本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種山扁豆丁酰膽堿酯酶抑制活性提取物及其組合物的制備方法和其制備預(yù)防及治療阿爾茨海默病(AD)等丁酰膽堿酯酶抑制活性藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

山扁豆(Cassia mimosoides L.)是豆科植物含羞草決明的全株。含羞草決明一年生或多年生亞灌木狀草本，高30-60cm。多分枝，通常被毛。葉互生，偶數(shù)羽狀復(fù)葉，長4-8cm；在葉柄的上端、最下1對小葉的下方有圓盤狀腺體1枚；小葉20-50對；托葉線狀錐形，長4-7mm，有明顯肋脈，宿存；葉片線狀鐮形，長3-4mm，寬約1mm，先端急尖，中脈靠近葉的上緣，兩側(cè)不對稱，干時呈紅褐色。花腋生，單朵或數(shù)朵排成總狀；總花梗頂端有2個苞片，長約3mm；萼長6-8mm，筒短，裂片5，披針形，被黃色疏毛；花黃色，花瓣5片，有等大，具短柄；雄蕊8-10，不等大，5長5短相間而生；子房線形，有毛。莢果鐮形，扁平，長2.5-5cm，寬約4mm，被毛，果柄長1.5-2cm。種子10-16顆?；?、果期8-10月。

山扁豆具有清熱解毒，健脾利濕，通便的功效。在高通量篩選的過程中，本發(fā)明意外地發(fā)現(xiàn)山扁豆具有很好的抑制丁酰膽堿酯酶的活性，該活性提取物及其組合物有望應(yīng)用于治療阿爾茨海默病(AD)等方面的醫(yī)藥用途。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供一種山扁豆提取物。

本發(fā)明還提供了以山扁豆提取物為主要活性成分的組合物。

本發(fā)明同時提供了山扁豆提取物及其組合物的制備和在制備丁酰膽堿酯酶抑制活性藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

維吾爾藥山扁豆經(jīng)水超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠（SiO₂）柱分離，上樣后的硅膠柱，用石油醚-丙酮混合溶劑梯度洗脫（石油醚-丙酮，比例見表1），各石油醚-丙酮比例混合溶劑洗脫液，濃縮，干燥后，利用體外篩選體系測試其丁酰膽堿酯酶抑制活性，意外地發(fā)現(xiàn)先用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:1，體積比）洗脫，繼用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:2，體積比）洗脫得到的石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:2，體積比）洗脫液經(jīng)回收有機溶劑，干燥，即為丁酰膽堿酯酶抑制活性提取物。而其他比例的洗脫部位，沒有丁酰膽堿酯酶抑制活性的作用。優(yōu)選的，先用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:1，體積比）洗脫，繼用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:2，體積比）洗脫得到的石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:2，體積比）洗脫液經(jīng)回收有機溶劑即得。丁酰膽堿酯酶抑制活性的提取物，可以通過以上方法得到富集，從而與其他雜質(zhì)類成分分離開。該山扁豆丁酰膽堿酯酶抑制活性提取物從未見文獻報道，其薄層色譜（TLC）分析結(jié)果見圖1， TLC分析條件：GF254硅膠板，展開系統(tǒng)：二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇（6:1:1）顯色方法：香草醛-硫酸顯色。

具體，發(fā)現(xiàn)過程如下：

1、山扁豆經(jīng)水超聲提取物的制備

取維吾爾藥山扁豆20 g，經(jīng)100 mL水超聲提取15 min，提取液濃縮后，得提取物SN0049B，樣品上柱：1.9991 g，拌樣硅膠3g，空白硅膠10g，石油醚-丙酮系統(tǒng)。

2、石油醚-丙酮混合溶劑梯度洗脫方法和結(jié)果

取維吾爾藥山扁豆20 g，經(jīng)100 mL水超聲提取15 min，提取液濃縮后，得提取物SN0049B，1.9991 g上柱，甲醇溶解，共用甲醇15 mL。上硅膠柱色譜，拌樣硅膠3 g，空白硅膠10g，玻璃柱內(nèi)徑2.0cm，石油醚-丙酮系統(tǒng)梯度洗脫（條件見表1），柱體積22 mL，每個梯度洗脫200mL，得到，各個濃度提取洗脫液的洗脫物，回收溶劑，即得，石油醚：丙酮梯度洗脫提取物，TLC分析結(jié)果見圖2，圖3，TLC分析條件：GF254硅膠板，展開系統(tǒng)：二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇（6:1:1），二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇（1:1:1）顯色方法：香草醛-硫酸顯色。

表1

3、抑制丁酰膽堿酯酶活性篩選方法和結(jié)果

1) 實驗條件

a、材料：DMSO(二甲基亞砜) (科密歐公司)；KH₂PO₄、K₂HPO₄·3H₂O(廣東汕頭市西隴化工廠)；BuChE酶(美國Sigma公司)；PNPG(美國Sigma公司)

b、實驗儀器：多功能酶標儀Bio-Rad Model 680型(Bio-Rad Laboratories Inc.)

