOTA作為造影單元，靶向單元三(對甲基苯基)鏻分子((對甲苯基)₃P)和Gd-DOTA均通過羧基與樹枝型分子相連，樹枝型分子的結(jié)構(gòu)單元采用賴氨酸，結(jié)構(gòu)單元個(gè)數(shù)k＝3，n＝2，m＝2時(shí)，連接子是氨基己酰賴氨酸，其中包含間隔子氨基己酸，其中一個(gè)間隔子的長度是0，另一個(gè)間隔子的結(jié)構(gòu)是NH₂(CH₂)₅COOH，合成的三苯基鏻靶向線粒體的造影劑分子的結(jié)構(gòu)如圖12所示，對應(yīng)探針分子(Gd-DOTA)₄-linker-(對甲苯基)₃P。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，利用Gd-DOTA作為造影單元，2個(gè)靶向單元三苯基鏻分子和Gd-DOTA均通過羧基與線型分子相連，線型分子的結(jié)構(gòu)單元采用賴氨酸，結(jié)構(gòu)單元個(gè)數(shù)k＝3，m＝1，n＝3時(shí)，連接子是氨基己酰賴氨酸，其中包含間隔子氨基己酸，其中一個(gè)間隔子的長度是0，另一個(gè)間隔子的結(jié)構(gòu)是NH₂(CH₂)₅COOH，合成的三苯基鏻靶向線粒體的造影劑分子的結(jié)構(gòu)如圖13所示，對應(yīng)探針分子(Gd-DOTA)₄-linker-TPP₂。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種利用本發(fā)明所述的靶向線粒體的磁共振造影劑分子標(biāo)記的細(xì)胞，以及通過脈沖電穿孔利用結(jié)合細(xì)胞線粒體的靶向線粒體的磁共振造影劑分子標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞方法。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種方法通過體外磁共振影像觀察結(jié)合細(xì)胞線粒體的造影劑分子標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞，在細(xì)胞標(biāo)記后不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)，其T₁加權(quán)成像和T₂加權(quán)成像對比度的變化過程。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種方法通過定點(diǎn)手術(shù)移植/注射，將靶向線粒體的磁共振造影劑分子標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)，利用11.7T活體磁共振T₂加權(quán)成像，觀察細(xì)胞移植體及其周邊組織的影像對比度在細(xì)胞移植后不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的變化過程。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種方法通過定點(diǎn)手術(shù)移植/注射，將靶向線粒體的磁共振造影劑分子標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞移植到大鼠體內(nèi)，利用3T活體磁共振T₂加權(quán)成像，觀察細(xì)胞移植體及其周邊組織的影像對比度。

具體實(shí)施例如下：

實(shí)施例1：靶向線粒體的造影劑分子Gd-DOTA-TPP的合成(圖6)

1、Bu^t₃DOTA(1,4,7–三(叔丁氧羰甲基)–10-(乙酸)-1,4,7,10–四氮雜環(huán)十二烷)的合成。按以下步驟從1,4,7,10–四氮雜環(huán)十二烷(Cyclen)開始合成：

a)稱取10.0g Cyclen和29.3g NaHCO₃置于1L的三口瓶中，加入50mL乙腈。在通風(fēng)櫥內(nèi)稱取37.4g溴乙酸叔丁酯，加20mL乙腈后混合均勻，放入滴液漏斗中。在冰浴和N₂保護(hù)下將溴乙酸叔丁酯的乙腈溶液緩慢滴加至三口瓶中的反應(yīng)混合物中。滴加完畢后，室溫下繼續(xù)攪拌30小時(shí)。濾除固體，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙腈，用甲苯重結(jié)晶2次，得16g白色固體Bu^t₃DO3A(1,4,7–三(叔丁氧羰甲 基)–1,4,7,10–四氮雜環(huán)十二烷)。

b)稱取1.38g K₂CO₃和2.57g Bu^t₃DO3A置于250mL的三口燒瓶中，加入50mL乙腈，在N₂保護(hù)和室溫?cái)嚢柘碌渭?.0g溴乙酸乙酯的5mL乙腈溶液，溫度升至70℃反應(yīng)12-24小時(shí)。冷卻至室溫，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。用CH₂Cl₂/MeOH(20:1)為展開劑進(jìn)行柱色譜層析分離，得到2.5g淡黃色粘稠狀泡沫狀產(chǎn)物1,4,7–三(叔丁氧羰甲基)–10-(乙氧羰甲基)1,4,7,10–四氮雜環(huán)十二烷(Bu^t₃Et-DOTA)。

c)稱取1.5g Bu^t₃Et-DOTA于250mL的三口燒瓶中，加入50mL二氧六環(huán)溶解，N₂保護(hù)下加入25mL 1.2M NaOH水溶液，50-70℃攪拌4小時(shí)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氧六環(huán)，用二氯甲烷萃取三次(每次25mL)，合并萃取液，用無水硫酸鈉干燥。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，用CH₂Cl₂/MeOH(20:1)為展開劑進(jìn)行柱色譜層析分離，得到1.0g淡黃色粘稠狀泡沫狀產(chǎn)物Bu^t₃DOTA。

2、Ph₃P(Br)(CH₂)₄COOH[溴化(4-羧丁基三苯基鏻)]的合成

稱取7.42g三苯基鏻和5.01g 5-溴戊酸置于100mL圓底燒瓶中，加入35mL二甲苯，攪拌溶解。加熱至140℃，冷凝回流4小時(shí)。冷卻至40℃～50℃，在強(qiáng)烈攪拌下用分液漏斗緩慢滴加30mL二甲基醚，得到白色晶體。抽濾，將白色晶體用少量二乙基醚洗兩次，得到產(chǎn)物溴化(4-羧丁基三苯基鏻)8.51克，產(chǎn)率68％。

