本發(fā)明公開了一種新型光療納米制劑的制備方法以及其在腫瘤成像與光動力學(xué)治療中的應(yīng)用,屬于納米材料和生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù):
光動力學(xué)治療是一種新興的癌癥治療手段,它避免了傳統(tǒng)治療方式(如化學(xué)療法、放射性療法及手術(shù)切除)侵入性強(qiáng)、全身毒性大和治療不完全等缺點(diǎn),具有特異性強(qiáng)、對正常組織傷害小以及無藥物毒性積累等優(yōu)勢。光動力學(xué)治療主要利用光敏劑分子在光照條件下產(chǎn)生的活性氧分子來殺死癌細(xì)胞。然而大多數(shù)光敏劑分子水溶性較差,在水溶液中易形成聚集體,這極大地抑制了光敏劑的單線態(tài)氧產(chǎn)率和治療效果。
目前常用的策略是將光敏劑載入到納米顆粒中來改善光動力學(xué)治療效果,這些納米顆粒主要包括脂質(zhì)體、膠束、量子點(diǎn)、金屬納米顆粒、高分子納米顆粒和氧化石墨烯等??傮w來說,現(xiàn)有的載藥策略主要可分為物理包裹和共價(jià)接枝兩種:物理包裹的方法雖然制備簡單,但存在載藥量低和藥物提前釋放等問題;共價(jià)接枝的策略所形成的納米顆粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,避免了藥物的提前釋放,然而納米顆粒表面過量裝載光敏劑會影響其水溶性并且導(dǎo)致光敏劑分子的自淬滅。因此,開發(fā)一種載藥量高且安全有效的光動力學(xué)治療藥物十分必要。
此外,光動力治療對于癌細(xì)胞的殺傷效果主要來自于單線態(tài)氧對細(xì)胞器的破壞作用。而單線態(tài)氧壽命短,作用距離有限,因此其抗癌療效很大程度上依賴于光敏劑的內(nèi)吞效率和亞細(xì)胞定位情況。一般來說,定位于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器的光動力療法效果更加顯著,作用于細(xì)胞膜的光療可以加速細(xì)胞的壞死,而定位在溶酶體等細(xì)胞器的光療相對而言效果較差??紤]到這些因素,提升光動力治療效果可以通過兩方面實(shí)現(xiàn),一是增加光敏劑的內(nèi)吞效率和內(nèi)吞量,二是改變光敏劑的亞細(xì)胞定位情況,使其主要分布于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等對單線態(tài)氧作用更加敏感的細(xì)胞器。
綜上所述,開發(fā)一種載藥量高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、具有細(xì)胞高內(nèi)吞效率和可實(shí)現(xiàn)特定細(xì)胞器靶向的安全有效的光療納米制劑十分必要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
發(fā)明目的:有鑒于此,為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題,申請人期望提供了一種載藥率高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、細(xì)胞內(nèi)吞量大且可定位于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的新型光療納米制劑。更進(jìn)一步的目的是提供一種制備上述光療納米制劑的方法。
技術(shù)方案:本發(fā)明提供了一種基于多面體低聚倍半硅氧烷(POSS)的新型光療納米制劑,其主要由帶有兩個(gè)以上(含兩個(gè))羧基的光敏劑分子、POSS以及聚乙二醇(PEG)分子組成。光敏分子與POSS通過交聯(lián),形成納米顆粒,PEG分子連接于納米顆粒上,形成一個(gè)整體。所述PEG為改性PEG ,NHS-PEG-OMe。該制劑中各組分比例為:100摩爾份POSS,30至500摩爾份光敏劑,100至400摩爾份NHS-PEG-OMe。
其中,POSS的分子通式為(RSiO1.5)n,n一般為6、8、10、12等。其中以n=6和8最典型,R可以為氫基、烷基、環(huán)氧基、亞烴基、苯基、芳基、亞芳基等。POSS的結(jié)構(gòu)有無規(guī)結(jié)構(gòu)、梯形結(jié)構(gòu)、籠形結(jié)構(gòu)、橋型結(jié)構(gòu)等。
優(yōu)選的,所述光敏劑分子為原卟啉、二氫卟吩e6(Ce6)或5,10,15,20-四(4-羧基苯基)卟啉。
優(yōu)選的,POSS包括八氨丙基六面體倍半硅氧烷和八氨乙基六面體倍半硅氧烷,進(jìn)一步優(yōu)選的,所述POSS為八氨丙基六面體倍半硅氧烷。
