本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種生甘草丁酰膽堿酯酶抑制活性提取物及其組合物的制備方法和其制備預(yù)防及治療阿爾茨海默病(AD)等丁酰膽堿酯酶抑制活性藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

甘草（學(xué)名：Glycyrrhiza uralensis），又名烏拉爾甘草，多年生草本植物，屬豆科。是一種補(bǔ)益中草藥。藥用部位是根及根莖，藥材性狀根呈圓柱形，長25～l00cm，直徑0.6～3.5cm。外皮松緊不一，表面紅棕色或灰棕色。根莖呈圓柱形，表面有芽痕，斷面中部有髓。氣微，味甜而特殊。功能主治清熱解毒，祛痰止咳、脘腹等。喜陰暗潮濕，日照長氣溫低的干燥氣候。甘草多生長在干旱、半干旱的荒漠草原、沙漠邊緣和黃土丘陵地帶。根和根狀莖供藥用。在高通量篩選的過程中，本發(fā)明意外地發(fā)現(xiàn)生甘草具有很好的抑制丁酰膽堿酯酶的活性，該活性提取物及其組合物有望應(yīng)用于治療阿爾茨海默病(AD)等方面的醫(yī)藥用途。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供一種生甘草提取物。

本發(fā)明還提供了以生甘草提取物為主要活性成分的組合物。

本發(fā)明同時提供了生甘草提取物及其組合物的制備和在制備丁酰膽堿酯酶抑制活性藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

維吾爾藥生甘草經(jīng)溶劑超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠（SiO₂）柱分離，上樣后的硅膠柱，用氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫（氯仿-甲醇，比例見表1），各氯仿-甲醇比例混合溶劑洗脫液，濃縮，干燥后，利用體外篩選體系測試其丁酰膽堿酯酶抑制活性，意外地發(fā)現(xiàn)先用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:0，體積比）洗脫，繼用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:3，體積比）洗脫得到的氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:3，體積比）洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，干燥，即為丁酰膽堿酯酶抑制活性提取物。而其他比例的洗脫部位，沒有丁酰膽堿酯酶抑制活性的作用。優(yōu)選的先用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:0，體積比）洗脫，繼用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:3，體積比）洗脫得到的氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:3，體積比）洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑干燥即得丁酰膽堿酯酶抑制活性提取物。丁酰膽堿酯酶抑制活性的提取物，可以通過以上方法得到富集，從而與其他雜質(zhì)類成分分離開。該生甘草丁酰膽堿酯酶抑制活性提取物從未見文獻(xiàn)報道，其薄層色譜（TLC）分析結(jié)果見圖1， TLC分析條件：GF254硅膠板，展開系統(tǒng)：氯仿：乙酸乙酯：甲醇（5:1:1）顯色方法：香草醛-硫酸顯色。

具體，發(fā)現(xiàn)過程如下：

1、生甘草經(jīng)溶劑超聲提取物的制備

取維吾爾藥生甘草20 g，經(jīng)100 mL甲醇超聲提取15 min，提取液濃縮后，得提取物SN0139，樣品上柱：2.2767g，拌樣硅膠2 g，空白硅膠10g，氯仿-甲醇系統(tǒng)。

2、氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫方法和結(jié)果

取維吾爾藥生甘草20 g，經(jīng)100 mL甲醇超聲提取15 min，提取液濃縮后，得提取物SN0139，2.2767 g上柱，甲醇溶解，共用甲醇15 mL。上硅膠柱色譜，拌樣硅膠2 g，空白硅膠10 g，玻璃柱內(nèi)徑2cm，氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫（條件見表1），柱體積22mL，每個梯度洗脫200mL，得到，各個濃度提取洗脫液的洗脫物，回收溶劑，即得，氯仿：甲醇梯度洗脫提取物，TLC分析結(jié)果見圖2，TLC分析條件：GF254硅膠板，展開系統(tǒng)：氯仿：乙酸乙酯：甲醇（5:1:1），氯仿：乙酸乙酯：甲醇（1:1:1）顯色方法：香草醛-硫酸顯色。

表1

3、抑制丁酰膽堿酯酶活性篩選方法和結(jié)果

1) 實(shí)驗(yàn)條件

a、材料：DMSO(二甲基亞砜) (科密歐公司)；KH₂PO₄、K₂HPO₄·3H₂O(廣東汕頭市西隴化工廠)；BuChE酶(美國Sigma公司)；PNPG(美國Sigma公司)

b、實(shí)驗(yàn)儀器：多功能酶標(biāo)儀Bio-Rad Model 680型(Bio-Rad Laboratories Inc.)

