本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體而言本發(fā)明涉及分子醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是微小RNA分子的醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
：microRNA(miRNA，又稱微小RNA)是一類內(nèi)生的、高度保守的、非編碼的小單鏈RNA，長度約18-25個核苷酸(nt)(Lietal.，2010)。它廣泛存在于生物界，從低等生物到人，甚至在古細(xì)菌和真菌中也能發(fā)現(xiàn)其蹤跡。microRNA通過與蛋白編碼基因的mRNAs反向互補，以調(diào)控其蛋白的表達(dá)(Ambrosetal.，2001)。已有研究報道m(xù)icroRNA參與調(diào)控多種生物學(xué)過程，例如細(xì)胞的發(fā)育調(diào)控，細(xì)胞增殖、分化、凋亡，腫瘤的發(fā)生和遷移，以及耐藥性的調(diào)節(jié)等過程(Zhaoetal.，2007)。研究表明microRNA能影響化療藥物的敏感性，而且越來越多的研究證實microRNA的異常表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的耐藥性。Climent等發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者由于11q染色體上mir-125b的缺失導(dǎo)致蒽環(huán)霉素類化療藥的耐藥性增加。同時乳腺癌患者對紫杉醇、5-氟尿嘧啶、拓?fù)涮婵档然熕幰伯a(chǎn)生耐藥性。已有專利公開申請基于microRNA的方法用于乳腺癌的診斷、預(yù)后和治療(US2006/029889，克勞斯等.，；US2010/0297627，Watsonetal.，)。因此microRNA對腫瘤化療藥物的敏感性起著十分重要的作用。乳腺癌的發(fā)病率位居首位，對女性生命造成嚴(yán)重的威脅。化學(xué)治療是目前治療乳腺癌的主要方法，但隨著治療的深入，乳腺癌患者往往會對藥物產(chǎn)生一定的耐藥性，使得治療難度加大。本所申請的基于代謝組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)microRNA 在調(diào)控乳腺癌細(xì)胞代謝水平方面的應(yīng)用，是本領(lǐng)域亟待發(fā)現(xiàn)microRNA的治療用途。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明發(fā)現(xiàn)一種microRNA可影響抗腫瘤藥物敏感性，所述治療藥物為它莫昔芬(tamoxifen)。所述microRNA為mir-103a-3p。所述mir-103a-3p的核苷酸序列為序列表中的SEQIDNO：1。因此，本發(fā)明的第一方面涉及用于制備一種具有影響腫瘤功能的藥物組合物，所述藥物組合物包括：a)有效量的mir-103a-3p和藥學(xué)上可接受的載體；b)腫瘤治療藥物。在本實施方案中，所述腫瘤是乳腺癌。本實施方案中，所述腫瘤治療藥物為化療劑，所述化療劑優(yōu)選為它莫昔芬(tamoxifen)。本發(fā)明的第二方面涉及microRNA在制備藥物中的應(yīng)用，尤其涉及mir-103a-3p在制備影響腫瘤細(xì)胞藥物敏感性的藥物組合物的應(yīng)用。在本實施方案中，所述腫瘤是乳腺癌。本實施方案中，所述腫瘤治療藥物為化療劑，所述化療劑優(yōu)選為它莫昔芬(tamoxifen)。附圖說明圖1為不同濃度MCF7細(xì)胞在384孔板中的生長曲線。圖2為不同濃度miRNA對細(xì)胞生長的影響。圖3為mir-103a-3p可增強它莫昔芬對腫瘤細(xì)胞生長的抑制效果。具體實施方式如本文所用，術(shù)語“影響抗腫瘤藥物敏感性”指本發(fā)明引起腫瘤細(xì)胞生長降低至一定水平所需的抗腫瘤藥物的顯著變化。如本文所用，術(shù)語“mir-103a-3p”、“miRNA-103a-3p”或“microRNA-103a-3p”可互換使用。本發(fā)明的術(shù)語中包含但不限于SEQIDNO：1所示序列或其同源序列。本發(fā)明的術(shù)語中還包含已知各種來源的mir-103a-3p的同源序列，例如人、大鼠、小鼠、馬等。如本文所用，術(shù)語“mir-103a-3p”指核酸編碼mir-103a-3p和同源物和其變體，包括對mir-103a-3p的功能或結(jié)構(gòu)不產(chǎn)生不利影響的取代、添加和缺失。本發(fā)明的術(shù)語中包含天然存在的mir-103a-3p序列中取代、添加或缺失一個或幾個核酸，或經(jīng)生物化學(xué)修飾，且仍具有生物活性的衍生RNA。本發(fā)明涉及治療型miRNA的設(shè)計、合成、構(gòu)建、組成、特性和應(yīng)用以及如此miRNA治療腫瘤的有效方式。更具體地，本發(fā)明公開了，人工合成的mir-103a-3p顯著影響腫瘤細(xì)胞藥物敏感性的代謝水平。mir-103a-3p以初始轉(zhuǎn)錄物(pri-miRNA)、miRNA前體、成熟miRNA、片段或其變體(保留成熟miRNA的生物活性)和DNA編碼的初始轉(zhuǎn)錄物(pri-miRNA)、miRNA前體、成熟miRNA、片段或其變體的形式存在，或以miRNA調(diào)控元件的形式存在。本發(fā)明所述mir-103a-3p的序列變體包括取代、插入或缺失變體的一種或多種。如本文所用，術(shù)語“核酸或核酸序列的同源性”是指它們天然或人工來源于一個共同祖先的核酸或核酸序列。一般由兩個或多個核酸或蛋白(或其序列)之間的序列相似性來推斷同源性。