3、用固相合成的方法合成DOTA-TPP：

步驟簡述如下：按傳統(tǒng)的Fmoc(氯甲酸芴甲酯)法在固相合成儀上合成，按圖6所示的結(jié)構(gòu)，從C端向N端依次偶聯(lián)氨基酸。首先固相載體2-氯三苯甲基樹脂1g，依次加入2.0g Fmoc-Lys(Mtt)-OH，1.77g Ph₃P(Br)(CH₂)₄COOH進(jìn)行縮合，每步的羧基和氨基縮合的條件是以50mL的DMF為溶劑，加入0.96g TBTU、0.41gHOBt縮合劑和2.5mL的堿DIPEA，25℃反應(yīng)大約24小時(shí)，具體時(shí)間以茚三酮顯色為準(zhǔn)來判斷羧基和氨基縮合是否結(jié)束；縮合結(jié)束之后抽干溶劑，分別用50mL甲醇，用DMF、甲醇和二氯甲烷洗三次。加入Ph₃P(Br)(CH₂)₄COOH之前脫除Fmoc的條件：25mL 20％哌啶/DMF室溫反應(yīng)0.5小時(shí)，抽干，再加入25mL 20％哌啶/DMF反應(yīng)0.5小時(shí)，抽干，分別用DMF、甲醇、二氯甲烷各洗滌三次。

縮合Ph₃P(Br)(CH₂)₄COOH之后，加入50mL 1％TFA/二氯甲烷脫去保護(hù)基團(tuán)Mtt，抽干。分別用DMF、甲醇、二氯甲烷各洗滌三次。加入1.72g Bu^t₃DOTA， 50mL的DMF溶劑，0.96g TBTU、0.41g HOBt縮合劑和2.5mL的堿DIPEA，25℃反應(yīng)，以茚三酮顯色判斷羧基和氨基縮合結(jié)束之后抽干溶劑，分別用50mL甲醇，用DMF、甲醇和二氯甲烷洗三次。加入50mL 50％TFA/二氯甲烷，25℃反應(yīng)40分鐘。過濾，取濾液，用三乙胺將濾液pH調(diào)到中性，濃縮至干。加入乙醚，析出白色固體，得粗產(chǎn)品。

粗產(chǎn)品進(jìn)一步用HPLC純化，Waters2535_2707_2998_WFC，XBridge Pre C18 5μm 19×150mm，流動(dòng)相為：溶劑A(0.1％TFA，水)，溶劑B(0.1％TFA，CH₃CN)，溶劑A在25分鐘內(nèi)從50％降到25％；流速10mL/分鐘。得到約200mg產(chǎn)品DOTA-TPP，純度95％以上。

4、將脫保護(hù)的DOTA-TPP與Gd³⁺絡(luò)合，得到Gd-DOTA-TPP靶向線粒體的造影劑分子。具體如下：將含有35.7mg的GdCl₃·6H₂O的水溶液約1.0mL滴加到100mg上述DOTA-TPP的水溶液中混合3小時(shí)，小心用1.0M氨水調(diào)pH值到6左右，室溫下靜態(tài)混合器轉(zhuǎn)動(dòng)過夜，然后用1.0M氨水和1.0M鹽酸小心調(diào)pH值到7-8，澄清水溶液冷凍干燥后得到白色粉末Gd-DOTA-TPP靶向線粒體的造影劑分子。用HPLC檢測Gd-DOTA-TPP的純度。HPLC條件，Waters2535_2707_2998，Sapphire C18 5μm 4.6×250mm，流動(dòng)相為：溶劑A(0.1％TFA，水)，溶劑B(0.1％TFA，80％CH₃CN，20％水)，溶劑B在20分鐘內(nèi)從22％升至42％；流速1.0mL/分鐘。純度95％以上。

實(shí)施例2：(Gd-DOTA)₄-TPP靶向線粒體的造影劑分子的合成(圖7)

1、按照實(shí)施例1合成Bu^t₃DOTA和Ph₃P(Br)(CH₂)₄COOH。

2、用固相合成的方法合成DOTA₄-TPP：步驟簡述如下：按傳統(tǒng)的Fmoc法在固相合成儀上合成，按圖7所示的結(jié)構(gòu)，從C端向N端依次偶聯(lián)氨基酸。首先固相載體2-氯三苯甲基樹脂1g，依次加入2.0g Fmoc-Lys(Mtt)-OH，1.77g Ph₃P(Br)(CH₂)₄COOH進(jìn)行縮合，每步的羧基和氨基縮合的條件是以50mL的DMF為溶劑，加入0.96g TBTU、0.41g HOBt縮合劑和2.5mL的堿DIPEA，25℃反應(yīng)大約24小時(shí)，具體時(shí)間以茚三酮顯色為準(zhǔn)來判斷羧基和氨基縮合是否結(jié)束；縮合結(jié)束之后抽干溶劑，分別用50mL甲醇，用DMF、甲醇和二氯甲烷洗三次。加入Ph₃P(Br)(CH₂)₄COOH之前脫除Fmoc的條件：25mL 20％哌啶/DMF室溫反應(yīng)0.5小時(shí)，抽干，再加入25mL 20％哌啶/DMF反應(yīng)0.5小時(shí)，抽干，分別用DMF、甲醇、 二氯甲烷各洗滌三次。

縮合Ph₃P(Br)(CH₂)₄COOH之后，加入50mL 1％TFA/二氯甲烷脫去賴氨酸側(cè)鏈的保護(hù)基團(tuán)Mtt，抽干溶劑。分別用DMF、甲醇、二氯甲烷各洗滌三次。然后依次加入Fmoc保護(hù)的氨基酸進(jìn)行縮合(2.0g Fmoc-Lys(Fmoc)-OH，4.0g Fmoc-Lys(Mtt)-OH，2.12g Fmoc-ε-Acp-OH)。每步的羧基和氨基縮合的條件是以50mL的DMF為溶劑，加入1.92g TBTU、0.82g HOBt縮合劑和5mL的堿DIPEA，25℃反應(yīng)大約24小時(shí)，具體時(shí)間以茚三酮顯色為準(zhǔn)來判斷羧基和氨基縮合是否結(jié)束；縮合結(jié)束之后抽干溶劑，分別用50mL甲醇，用DMF、甲醇和二氯甲烷洗三次。加入下一個(gè)Fmoc保護(hù)的氨基酸之前脫除上一個(gè)Fmoc的條件：25mL 20％哌啶/DMF室溫反應(yīng)0.5小時(shí)，抽干，再加入25mL 20％哌啶/DMF反應(yīng)0.5小時(shí)，抽干，分別用DMF、甲醇、二氯甲烷各洗滌三次。

