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一種疫苗用佐劑及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號:12731009閱讀:3182來源:國知局

本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及用于增強抗原免疫應(yīng)答的佐劑。



背景技術(shù):

細菌、病毒及寄生蟲感染廣泛分布于人和動物,由這些感染劑引起的疾病通常對抗生素等化學(xué)物質(zhì)具有抗性,因此沒有有效的治療方法。因此,本領(lǐng)域愈來愈多使用疫苗學(xué)方法以控制傳染,具體是通過用活的病原體、經(jīng)滅活的病原體或其產(chǎn)物、或經(jīng)基因工程手段將病原體蛋白質(zhì)亞基制備成疫苗進行疫苗接種來誘導(dǎo)特異性免疫。然而,當(dāng)單獨給予某些抗原時難以對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生足夠的刺激作用。因此,必須加入能夠使機體免疫應(yīng)答增加的免疫佐劑來獲得足夠量的保護性抗體。

免疫佐劑是疫苗必不可少的組成部分,不僅能影響機體對疫苗免疫應(yīng)答的強度,而且能針對特定病原體誘導(dǎo)最有效的免疫應(yīng)答類型(Mbow ML,De Gregorio E,Valiante NM,et al.New adjuvants for human vaccines.Current opinion in immunology,2010,22(3):411-416)。目前,研究的免疫佐劑類型很多,如油佐劑、弗氏佐劑、微生物及其代謝產(chǎn)物、核酸及其類似物、細胞因子、脂質(zhì)體等(Dey AK,Srivastava IK.Novel adjuvants and delivery systems for enhancing immune responses induced by immunogens.Expert review of vaccines,2011,10:227-251),但由于存在不同程度的毒副作用或安全隱患等一些不可避免的缺陷而難以實際應(yīng)用(Mbow ML,De Gregorio E,Valiante NM,Rappuoli R.New adjuvants for human vaccines.Current opinion in immunology,2010,22(3):411-416;Batista-Duharte A,Lindblad EB, Oviedo-Orta E.Progress in understanding adjuvant immunotoxicity mechanisms.Toxicology letters,2011,203(2):97-105),導(dǎo)致這些佐劑遠遠不能滿足新型疫苗發(fā)展的需求。因此,尋找安全、有效、新型的免疫佐劑是當(dāng)前疫苗研究領(lǐng)域的一個熱點(Schijins VEJC,Lavelle EC.Teends in vaccine adjuvants.Expert review of vaccines,2011,10(4):539-550)。并且,免疫佐劑研究現(xiàn)已被列為疫苗研究的優(yōu)先領(lǐng)域(Harandi AM,Medaglini D,Shattock RJ.Vaccine adjuvants:A priority for vaccine research.Vaccine,2010,28(12):2363-2366;Harand AM,Brewe J,Schijn V.Conference scene:recent advancements in immunopotentiators for modern vaccines.Immunotherapy,2011,3(11):1297-1301)。

目前商品化的菌苗(如豬肺炎支原體菌苗、副豬嗜血桿菌菌苗)是通過在含血清的培養(yǎng)基上生長所得的生物體制備而成,引起了對于免疫物質(zhì)中存在的血清組分(如免疫復(fù)合物或非免疫原性特異性蛋白)誘導(dǎo)副反應(yīng)發(fā)生(見中國專利CN104334186A)。

另外,在獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域臨床試驗的研究中,發(fā)現(xiàn)蛋白的重復(fù)性和穩(wěn)定性十分重要,良好的穩(wěn)定性是數(shù)據(jù)可靠的一個重要標(biāo)志。但是,在臨床試驗中,一些蛋白的穩(wěn)定性較差,在一般條件下極易降解或變性,直接影響試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此,如何保持蛋白的穩(wěn)定性是臨床試驗中的關(guān)鍵技術(shù)。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

本發(fā)明解決的主要技術(shù)問題是提供一種有效的疫苗用佐劑,能夠有效增強抗原的免疫效力。所述疫苗用佐劑與抗原共同使用,能夠簡化免疫程序,僅需一次免疫即能達到商業(yè)疫苗兩次免疫的效果。

本發(fā)明涉及一種疫苗用佐劑,所述佐劑包括丙烯酸系聚合物和纖維素醚。

本發(fā)明還涉及一種疫苗用佐劑,所述佐劑包括丙烯酸系聚合物和纖維素醚以及免疫增強劑;所述免疫增強劑為含皂苷的組合物,優(yōu)選 為免疫刺激復(fù)合物。

本發(fā)明還涉及一種疫苗組合物,其中,所述疫苗組合物包括免疫量的抗原和本發(fā)明的丙烯酸系聚合物和纖維素醚佐劑。

本發(fā)明還涉及一種疫苗組合物,其中,所述疫苗組合物包括免疫量的抗原和本發(fā)明的丙烯酸系聚合物、纖維素醚和免疫增強劑佐劑。

本發(fā)明解決的另一技術(shù)問題是提供一種抗原蛋白穩(wěn)定劑,所述抗原蛋白穩(wěn)定劑能夠在制備過程中和適當(dāng)條件下長期保持蛋白原有分子量、結(jié)構(gòu)和/或生物活性。

本發(fā)明涉及一種抗原蛋白穩(wěn)定劑,所述穩(wěn)定劑包括丙烯酸系聚合物和纖維素醚。

本發(fā)明還涉及一種抗原蛋白穩(wěn)定劑,所述穩(wěn)定劑包括丙烯酸系聚合物、纖維素醚和含皂苷的組合物。

本發(fā)明的佐劑在抗原含量較低、單次免疫時也能使動物獲得較好的免疫應(yīng)答水平,減少了豬的應(yīng)激反應(yīng),降低了副反應(yīng)的發(fā)生;所述佐劑還可以用于稀釋活疫苗,并使活疫苗以肌肉注射形式免疫豬只,使操作簡便。此外,所述佐劑還可用作蛋白穩(wěn)定液保存蛋白,使蛋白穩(wěn)定不降解或不發(fā)生不可逆變化。

具體實施方式

以下,對本發(fā)明的實施方式進行說明。

術(shù)語“佐劑”是指當(dāng)與抗原連同投與時,使受試者對這一抗原的免疫反應(yīng)增強的化合物。

術(shù)語“丙烯酸系聚合物”是指含有丙烯酸系部分的任何聚合物或共聚物,包括但不限于聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚丙烯腈和聚丙烯酸的烷基酯。丙烯酸系聚合物的實例包括如聚(丙烯酰胺-共-甲基丙烯酸丁酯)、丙烯酸-甲基丙烯酸、丙烯酸-丙烯酰胺和聚(甲基丙烯酸酯)。市售丙烯酸系聚合物的實例包括卡波普Carbopol(古德里奇公司B.F.Goodrich Co.,美國俄亥俄州克利夫蘭Cleveland Ohio)、卡伯賽Carboset(古德里奇公司B.F.Goodrich Co., 美國俄亥俄州克利夫蘭Cleveland Ohio)、尼奧克Neocryl(安萬克公司Avecia Inc.,美國特拉華州威爾明頓Wilmington Del.)和尤特奇Eudragit(羅姆科技公司Rohm Tech,Inc.,美國馬莎諸塞州馬二登Malden Mass.)。特別適用于本發(fā)明佐劑中的丙烯酸系聚合物為卡波姆(Carbomer,商品名Carbopol),在所述技術(shù)領(lǐng)域中通常還指并且已知是與聚烯丙基蔗糖交聯(lián)的丙烯酸的水溶性聚合物,這些化合物見Phameuropa(1996,8(2)),本領(lǐng)域技術(shù)人員還可參見美國專利US2909462,其描述了這類丙烯酸系聚合物,其與聚羥基化的化合物交聯(lián),所述化合物具有至少3個羥基,優(yōu)選不超過8個,其中至少3個羥基的氫原子被具有至少2個碳原子的不飽和脂烴基(aliphatic radical)取代,優(yōu)選為含有2-4個碳原子的基團,例如乙烯基、烯丙基和其它烯屬不飽和基團(ethylenically unsaturated group)。所述不飽和基團自身可包含其它取代基,如甲基。這些產(chǎn)品以卡波普的名義出售,以BF Goodrich(Ohio,USA)特別合適,它們與烯丙基蔗糖或與烯丙基季戊四醇(allyl pentaerythritol)交聯(lián),這其中可提及卡波普941、980、981、940、2020、974P、934P和971P,最優(yōu)選使用卡波普971P。