2) 實驗方法和過程

樣品處理：將1 mg待測樣品溶于20 μL二甲基亞砜(DMSO)作為母液，取1 μL母液加入249 μL蒸餾水配成200 μg·mL^-1的溶液。

丁酰膽堿酯酶抑制活性測定方法：

在96孔板上測定樣品的BuchE抑制活性。具體操作如下：在96孔板中依次加入25 μL PBS (100 mM, pH 8.0)，25 μL BuChE (≥0.04 U/mL, pH 8.0 PBS溶解稀釋)，25 μL樣品溶液(200 μg·mL^-1)。加25 μL BuSCH(1.6 mM, pH 8.0 PBS溶解稀釋)及25 μL DTNB(4.0 mM, pH 8.0 PBS溶解稀釋)，37℃孵育60 min后，用酶標儀在412 nm下測定其吸光度值。樣品抑制百分率按以下公式計算:

酶活性抑制率% = [A_空白- (A_樣品- A_背景)] / A_空白× 100

式中A_空白：不加樣品反應(yīng)后的吸收值；

A_樣品：加入樣品反應(yīng)后的吸收值；

A_背景：只加樣品的吸收值。

3) 實驗結(jié)果

表2

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：

本發(fā)明的優(yōu)選方案如下：維吾爾藥山扁豆經(jīng)水超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱，先用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:1，體積比）洗脫，繼用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:2，體積比）洗脫，用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:2，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機溶劑，干燥，即為該丁酰膽堿酯酶抑制活性提取物。該丁酰膽堿酯酶抑制活性提取物從未見文獻報道，其TLC分析表征如圖1。

4、丁酰膽堿酯酶抑制活性有效提取物的提取方法研究

1）提取溶劑的種類研究

分別用甲醇、丙酮、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶劑、乙醇水混合溶劑等有機溶劑提取，并測試提取物的丁酰膽堿酯酶抑制活性，實驗結(jié)果如下：

表3

研究結(jié)果表明：提取用有機溶劑可以為甲醇、石油醚、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶劑、乙醇水混合溶劑。

2）提取溶劑的用量研究

分別用1、2、5、10、20、30、40、50倍（重量/體積比）有機溶劑提取，并測試提取物的丁酰膽堿酯酶抑制活性，結(jié)果如下：

表4

活性提取物的提取所用有機溶劑用量為藥材重量的2-50倍（重量/體積比）。

3）干燥方法的研究

分別用真空干燥法、冷凍干燥法、鼓風(fēng)干燥、離心干燥、旋蒸干燥法等方法，對得到的抑制丁酰膽堿酯酶活性提取物進行干燥，以含水量、TLC、活性測試為指標，發(fā)現(xiàn)真空干燥法、冷凍干燥法、鼓風(fēng)干燥、離心干燥、旋蒸干燥法適用于對丁酰膽堿酯酶抑制活性提取物進行干燥，其中，最優(yōu)為真空干燥法、冷凍干燥法。

表5

因此，山扁豆丁酰膽堿酯酶抑制活性提取物的制備方法為：

維吾爾藥山扁豆經(jīng)有機溶劑超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱，先用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:1，體積比）洗脫，洗脫2-50倍柱體積，繼用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:2，體積比）洗脫，洗脫2-50倍柱體積，用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:2，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機溶劑，干燥，即為該活性提取物。以上條件最優(yōu)為先用石油醚：丙酮混合溶劑（石油醚：丙酮，100:1，體積比）洗脫20倍柱體積，繼用石油醚：丙酮混合溶劑（石油醚：丙酮，100:2，體積比）洗脫15倍柱體積。其中，

1) 提取物提取用有機溶劑可以為甲醇、石油醚、水、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶劑、乙醇水混合溶劑，最優(yōu)條件為甲醇和95%乙醇?；钚蕴崛∥锾崛∮糜袡C溶劑用量為藥材重量的2-50倍（重量/體積比）。

2) 提取物干燥方法可以為真空干燥法、冷凍干燥法、鼓風(fēng)干燥、離心干燥、旋蒸干燥法等，最優(yōu)為真空干燥法、冷凍干燥法。

5. 山扁豆抑制丁酰膽堿酯酶活性提取物（先用100:1的石油醚-丙酮混合溶劑洗脫，繼用100:2的石油醚-丙酮混合溶劑洗脫得到的提取物）的醫(yī)藥用途研究

按優(yōu)化的山扁豆丁酰膽堿酯酶抑制活性提取物制備方法制備的活性提取物，經(jīng)測試，其丁酰膽堿酯酶抑制活性為IC₅₀=22.4 μg/mL。

由于丁酰膽堿酯酶抑制劑具有治療阿爾茨海默病等方面的醫(yī)藥用途。因此，我們發(fā)現(xiàn)的山扁豆丁酰膽堿酯酶抑制活性提取物具有廣泛的醫(yī)藥用途。