在最后縮合Fmoc-ε-Acp-OH并且脫掉Fmoc之后，加入100mL 1％TFA/二氯甲烷脫去保護(hù)基團(tuán)Mtt，抽干。分別用DMF、甲醇、二氯甲烷各洗滌三次。加入7gBu^t₃DOTA，200mL的DMF溶劑，4g TBTU、1.64g HOBt縮合劑和10mL的堿DIPEA，25℃反應(yīng)，以茚三酮顯色判斷羧基和氨基縮合結(jié)束之后抽干溶劑，分別用50mL甲醇，用DMF、甲醇和二氯甲烷洗三次。加入50mL 50％TFA/二氯甲烷，25℃反應(yīng)40分鐘。過濾，取濾液，用三乙胺將濾液pH調(diào)到中性，濃縮至干。加入乙醚，析出白色固體，得粗產(chǎn)品。

粗產(chǎn)品進(jìn)一步用HPLC純化，Waters2535_2707_2998_WFC，XBridge Pre C18 5μm 19×150mm，流動(dòng)相為：溶劑A(0.1％TFA，水)，溶劑B(0.1％TFA，CH₃CN)，溶劑A15分鐘內(nèi)從80％降到65％；流速10mL/分鐘。得到約200mg產(chǎn)品(DOTA)₄-TPP，純度95％以上。

3、將脫保護(hù)的DOTA₄-TPP與Gd³⁺絡(luò)合，得到(Gd-DOTA)₄-TPP靶向線粒體的造影劑分子。具體如下：將含有12.8mg的GdCl₃·6H₂O的水溶液約0.5mL滴加到100mg上述DOTA₄-TPP的水溶液中混合3小時(shí)，小心用1.0M氨水調(diào)pH值到6左右，室溫下靜態(tài)混合器轉(zhuǎn)動(dòng)過夜，然后用1.0M氨水和1.0M鹽酸小心調(diào)pH值到7-8，澄清水溶液冷凍干燥后得到白色粉末(Gd-DOTA)₄-TPP靶向線粒體的造影劑分子。用HPLC檢測(Gd-DOTA)₄-TPP的純度。HPLC條件，Waters2535_2707_2998，Sapphire C18 5μm 4.6×250mm，流動(dòng)相為：溶劑A(0.1％TFA，水)，溶劑B(0.1％TFA，80％CH₃CN，20％水)，溶劑B在20分鐘內(nèi)從24％升至44％；流速1.0mL/分鐘。純 度95％以上。

實(shí)施例3：(Gd-DOTA)₄-linker-TPP靶向線粒體的造影劑分子的合成(這里的spacer為Acp)(圖8，樹枝型分子)

1、按照實(shí)施例1的方法合成分別Bu^t₃DOTA和Ph₃P(Br)(CH₂)₄COOH。

2、用固相合成的方法合成DOTA₄-linker-TPP：

步驟簡述如下：按傳統(tǒng)的Fmoc法在固相合成儀上合成，按圖8所示的結(jié)構(gòu)，從C端向N端依次偶聯(lián)氨基酸。首先固相載體2-氯三苯甲基樹脂1g，依次加入2.0g Fmoc-Lys(Mtt)-OH，1.77g Ph₃P(Br)(CH₂)₄COOH進(jìn)行縮合，每步的羧基和氨基縮合的條件是以50mL的DMF為溶劑，加入0.96g TBTU、0.41g HOBt縮合劑和2.5mL的堿DIPEA，25℃反應(yīng)大約24小時(shí)，具體時(shí)間以茚三酮顯色為準(zhǔn)來判斷羧基和氨基縮合是否結(jié)束；縮合結(jié)束之后抽干溶劑，分別用50mL甲醇，用DMF、甲醇和二氯甲烷洗三次。加入Ph₃P(Br)(CH₂)₄COOH之前脫除Fmoc的條件：25mL 20％哌啶/DMF室溫反應(yīng)0.5小時(shí)，抽干，再加入25mL 20％哌啶/DMF反應(yīng)0.5小時(shí)，抽干，分別用DMF、甲醇、二氯甲烷各洗滌三次。

縮合Ph₃P(Br)(CH₂)₄COOH之后，加入50mL 1％TFA/二氯甲烷脫去賴氨酸側(cè)鏈的保護(hù)基團(tuán)Mtt，抽干溶劑。分別用DMF、甲醇、二氯甲烷各洗滌三次。然后依次加入Fmoc保護(hù)的氨基酸進(jìn)行縮合(1.06g Fmoc-ε-Acp-OH，2.0g Fmoc-Lys(Fmoc)-OH，4.0g Fmoc-Lys(Mtt)-OH，2.12g Fmoc-ε-Acp-OH)。每步的羧基和氨基縮合的條件是以50mL的DMF為溶劑，加入1.92g TBTU、0.82g HOBt縮合劑和5mL的堿DIPEA，25℃反應(yīng)大約24小時(shí)，具體時(shí)間以茚三酮顯色為準(zhǔn)來判斷羧基和氨基縮合是否結(jié)束；縮合結(jié)束之后抽干溶劑，分別用50mL甲醇，用DMF、甲醇和二氯甲烷洗三次。加入下一個(gè)Fmoc保護(hù)的氨基酸之前脫除上一個(gè)Fmoc的條件：25mL 20％哌啶/DMF室溫反應(yīng)0.5小時(shí)，抽干，再加入25mL 20％哌啶/DMF反應(yīng)0.5小時(shí)，抽干，分別用DMF、甲醇、二氯甲烷各洗滌三次。

在最后縮合Fmoc-ε-Acp-OH并且脫掉Fmoc之后，加入100mL 1％TFA/二氯甲烷脫去保護(hù)基團(tuán)Mtt，抽干。分別用DMF、甲醇、二氯甲烷各洗滌三次。加入7g Bu^t₃DOTA，200mL的DMF溶劑，4g TBTU、1.64g HOBt縮合劑和10mL的堿DIPEA，25℃反應(yīng)，以茚三酮顯色判斷羧基和氨基縮合結(jié)束之后抽干溶劑，分別用50mL甲醇，用DMF、甲醇和二氯甲烷洗三次。加入50mL 50％TFA/二氯甲 烷，25℃反應(yīng)40分鐘。過濾，取濾液，用三乙胺將濾液pH調(diào)到中性，濃縮至干。加入乙醚，析出白色固體，得粗產(chǎn)品。