術(shù)語“纖維素醚”是指纖維素的醚類衍生物如羧甲基纖維素CMC、羥乙基纖維素HEC、羥丙基甲基纖維素HMPC,還包括它的鹽類即羧甲基纖維素鹽。所述羧甲基纖維素鹽包括但不限于羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素鉀、羧甲基纖維素鈣,優(yōu)選為羧甲基纖維素鈉。

術(shù)語“羧甲基纖維素鈉”(Sodium carboxymethylcellulose)是基于纖維素的生物聚合物,并通過在含有單氯乙酸鈉的氫氧化鈉溶液中對纖維素進行酯化來生產(chǎn)(Feddersen等,羧甲基纖維素鈉Sodium carboxymethylcellulose,在Whistler RL,BeMiller JN主編的《工業(yè)膠多糖及其衍生物》Industrial gums polysaccharides and their derivatives,Marcel Dekker Inc.,New York,第三版(1993):537-578),給出了取代度DS作為酯化程度的度量,所述取代度是指葡萄糖單元中被酯化羥基的平均數(shù)量。存在三個反應(yīng)性羥基允許引入三個羧甲基鈉基團。羧甲基纖維素鈉的特性取決于其取代度及其聚合度(Belitz等,Lehrbuch der Lebensmittelchemie.Springer-verlag,Berlin,第四版,1992),所述聚合度是指在聚合過程中相連形成大分子的單體分子的平均數(shù)量。根據(jù)本發(fā)明,優(yōu)選的羧甲基纖維素鈉具有125000g/mol的平均分子質(zhì)量。所述“羧甲基纖維素鈉”還包含在其定義的嚴(yán)格意義上不是羧甲基纖維素鈉,但是由于如纖維素或其他多種糖通過羥基化、羧基化、酯化和/或醚化進行的例如衍生化而具有與羧甲基纖維素鈉相同或相似特性,因此能夠等同地使用的多糖。

本發(fā)明的第一方面在于提供一種疫苗用佐劑,所述佐劑包括丙烯酸系聚合物和纖維素醚。

作為本發(fā)明的一種實施方式,本發(fā)明的疫苗用佐劑中,所述丙烯酸系聚合物包括聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚丙烯腈和聚丙烯酸的烷基酯。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式,本發(fā)明的疫苗用佐劑中,所述丙烯酸系聚合物包括卡波普、卡伯賽、尼奧克Neocryl、尤特奇Eudragit。

作為本發(fā)明的一種更優(yōu)選實施方式,本發(fā)明的疫苗用佐劑中,所述丙烯酸系聚合物包括卡波普941、980、981、940、2020、974P、934P和971P。

作為本發(fā)明的一種實施方式,纖維素醚包括羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素鉀、羧甲基纖維素鈣、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素。

作為本發(fā)明的一種實施方式,本發(fā)明的疫苗用佐劑中,所述丙烯酸系聚合物以卡波姆計為2-10mg/ml,所述纖維素醚為0.1-8mg/ml。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式,本發(fā)明的疫苗用佐劑中,所述丙烯酸系聚合物以卡波姆計為4-10mg/ml,所述纖維素醚為4-8mg/ml。

術(shù)語“免疫增強劑”(immunopotentiator)是指本身不具有免疫原性,但可以用于刺激免疫系統(tǒng)以改善對其它具有免疫原性的物質(zhì)的應(yīng)答。如同目的抗原一起使用或分別施用于同一對象時,可直接或間接地調(diào)節(jié)所述抗原誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)或改變該抗原的免疫反應(yīng)類型(包括 例如體液免疫、細胞免疫)。所述免疫增強劑包括但不限于含皂苷的組合物、活性乳酸菌、蜂膠、維生素E、左旋咪唑、轉(zhuǎn)移因子、白細胞介素、干擾素、胸腺肽、轉(zhuǎn)移因子、球蛋白、卡介苗或其組合。

術(shù)語“含皂苷的組合物”可包含純化或部分純化制劑如QS21(商品名為StimulonTM),以及脂質(zhì)制劑如免疫刺激復(fù)合物ISCOM。所述皂苷(saponin)又稱皂角苷、皂素、堿皂體或皂草苷,是固醇苷和三萜苷的異源基團,可見于多種植物的皮、葉子、莖、根、甚至花中包括但不限于Quilaja皂苷、Ginseng皂苷、Panax notoginseng皂苷、Platycodon grandiflorum皂苷、Astragalus皂苷、Achyranthes皂苷、Polygala皂苷,以及Sun等文獻中所提及的皂苷(Sun HX,Xie Y,Ye YP.Advances in saponin-based adjuvants.Vaccine,2009,27(12):1787-1796),優(yōu)選為Quilaja皂苷。所述純化或部分純化制劑可用HPLC和RP-HPLC純化,利用這些技術(shù)已鑒定出特異性的純化組分,其中包括QuilA、QS21、QS7、QS17、QS18、QH-A、QH-B、QH-C、VaxSap、SuperSap、GPI-0100、QP UF1000的至少一種。

術(shù)語“免疫刺激復(fù)合物”(immunostimulating complex,ISCOM)是指不含有抗原的免疫刺激復(fù)合物即免疫刺激復(fù)合物基質(zhì)(ISCOM-matrix)與疫苗混合后也同樣能夠起到免疫佐劑的效果,是在糖苷如三萜式皂苷(具體為Quil A)和膽固醇,例如歐洲公開號EPA109942和180564。典型的ISCOM是含皂苷、膽固醇的獨特粒子,進一步還包括磷脂如腦磷脂或卵磷脂,任何已知的皂苷都可用于ISCOM中。優(yōu)選ISCOM包含QuilA(南美Quillaja saponin三萜烯皂甙)、膽固醇、卵磷脂,混勻共價結(jié)合而成,電鏡下呈籠式或高爾夫球氏的免疫復(fù)合物。關(guān)于皂苷和ISCOM以及形成ISCOM的方法詳見Barr等文獻(Barr IG,Sjolander A,Cox JC.ISCOMs and other saponin based adjuvants.Advanced drug delivery reviews,1998,32(3):247-271)。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備用于本發(fā)明的ISCOM,這些技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的,描述于例如美國專利號4981684、5178860、5679354、6027732,歐洲公開號EPA109942、180564、231039,以及Coulter等(Coulter A,Wong TY,Drane D,et al.Studies on experimental adjuvanted influenza vaccines:comparison of immune stimulating complexes(IsxomsTM)and oil-in-water vaccines.Vaccine,1998,16(11-12):1243-1253)。

作為本發(fā)明的一種實施方式,本發(fā)明的疫苗用佐劑中,所述佐劑還包括免疫增強劑,所述免疫增強劑包括含皂苷的組合物、活性乳酸菌、蜂膠、維生素E、左旋咪唑、轉(zhuǎn)移因子、白細胞介素、干擾素、胸腺肽、轉(zhuǎn)移因子、球蛋白、卡介苗或其組合。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式,本發(fā)明的疫苗用佐劑中,所述免疫增強劑包括含皂苷的組合物,所述含皂苷的組合物優(yōu)選為免疫刺激復(fù)合物。所述含皂苷的組合物包括QuilA、QS21、QS7、QS17、QS18、QH-A、QH-B、QH-C、VaxSap、SuperSap、GPI-0100和QP UF1000、免疫刺激復(fù)合物的至少一種。

作為本發(fā)明的一種實施方式,本發(fā)明的疫苗用佐劑中,所述丙烯酸系聚合物以卡波姆計為2-10mg/ml,所述纖維素醚為0.1-8mg/ml,和所述含皂苷的組合物以QuilA計為0.1-10mg/ml。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式,本發(fā)明的疫苗用佐劑中,所述丙烯酸系聚合物以卡波姆計為4-10mg/ml,所述纖維素醚為4-8mg/ml,和所述含皂苷的組合物以QuilA計為4-10mg/ml。