2) 實(shí)驗(yàn)方法和過程

樣品處理：將1 mg待測樣品溶于20 μL二甲基亞砜(DMSO)作為母液，取1 μL母液加入249 μL蒸餾水配成200 μg·mL^-1的溶液。

丁酰膽堿酯酶抑制活性測定方法：

在96孔板上測定樣品的BuchE抑制活性。具體操作如下：在96孔板中依次加入25 μL PBS (100 mM, pH 8.0)，25 μL BuChE (≥0.04 U/mL, pH 8.0 PBS溶解稀釋)，25 μL樣品溶液(200 μg·mL^-1)。加25 μL BuSCH(1.6 mM, pH 8.0 PBS溶解稀釋)及25 μL DTNB(4.0 mM, pH 8.0 PBS溶解稀釋)，37℃孵育60 min后，用酶標(biāo)儀在412 nm下測定其吸光度值。樣品抑制百分率按以下公式計算:

酶活性抑制率% = [A_空白- (A_樣品- A_背景)] / A_空白× 100

式中A_空白：不加樣品反應(yīng)后的吸收值；

A_樣品：加入樣品反應(yīng)后的吸收值；

A_背景：只加樣品的吸收值。

3) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：

本發(fā)明的優(yōu)選方案如下：維吾爾藥生甘草經(jīng)溶劑超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱，先用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:0，體積比）洗脫，繼用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:3，體積比）洗脫，用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:3，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，干燥，即為該丁酰膽堿酯酶抑制活性提取物。該丁酰膽堿酯酶抑制活性提取物從未見文獻(xiàn)報道，其TLC分析表征如圖1。

4、丁酰膽堿酯酶抑制活性有效提取物的提取方法研究

1）提取溶劑的種類研究

分別用甲醇、甲醇、氯仿、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶劑、乙醇水混合溶劑等有機(jī)溶劑提取，并測試提取物的丁酰膽堿酯酶抑制活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

表3

研究結(jié)果表明：提取用有機(jī)溶劑可以為甲醇、氯仿、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶劑、乙醇水混合溶劑。

2）提取溶劑的用量研究

分別用1、2、5、10、20、30、40、50倍（重量/體積比）有機(jī)溶劑提取，并測試提取物的丁酰膽堿酯酶抑制活性，結(jié)果如下：

表4

活性提取物的提取所用有機(jī)溶劑用量為藥材重量的2-50倍（重量/體積比）。

3）干燥方法的研究

分別用真空干燥法、冷凍干燥法、鼓風(fēng)干燥、離心干燥、旋蒸干燥法等方法，對得到的抑制丁酰膽堿酯酶活性提取物進(jìn)行干燥，以含水量、TLC、活性測試為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)真空干燥法、冷凍干燥法、鼓風(fēng)干燥、離心干燥、旋蒸干燥法適用于對丁酰膽堿酯酶抑制活性提取物進(jìn)行干燥，其中，最優(yōu)為真空干燥法、冷凍干燥法。

表5

優(yōu)選地，生甘草丁酰膽堿酯酶抑制活性提取物的制備方法為：

維吾爾藥生甘草經(jīng)溶劑超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱，先用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:0，體積比）洗脫，洗脫2-50倍柱體積，繼用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:3，體積比）洗脫，洗脫2-50倍柱體積，用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:3，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，干燥，即為該活性提取物。以上條件最優(yōu)為先用氯仿：甲醇混合溶劑（氯仿：甲醇，100:0，體積比）洗脫20倍柱體積，繼用氯仿：甲醇混合溶劑（氯仿：甲醇，100:3，體積比）洗脫15倍柱體積。其中，

1) 提取物提取用有機(jī)溶劑可以為甲醇、氯仿、水、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶劑、乙醇水混合溶劑，最優(yōu)條件為甲醇和95%乙醇?；钚蕴崛∥锾崛∮糜袡C(jī)溶劑用量為藥材重量的2-50倍（重量/體積比）。

2) 提取物干燥方法可以為真空干燥法、冷凍干燥法、鼓風(fēng)干燥、離心干燥、旋蒸干燥法等，最優(yōu)為真空干燥法、冷凍干燥法。

5. 生甘草抑制丁酰膽堿酯酶活性提取物（先用100:0的氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，繼用100:3的氯仿-甲醇混合溶劑洗脫得到的提取物）的醫(yī)藥用途研究

按優(yōu)化的生甘草丁酰膽堿酯酶抑制活性提取物制備方法制備的活性提取物，經(jīng)測試，其丁酰膽堿酯酶抑制活性為IC₅₀=29.6 μg/mL。

由于丁酰膽堿酯酶抑制劑具有治療阿爾茨海默病等方面的醫(yī)藥用途。因此，我們發(fā)現(xiàn)的生甘草丁酰膽堿酯酶抑制活性提取物具有廣泛的醫(yī)藥用途。