粗產(chǎn)品進(jìn)一步用HPLC純化，Waters2535_2707_2998_WFC，XBridge Pre C18 5μm 19×150mm，流動(dòng)相為：溶劑A(0.1％TFA，水)，溶劑B(0.1％TFA，CH₃CN)，溶劑A在15分鐘從80％降到65％；流速10mL/分鐘。得到約200mg產(chǎn)品(DOTA)₄-linker-TPP，純度95％以上。

3、將脫保護(hù)的DOTA₄-spacer-TPP與Gd³⁺絡(luò)合，得到(Gd-DOTA)₄-linker-TPP靶向線粒體的造影劑分子。具體如下：將含有12.8mg的GdCl₃·6H₂O的水溶液約0.5mL滴加到100mg上述DOTA₄-linker-TPP的水溶液中混合3小時(shí)，小心用1.0M氨水調(diào)pH值到6左右，室溫下靜態(tài)混合器轉(zhuǎn)動(dòng)過夜，然后用1.0M氨水和1.0M鹽酸小心調(diào)pH值到7-8，澄清水溶液冷凍干燥后得到白色粉末(Gd-DOTA)₄-linker-TPP靶向線粒體的造影劑分子。用HPLC檢測(Gd-DOTA)₄-linker-TPP的純度。HPLC條件，Waters2535_2707_2998，Sapphire C18 5μm 4.6×250mm，流動(dòng)相為：溶劑A(0.1％TFA，水)，溶劑B(0.1％TFA，80％CH₃CN，20％水)，溶劑B在20分鐘內(nèi)從24％升至44％；流速1.0mL/分鐘。純度95％以上。

實(shí)施例4：(Gd-DOTA)₄-linker-TPP靶向線粒體的造影劑分子的合成(這里的spacer為Acp)(圖9，線型分子)

1、按照實(shí)施例1的方法合成Bu^t₃DOTA和Ph₃P(Br)(CH₂)₄COOH。

2、按照實(shí)施例3合成DOTA₄-linker-TPP的方法，按圖9所示的結(jié)構(gòu)用固相合成的方法合成線型分子連接的DOTA₄-linker-TPP。

3、將脫保護(hù)的DOTA₄-spacer-TPP與Gd³⁺絡(luò)合，得到(Gd-DOTA)₄-linker-TPP靶向線粒體的造影劑分子。具體如下：將含有12.8mg的GdCl₃·6H₂O的水溶液約0.5mL滴加到100mg上述DOTA₄-linker-TPP的水溶液中混合3小時(shí)，小心用1.0M氨水調(diào)pH值到6左右，室溫下靜態(tài)混合器轉(zhuǎn)動(dòng)過夜，然后用1.0M氨水和1.0M鹽酸小心調(diào)pH值到7-8，澄清水溶液冷凍干燥后得到白色粉末(Gd-DOTA)₄-linker-TPP靶向線粒體的造影劑分子。用HPLC檢測(Gd-DOTA)₄-linker-TPP的純度。HPLC條件，Waters2535_2707_2998，Sapphire C18 5μm 4.6×250mm，流動(dòng)相為：溶劑A(0.1％TFA水)，溶劑B(0.1％TFA，80％CH₃CN，20％水)，溶劑B在20分鐘內(nèi)從24％升至44％；流速1.0mL/分鐘。純度95％以上。

實(shí)施例5：(Dy-DOTA)₄-linker-TPP靶向線粒體的造影劑分子的合成(這里的linker＝Acp)(圖10)

1、按照實(shí)施例1的方法合成Bu^t₃DOTA和Ph₃P(Br)(CH₂)₄COOH。

2、按照實(shí)施例3的方法合成DOTA₄-linker-TPP：

3、將脫保護(hù)的DOTA₄-linker-TPP與Dy³⁺絡(luò)合，得到(Dy-DOTA)₄-linker-TPP靶向線粒體的造影劑分子。具體如下：將含有13.0mg的DyCl₃·6H₂O的水溶液約0.5mL滴加到100mg上述DOTA₄-linker-TPP的水溶液中混合3小時(shí)，小心用1.0M氨水調(diào)pH值到6左右，室溫下靜態(tài)混合器轉(zhuǎn)動(dòng)過夜，然后用1.0M氨水和1.0M鹽酸小心調(diào)pH值到7-8，澄清水溶液冷凍干燥后得到白色粉末(Dy-DOTA)₄-linker-TPP靶向線粒體的造影劑分子。用HPLC檢測(Dy-DOTA)₄-linker-TPP的純度。HPLC條件，Waters2535_2707_2998，Sapphire C18 5μm 4.6×250mm，流動(dòng)相為：溶劑A(0.1％TFA，水)，溶劑B(0.1％TFA，80％CH₃CN，20％水)，溶劑B在20分鐘內(nèi)從24％升至44％；流速1.0mL/分鐘。純度95％以上。

實(shí)施例6：(Gd-DTPA)₄-linker-TPP靶向線粒體的造影劑分子的合成(這里的linker＝Acp)(圖11)

1、按照實(shí)施例1的方法合成Ph₃P(Br)(CH₂)₄COOH

2、用固相合成的方法合成DTPA₄-linker-TPP：

步驟簡述如下：按傳統(tǒng)的Fmoc法在固相合成儀上合成，按圖10所示的結(jié)構(gòu)，從C端向N端依次偶聯(lián)氨基酸。首先固相載體2-氯三苯甲基樹脂1g，依次加入2.0g Fmoc-Lys(Mtt)-OH，1.77g Ph₃P(Br)(CH₂)₄COOH進(jìn)行縮合，每步的羧基和氨基縮合的條件是以50mL的DMF為溶劑，加入0.96g TBTU、0.41g HOBt縮合劑和2.5mL的堿DIPEA，25℃反應(yīng)大約24小時(shí)，具體時(shí)間以茚三酮顯色為準(zhǔn)來判斷羧基和氨基縮合是否結(jié)束；縮合結(jié)束之后抽干溶劑，分別用50mL甲醇，用DMF、甲醇和二氯甲烷洗三次。加入Ph₃P(Br)(CH₂)₄COOH之前脫除Fmoc的條件：25mL 20％哌啶/DMF室溫反應(yīng)0.5小時(shí)，抽干，再加入25mL 20％哌啶/DMF反應(yīng)0.5小時(shí)，抽干，分別用DMF、甲醇、二氯甲烷各洗滌三次。