術(shù)語“免疫有效量”又稱免疫保護量或產(chǎn)生免疫應(yīng)答的有效量,為可在接受者體內(nèi)有效誘導(dǎo)免疫原性應(yīng)答的量。所述免疫應(yīng)答可能足以用于診斷目的或其它試驗,或可能適合用于預(yù)防疾病的征兆或癥狀,包括由病原體引起的感染所造成的不利的健康結(jié)果或其并發(fā)癥。體液免疫力或由細胞介導(dǎo)的免疫力或此二者均可被誘導(dǎo)。動物對免疫原性組合物的免疫應(yīng)答可通過例如測量抗體效價、淋巴細胞增殖分析而間接評估,或在以野生型毒株攻擊后通過監(jiān)測征兆或癥狀來直接評估,而該由疫苗提供的保護性免疫力可通過測量例如受試者的臨床征兆如死亡率、發(fā)病率的減少、溫度數(shù)值、受試者總體生理狀況及總體健康和表現(xiàn)來評估。所述免疫應(yīng)答可包括但不限于誘導(dǎo)細胞性和/或體液免疫力。

術(shù)語“抗原”又稱免疫原,是指任何刺激免疫應(yīng)答的物質(zhì),是一種能夠被抗體結(jié)合的分子,還能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生B-和/或T-細胞的體液免疫應(yīng)答和/或細胞免疫應(yīng)答,還具有一個或多個表位(B-和T-表位)。所述抗原包括殺死的、滅活的、減毒的或經(jīng)修飾的活的細菌、病毒或寄生蟲,或其培養(yǎng)細胞制劑、上清液;還包括亞單位抗原,所述亞單位抗原為個別的或其任何組合的多核苷酸、多肽、重組蛋白質(zhì)、合成的肽、蛋白質(zhì)提取物、細胞、組織、多糖、脂質(zhì)或其片段,亦包括抗體如抗受試者遺傳型抗體或其片段以及可模擬抗原或抗原決定簇(表位)的合成肽模擬位mimotopes。其中,所述殺死的、滅活的細菌、病毒或寄生蟲是指含有不再能夠復(fù)制或生長的感染性生物體或病原體,病原體可通過各種方法包括凍融、化學(xué)處理(如用硫柳汞或福爾馬林處理)、聲處理、照射、熱或任何其它足以阻止生物體復(fù)制或生長的常用方法來實現(xiàn)滅活而維持其免疫原性;所述經(jīng)修飾的活的細菌、病毒或寄生蟲是指在人工條件下促使其變異,失去致病性但保留免疫原性、繁衍能力和剩余毒力的抗原,接種后在動物體內(nèi)有一定程度的繁殖或復(fù)制,但不會導(dǎo)致發(fā)病。

術(shù)語“豬圓環(huán)病毒抗原”是指含有至少一種豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV)抗原形式的任何組合物,所述豬圓環(huán)病毒抗原可誘導(dǎo)、刺激或增強抵抗豬圓環(huán)病毒感染的免疫應(yīng)答,所述抗原形式包括但不限于滅活的、活的或亞單位的抗原。所述豬圓環(huán)病毒抗原包含SH株(保藏號為CGMCC No.23890,參見中國專利CN101240264A)、SD株(保藏號為CGMCC No.7707,參見中國專利CN103421748A)、D株(保藏號為CGMCC No.7245,參見中國專利CN103275938A)、WH株(保藏號為CCTCC No.V201333,參見中國專利CN103409374A)、ZJ/H株(保藏號為CGMCC No.6391,參見中國專利CN102787100A)、DBN-SX07株(保藏號為CGMCC No.3064,參見中國專利CN101549155A)、V201312株(保藏號為CCTCC No.V201312,參見中國專利CN103436498A),還可以包含以下組合物的任一種抗原如梅里亞公司Merial的輝瑞公司Pfizer 的PCV2、哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗(LG株)、浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗(ZJ/C株)、勃林格殷格翰公司Boehringer-Ingelheim的Ingelvac

術(shù)語“豬肺炎支原體抗原”是指含有至少一種豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)抗原形式的任何組合物,所述豬肺炎支原體抗原可誘導(dǎo)、刺激或增強抵抗豬肺炎支原體感染的免疫應(yīng)答,所述抗原形式包括但不限于滅活的、活的或亞單位的抗原,或其培養(yǎng)上清液。所述豬肺炎支原體抗原包含HN0613株(保藏號為CCTCC No.M2012230,參見中國專利CN103083655A)、J株(購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC,ATCC編號為25934)、NJ株(保藏號為CCTCC No.M2012286,參見中國專利CN103585622A)、HDZK-Mhp57株(保藏號為CGMCC No.8096,參見中國專利CN103484414A)、AN306株(保藏號為CCTCC No.M2012431,參見中國專利CN103740625A)、DJ-166株(保藏號為CGMCC No.4545,參見中國專利CN103184171A)和NM04/41259株(保藏號為NM04/41259株,參見中國專利CN102458462A),還可以包含以下組合物的任一種抗原如哈藥集團公司的瑞倍適Respisure和瑞倍適-旺RespisureOne、英特威公司的安百克M+PAC、勃林格殷格翰公司的M.hyo、美國普泰克公司的MycoGard、美國輝瑞公司的RespiFend MH、碩騰(上海)動物保健品有限公司的瑞富特-旺Suvaxyn MH-one、梅里亞動物保健公司的豬克喘SprintVac、海博萊公司的喜宜豐Mypravac Suis、國內(nèi)生產(chǎn)的Z株活疫苗、168株活疫苗和RM48株活疫苗。

術(shù)語“副豬嗜血桿菌抗原”是指含有至少一種副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS)抗原形式的任何組合物,所述副豬嗜血桿菌抗原接種豬可誘導(dǎo)、刺激或增強抵抗副豬嗜血桿菌感染的免疫應(yīng)答,所述抗原形式包括但不限于滅活的、活的或亞單位的抗原,或其培養(yǎng)上清液。所述副豬嗜血桿菌抗原包括本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的臨 床分離的野毒株,包含目前已鑒定的1-15個血清型或無法測定血清型的副豬嗜血桿菌,包含至少兩個血清型的混合抗原如4型(如JS株,保藏號為CCTCC No.M2011172,參見中國專利CN103083655A)和5型(如ZJ株,保藏號為CCTCC No.M2011173,參見中國專利CN103083655A)的混合抗原,還可以包含以下組合物的任一種抗原如勃林格殷格翰公司的Ingelvac HP-1、海博萊公司Hipra的Hiprasuis-Glasser、中牧實業(yè)股份有限公司成都藥械廠和武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司的副豬嗜血桿菌滅活疫苗(4型MD0322株+5型SHO165株)。

本發(fā)明的第二方面在于提供一種疫苗組合物,其中,所述疫苗組合物包括免疫量的抗原和本發(fā)明的佐劑。

作為本發(fā)明的一種實施方式,本發(fā)明的疫苗組合物中,所述抗原包括豬圓環(huán)病毒抗原、豬肺炎支原體抗原、副豬嗜血桿菌抗原、豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原、豬細小病毒抗原、多殺巴斯德菌抗原、豬鏈球菌抗原、豬葡萄球菌抗原、支氣管炎博德特菌抗原、大葉性肺炎放線桿菌抗原、大腸桿菌抗原、豬萎縮性鼻炎抗原、豬偽狂犬病毒抗原、豬霍亂沙門氏菌抗原、腸炎沙門氏菌抗原、豬紅斑丹毒絲菌抗原、豬鼻支原體抗原、豬滑液支原體抗原、豬鉤端螺旋體細菌抗原、豬呼吸道冠狀病毒抗原、豬流行性腹瀉病毒抗原、豬輪狀病毒抗原、豬傳染性胃腸炎病毒抗原、豬細環(huán)病毒抗原、豬巨細胞病毒抗原、豬腸病毒抗原、腦心肌炎病毒抗原、豬流感病毒抗原、豬瘟病毒抗原中的一種或多種;以及所述佐劑包括丙烯酸系聚合物和纖維素醚。