6、山扁豆抑制丁酰膽堿酯酶活性提取物的組合物及其制備方法研究

1）固體分散體

處方

山扁豆提取物 20 g

Vc 1 g

聚乙烯吡咯烷酮 79 g

固體分散100g

制備方法：

稱取山扁豆提取物和載體聚乙烯吡咯烷酮（PVP）按比例1:2、1:4、1:6的質(zhì)量比分別放入燒杯中，加入適量的無水乙醇和Vc，用磁力攪拌器攪拌至山扁豆提取物和載體完全溶解，充分混合均勻后轉(zhuǎn)入旋蒸儀中除去有機溶劑，干燥，粉碎過80目篩，即得山扁豆有效提取物PVP包合物。

2）環(huán)糊精包合物

處方：

山扁豆提取物 20 g

Vc 1 g

β-環(huán)糊精 79 g

包合物100g

制備方法：

將β-環(huán)糊精與 1～5 倍水研勻,加山扁豆有效提取物( 水難溶性的應(yīng)先溶于少量有機溶劑中) 繼續(xù)充分研磨至成糊狀物, 低溫干燥即得環(huán)糊精包合物。

3）分散片處方:

山扁豆提取物 100

十二烷基硫酸鈉 1

Vc 1

預(yù)膠化淀粉 10

可溶性淀粉 100

交聯(lián)聚維酮 10

微晶纖維素 9

微分硅膠 0.3

滑石粉 1

100片

制備方法：

1. 山扁豆有效提取物分散體的制備，精密稱取山扁豆提取物、Vc，加入處方量的十二烷基硫酸鈉，用適量的濃度為70%乙醇溶解并加入等比例的可溶性淀粉混合均勻后，在70℃的溫度下蒸干，粉碎，過100目篩；

2. 將第一步中的山扁豆有效提取物淀粉分散體與處方量的交聯(lián)聚維酮，預(yù)膠化淀粉，用適量的濃度為70%乙醇做濕潤劑，邊加入邊攪拌，制成濕顆粒過14目篩，室溫下放置15min 后， 60℃烘箱烘干45min，16目篩整粒，加入處方量的滑石粉和微分硅膠，混合均勻后，壓片即得。

7、山扁豆抑制丁酰膽堿酯酶活性提取物的檢測方法研究

我們發(fā)現(xiàn)，可以用薄層色譜的方法，很好地檢測和標示山扁豆丁酰膽堿酯酶抑制活性提取物的特征。見圖1

具體條件為：GF254硅膠板，展開系統(tǒng)：二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇（6:1:1）顯色方法：香草醛-硫酸顯色。

附圖說明：

圖1 山扁豆丁酰膽堿酯酶抑制活性提取物的TLC色譜圖；

圖2山扁豆溶劑提取物的TLC色譜圖；

圖3山扁豆溶劑提取物的TLC色譜圖。

具體實施方式

以下實施例表示本發(fā)明的實用性，本發(fā)明不受此限制。

實施例 1：

取維吾爾藥山扁豆20 g，經(jīng)100 mL甲醇超聲提取15 min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2.0cm 內(nèi)徑小柱），先用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:1，體積比）洗脫，洗脫15倍柱體積，繼用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:2，體積比）洗脫，洗脫25倍柱體積，用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:2，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機溶劑，真空干燥，即為該活性提取物。經(jīng)測試，其丁酰膽堿酯酶抑制活性為IC₅₀=85.0 μg/mL。

實施例2：

取維吾爾藥山扁豆20 g，經(jīng)100 mL乙醇超聲提取15 min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2.0cm 內(nèi)徑小柱），先用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:1，體積比）洗脫，洗脫15倍柱體積，繼用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:2，體積比）洗脫，洗脫25倍柱體積，用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:2，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機溶劑，冷凍干燥，即為該活性提取物。經(jīng)測試，其丁酰膽堿酯酶抑制活性為IC₅₀=88.0 μg/mL。

實施例3：

取維吾爾藥山扁豆20 g，經(jīng)100 mL石油醚超聲提取15 min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2.0cm 內(nèi)徑小柱），先用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:1，體積比）洗脫，洗脫15倍柱體積，繼用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:2，體積比）洗脫，洗脫25倍柱體積，用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:2，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機溶劑，旋蒸干燥法，即為該活性提取物。經(jīng)測試，其丁酰膽堿酯酶抑制活性為IC₅₀=78.0 μg/mL。