優(yōu)選的,所述PEG的分子量為500-10000。進(jìn)一步優(yōu)選的,所述PEG的分子量為2000。
進(jìn)一步的,本發(fā)明還提供了一種基于POSS的新型光療納米制劑得制備方法,包括以下步驟:
(1)活化光敏劑的羧基:稱取光敏劑、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC),分別溶解于二甲基亞砜(DMSO);將EDC溶液和NHS溶液依次加入到光敏劑溶液中,室溫下反應(yīng)2-4小時(shí),得到活化后的光敏劑溶液;
(2)將POSS溶解于DMSO中,加入三乙胺,室溫下處理過夜;
(3)將活化后的光敏劑與經(jīng)三乙胺處理的POSS混合,室溫下反應(yīng)4-12小時(shí);
(4)向上述溶液中加入NHS-PEG-OMe,室溫下反應(yīng)6-9小時(shí);反應(yīng)結(jié)束后,在DMSO中透析純化,再用超純水透析純化,然后冷凍干燥,得到樣品。
優(yōu)選的,在所述步驟1中,光敏劑分子、EDC和NHS的摩爾比為1:(4-40):(6-60)。
進(jìn)一步優(yōu)選的,在所述步驟1中,光敏劑分子、EDC和NHS的摩爾比為1:(8-12):(10-18)。更為優(yōu)選的,光敏劑分子、EDC和NHS的摩爾比為1:10:15。
優(yōu)選的,在所述步驟2中,POSS與三乙胺的摩爾比為1:(8-96)。
進(jìn)一步優(yōu)選的,所述POSS與三乙胺的摩爾比為1:(18-30)。更為優(yōu)選的,POSS與三乙胺的摩爾比為1:24。
優(yōu)選的,在所述步驟3中,POSS與光敏劑分子的摩爾比為1:(0.5-7)。
進(jìn)一步優(yōu)選的,在所述步驟3中,POSS與光敏劑分子的摩爾比為1:(1-4)。更為優(yōu)選的,POSS與光敏劑分子1:3。
優(yōu)選的,在所述步驟4中,POSS與NHS-PEG-OMe分子的摩爾比為1:(2-6)。
進(jìn)一步優(yōu)選的,在所述步驟4中,POSS與NHS-PEG-OMe分子的摩爾比為1:(4-6)。更為優(yōu)選的,POSS與NHS-PEG-OMe分子的摩爾比為1:5。
更進(jìn)一步的,本發(fā)明還提供了一種光療納米制劑在作為或制備腫瘤成像或光動力治療藥物中的應(yīng)用。提供一種光療納米制劑在制備或作為腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。并進(jìn)一步提供了一種光療納米制劑在腫瘤成像及光動力治療中的應(yīng)用。所述的光療納米制劑包括光敏劑分子,該光敏劑分子可與POSS通過非特異性共價(jià)交聯(lián)形成納米顆粒,再進(jìn)行表面PEG修飾制得。該光療納米制劑的制備方法如上文所述,此處不再重新描述。
優(yōu)選的,所述光敏劑為原卟啉、Ce6或5,10,15,20-四(4-羧基苯基)卟啉。
進(jìn)一步優(yōu)選的,所述光敏劑為Ce6,所述PEG的分子量為1000-10000。
進(jìn)一步優(yōu)選的,所述PEG的分子量為2000。優(yōu)選的,POSS與光敏劑分子的摩爾比為1:(0.5-7)。
進(jìn)一步優(yōu)選的,POSS與光敏劑分子的摩爾比為1:3。
優(yōu)選的,POSS與NHS-PEG-OMe分子的摩爾比為1:(2-6)。
進(jìn)一步優(yōu)選的,POSS與NHS-PEG-OMe分子的摩爾比為1:5。
本發(fā)明所述新型光療納米制劑通過光敏劑上多個(gè)羧基與POSS上多個(gè)氨基進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)制備納米顆粒,其反應(yīng)條件溫和,載藥量極高,易于制備和純化,具有良好的水分散性和穩(wěn)定性。該共價(jià)交聯(lián)的構(gòu)建方式可有效避免光敏劑在體內(nèi)循環(huán)中提前釋放的問題。此外,POSS獨(dú)特的籠型六面體的剛性結(jié)構(gòu)有效地抑制了光敏劑的自淬滅效應(yīng),從而保證了其光動力治療效果。
技術(shù)效果:相對于現(xiàn)有技術(shù),本發(fā)明具有以下優(yōu)勢:
(1)合成簡便:該納米顆粒全程在室溫下反應(yīng),反應(yīng)條件溫和,制備方法簡單,可行性高。
(2)良好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性:通過共價(jià)交聯(lián)的方式裝載光敏劑,避免了藥物的提前釋放。
(3)載藥量高:將光敏劑作為納米顆粒構(gòu)建的一部分,極大地提高了光敏劑的裝載效率,達(dá)到了19.8 wt%,高于目前絕大多數(shù)的載藥體系。