作為本發(fā)明的一種實施方式,本發(fā)明的疫苗組合物中,所述抗原包括上述抗原的一種或多種;以及所述佐劑包括丙烯酸系聚合物、纖維素醚和含皂苷的組合物。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式,本發(fā)明的疫苗組合物中,所述抗原由豬圓環(huán)病毒抗原、豬肺炎支原體抗原、副豬嗜血桿菌抗原組成,所述佐劑包括丙烯酸系聚合物和纖維素醚。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式,本發(fā)明的疫苗組合物中,所述 抗原由豬圓環(huán)病毒抗原、豬肺炎支原體抗原、副豬嗜血桿菌抗原組成,所述佐劑包括丙烯酸系聚合物、纖維素醚和含皂苷的組合物。

作為本發(fā)明的一種最優(yōu)選實施方式,本發(fā)明的疫苗組合物中,所述抗原由豬圓環(huán)病毒SH株滅活抗原、豬肺炎支原體HN0613株滅活抗原、副豬嗜血桿菌4型JS株和5型ZJ株滅活抗原組成,所述佐劑包括丙烯酸系聚合物、纖維素醚和免疫刺激復(fù)合物。

作為本發(fā)明的一種實施方式,本發(fā)明的疫苗組合物中,所述佐劑的含量為5%-30%V/V。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式,本發(fā)明的疫苗組合物中,所述佐劑的含量為10%-25%V/V。

術(shù)語“蛋白”包括化學(xué)合成的蛋白、培養(yǎng)細胞的基因編碼的天然合成的蛋白以及由細胞分泌的重組蛋白。所述重組蛋白是由分子生物技術(shù)引入細胞的轉(zhuǎn)基因編碼的那些,可通過化學(xué)方法或翻譯后過程中的酶進行修飾。所述蛋白包括動物蛋白,是通過細胞培養(yǎng)產(chǎn)生的那些,也包括其他來源例如昆蟲、細菌、植物等表達的蛋白,以及突變的、人工的、合成的、融合的或嵌合的蛋白。根據(jù)本發(fā)明,所述蛋白包括但不限于兔病毒性出血癥病毒RHDV的VP60蛋白,犬細小病毒PPV的VP2蛋白,豬圓環(huán)病毒PCV2的Cap、Rep蛋白,豬肺炎支原體的P46、P65、NrdF、P97R1、P102、PdhA、XylF、P78、EutD、Mhp145、P132、Mhp389蛋白,副豬嗜血桿菌HPS的PilA、OMP、HbpA、OppA、PalA蛋白,豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV的Nsp2、GP3、GP4、GP5、M、N蛋白,豬細小病毒PPV的VP2蛋白,多殺巴斯德菌P.multocide的hyaE蛋白,豬鏈球菌S.suis的38KDa、SaoA、MRP、HM6、GAPDH、Omp40、VirB4、SLY蛋白,豬葡萄球菌S,hyicus的ExhA、ExhB、ExhC、ExhD蛋白,支氣管炎博德特菌Bb的P68蛋白,大葉性肺炎放線桿菌APP的Omp20、OmpW、Omp27、Omp27、OmpA1和OmpA2蛋白,大腸桿菌E.coli的K88、K99、987P、F41、F17、LTB、Orf353、TolC蛋白,豬萎縮性鼻炎AR的PMT,豬偽狂犬病毒PRV的gB、gC、gD、gE,腸炎沙門氏菌S.enteria的Hfq蛋白,豬紅 斑丹毒絲菌E.rhusiopathiae的SpaA、Lipo蛋白,豬鼻支原體Mhr的P37蛋白,豬呼吸道冠狀病毒PRCV的S、N蛋白,豬流行性腹瀉病毒PEDV的S、M、N蛋白,豬輪狀病毒PRV的VP4、VP6、VP7蛋白,豬傳染性胃腸炎病毒TGEV的S、M、N蛋白,豬細環(huán)病毒TTSuV的Cap蛋白,豬巨細胞病毒PCMV的gB蛋白,豬腦心肌炎病毒EMCV的VP1、VP2、3AB蛋白,豬流感病毒的HA、NP、NA、M、NS蛋白,豬瘟病毒CSFV的E0、E1、E2蛋白中的一種或多種。

術(shù)語“蛋白穩(wěn)定液”是指使免疫原性蛋白成分的穩(wěn)定性得以顯著改善,在制備過程中和適當(dāng)條件下長期(例如數(shù)月至數(shù)年)優(yōu)選地超過12個月(例如24個月或36個月)保存后,保持蛋白原有分子量、結(jié)構(gòu)和/或生物活性的至少80%優(yōu)選至少90%不變,保持蛋白生物穩(wěn)定性、物理穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性,不會形成化學(xué)降解產(chǎn)物,不會發(fā)生不可逆變化(例如聚集、沉淀或變性)。所述化學(xué)降解產(chǎn)物與天然蛋白結(jié)構(gòu)相比具有潛在的更低生物效價和/或潛在的更低免疫原性。

本發(fā)明的第三方面在于提供一種抗原蛋白穩(wěn)定劑。

作為本發(fā)明的一種實施方式,本發(fā)明的所述抗原蛋白穩(wěn)定劑包括丙烯酸系聚合物和纖維素醚。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式,本發(fā)明的所述抗原蛋白穩(wěn)定劑包括丙烯酸系聚合物、纖維素醚和含皂苷的組合物。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式,本發(fā)明的所述抗原蛋白穩(wěn)定劑包括丙烯酸系聚合物、纖維素醚和免疫刺激復(fù)合物。

作為本發(fā)明的一種實施方式,本發(fā)明的所述抗原蛋白穩(wěn)定劑中所述丙烯酸系聚合物以卡波姆計為2-10mg/ml,所述纖維素醚為0.1-8mg/ml,和所述含皂苷的組合物以QuilA計為0.1-10mg/ml。

下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明,本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述更為清楚。但這些實施例僅是范例性的,并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是,在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或 替換,但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

本發(fā)明實施例中豬圓環(huán)病毒抗原以滅活的豬圓環(huán)病毒2型SH株,豬肺炎支原體抗原以滅活的豬肺炎支原體HN0613株和活的豬肺炎支原體168株,副豬嗜血桿菌抗原以滅活的4型副豬嗜血桿菌JS株和5型副豬嗜血桿菌ZJ株為例進行闡述,但該實施方式無論在任何情況下均不構(gòu)成對本發(fā)明的限定。

本發(fā)明實施例中肺病變指數(shù)采用28分法進行評判。所述28分法是根據(jù)豬支原體肺炎的典型肺部眼觀病變,對發(fā)病程度進行量化判定,包括肺尖葉、心葉、膈葉、中間葉出現(xiàn)的實質(zhì)樣病變,如“肉樣變”、“胰樣變”。肺炎病變評分標(biāo)準(zhǔn)為:2個尖葉、2個心葉、2個膈葉、1個中間葉共計7個肺葉,每個肺葉滿分為4分,共計28分。根據(jù)發(fā)生實質(zhì)病變的肺葉面積所占該葉的比例,分別對每個肺葉進行打分。無肺炎病變記為0分;病變面積比例為1%-25%,記為1分;病變面積比例26%-50%,記為2分;病變面積比例為51%-75%,記為3分;病變面積比例為76%-100%,記為4分。如肺葉正反兩面均有病變,以病變面積大的一面進行記分。各個肺葉打分總和即為該發(fā)病株的肺炎病變得分。分別對免疫組豬和對照組豬進行記分后,按照以下公式計算免疫組豬的肺葉病變減少率:

本發(fā)明實施例統(tǒng)計分析方法為:統(tǒng)計7個肺葉的肺病變指數(shù),確定病變程度。用SPSS計算機軟件進行ANOVA分析,比較各組間差異,確定病變差異的有效性。

本發(fā)明中所用的pH7.2PBS溶液配方為:800ml蒸餾水中加入NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO41.42g、KH2PO40.27g,調(diào)pH值至7.4,定容至1000ml,經(jīng)121℃高壓滅菌30分鐘后使用,但該實施方式無論在任何情況下均不構(gòu)成對本發(fā)明的限定。