6、生甘草抑制丁酰膽堿酯酶活性提取物的組合物及其制備方法研究

1）固體分散體

處方

生甘草提取物 20 g

Vc 1 g

聚乙烯吡咯烷酮 79 g

固體分散100g

制備方法：

稱取生甘草提取物和載體聚乙烯吡咯烷酮（PVP）按比例1:2、1:4、1:6的質(zhì)量比分別放入燒杯中，加入適量的無水乙醇和Vc，用磁力攪拌器攪拌至生甘草提取物和載體完全溶解，充分混合均勻后轉(zhuǎn)入旋蒸儀中除去有機(jī)溶劑，干燥，粉碎過80目篩，即得生甘草有效提取物PVP包合物。

2）環(huán)糊精包合物

處方：

生甘草提取物 20 g

Vc 1 g

β-環(huán)糊精 79 g

包合物100g

制備方法：

將β-環(huán)糊精與 1～5 倍水研勻,加生甘草有效提取物( 水難溶性的應(yīng)先溶于少量有機(jī)溶劑中) 繼續(xù)充分研磨至成糊狀物, 低溫干燥即得環(huán)糊精包合物。

3）分散片處方:

生甘草提取物 100

十二烷基硫酸鈉 1

Vc 1

預(yù)膠化淀粉 10

可溶性淀粉 100

交聯(lián)聚維酮 10

微晶纖維素 9

微分硅膠 0.3

滑石粉 1

100片

制備方法：

1. 生甘草有效提取物分散體的制備，精密稱取生甘草提取物、Vc，加入處方量的十二烷基硫酸鈉，用適量的濃度為70%乙醇溶解并加入等比例的可溶性淀粉混合均勻后，在70℃的溫度下蒸干，粉碎，過100目篩；

2. 將第一步中的生甘草有效提取物淀粉分散體與處方量的交聯(lián)聚維酮，預(yù)膠化淀粉，用適量的濃度為70%乙醇做濕潤劑，邊加入邊攪拌，制成濕顆粒過14目篩，室溫下放置15min 后， 60℃烘箱烘干45min，16目篩整粒，加入處方量的滑石粉和微分硅膠，混合均勻后，壓片即得。

7、生甘草抑制丁酰膽堿酯酶活性提取物的檢測方法研究

我們發(fā)現(xiàn)，可以用薄層色譜的方法，很好地檢測和標(biāo)示生甘草丁酰膽堿酯酶抑制活性提取物的特征。見圖1

具體條件為：GF254硅膠板，展開系統(tǒng)：氯仿：乙酸乙酯：甲醇（5:1:1）顯色方法：香草醛-硫酸顯色。

附圖說明：

圖1 生甘草丁酰膽堿酯酶抑制活性提取物的TLC色譜圖；

圖2 生甘草溶劑提取物的TLC色譜圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例表示本發(fā)明的實(shí)用性，本發(fā)明不受此限制。

實(shí)施例 1：

取維吾爾藥生甘草20 g，經(jīng)100 mL甲醇超聲提取15 min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2cm 內(nèi)徑小柱），先用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100: 0，體積比）洗脫，洗脫15倍柱體積，繼用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:3，體積比）洗脫，洗脫25倍柱體積，用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:3，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，真空干燥，即為該活性提取物。經(jīng)測試，其丁酰膽堿酯酶抑制活性為IC₅₀=84.0 μg/mL。

實(shí)施例2：

取維吾爾藥生甘草20 g，經(jīng)100 mL乙醇超聲提取15 min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2.0cm 內(nèi)徑小柱），先用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100: 0，體積比）洗脫，洗脫15倍柱體積，繼用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:3，體積比）洗脫，洗脫25倍柱體積，用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:3，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，冷凍干燥，即為該活性提取物。經(jīng)測試，其丁酰膽堿酯酶抑制活性為IC₅₀=90.0 μg/mL。

實(shí)施例3：

取維吾爾藥生甘草20 g，經(jīng)100 mL石油醚超聲提取15 min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2.0cm 內(nèi)徑小柱），先用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100: 0，體積比）洗脫，洗脫15倍柱體積，繼用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:3，體積比）洗脫，洗脫25倍柱體積，用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:3，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，旋蒸干燥法，即為該活性提取物。經(jīng)測試，其丁酰膽堿酯酶抑制活性為IC₅₀=79.0 μg/mL。