(4)有效抑制了光敏劑的自淬滅效應(yīng):POSS的立體籠型結(jié)構(gòu)有效抑制了光敏劑的自淬滅效應(yīng),使其熒光產(chǎn)率及單線態(tài)氧產(chǎn)率不受影響,確保了其成像以及光療效果。
(5)細(xì)胞內(nèi)吞量大,多細(xì)胞器靶向:癌細(xì)胞對該光療納米制劑攝取量大,且光敏劑主要定位于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng),有效提高了光動力治療效果。
(6)診療一體化:可以通過尾靜脈注射入小鼠體內(nèi),并通過被動靶向富集到腫瘤區(qū)域,實(shí)現(xiàn)了良好的腫瘤成像和優(yōu)異的光動力治療效果。
(7)良好的安全性:在無光照的條件下,該光療納米制劑的細(xì)胞毒性很低,對正常組織幾乎無毒副作用。
附圖說明:
圖1是本發(fā)明的合成示意圖。
圖2a至圖2h分別是不同處理時(shí)間下多面體低聚倍半硅氧烷-二氫卟吩e6-聚乙二醇、二氫卟吩e6對人宮頸癌細(xì)胞的成像效果圖。
圖3a至圖3o是本發(fā)明在人宮頸癌細(xì)胞中的細(xì)胞器定位圖,分別為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、線粒體。
圖4是本發(fā)明對人宮頸癌細(xì)胞的光動力治療效果圖。
圖5是本發(fā)明對人宮頸癌細(xì)胞的暗毒性評價(jià)結(jié)果。
圖6a至圖6j分別為不同處理時(shí)間下二氫卟吩e6、多面體低聚倍半硅氧烷-二氫卟吩e6-聚乙二醇對荷瘤小鼠的體內(nèi)成像效果圖。
圖7是本發(fā)明對荷瘤小鼠的光動力抗癌效果圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)例,進(jìn)一步闡明本發(fā)明,應(yīng)理解這些實(shí)例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍,在閱讀了本發(fā)明之后,本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的各種等價(jià)形式的修改均落于本申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。
實(shí)施例1
POSS-Ce6-PEG的合成過程如下(示意圖見圖1):
(1) 首先以Ce6、EDC以及NHS為原料對Ce6分子的羧基進(jìn)行活化。稱取10 mg Ce6、 26.0 mg EDC和28.9 mg NHS并分別溶于1 mL DMSO,Ce6先與EDC混合隨后再加入NHS于室溫下(本文中指20-25℃)反應(yīng)4小時(shí)使羧基活化完全。
(2) 按照八氨丙基六面體倍半硅氧烷與Ce6的摩爾比為1:3稱取6.55 mg八氨丙基六面體倍半硅氧烷(POSS),按照POSS與三乙胺的摩爾比為1:24取18.57 μL三乙胺共溶于DMSO中,并與上述反應(yīng)體系混合,室溫下反應(yīng)過夜。
(3) 按照POSS和NHS-PEG-OMe(其中PEG的分子量為2000)的摩爾比為1:5稱取NHS-PEG-OMe 58.6 mg溶于DMSO,并與上述反應(yīng)體系混合,室溫下反應(yīng)8小時(shí)后用截留分子量為10k的透析袋在DMSO中透析2天,隨后在超純水中透析1天進(jìn)行純化。最后在凍干機(jī)中冷凍干燥得到POSS-Ce6-PEG的干粉,于-20℃中冷凍保存。
實(shí)施例2-4
實(shí)施例2光療納米制劑的制備步驟與實(shí)施例1相同,只是步驟(2)中POSS與Ce6的摩爾比為1:0.5。
實(shí)施例3光療納米制劑的制備步驟與實(shí)施例1相同,只是步驟(2)中POSS與Ce6的摩爾比為1:4。
實(shí)施例4光療納米制劑的制備步驟與實(shí)施例1相同,只是步驟(2)中POSS與Ce6的摩爾比為1:7。
實(shí)施例5-7
實(shí)施例5光療納米制劑的制備步驟與實(shí)施例1相同,只是步驟(2)中POSS與Ce6的反應(yīng)時(shí)間為4小時(shí)。
實(shí)施例6光療納米制劑的制備步驟與實(shí)施例1相同,只是步驟(2)中POSS與Ce6的反應(yīng)時(shí)間為8小時(shí)。
實(shí)施例7光療納米制劑的制備步驟與實(shí)施例1相同,只是步驟(2)中POSS與Ce6的反應(yīng)時(shí)間為12小時(shí)。
實(shí)施例8-10
實(shí)施例8光療納米制劑的制備步驟與實(shí)施例1相同,只是步驟(3)NHS-PEG-OMe分子中PEG的分子量(本文中指粘均分子量)為500。
實(shí)施例9光療納米制劑的制備步驟與實(shí)施例1相同,只是步驟(3)NHS-PEG-OMe分子中PEG的分子量為5000。