如本文所用，序列之間相似性的百分比為50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％時，可建立同源性。確定序列相似性的算 法可通過美國國家生物技術(shù)信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)公開獲得。如本文所用，所述“有效量”是指足以產(chǎn)生生物活性的藥物組合物的量。所選用的劑量水平取決于多種因素，包括藥物組合物的活性、給藥途徑、與其他藥物或治療方法的組合、所治療患者的嚴(yán)重程度等。優(yōu)選地最合適的劑量由本領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員來評定。本發(fā)明的藥物組合物在無菌的和無熱源的條件下制備。所述藥物組合物的制備方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)，可參考Remington’sPharmaceuticalScience，第17版，MackPublishingCompany，Easton，Pa.(1985)中其公開內(nèi)容所描述的。合適的藥學(xué)上可接受的載體包括水、緩沖水溶液、生理鹽水、0.4％的鹽水、有機溶劑等。本發(fā)明的藥物組合物包括常規(guī)的藥物賦形劑和/或添加劑。合適的藥物賦形劑包括穩(wěn)定劑、抗氧化劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、緩沖劑和pH調(diào)節(jié)劑。合適的添加劑包括例如生理生物相容性緩沖劑(鹽酸氨丁三醇)、螯合劑(DTPA或DTPA-雙酰胺)或鈣螯合物(DTPA鈣、CaNaDTPA-雙酰胺)，鈣或鈉鹽(氯化鈣、抗壞血酸鈣、葡萄糖酸鈣或乳酸鈣)的加入。本發(fā)明的藥物組合物可以液態(tài)形式包裝或凍干。本發(fā)明的固體藥物組合物，可用常規(guī)的藥學(xué)上可接受的無毒載體例如藥物級的甘露醇、乳糖、淀粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。用于將核酸導(dǎo)入細(xì)胞的方法在此領(lǐng)域內(nèi)有很多，其包括但不限于脂質(zhì)體包裹RNA法、電穿孔法、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、病毒和非病毒載體等。本發(fā)明所用的材料和試劑均來自市購。實施例：材料和方法1.細(xì)胞的培養(yǎng)將乳腺癌細(xì)胞系MCF7(航天醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用國家重點實驗室張華博士贈送)在加入10％胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)基(Hyclone)中，放置于37℃、5％CO2濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.mir-103a-3p激動劑轉(zhuǎn)染mir-103a-3p激動劑是直接將mir-103a-3p的成熟序列(SEQIDNO：1)經(jīng)過特殊化學(xué)修飾(如全鏈上的甲基化修飾、5’端和3’端的硫代修飾和3’端的膽固醇修飾)而合成的，它通過模擬內(nèi)源性mir-103a-3p的作用來調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。將MCF7細(xì)胞鋪板于6孔板中，過夜培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到50％時，用無血清培養(yǎng)基(Opti-MEM)稀釋mir-103a-3p激動劑(廣州銳博生物科技有限公司)儲存液。輕輕混勻，向孔中加入上述混合液。待轉(zhuǎn)染4-6小時后，將含有miRNA的培養(yǎng)基去掉，加入新的細(xì)胞培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染一段時間后，用發(fā)光法細(xì)胞活力測試(CTGassay)檢測細(xì)胞存活量。本實施例中，采用的策略為在細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA24小時后，將細(xì)胞重新接種到384孔板中，然后加入抗腫瘤藥物，一段時間以后進(jìn)行細(xì)胞活性測試。從圖1中可以看到每孔500個細(xì)胞這種濃度能保證細(xì)胞在120個小時的時間內(nèi)依然有持續(xù)的生長空間，因此我們選用該細(xì)胞濃度進(jìn)行后續(xù)實驗。從圖2中可以看到，不同濃度的miRNA對細(xì)胞生長的影響幾乎一致，我們選用100nM的miRNA濃度進(jìn)行后續(xù)實驗。在本實驗中，細(xì)胞中均加入400nM，從圖3中可以看出，mir-103a-3p可大大增強它莫昔芬對腫瘤細(xì)胞的抑制效果。表1mir-103a-3p可降低它莫昔芬對腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度無處理Lipo3000mir-103a-3pIC50(nM)283137341101表1顯示，加入mir-103a-3p后，可以使他莫昔芬對腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度大大下降，降低至不加microRNA時的不到40％。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補充，這些改進(jìn)和補充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3