實(shí)施例4：

取維吾爾藥生甘草20 g，經(jīng)100 mL丙酮超聲提取15 min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2.0cm 內(nèi)徑小柱），先用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100: 0，體積比）洗脫，洗脫15倍柱體積，繼用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:3，體積比）洗脫，洗脫25倍柱體積，用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:3，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，鼓風(fēng)干燥，即為該活性提取物。經(jīng)測試，其丁酰膽堿酯酶抑制活性為IC₅₀=84.0 μg/mL。

實(shí)施例5：

取維吾爾藥生甘草20 g，經(jīng)100 mL氯仿超聲提取15 min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2.0cm 內(nèi)徑小柱），先用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100: 0，體積比）洗脫，洗脫15倍柱體積，繼用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:3，體積比）洗脫，洗脫25倍柱體積，用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:3，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，離心干燥，即為該活性提取物。經(jīng)測試，其丁酰膽堿酯酶抑制活性為IC₅₀=80.0 μg/mL。

實(shí)施例6：

取維吾爾藥生甘草20 g，經(jīng)100 mL乙酸乙酯超聲提取15 min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2.0cm 內(nèi)徑小柱），先用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100: 0，體積比）洗脫，洗脫15倍柱體積，繼用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:3，體積比）洗脫，洗脫25倍柱體積，用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:3，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，冷凍干燥，即為該活性提取物。經(jīng)測試，其丁酰膽堿酯酶抑制活性為IC₅₀=76.0 μg/mL。

實(shí)施例7：

取維吾爾藥生甘草20 g，經(jīng)100 mL甲醇水混合溶劑（甲醇：水=1：1）超聲提取15 min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2.0cm 內(nèi)徑小柱），先用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100: 0，體積比）洗脫，洗脫15倍柱體積，繼用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:3，體積比）洗脫，洗脫25倍柱體積，用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:3，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，冷凍干燥，即為該活性提取物。經(jīng)測試，其丁酰膽堿酯酶抑制活性為IC₅₀=88.0 μg/mL。

實(shí)施例8：

取維吾爾藥生甘草20 g，經(jīng)100 mL乙醇水混合溶劑（乙醇：水=1：1）超聲提取15 min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2.0cm 內(nèi)徑小柱），先用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100: 0，體積比）洗脫，洗脫15倍柱體積，繼用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:3，體積比）洗脫，洗脫25倍柱體積，用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:3，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，冷凍干燥，即為該活性提取物。經(jīng)測試，其丁酰膽堿酯酶抑制活性為IC₅₀=70.0 μg/mL。

實(shí)施例9：

取維吾爾藥生甘草20 g，經(jīng)100 mL乙醇-水混合溶劑（乙醇：水=90：10）超聲提取15 min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2.0cm 內(nèi)徑小柱），先用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100: 0，體積比）洗脫，洗脫15倍柱體積，繼用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:3，體積比）洗脫，洗脫25倍柱體積，用氯仿-甲醇混合溶劑（氯仿-甲醇，100:3，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，冷凍干燥，即為該活性提取物。經(jīng)測試，其丁酰膽堿酯酶抑制活性為IC₅₀=75.0 μg/mL。

實(shí)施例 10：固體分散體

稱取生甘草提取物和載體聚乙烯吡咯烷酮（PVP）按比例1:2、1:4、1:6的質(zhì)量比分別放入燒杯中，加入適量的無水乙醇和Vc，用磁力攪拌器攪拌至生甘草提取物和載體完全溶解，充分混合均勻后轉(zhuǎn)入旋蒸儀中除去有機(jī)溶劑，干燥，粉碎過80目篩，即得生甘草有效提取物PVP包合物。

實(shí)施例 11：環(huán)糊精包合物

將β-環(huán)糊精與 1～5 倍水研勻,加生甘草有效提取物( 水難溶性的應(yīng)先溶于少量有機(jī)溶劑中) 繼續(xù)充分研磨至成糊狀物, 低溫干燥即得環(huán)糊精包合物。

實(shí)施例 12：分散片

1. 生甘草有效提取物分散體的制備，精密稱取生甘草提取物、Vc，加入處方量的十二烷基硫酸鈉，用適量的濃度為70%乙醇溶解并加入等比例的可溶性淀粉混合均勻后，在70℃的溫度下蒸干，粉碎，過100目篩；

2. 將第一步中的生甘草有效提取物淀粉分散體與處方量的交聯(lián)聚維酮，預(yù)膠化淀粉，用適量的濃度為70%乙醇做濕潤劑，邊加入邊攪拌，制成濕顆粒過14目篩，室溫下放置15min 后， 60℃烘箱烘干45min，16目篩整粒，加入處方量的滑石粉和微分硅膠，混合均勻后，壓片即得。