實(shí)施例10光療納米制劑的制備步驟與實(shí)施例1相同,只是步驟(3)NHS-PEG-OMe分子中PEG的分子量為10000。
實(shí)施例11-13
實(shí)施例11光療納米制劑的制備步驟與實(shí)施例1相同,只是步驟(3)中POSS與NHS-PEG-OMe的摩爾比為1:2。
實(shí)施例12光療納米制劑的制備步驟與實(shí)施例1相同,只是步驟(3)中POSS與NHS-PEG-OMe的摩爾比為1:4。
實(shí)施例13光療納米制劑的制備步驟與實(shí)施例1相同,只是步驟(3)中POSS與NHS-PEG-OMe的摩爾比為1:6。
實(shí)施例14
光療納米制劑的制備步驟與實(shí)施例1相同,只是步驟(2)和(3)中POSS為八氨乙基六面體低聚倍半硅氧烷。
實(shí)施例15
評價(jià)人宮頸癌細(xì)胞對實(shí)施例1所制得的光療納米制劑的內(nèi)吞效率,方法如下:
(1)細(xì)胞培養(yǎng)及種板:復(fù)蘇人宮頸癌細(xì)胞,在DMEM完全培養(yǎng)基中于37oC、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞密度長至80%左右時(shí),用胰酶將細(xì)胞消化下來并按5 × 104 個(gè)/mL的細(xì)胞密度進(jìn)行種板,繼續(xù)在37oC、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 小時(shí);
(2)藥物與細(xì)胞作用:將人宮頸癌細(xì)胞于8孔板中培養(yǎng),24小時(shí)后,將光療納米制劑和游離的Ce6分別溶于DMEM完全培養(yǎng)基后加入8孔板(200 μL/孔),繼續(xù)在37oC、5% CO2環(huán)境中共孵育;
(3)共聚焦熒光顯微鏡成像觀測:在藥物與細(xì)胞孵育的不同時(shí)間點(diǎn),用波長為552 nm激光作為激發(fā)光,光療納米制劑發(fā)出紅色熒光,進(jìn)行觀察。
熒光成像結(jié)果見圖2a至圖2h。由圖可見,POSS-Ce6-PEG在細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)高于游離Ce6,并且隨時(shí)間增加熒光逐漸增強(qiáng)。證明該光療納米制劑能夠被癌細(xì)胞大量內(nèi)吞。
實(shí)施例16
觀察實(shí)施例1所制得的POSS-Ce6-PEG在人宮頸癌細(xì)胞中的細(xì)胞器定位情況,其方法如下:
將人宮頸癌細(xì)胞于8孔板中培養(yǎng),24小時(shí)后,將光療納米制劑按Ce6濃度3 μg/mL分散于DMEM完全培養(yǎng)基后加入8孔板(200 μL/孔),于37oC、5% CO2環(huán)境中共孵育2小時(shí)后用PBS清洗兩次,再分別加入細(xì)胞器(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和溶酶體)染色試劑,孵育半小時(shí)后,用PBS清洗兩次,加入細(xì)胞核染色試劑,10分鐘后用PBS清洗兩次,加入DMEM完全培養(yǎng)基。
共聚焦熒光顯微鏡成像觀測:在藥物與細(xì)胞孵育的不同時(shí)間點(diǎn),用波長為405、488和552 nm的激光作為激發(fā)光進(jìn)行觀察。細(xì)胞核染色試劑在405 nm的激發(fā)光下發(fā)出藍(lán)色熒光,細(xì)胞器(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和溶酶體)染色試劑在488 nm的激發(fā)光下發(fā)出綠色熒光,光療納米制劑在552 nm的激發(fā)光下發(fā)出紅色熒光。結(jié)果見圖3a至3o。由圖可見,光療納米制劑被細(xì)胞內(nèi)吞后,主要定位于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。考慮到線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均對單線態(tài)氧具有較高的敏感性,因此該光療納米制劑將具有非常好的光動力治療效果(具體結(jié)果見實(shí)施例17)。
實(shí)施例17
評價(jià)實(shí)施例1所制得的POSS-Ce6-PEG與游離Ce6對人宮頸癌細(xì)胞的光療效果,其方法如下:
(1)細(xì)胞光療:在DMEM完全培養(yǎng)基中配制游離Ce6溶液與POSS-Ce6-PEG溶液,使兩者最終含有的Ce6濃度為2 μg/mL。分別加入100 μL上述溶液于相應(yīng)的孔中,在37oC、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)5 h。隨后,用670 nm激光在8 mW/cm2的功率密度下分別照射0-10分鐘,再轉(zhuǎn)移至37oC、5% CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí);
(2)細(xì)胞存活率檢測:配制濃度為5 mg/mL的MTT溶液,并于每個(gè)細(xì)胞孔中加入10 μL噻唑藍(lán)(MTT)溶液,于37oC、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)4 h。倒出每個(gè)孔中的培養(yǎng)液,各加入150 μL DMSO,最后用酶標(biāo)儀測量在492 nm處的吸光度。結(jié)果見圖4。
如圖所示,實(shí)施例1所制得的光療納米制劑較游離Ce6具有更好的光動力學(xué)抗癌效果。
實(shí)施例18
評價(jià)實(shí)施例1所制得的光療納米制劑的細(xì)胞暗毒性,步驟如下:將人宮頸癌細(xì)胞按5 × 104 個(gè)/mL的密度接種于96孔板中,培養(yǎng)24小時(shí)后,再與不同濃度的光療納米制劑避光孵育24小時(shí),最后利用MTT檢測法評價(jià)光療納米制劑對人宮頸癌細(xì)胞的毒性,結(jié)果見圖5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明無光照條件下,該光療納米制劑在較高的濃度下也幾乎沒有細(xì)胞毒性。
實(shí)施例19
測試實(shí)施例1所制得的光療納米制劑在小鼠體內(nèi)成像效果,步驟如下:取健康狀況良好的4周齡BALA/c無胸腺的雌性裸鼠若干只,并皮下注射鼠源宮頸癌細(xì)胞(U14)。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100 mm3左右時(shí),將Ce6和實(shí)施例1所得光療納米制劑通過尾靜脈注射的方式注射到裸鼠體內(nèi)。然后將裸鼠經(jīng)異氟烷氣體麻醉后放入成像暗箱平臺,在小動物活體成像系統(tǒng)中用600 nm激發(fā)光激發(fā)并接收670 nm波段的發(fā)射光,曝光時(shí)間為750 ms。分別在不同時(shí)間點(diǎn)(0、2、6、12 和24小時(shí))采集成像數(shù)據(jù),并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖6a至圖6j。
由圖可見,Ce6在注射進(jìn)入裸鼠體內(nèi)后幾乎觀察不到熒光,而本發(fā)明所得光療納米制劑則能夠富集到腫瘤區(qū)域,呈現(xiàn)出非常明顯的體內(nèi)熒光,并且可以在腫瘤區(qū)域滯留至少10小時(shí)。
實(shí)施例20
評價(jià)實(shí)施例1所制得的光療納米制劑的小鼠體內(nèi)光動力抗癌效果,步驟如下:當(dāng)腫瘤體積達(dá)到50 mm3左右時(shí),將Ce6和實(shí)施例1所得光療納米制劑通過尾靜脈注射的方式注射到裸鼠體內(nèi),注射完成6小時(shí)后,用670 nm 的紅色激光照射腫瘤區(qū)域,激光功率為20 mW/cm2,照射時(shí)間為20分鐘。隨后每隔一天測量腫瘤體積及裸鼠體重,腫瘤體積 = 0.5 ×腫瘤長度× 腫瘤寬度2,結(jié)果見圖附圖7。由圖可見,與生理鹽水和Ce6相比,本發(fā)明所得光療納米制劑可以顯著抑制小鼠體內(nèi)的腫瘤生長,具有很好的腫瘤光動力學(xué)療效。
以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,但是,本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié),在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi),可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種等同變換,這些等同變換均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。另外需要說明的是,在上述具體實(shí)施方式中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征,在不矛盾的情況下,可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合。為了避免不必要的重復(fù),本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。