本發(fā)明中所用到的化學(xué)試劑均為分析純,購自國藥集團,但該實施方式無論在任何情況下均不構(gòu)成對本發(fā)明的限定。

為使本發(fā)明更加容易理解,下面結(jié)合具體實施例,進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實施例僅用于本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明所述的實驗方法,若無特殊說明,均為常規(guī)方法;所述的生物材料,若無特殊說明,均可從商業(yè)途徑獲得。

實施例1抗原的制備及鑒定

1.1豬圓環(huán)病毒抗原的制備及含量測定

1.1.1豬圓環(huán)病毒2型SH株的制備

將毒種豬圓環(huán)病毒2型SH株用MEM液體培養(yǎng)基(用購自美國Invitrogen公司的MEM干粉培養(yǎng)基按說明書配制)作1:9V/V稀釋,然后按細胞培養(yǎng)液體積的5%接種于PK15(ATCC,保藏號為CCL-33)單層細胞,37℃吸附30分鐘,加入細胞維持液(MEM液體培養(yǎng)基中添加4%犢牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖鹽酸),37℃培養(yǎng)4日,凍融2-3次,收獲病毒,病毒滴度為106.5TCID50/ml。

用轉(zhuǎn)瓶細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)病毒液,將長滿單層的PK15細胞,倒去細胞培養(yǎng)液(MEM液體培養(yǎng)基中添加6%犢牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖鹽酸),將毒種液按0.1-0.2TCID50/個細胞的接種量接種于PK15細胞上,旋轉(zhuǎn)細胞瓶2周,37℃吸附30分鐘,加入細胞維持液,置37℃旋轉(zhuǎn)(10-12轉(zhuǎn)/小時)培養(yǎng)。每日觀察1-2次,細胞生長良好,37℃培養(yǎng)4日收獲細胞和細胞液,凍融3次,置-20℃以下保存病毒液。

將制備的病毒液用中空纖維濾柱(Millipore公司孔徑10μm與0.45μm)過濾,除去細胞碎片,然后用密理博(Millipore公司)膜包(分子截留量為300Kda)作5倍V/V濃縮。

1.1.2豬圓環(huán)病毒2型SH株病毒液含量測定

將病毒液用MEM液體培養(yǎng)基按本領(lǐng)域技術(shù)人員通用方法作10倍系列稀釋,取10-5、10-6、10-73個稀釋度,每個稀釋度分別接種96孔培養(yǎng)板PK15細胞單層4孔,每孔0.1ml,同時設(shè)立陰性對照,在37℃含5%CO2的溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時,換細胞維持液,繼續(xù)培養(yǎng) 24小時;用冷丙酮固定細胞,用間接免疫熒光試驗IFA測定每個稀釋度含有PCV2陽性細胞(呈綠色)的孔數(shù),根據(jù)Karber氏法計算病毒TCID50。計算結(jié)果表明:豬圓環(huán)病毒2型SH株的含量為5×106.0TCID50/ml。

1.1.3豬圓環(huán)病毒2型SH株病毒液的滅活及檢驗

將檢驗合格的病毒液加入甲醛溶液(洛陽市化學(xué)試劑廠分析純,含量為37%-40%V/V),使甲醛溶液的終濃度為0.2%V/V,37℃滅活18小時,每4小時攪拌1次,每次10分鐘,滅活結(jié)束后將滅活病毒液置2-8℃保存。

對滅活病毒液進行滅活檢驗,取少量滅活病毒液接種已長成單層的PK15細胞,37℃吸附1小時后棄病毒液,加入新的細胞維持液,37℃培養(yǎng)2日,無細胞病變CPE,連續(xù)盲傳3次,長成細胞單層后換成細胞維持液,37℃培養(yǎng)2日,用間接免疫熒光法IFA檢測,無綠色PCV2陽性細胞產(chǎn)生,表明豬圓環(huán)病毒2型SH株病毒液滅活成功。

1.2豬肺炎支原體抗原的制備及含量測定

1.2.1豬肺炎支原體HN0613株的制備及含量測定

凍干菌種啟封后,按10%接種量接種液體培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng)3-7日,待pH值由7.5降至6.8時收獲,經(jīng)純粹檢驗,作為一級生產(chǎn)種子。取一級種子按5%接種量接種液體培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng)3-7日,待pH值由7.5降至6.8時收獲,經(jīng)純粹檢驗,作為二級生產(chǎn)種子。

其中,豬肺炎支原體液體培養(yǎng)基的配方:牛心浸出液(BD公司)300ml,雙蒸水360m1,校正pH值到7.4,121℃滅菌15分鐘。再加入下列過濾除菌的成份:Hank's平衡鹽溶液(10×)40m1,0.25%W/V酚紅10m1,馬血清200m1,5%W/V水解乳蛋白100m1,25%W/V酵母浸出液20m1,10000IU/ml青霉素10ml。

將鑒定合格的豬肺炎支原體HN0613株的二級種子分別按5%V/V接種于液體培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng)3-7日,待pH值由7.5降至6.8時收獲菌液。將收獲到的菌液用密理博(Millipore公司)膜包(分子截留量為300Kda)作10倍V/V濃縮。

按照菌液活菌計數(shù)法測定豬肺炎支原體菌液含量,將含酚紅指示劑的液體培養(yǎng)基分裝至小試管中,設(shè)兩排,每排13支,1.8ml/支,取0.2ml待檢培養(yǎng)物接種至第一支小試管,混勻后依次10倍稀釋至第12支小試管,第13管為對照管,置37℃搖振培養(yǎng),記錄21天為止產(chǎn)生顏色變化的最高管數(shù),以判定CCU滴度,取兩排結(jié)果的平均值。結(jié)果表明:豬肺炎支原體HN0613株的含量為1×109CCU/ml。

1.2.1.1豬肺炎支原體HN0613株菌液的滅活及鑒定

在收獲的菌液中加入甲醛溶液,使甲醛溶液的終濃度為0.3%V/V,37℃滅活24小時,其間每隔4小時攪拌1次,每次10分鐘,滅活結(jié)束后將滅活菌液置2-8℃保存。

對滅活后的菌液進行滅活檢驗,取1ml滅活菌液接種50ml液體培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng),于第5、10日各移植一次,最后一次移植后繼續(xù)培養(yǎng)觀察11日,培養(yǎng)基pH值不降低,培養(yǎng)基著色均未發(fā)生變化。

1.2.2豬肺炎支原體168株抗原

豬肺炎支原體168株活疫苗凍干粉,購自南京天邦生物科技有限公司,每份含豬肺炎支原體168株活菌為1×107CCU。

1.3副豬嗜血桿菌抗原的制備及鑒定

1.3.1副豬嗜血桿菌4型JS株和5型ZJ株的制備

將副豬嗜血桿菌4型JS株和5型ZJ株劃線接種于含5%新生牛血清和0.005%煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD(美國BBI公司)的胰蛋白大豆瓊脂平板(簡稱TSA/NAD平板),37℃培養(yǎng)24-48小時,各挑選5個以上典型菌落,純粹檢驗合格后,作為一級種子。一級種子挑取單個菌落,接入含5%新生牛血清和0.005%NAD的胰蛋白大豆肉湯(簡稱TSB/NAD液體培養(yǎng)基),37℃搖床180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)12小時,同時取樣革蘭氏染色,在顯微鏡下觀察細菌形態(tài)均勻,符合副豬嗜血桿菌的形態(tài)特征,無任何雜菌生長,作為二級種子。

其中,含5%血清的TSA/NAD平板的制備方法:胰蛋白大豆瓊脂(Tryptic Soy Agar,TSA,BD Difico產(chǎn)品)40克加入945ml蒸餾水,充分搖勻后加熱至充分溶解,121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘,溫度 降至60℃左右,加入50ml過濾除菌的牛血清,5ml過濾除菌的1%NAD,充分搖勻后倒平皿;含5%新生牛血清的TSB/NAD液體培養(yǎng)基的制備方法:胰大豆蛋白肉湯(Tryptic Soy Broth,TSB,BD Difico產(chǎn)品)30g加入940ml蒸餾水,充分搖勻后加熱至充分溶解,121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘,加入50ml過濾除菌的牛血清,10ml過濾除菌的0.01%NAD即成。