縮合Ph₃P(Br)(CH₂)₄COOH之后，加入50mL 1％TFA/二氯甲烷脫去賴氨酸側(cè)鏈的保護(hù)基團(tuán)Mtt，抽干溶劑。分別用DMF、甲醇、二氯甲烷各洗滌三次。然后 依次加入Fmoc保護(hù)的氨基酸進(jìn)行縮合(1.06g Fmoc-ε-Acp-OH，2.0g Fmoc-Lys(Fmoc)-OH，4.0g Fmoc-Lys(Mtt)-OH，2.12g Fmoc-ε-Acp-OH)。每步的羧基和氨基縮合的條件是以50mL的DMF為溶劑，加入1.92g TBTU、0.82g HOBt縮合劑和5mL的堿DIPEA，25℃反應(yīng)大約24小時(shí)，具體時(shí)間以茚三酮顯色為準(zhǔn)來判斷羧基和氨基縮合是否結(jié)束；縮合結(jié)束之后抽干溶劑，分別用50mL甲醇，用DMF、甲醇和二氯甲烷洗三次。加入下一個(gè)Fmoc保護(hù)的氨基酸之前脫除上一個(gè)Fmoc的條件：25mL 20％哌啶/DMF室溫反應(yīng)0.5小時(shí)，抽干，再加入25mL 20％哌啶/DMF反應(yīng)0.5小時(shí)，抽干，分別用DMF、甲醇、二氯甲烷各洗滌三次。

在最后縮合Fmoc-ε-Acp-OH并且脫掉Fmoc之后，加入100mL 1％TFA/二氯甲烷脫去保護(hù)基團(tuán)Mtt，抽干。分別用DMF、甲醇、二氯甲烷各洗滌三次。加入4.0g DTPAA(二乙三胺五乙酸酸酐)，200mL的DMF溶劑和10mL的堿DIPEA，25℃反應(yīng)，以茚三酮顯色判斷羧基和氨基縮合結(jié)束之后抽干溶劑，分別用50mL甲醇，用DMF、甲醇和二氯甲烷洗三次。加入50mL 50％TFA/二氯甲烷，25℃反應(yīng)40分鐘。過濾，取濾液，用三乙胺將濾液pH調(diào)到中性，濃縮至干。加入乙醚，析出白色固體，得粗產(chǎn)品。

粗產(chǎn)品進(jìn)一步用HPLC純化，Waters2535_2707_2998_WFC，XBridge Pre C18 5μm 19×150mm，流動(dòng)相為：溶劑A(0.1％TFA，水)，溶劑B(0.1％TFA，CH₃CN)，溶劑A在15分鐘內(nèi)從80％降到65％；流速10mL/分鐘。得到約200mg產(chǎn)品(DTPA)₄-spacer-TPP，純度95％以上。

3、將脫保護(hù)的DTPA₄-linker-TPP與Gd³⁺絡(luò)合，得到(Gd-DTPA)₄-linker-TPP靶向線粒體的造影劑分子。具體如下：將含有12.8mg的GdCl₃·6H₂O的水溶液約0.5mL滴加到100mg上述DTPA₄-linker-TPP的水溶液中混合3小時(shí)，小心用1.0M氨水調(diào)pH值到6左右，室溫下靜態(tài)混合器轉(zhuǎn)動(dòng)過夜，然后用1.0M氨水和1.0M鹽酸小心調(diào)pH值到7-8，澄清水溶液冷凍干燥后得到白色粉末(Gd-DTPA)₄-linker-TPP靶向線粒體的造影劑分子。用HPLC檢測(Gd-DTPA)₄-linker-TPP的純度。HPLC條件，Waters2535_2707_2998，Sapphire C18 5μm 4.6×250mm，流動(dòng)相為：溶劑A(0.1％，TFA水)，溶劑B(0.1％TFA，80％CH₃CN，20％水)，溶劑B在20分鐘內(nèi)從24％升至44％；流速1.0mL/分鐘。純度95％以上。

實(shí)施例7：(Gd-DOTA)₄-linker-(對甲苯基)₃P靶向線粒體的造影劑分子的合成(這里的linker＝Acp)(圖12)

1、按照實(shí)施例1合成Bu^t₃DOTA。

2、(對甲苯基)₃P(Br)(CH₂)₄COOH[溴化(4-羧丁基三(對甲基苯基)鏻)]的合成

按照實(shí)施例1合成Ph₃P(Br)(CH₂)₄COOH的步驟，把原料7.42g的三苯基膦換成8.61g的三對甲苯基膦，其它原料和條件都不變。得產(chǎn)物溴化(4-羧丁基三對甲苯基鏻)8.0克，產(chǎn)率58％。

3、用固相合成的方法合成DOTA₄-linker-(對甲苯基)₃P：

按照實(shí)施例3的合成步驟，把原料1.77g Ph₃P(Br)(CH₂)₄COOH換成1.94g的(對甲苯基)₃P(Br)(CH₂)₄COOH，其它原料和條件以及檢測步驟都不變。

4、將脫保護(hù)的DOTA₄-linker-(對甲苯基)₃P與Gd³⁺絡(luò)合，得到(Gd-DOTA)₄-linker-(對甲苯基)₃P靶向線粒體的造影劑分子。按照實(shí)施例3的絡(luò)合步驟，將含有12.6mg的GdCl₃·6H₂O的水溶液約0.5mL滴加到100mg上述DOTA₄-linker-(對甲苯基)₃P的水溶液中混合，其它原料和條件以及檢測步驟都不變。