實施例4：

取維吾爾藥山扁豆20 g，經(jīng)100 mL丙酮超聲提取15 min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2.0cm 內(nèi)徑小柱），先用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:1，體積比）洗脫，洗脫15倍柱體積，繼用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:2，體積比）洗脫，洗脫25倍柱體積，用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:2，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機溶劑，鼓風(fēng)干燥，即為該活性提取物。經(jīng)測試，其丁酰膽堿酯酶抑制活性為IC₅₀=83.0 μg/mL。

實施例5：

取維吾爾藥山扁豆20 g，經(jīng)100 mL氯仿超聲提取15 min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2.0cm 內(nèi)徑小柱），先用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:1，體積比）洗脫，洗脫15倍柱體積，繼用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:2，體積比）洗脫，洗脫25倍柱體積，用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:2，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機溶劑，離心干燥，即為該活性提取物。經(jīng)測試，其丁酰膽堿酯酶抑制活性為IC₅₀=80.0 μg/mL。

實施例6：

取維吾爾藥山扁豆20 g，經(jīng)100 mL乙酸乙酯超聲提取15 min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2.0cm 內(nèi)徑小柱），先用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:1，體積比）洗脫，洗脫15倍柱體積，繼用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:2，體積比）洗脫，洗脫25倍柱體積，用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:2，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機溶劑，冷凍干燥，即為該活性提取物。經(jīng)測試，其丁酰膽堿酯酶抑制活性為IC₅₀=75.0 μg/mL。

實施例7：

取維吾爾藥山扁豆20 g，經(jīng)100 mL甲醇水混合溶劑（甲醇：水=1：1）超聲提取15 min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2.0cm 內(nèi)徑小柱），先用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:1，體積比）洗脫，洗脫15倍柱體積，繼用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:2，體積比）洗脫，洗脫25倍柱體積，用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:2，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機溶劑，冷凍干燥，即為該活性提取物。經(jīng)測試，其丁酰膽堿酯酶抑制活性為IC₅₀=88.0 μg/mL。

實施例8：

取維吾爾藥山扁豆20 g，經(jīng)100 mL乙醇水混合溶劑（乙醇：水=1：1）超聲提取15 min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2.0cm 內(nèi)徑小柱），先用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:1，體積比）洗脫，洗脫15倍柱體積，繼用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:2，體積比）洗脫，洗脫25倍柱體積，用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:2，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機溶劑，冷凍干燥，即為該活性提取物。經(jīng)測試，其丁酰膽堿酯酶抑制活性為IC₅₀=66.0 μg/mL。

實施例9：

取維吾爾藥山扁豆20 g，經(jīng)100 mL乙醇-水混合溶劑（乙醇：水=90：10）超聲提取15 min，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅膠柱（2.0cm 內(nèi)徑小柱），先用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:1，體積比）洗脫，洗脫15倍柱體積，繼用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:2，體積比）洗脫，洗脫25倍柱體積，用石油醚-丙酮混合溶劑（石油醚-丙酮，100:2，體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機溶劑，冷凍干燥，即為該活性提取物。經(jīng)測試，其丁酰膽堿酯酶抑制活性為IC₅₀=73.0 μg/mL。

實施例 10：固體分散體

稱取山扁豆提取物和載體聚乙烯吡咯烷酮（PVP）按比例1:2、1:4、1:6的質(zhì)量比分別放入燒杯中，加入適量的無水乙醇和Vc，用磁力攪拌器攪拌至山扁豆提取物和載體完全溶解，充分混合均勻后轉(zhuǎn)入旋蒸儀中除去有機溶劑，干燥，粉碎過80目篩，即得山扁豆有效提取物PVP包合物。

實施例 11：環(huán)糊精包合物

將β-環(huán)糊精與 1～5 倍水研勻,加山扁豆有效提取物( 水難溶性的應(yīng)先溶于少量有機溶劑中) 繼續(xù)充分研磨至成糊狀物, 低溫干燥即得環(huán)糊精包合物。

實施例 12：分散片

1. 山扁豆有效提取物分散體的制備，精密稱取山扁豆提取物、Vc，加入處方量的十二烷基硫酸鈉，用適量的濃度為70%乙醇溶解并加入等比例的可溶性淀粉混合均勻后，在70℃的溫度下蒸干，粉碎，過100目篩；

2. 將第一步中的山扁豆有效提取物淀粉分散體與處方量的交聯(lián)聚維酮，預(yù)膠化淀粉，用適量的濃度為70%乙醇做濕潤劑，邊加入邊攪拌，制成濕顆粒過14目篩，室溫下放置15min 后， 60℃烘箱烘干45min，16目篩整粒，加入處方量的滑石粉和微分硅膠，混合均勻后，壓片即得。