將鑒定合格的副豬嗜血桿菌4型JS株與5型ZJ株的二級種子分別按1:100V/V接種于TSB/NAD液體培養(yǎng)基,置37℃搖床200rpm培養(yǎng)。培養(yǎng)至12-16小時,收獲菌液。

將收獲的菌液(副豬嗜血桿菌4型JS株和5型ZJ株)分別以連續(xù)離心機(10000轉(zhuǎn)/分鐘)離心后再以PBS溶液復(fù)溶至離心前的體積,然后用密理博膜包(分子截留量為300Kda)作5倍V/V濃縮。

菌液取樣,按本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法作10倍系列稀釋,取10-6、10-72個稀釋度接種于前述TSA/NAD固體培養(yǎng)基,每個平板接種0.1ml,37℃培養(yǎng)24小時后,選擇菌落數(shù)在30和300之間的平板進行菌落計數(shù)。計數(shù)結(jié)果表明:副豬嗜血桿菌4型JS株和5型ZJ株的含量均為5×109CFU/ml。

1.3.2副豬嗜血桿菌4型JS株和5型ZJ株菌液的滅活及鑒定

在收獲的菌液中加入甲醛溶液,使甲醛溶液的終濃度為0.3%V/V,37℃滅活24小時,其間每隔4小時攪拌1次,每次10分鐘,滅活結(jié)束后將滅活菌液置2-8℃保存。

對滅活后的菌液進行滅活檢驗,制備6個平皿的TSA/NAD固體培養(yǎng)基,無菌操作將滅活的菌液在其中3個TSA/NAD固體培養(yǎng)基平皿上滴加1滴,用接種環(huán)劃線,置37℃普通溫箱培養(yǎng),同時設(shè)立3個不接菌的TSA/NAD固體培養(yǎng)基作對照。24小時后觀察,平皿中無任何細菌生長,同時對照未接菌的2個培養(yǎng)基也應(yīng)無細菌生長,繼續(xù)觀察結(jié)果至48小時6個平皿中均無細菌生長。

實施例2佐劑的制備

卡波姆母液的制備:取卡波姆971P溶于蒸餾水,室溫放置過夜使其充分溶脹得到20mg/ml的卡波姆溶液,加入3M氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至7.2,加適量蒸餾水調(diào)節(jié)卡波姆溶液,得到終濃度為15mg/ml的卡波姆母液。

羧甲基纖維素鈉母液的制備:將1g羧甲基纖維素鈉與100ml蒸餾水混合,加熱煮沸直到完全溶解,然后冷卻至室溫,即配置成濃度為10mg/ml的羧甲基纖維素鈉母液。

ISCOM基質(zhì)母液的制備:取12mg/ml的脂類混合物儲備液加入PBS溶液中,再加入30mg/ml QuilA儲備液,使終濃度為QuilA 15mg/ml、磷脂酰膽堿3mg/ml、膽固醇3mg/ml,充分混勻后冰浴超聲處理,室溫放置1.5小時后,轉(zhuǎn)移至透析袋中,以PBS溶液為外液室溫透析3天,經(jīng)0.22μm濾膜除菌后于4℃保存,得QuilA終濃度為15mg/ml的ISCOM基質(zhì)母液。

以上母液均于121℃高壓滅菌30分鐘后備用。

實施例3滅活疫苗組合物的制備及動物試驗

3.1滅活疫苗組合物的制備

將實施例1制備的抗原、實施例2制備的佐劑之各成分母液,使用PBS溶液稀釋,使稀釋后的各抗原溶液與佐劑終濃度按表1中滅活的疫苗組合物所含組分混合,以500-800轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速攪拌10-15分鐘,在終止攪拌前加入1%V/V的硫柳汞(購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司)溶液,使其終濃度不超過萬分之一,充分振蕩混勻、分裝,分裝后2-8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1滅活疫苗組合物所含組分

3.2滅活疫苗組合物之豬圓環(huán)病毒抗原的效力試驗

將實施例3.1所制備的疫苗1-1、1-2、1-3、1-6、1-7、1-9、2-1、2-2、2-3、2-6、2-7、2-9以及參考疫苗對照組(PCV2疫苗,由普萊柯生物工程股份有限公司生產(chǎn))分別頸部肌肉注射免疫14-21日齡仔豬(排除豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒2型和豬瘟),5頭/組,2ml/頭,同時設(shè)置空白對照組,共14組(共70頭仔豬)。免疫接種后21天、35天、60天、90天對每頭豬采血,收集血清,保存在-20℃直到測試。

按照血清學(xué)方法對豬圓環(huán)病毒抗原部分的免疫效果進行評價,具體為:

(1)ELISA抗體檢測用大腸桿菌表達的PCV2ORF2蛋白(按 照中國專利CN101101296A制備)作為抗原,通過方陣滴定試驗確定抗原的最佳包被濃度。將抗原稀釋到最佳包被濃度后包被酶標(biāo)板,100μl/孔,后4℃包被過夜;洗滌3次,每次3-5分鐘;每孔加200μl的0.15%M/V BSA封閉液封閉板子,37℃作用2小時;洗滌;將待檢血清用PBS倍比稀釋,每個樣品一行,每孔加100μ1,37℃作用1h;洗滌;然后加入酶標(biāo)的SPA(1:10000倍稀釋),100μl/孔,37℃作用1h;洗滌;加底物液TMB顯色,最后用2mol/L的H2SO4終止反應(yīng)。結(jié)果判定:待檢血清OD450值/陰性血清OD450值≥2.1為陽性。

(2)血清中和試驗采用固定病毒稀釋血清法。待檢血清56℃加熱30分鐘,10000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘,小心吸出上清,做1:2稀釋后進行倍比稀釋;分別與等量PCV2病毒液混合,37℃1h,接種于含單層PK15細胞的96孔板內(nèi),100μ1/孔,每一稀釋度接種4孔,同時設(shè)細胞對照和病毒對照孔。37℃培養(yǎng)12h,用300mmol/L的D-氨基葡萄糖處理,37℃繼續(xù)培養(yǎng)48h,80%丙酮固定細胞,用間接免疫熒光法測定每個稀釋度含有熒光的孔數(shù)。以能夠抑制50%特異性熒光細胞數(shù)的細胞孔的血清最大稀釋度作為待檢血清的中和效價,并計算每組平均值。

血清學(xué)評價結(jié)果見表2。

表2滅活疫苗組合物之豬圓環(huán)病毒抗原的效力試驗結(jié)果

注:參考疫苗對照組所用的PCV2疫苗由普萊柯生物工程股份有限公司生產(chǎn),抗原含量為107.0TCID50/ml,按廠家說明書進行兩次免疫。

由表2可知:A1-1至A1-3、A2-1至A2-3組同一含量的PCV2抗原(單苗)不同佐劑含量時,免疫后所產(chǎn)生的抗體隨佐劑含量的增大而略微升高,且與高抗原含量的PCV2參考單苗所產(chǎn)生的抗體基本一致,并能持續(xù)到并能持續(xù)至少60天;含相同含量佐劑的PCV2聯(lián) 苗免疫后所產(chǎn)生的抗體與PCV2參考單苗所產(chǎn)生的抗體基本一致,并能持續(xù)到并能持續(xù)至少60天,表明疫苗1-1、1-2、1-3、1-6、1-7、1-9、2-1、2-2、2-3、2-6、2-7、2-9分別免疫動物后能刺激機體產(chǎn)生PCV2特異性抵抗力,效果確實,并且疫苗1-6、1-7、1-9、2-6、2-7、2-9之其他抗原對PCV2抗原的免疫效果無影響;并且疫苗組合物中佐劑含卡波姆、ISCOM和羧甲基纖維素鈉的免疫效果優(yōu)于含卡波姆、羧甲基纖維素鈉的。

3.3滅活疫苗組合物之豬肺炎支原體抗原的效力試驗

將實施例3.1所制備的疫苗組合物1-4、1-6、1-8、1-9、2-4、2-6、2-8、2-9,分別頸部肌肉注射免疫14-21日齡仔豬(排除豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)2型和豬瘟),5頭/組,2ml/頭,同時設(shè)置參考疫苗對照組、攻毒對照組,共10組(共50頭仔豬)。免疫接種后觀察體溫、副反應(yīng)至28日,并于28日對所有豬氣管注射豬肺炎支原體濟南系強毒CVCC354株(保藏號為CVCC354,保藏單位為國家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心),100MID50/頭,觀察28天后解剖,并觀察肺部病變,按照28分法對肺部病變進行評分。攻毒前后,分別對試驗組仔豬進行稱重,并計算平均日增重。