實(shí)施例8：(Gd-DOTA)₄-linker-TPP₂靶向線粒體的造影劑分子的合成(圖13，這里的linker為Lys(Acp)-NH₂，造影單元Gd-DOTA連接在線型多肽分子上，兩個(gè)靶向單元TPP連接在線型分子的同一端，該Lys的羧基被酰胺化)

1、按照實(shí)施例1的方法合成Bu^t₃DOTA和Ph₃P(Br)(CH₂)₄COOH。

2、按圖13所示的結(jié)構(gòu)用固相合成的方法合成線型分子連接的DOTA₄-linker-TPP₂。本實(shí)施例中，連接子賴氨酸的羧基轉(zhuǎn)換成了酰胺基(本發(fā)明所述的所有靶向線粒體的造影劑分子的連接子賴氨酸的羧基都可以轉(zhuǎn)換成酰胺基，并且具有同樣的造影效果)。

步驟簡述如下：按傳統(tǒng)的Fmoc法在固相合成儀上合成，按圖10所示的結(jié)構(gòu)，從C端向N端依次偶聯(lián)氨基酸。首先固相載體使用用于生產(chǎn)C端酰胺結(jié)尾的多肽的樹脂如Rink Amide AM Resin或者Rink Amide MBHA Resin/Knorr Resin 1g，依次加入2.0g Fmoc-Lys(Mtt)-OH、2.0g Fmoc-Lys(Fmoc)-OH、3.54g Ph₃P(Br)(CH₂)₄COOH進(jìn)行縮合。每步的羧基和氨基縮合的條件、羧基和氨基縮合是否結(jié)束的判斷標(biāo)準(zhǔn)、縮合結(jié)束之后的后處理、加入Ph₃P(Br)(CH₂)₄COOH之 前脫除Fmoc的條件等與實(shí)施例3相同。

縮合Ph₃P(Br)(CH₂)₄COOH之后，加入50mL 1％TFA/二氯甲烷脫去賴氨酸側(cè)鏈的保護(hù)基團(tuán)Mtt，抽干溶劑。分別用DMF、甲醇、二氯甲烷各洗滌三次。然后依次加入1.06g Fmoc-ε-Acp-OH，2.0g Mtt-Lys(Fmoc)-OH,1.72g Bu^t₃DOTA進(jìn)行縮合。每步的羧基和氨基縮合的條件是以50mL的DMF為溶劑，加入1.92g TBTU、0.82g HOBt縮合劑和5mL的堿DIPEA，25℃反應(yīng)大約24小時(shí)，具體時(shí)間以茚三酮顯色為準(zhǔn)來判斷羧基和氨基縮合是否結(jié)束；縮合結(jié)束之后抽干溶劑，分別用50mL甲醇，用DMF、甲醇和二氯甲烷洗三次。加入下一個(gè)分子縮合之前脫除上一個(gè)Fmoc的條件：25mL 20％哌啶/DMF室溫反應(yīng)0.5小時(shí)，抽干，再加入25mL 20％哌啶/DMF反應(yīng)0.5小時(shí)，抽干，分別用DMF、甲醇、二氯甲烷各洗滌三次。這樣完成一個(gè)造影單元絡(luò)合劑DOTA的線性連接。再重復(fù)此過程兩次，完成三個(gè)造影單元絡(luò)合劑DOTA的線性連接；最后一個(gè)造影單元絡(luò)合劑DOTA的線性連接與上述過程相同，但是所加的縮合分子只加入1.06g Fmoc-ε-Acp-OH，1.72g Bu^t₃DOTA進(jìn)行縮合，不加Mtt-Lys(Fmoc)-OH分子。

全部縮合之后加入50mL 50％TFA/二氯甲烷，25℃反應(yīng)40分鐘。過濾，取濾液，用三乙胺將濾液pH調(diào)到中性，濃縮至干。加入乙醚，析出白色固體，得粗產(chǎn)品。

粗產(chǎn)品進(jìn)一步用HPLC純化，Waters2535_2707_2998_WFC，XBridge Pre C18 5μm 19×150mm，流動(dòng)相為：溶劑A(0.1％TFA，水)，溶劑B(0.1％TFA，CH₃CN)，溶劑A在15分鐘內(nèi)從80％降到65％；流速10mL/分鐘。得到約200mg產(chǎn)品(DTPA)₄-spacer-TPP，純度95％以上。

3、將脫保護(hù)的DOTA₄-linker-TPP₂與Gd³⁺絡(luò)合，得到(Gd-DOTA)₄-linker-TPP₂靶向線粒體的造影劑分子。具體如下：將含有12.8mg的GdCl₃·6H₂O的水溶液約0.5mL滴加到100mg上述DOTA₄-linker-TPP₂的水溶液中混合3小時(shí)，小心用1.0M氨水調(diào)pH值到6左右，室溫下靜態(tài)混合器轉(zhuǎn)動(dòng)過夜，然后用1.0M氨水和1.0M鹽酸小心調(diào)pH值到7-8，澄清水溶液冷凍干燥后得到白色粉末(Gd-DOTA)₄-linker-TPP₂靶向線粒體的造影劑分子。用HPLC檢測(Gd-DOTA)₄-linker-TPP₂的純度。HPLC條件，Waters2535_2707_2998，Sapphire C18 5μm 4.6×250mm，流動(dòng)相為：溶劑A(0.1％TFA水)，溶劑B(0.1％TFA，80％CH₃CN，20％水)，溶劑B在20分鐘內(nèi)從24％升至44％；流速1.0mL/分鐘。純 度95％以上。

實(shí)施例9：三苯基鏻靶向線粒體的造影劑分子標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法

1、將凍存在液氮里的人源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)取出，在37℃水浴中迅速解凍。在超凈臺中，用1mL移液槍將解凍后細(xì)胞的凍存液取出并置于10mL滅菌離心管中，同時(shí)加入2mL完全培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM-F12 80％～90％，澳洲胎牛血清10％～20％，雙抗1％)，1000轉(zhuǎn)每分鐘離心5分鐘，吸去培養(yǎng)基。加3mL完全培養(yǎng)基于離心管中，將細(xì)胞沉淀吹散，取出細(xì)胞懸液，置于100×20mm培養(yǎng)皿中，繼續(xù)加入5mL完全培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使細(xì)胞均勻分散于完全培養(yǎng)基中。再放入37℃，5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞復(fù)蘇第二天，更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)貼壁細(xì)胞密度達(dá)到80％～90％，吸去培養(yǎng)基。用2mL無菌PBS溶液輕輕洗滌長滿細(xì)胞的培養(yǎng)皿，再加入1mL PBS和1mL胰蛋白酶，顯微鏡下及時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞消化完全后，吸去胰酶，用含4m完全培養(yǎng)基吹打細(xì)胞，一分為二轉(zhuǎn)移至兩個(gè)100×20mm培養(yǎng)皿中，再分別加入6mL完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)取用6-9代的細(xì)胞。

2、細(xì)胞處理：當(dāng)貼壁細(xì)胞密度達(dá)到80％～90％時(shí)，用2ml無菌PBS溶液輕輕洗滌長滿細(xì)胞的培養(yǎng)皿，再加入1mL PBS和1mL胰蛋白酶,顯微鏡下及時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞消化完全后，吸去胰蛋白酶。用4mL完全培養(yǎng)基吹打細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至10mL滅菌離心管，1000轉(zhuǎn)每分鐘離心5分鐘，吸去培養(yǎng)基得到細(xì)胞沉淀。再用4mL PBS進(jìn)行同樣的重懸操作。

3、電穿孔標(biāo)記細(xì)胞

將按照本發(fā)明方法制備的三苯基鏻靶向線粒體的造影劑分子溶于生理鹽水，配成1、2、5、10、20、40mM的濃度系列。取100μL樣品溶液置于細(xì)胞沉淀中(100μL含細(xì)胞量為100萬～200萬個(gè))，吹散細(xì)胞，將吹散的細(xì)胞置于96孔板中，采用壹達(dá)電轉(zhuǎn)染儀器及電壓120V，脈寬100μs，間隔1000ms，重復(fù)6次的電擊實(shí)驗(yàn)條件，將所述靶向線粒體的造影劑分子導(dǎo)入細(xì)胞質(zhì)中，在施加一定的電脈沖進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，需保證96孔板中的細(xì)胞是均勻分散在生理鹽水中，而不是已經(jīng)沉積在96孔板的底部。

實(shí)施例10：三苯基鏻靶向線粒體的造影劑分子標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞的體外 MRI影像方法

1、用實(shí)施例1和2制備的三苯基鏻靶向線粒體的造影劑分子，按照實(shí)施例9的方法標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞，每種探針濃度標(biāo)記的細(xì)胞一半轉(zhuǎn)移至10mL離心管中，并用3mL PBS洗培養(yǎng)皿，同樣移至離心管中。1200轉(zhuǎn)每分鐘離心5分鐘，除掉PBS。用外徑1.3mm的毛細(xì)管將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至內(nèi)徑為1.5mm的一端封口的毛細(xì)管中，1500轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘，將細(xì)胞密堆積于毛細(xì)管的底部，用于體外MRI影像試驗(yàn)。

2、另一半細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，直到細(xì)胞的數(shù)量翻倍后，再將其中一半細(xì)胞密堆積于毛細(xì)管的底部，用于體外MRI影像試驗(yàn)。另一半細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，直到細(xì)胞的數(shù)量翻倍。依此直到體外細(xì)胞MRI影像實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有差異。

3、將毛細(xì)管中的細(xì)胞在11.7T磁共振譜儀中進(jìn)行T₁加權(quán)和T₂加權(quán)成像。T₁加權(quán)像采用的是飽和恢復(fù)序列，TE＝5.2ms，TR＝500ms，F(xiàn)OV＝12×12mm²，矩陣＝96×96，層面厚度＝0.8mm，層面間隔＝0.2mm，累加次數(shù)＝4；T₂加權(quán)像采用的是多層面回波，TR＝3000ms，TE＝80ms，20個(gè)回波，F(xiàn)OV＝12×12mm²，矩陣＝96×96，層面厚度＝0.8mm，層面間隔＝0.2mm，累加次數(shù)＝1。

圖14是本實(shí)施例利用不同結(jié)構(gòu)的含三苯基鏻的靶向線粒體的造影劑分子在不同探針濃度下標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞標(biāo)記后再經(jīng)不同時(shí)間繁殖后得到的體外T₁加權(quán)和T₂加權(quán)MRI影像結(jié)果。實(shí)施例中也包括用不具細(xì)胞結(jié)合能力的Gd-DOTA標(biāo)記細(xì)胞作為體外MRI影像實(shí)驗(yàn)參考對比。

圖15是本實(shí)施例得到的磁標(biāo)記細(xì)胞經(jīng)不同時(shí)間繁殖后得到的體外T₁加權(quán)MRI影像信號強(qiáng)度隨細(xì)胞繁殖時(shí)間的變化?？梢钥吹剑?1)細(xì)胞剛被標(biāo)記時(shí)，Gd-DOTA標(biāo)記細(xì)胞的T₁加權(quán)MRI影像信號增強(qiáng)效應(yīng)顯著，經(jīng)含三苯基鏻的靶向線粒體的造影劑分子標(biāo)記的磁標(biāo)記細(xì)胞的T₁加權(quán)MRI影像信號增強(qiáng)效應(yīng)不顯著，甚至呈現(xiàn)信號減弱效應(yīng)；(2)伴隨磁標(biāo)記細(xì)胞的繁殖，所有磁標(biāo)記細(xì)胞的T₁加權(quán)MRI影像信號強(qiáng)度都迅速恢復(fù)(1～2天之內(nèi))到無標(biāo)記細(xì)胞的信號強(qiáng)度水平，表明磁共振T₁加權(quán)模式下長時(shí)間示蹤移植細(xì)胞體的局限性。