攻毒后大約10天左右,攻毒對照組其中4頭豬陸續(xù)出現(xiàn)咳嗽、氣喘等癥狀,皮毛不光滑;參考疫苗對照組有1頭豬出現(xiàn)了咳嗽的癥狀、并發(fā)生了副反應(yīng);其他免疫組的豬未出現(xiàn)氣喘病的類似癥狀。攻毒前后,各試驗組豬的肺炎病變平均得分和平均日增重結(jié)果見表3。

表3滅活疫苗組合物之豬肺炎支原體抗原的效力試驗結(jié)果

注1:參考疫苗對照組所選用的疫苗為現(xiàn)有產(chǎn)品中的豬支原體肺炎滅活疫苗(J株),即安百克(M+PAC),按廠家說明書進行免疫。

注2:體溫“無”表明未發(fā)生一過性體溫升高,“有”表明發(fā)生一過性體溫升高,其中一過性體溫升高是指于二免疫后第1-2天體溫會短暫呈現(xiàn)40.5度,并于第3天恢復(fù)正常體溫。

注3:副反應(yīng)“無”表明未發(fā)生過副反應(yīng),“有”表明發(fā)生過副反應(yīng),其中副反應(yīng)是指出現(xiàn)過短暫性精神沉郁、食欲減退、過敏反應(yīng)中的至少一種。

注4:差異性統(tǒng)計分析中,組間比較,字母相同者表示差異不顯著,字母不同者表示差異顯著(p<0.05)。

由表3可知:第B1-1至B1-4組(即分別免疫疫苗1-4、1-6、1-8、1-9)、第B2-1至B2-4組(即分別免疫疫苗2-4、2-6、2-8、2-9)使用含豬肺炎支原體抗原和同樣含量佐劑的單苗或聯(lián)苗進行免疫,之后進行攻毒,結(jié)果顯示免疫豬均未發(fā)生一過性體溫升高,也未出現(xiàn)副反應(yīng),并且肺炎病變減少率分別均>73%、>84%,平均日增重分別為0.0412-0.0415kg、0.0445-0.0453kg,B1、B2各小組之間差異不顯著(p>0.05);與參考疫苗對照組相比,差異均顯著(p<0.05);與攻毒對照組相比,差異均顯著(p<0.05);并且疫苗組合物中佐劑含卡波姆、ISCOM和羧甲基纖維素鈉的免疫效果顯著優(yōu)于含卡波姆、羧甲基纖維素鈉的(p<0.05)。

3.4滅活疫苗組合物之副豬嗜血桿菌抗原的效力試驗

將實施例3.1所制備的疫苗組合物1-5、1-7、1-8、1-9、2-5、2-7、2-8、2-9,分別頸部肌肉注射免疫14-21日齡仔豬(排除豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)2型和豬瘟),5頭/組,2ml/頭,同時設(shè)置參考疫苗對照組、攻毒對照組,共10組(命名為C1-1、C1-2、C1-3、C1-4、C2-1、C2-2、C2-3、C2-4、參考疫苗對照組1、攻毒對照組1);同時做重復(fù)試驗,共10組(命名為C1-5、C1-6、C1-7、C1-8、C2-5、C2-6、C2-7、C2-8、參考疫苗對照組2、攻毒對照組2),詳見表4。

免疫接種后28天進行攻毒,前10組用副豬嗜血桿菌4型腹腔注射3ml進行攻毒,攻毒劑量為9.0×109CFU/頭;后10組用副豬嗜血桿菌5型腹腔注射3ml進行攻毒,攻毒劑量為6.0×109CFU/頭,攻毒后觀察各組豬臨床表現(xiàn),觀察14天后剖殺進行病理觀察。攻毒前后分別對試驗組仔豬進行稱重,以計算平均日增重。

表4滅活疫苗組合物之副豬嗜血桿菌抗原的效力試驗結(jié)果

注1:參考疫苗對照組所用副豬嗜血桿菌病滅活疫苗為中牧實業(yè)股份有限公司成都藥械廠生產(chǎn)的,抗原含量為4.0×109CFU/頭份,按照廠家說明書進行兩次免疫。

注2:差異性統(tǒng)計分析中,組間比較,字母相同者表示差異不顯著,字母不同者表示差異顯著(p<0.05)。

由表4可知:第C1-1至C1-4組、第C1-5至C1-8組(即分別免疫疫苗1-5、1-7、1-8、1-9),第C2-1至C2-4組、第C2-5至C2-8組(即分別免疫疫苗2-5、2-7、2-8、2-9)使用含副豬嗜血桿菌抗原和同樣含量佐劑的單苗或聯(lián)苗進行免疫,之后進行攻毒,結(jié)果顯示免疫豬獲得完全保護,平均日增重分別為0.0311-0.0317kg、0.0388-0.0344kg,C1、C2各小組內(nèi)相互之間差異不顯著(p>0.05);與參考疫苗對照組相比,抗原含量低還能使免疫保護效率高,并且平均日增重差異均顯著(p<0.05);與攻毒對照組相比,平均日增重差異均顯著(p<0.05);并且疫苗組合物中佐劑含卡波姆、ISCOM和羧甲基纖維素鈉的免疫效果顯著優(yōu)于含卡波姆、羧甲基纖維素鈉的(p<0.05)。

實施例4活疫苗組合物的制備及動物試驗

4.1活疫苗之豬支原體肺炎活疫苗(168株)的制備

活疫苗組合物以豬支原體肺炎活疫苗(168株)為例,將實施例1.2制備的豬肺炎支原體168株抗原、經(jīng)PBS稀釋的實施例2制備的佐劑作為活疫苗稀釋劑按表5進行配制,用2ml活疫苗稀釋劑溶解1頭份豬支原體肺炎活疫苗(168株)。

表5豬支原體活疫苗稀釋后所含組分及終濃度

4.2豬支原體肺炎活疫苗(168株)的動物試驗

將實施例4.1所制備的疫苗組合物,分別按表5采用頸部肌肉注射免疫14-21日齡仔豬45頭(排除豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)2型和豬瘟),5頭/組,2ml/頭,同時設(shè)置參考疫苗對照組、現(xiàn)有技術(shù)對照組、攻毒對照組,共9組。

免疫前及接種后觀察體溫、副反應(yīng)至28日,并于28日對所有豬氣管注射豬肺炎支原體濟南系強毒CVCC354株(保藏號為CVCC354,保藏單位為國家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心),100MID50/頭,觀察28天后解剖,并觀察肺部病變,按照28分法對肺部病變進行評分?。攻毒前后,分別對試驗組仔豬進行稱重,并計算平均日增重。

安全性試驗結(jié)果:免疫組I-VI的體溫?zé)o明顯變化,剖殺后觀察肺病變時也未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化。

攻毒試驗結(jié)果:攻毒后大約10天左右,攻毒對照組豬只(其中4只)陸續(xù)出現(xiàn)咳嗽、氣喘等癥狀,皮毛不光滑;第VII、VIII組各有一頭豬出現(xiàn)了咳嗽的癥狀;其他組別沒有豬只出現(xiàn)氣喘病的類似癥狀。攻毒前后,各試驗組豬只的肺炎病變平均得分和平均日增重結(jié)果見表6。

表6豬支原體活疫苗免疫后觀察結(jié)果及效力試驗結(jié)果

注1:參考疫苗對照組為南京天邦生物科技有限公司生產(chǎn)的支必寧,按廠家說明書進行肺內(nèi)注射;現(xiàn)有技術(shù)對照組為按照中國專利CN103071151B制備的豬肺炎支原體活疫苗(168株),含該專利提及的疫苗專用稀釋劑,按該專利頸部肌肉注射方式免疫,共免疫2次間隔2周。