圖16是本實(shí)施例得到的磁標(biāo)記細(xì)胞經(jīng)不同時(shí)間繁殖后得到的體外T₂加權(quán)MRI影像信號強(qiáng)度隨細(xì)胞繁殖時(shí)間的變化。可以看到：(1)細(xì)胞剛被標(biāo)記時(shí)，Gd-DOTA標(biāo)記的磁標(biāo)記細(xì)胞的T₂加權(quán)MRI影像信號呈現(xiàn)顯著的增強(qiáng)效應(yīng)，經(jīng)含三苯基鏻的靶向線粒體的造影劑分子標(biāo)記的磁標(biāo)記細(xì)胞的T₂加權(quán)MRI影像信號 呈現(xiàn)顯著的信號減弱效應(yīng)，隨細(xì)胞標(biāo)記時(shí)探針濃度的增加，信號減弱程度越顯著，甚至能到達(dá)乃至低于噪音水平；(2)伴隨磁標(biāo)記細(xì)胞的繁殖，經(jīng)含三苯基鏻的靶向線粒體的造影劑分子標(biāo)記的磁標(biāo)記細(xì)胞的T₂加權(quán)MRI影像信號強(qiáng)度恢復(fù)速度明顯慢于其T₁加權(quán)MRI影像信號增強(qiáng)效應(yīng)的恢復(fù)速度，約5天內(nèi)仍然處于噪聲水平，約10天內(nèi)仍與無標(biāo)記細(xì)胞呈現(xiàn)顯著的對比度差異(暗信號)，需要約16天才達(dá)到無標(biāo)記細(xì)胞的信號強(qiáng)度水平，表明磁共振T₂加權(quán)模式下長時(shí)間示蹤移植細(xì)胞體的可行性。

實(shí)施例11：三苯基鏻靶向線粒體的造影劑分子標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞移植小鼠體內(nèi)的11.7T活體磁共振T₂加權(quán)影像

1、按實(shí)施例9的方法，利用(Gd-DOTA)₄-TPP靶向線粒體的造影劑分子通過脈沖電穿孔方法標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞，靶向線粒體的造影劑分子濃度為20mM；

2、將約3×10⁵個(gè)磁標(biāo)記的細(xì)胞通過定點(diǎn)注射的方法移植到小鼠顱內(nèi)，并在細(xì)胞移植后不同時(shí)間點(diǎn)(D0～D10)對細(xì)胞移植位置進(jìn)行11.7T磁共振T₂加權(quán)成像(S是影像的片層序號)。使用直徑為38mm的鳥籠線圈，采用RARE序列參數(shù)設(shè)置：TE＝7ms，TR＝125、300、500、750、1000、1500、3000、5000ms，F(xiàn)OV＝20×20mm²，矩陣＝128×128，層面厚度＝0.5mm，平均數(shù)＝4。得到的影像效果如圖17所示：移植細(xì)胞一部分位于顱內(nèi)，并長時(shí)間(D0～D10)呈現(xiàn)顯著的暗信號(白色箭頭指示位置)；一部分位于腦室內(nèi)，該部分細(xì)胞在移植后的當(dāng)天(D0)就在腦室內(nèi)快速遷移并呈現(xiàn)顯著的暗信號，隨后(D1～D4)該細(xì)胞移植體開始釋放靶向線粒體的造影劑分子并使其所處周邊組織呈現(xiàn)顯著的亮信號(灰色箭頭指示位置)。一周后細(xì)胞開始死亡，死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜破裂后釋放的靶向線粒體的造影劑分子也使其所處周邊組織呈現(xiàn)顯著的亮信號(黑色箭頭指示位置)。這是本發(fā)明提供的磁共振靶向線粒體的造影劑分子及影像方法的一個(gè)顯著特點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中可以明確地將細(xì)胞移植體與其周邊的組織區(qū)分開來。

實(shí)施例12：三苯基鏻靶向線粒體的造影劑分子標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞移植大鼠體內(nèi)的3T活體磁共振T₂加權(quán)影像

1、按實(shí)施例9的方法，利用(Gd-DOTA)₄-TPP靶向線粒體的造影劑分子通過脈沖電穿孔方法標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞，靶向線粒體的造影劑分子濃度為20mM；

2、將約1×10⁷個(gè)磁標(biāo)記細(xì)胞通過定點(diǎn)注射的方法移植到小鼠前腿肌肉中， 并在磁標(biāo)記細(xì)胞移植后對磁標(biāo)記細(xì)胞移植位置進(jìn)行3T磁共振T₂加權(quán)成像，得到的影像效果如圖18所示，細(xì)胞移植體呈現(xiàn)顯著的暗信號，說明本發(fā)明提供的靶向線粒體的造影劑分子、由其標(biāo)記的磁標(biāo)記細(xì)胞及磁共振影像活體示蹤方法在臨床影像設(shè)備上也具有應(yīng)用可行性。

實(shí)施例13：雙三苯基鏻靶向線粒體的造影劑分子標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞的體外MRI影像

用實(shí)施例8制備的雙三苯基鏻靶向線粒體的造影劑分子，按照實(shí)施例9的方法標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞，按照實(shí)施例10的方法進(jìn)行磁標(biāo)記細(xì)胞的體外T₂加權(quán)MRI影像。

圖19是本實(shí)施例得到的磁標(biāo)記細(xì)胞經(jīng)不同時(shí)間繁殖后得到的體外T₂加權(quán)MRI影像信號強(qiáng)度隨細(xì)胞繁殖時(shí)間的變化與實(shí)施例10中部分結(jié)果的對比。可以看到：經(jīng)含雙三苯基鏻的靶向線粒體的造影劑分子標(biāo)記的磁標(biāo)記細(xì)胞的T₂加權(quán)MRI影像信號強(qiáng)度恢復(fù)速度明顯慢于經(jīng)含一個(gè)三苯基鏻的靶向線粒體的造影劑分子標(biāo)記的磁標(biāo)記細(xì)胞，表明前者在磁共振T₂加權(quán)模式下可以在更長的時(shí)間范圍內(nèi)活體示蹤移植細(xì)胞體。

圖20是本實(shí)施例得到的磁標(biāo)記細(xì)胞經(jīng)不同時(shí)間繁殖后得到的體外T₂加權(quán)MRI影像信號強(qiáng)度與細(xì)胞中Gd含量變化的關(guān)系，表明要使磁標(biāo)記細(xì)胞在T₂加權(quán)MRI影像信號強(qiáng)度降到噪聲水平所需要的最少細(xì)胞Gd含量可以低至5×10⁹Gd/細(xì)胞。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。