注2:體溫“無”表明未發(fā)生一過性體溫升高,“有”表明發(fā)生一過性體溫升高,其中一過性體溫升高是指于二免疫后第1-2天體溫會短暫呈現(xiàn)40.5度,并于第3天恢復(fù)正常體溫。

注3:副反應(yīng)“無”表明未發(fā)生過副反應(yīng),“有”表明發(fā)生過副反應(yīng),其中副反應(yīng)是指出現(xiàn)過短暫性精神沉郁、食欲減退、過敏反應(yīng)中的至少一種。

注4:差異性統(tǒng)計分析中,組間比較,字母相同者表示差異不顯著,字母不同者表示差異顯著(p<0.05)。

由表6可知:

(1)第I-III組(即免疫活疫苗1-3)使用含卡波姆、羧甲基纖維素鈉的佐劑稀釋豬肺炎支原體活疫苗(168株)進行頸部肌肉注射免疫,之后進行攻毒,結(jié)果顯示:隨佐劑中各組分含量的升高免疫效果(肺炎病變減少率、平均日增重)增加,免疫豬只未發(fā)生一過性體溫升高,也未出現(xiàn)副反應(yīng),并且各組之間免疫效果差異顯著(p<0.05);與第VII組(即參考疫苗對照組,免疫組分為支必寧)相比,除第I組外差異均顯著(p<0.05),并且肌肉注射比肺內(nèi)注射操作簡便、可接受度高;與VIII組(即現(xiàn)有技術(shù)對照組)相比,除第I組外差異均顯著(p<0.05),且免疫次數(shù)少,降低了免疫成本,節(jié)約了免疫程序,經(jīng)濟可靠;與攻毒對照組相比,差異均顯著(p<0.05)。

(2)第IV-VI組(即免疫活疫苗4-6)使用含卡波姆、ISCOM、羧甲基纖維素鈉的佐劑稀釋豬肺炎支原體活疫苗(168株)進行頸部肌肉注射免疫,之后進行攻毒,結(jié)果顯示:隨佐劑中各組分含量的升高免疫效果(肺炎病變減少率、平均日增重)增加,免疫豬只未發(fā)生一過性體溫升高,也未出現(xiàn)副反應(yīng),并且各組之間差異顯著(p<0.05);與第I-III組相比,除ISCOM外相同含量組分的佐劑稀釋活疫苗后的免疫效果較優(yōu),且差異顯著(p<0.05);與第VII組(即參考疫苗對照組,免疫組分為支必寧)相比,差異均顯著(p<0.05),并且肌肉注射比肺內(nèi)注射操作簡便、可接受度高;與VIII組(即現(xiàn)有技術(shù)對照組)相比,差異均顯著(p<0.05),且免疫次數(shù)少,降低了免疫成本,節(jié)約了免疫程序,經(jīng)濟可靠;與攻毒對照組相比,差異均顯著(p<0.05)。

實施例5蛋白穩(wěn)定液的應(yīng)用

5.1RHDV VP60蛋白穩(wěn)定性研究

按照中國專利CN103555766A中所描述的方法制備兔出血癥病毒(Rbabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)的免疫原性VP60蛋白,對表達后的VP60蛋白進行鑒定確認(rèn)無疑后進行純化,并用人的O型紅細胞的凝集價進行檢測,檢測結(jié)果表明VP60蛋白的血凝價HA為1:217。

將實施例2制備的佐劑各成分母液即卡波姆母液、ISOCM基質(zhì)母液、羧甲基纖維素鈉母液用以制備VP60蛋白穩(wěn)定液,用PBS稀釋制備RHDV VP60蛋白溶液(溶液1-2),使各組分終濃度為:VP60HA為1:214,卡波姆為1mg/ml,羧甲基纖維素鈉為0.1mg/ml。同時,制備溶液(溶液3-4)使各組分終濃度為:VP60HA為1:214,卡波姆為1mg/ml,皂苷為0.1mg/ml,羧甲基纖維素鈉為0.1mg/ml。

取同樣劑量的RHDV VP60蛋白溶液各2份在2-8℃分別存放6、12、18、24、30、36個月,并用PBS稀釋的VP60蛋白溶液2份做對照,對不同保存條件下的蛋白溶液進行血凝檢測,結(jié)果見表7。

表7 RHDV VP60蛋白穩(wěn)定性試驗結(jié)果

由表7可知:含卡波姆、羧甲基纖維素鈉的溶液作為RHDV VP60蛋白穩(wěn)定液使VP60蛋白穩(wěn)定至少24個月,含卡波姆、ISCOM、羧甲基纖維素鈉的溶液作為RHDV VP60蛋白穩(wěn)定液使VP60蛋白穩(wěn)定至少30個月,而以PBS作為保存溶液的對照組HA隨時間的延長而逐漸降低,表明蛋白出現(xiàn)了一定程度的降解或發(fā)生了不可逆變化。

5.2PCV2Cap蛋白穩(wěn)定性研究

按照中國專利CN104017813A中所描述的方法制備豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)的免疫原性Cap蛋白,對表達后的Cap蛋白進行鑒定確認(rèn)無疑后進行純化,按照BCA蛋白定量試劑盒(購自Merck公司)說明書的方法定量Cap蛋白的濃度,結(jié)果表明:Cap蛋白的濃度為2mg/ml。

將實施例2制備的佐劑各成分母液即卡波姆母液、ISOCM基質(zhì)母液、羧甲基纖維素鈉母液用以制備Cap蛋白穩(wěn)定液,用PBS稀釋制備PCV2Cap蛋白溶液(溶液1-2),使各組分終濃度為:Cap蛋白濃度為0.40mg/ml,卡波姆為1mg/ml,羧甲基纖維素鈉為0.1mg/ml。同時,制備溶液(溶液3-4)使各組分終濃度為:Cap蛋白濃度為0.40mg/ml,卡波姆為1mg/ml,皂苷為0.1mg/ml,羧甲基纖維素鈉為0.1mg/ml。

取同樣劑量的PCV2Cap蛋白溶液各2份在2-8℃分別存放6、12、18、24、30、36個月,并用PBS稀釋的Cap蛋白溶液2份做對照,對不同保存條件下的蛋白溶液分別進行BCA測定,結(jié)果見表8。

表8 PCV2Cap蛋白穩(wěn)定性試驗結(jié)果

由表8可知:含卡波姆、羧甲基纖維素鈉的溶液作為PCV2Cap蛋白穩(wěn)定液,使Cap蛋白穩(wěn)定至少24個月,含卡波姆、ISCOM基質(zhì)、羧甲基纖維素鈉的溶液作為PCV2Cap蛋白穩(wěn)定液,使Cap蛋白穩(wěn)定至少30個月,而以PBS作為保存溶液的對照組中Cap蛋白的濃度隨保存時間的延長而逐漸降低,蛋白出現(xiàn)了一定程度的降解或發(fā)生了不可逆變化。

綜上所述,含卡波姆、免疫刺激復(fù)合物和羧甲基纖維素鈉佐劑的疫苗組合物的免疫效果顯著優(yōu)于含卡波姆、羧甲基纖維素鈉的,這些疫苗組合物(1)免疫動物后的免疫應(yīng)答水平隨佐劑含量的增加而升高,且與現(xiàn)有商品化疫苗的免疫應(yīng)答水平基本一致,免疫持續(xù)時間也較長,效果確實;(2)在抗原含量較低時也能使動物獲得較好的免疫應(yīng)答水平及完全保護,免疫次數(shù)少使豬的應(yīng)激反應(yīng)減少甚至無,且無副反應(yīng)發(fā)生;(3)該佐劑還可以用于稀釋活疫苗,使活疫苗以肌肉注射形式免疫豬只,使豬只無一過性體溫升高、副反應(yīng)發(fā)生,使豬只肺炎病變率較少、平均日增重升高等良好的免疫效果,優(yōu)于現(xiàn)有活疫苗,并使操作簡便、成本降低、程序節(jié)約、經(jīng)濟可靠;(4)該佐劑可作為蛋白穩(wěn)定液使用,使蛋白穩(wěn)定不降解或不發(fā)生了不可逆變化。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已,并不用以限制本發(fā)明,凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi),所作的任何修改、等同替換、改進等,均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

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