本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及中藥有效成分淫羊藿苷的新的藥用用途，具體涉及淫羊藿苷在制備治療皮炎藥物中的用途。

背景技術(shù)：

現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了皮炎是一種常見(jiàn)皮膚病，包括夏季皮炎、脂溢性皮炎、日光性皮炎、藥物性皮炎、接觸性皮炎、激素依賴(lài)性皮炎、神經(jīng)性皮炎等，其臨床表現(xiàn)為，可出現(xiàn)皮膚紅腫、瘙癢、脫皮、變厚等現(xiàn)象。

從天然藥物中篩選活性成分是一直是抗皮炎藥物研發(fā)的熱點(diǎn)領(lǐng)域。

淫羊藿苷存在于淫羊藿藥材中，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

有研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷可以抑制皮膚黑素生成，用于皮膚增白。然而目前關(guān)于淫羊藿苷在抗皮炎方面的用途未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供中藥有效成分淫羊藿苷的新的藥用用途，具體涉及淫羊藿苷在制備治療皮炎藥物中的用途。

本發(fā)明是基于以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。

采用TNF-α/IFN-γ刺激皮膚角質(zhì)細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞)作為皮炎體外模型，并給予淫羊藿苷干預(yù)，結(jié)果顯示：1.淫羊藿苷可有效抑制TNF-α/IFN-γ誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞炎癥因子(IL-6、IL-1β和IL-8)水平的升高。2.淫羊藿苷抗皮炎 的作用與抑制磷酸化p38、磷酸化ERK的表達(dá)有關(guān)。3.淫羊藿苷拮抗皮膚炎癥的作用還與增加皮膚角質(zhì)細(xì)胞分泌皮質(zhì)醇有關(guān)。所述的淫羊藿苷可制備治療皮炎的藥物。

附圖說(shuō)明

圖1為0.5、1h、2h、4h淫羊藿苷細(xì)胞活力試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果，其中，淫羊藿苷濃度從5μM至150μM，均未發(fā)現(xiàn)對(duì)HaCaT細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。

圖2-1顯示了淫羊藿苷各濃度對(duì)HaCaT細(xì)胞分泌IL-6的抑制作用，其中，TNF-α/IFN-γ20ng/mL刺激HaCaT細(xì)胞24h后，細(xì)胞上清IL-6濃度較正常組明顯升高，各濃度淫羊藿苷干預(yù)后，細(xì)胞上清中IL-6均降低，其中淫羊藿苷高劑量組與氫化可的松陽(yáng)性對(duì)照組IL-6顯著降低，#p<0.05vs正常組；*p<0.05vs TNF-α+IFN-γ組，ME，正常組；T，TNF-α；I,IFN-γ；ICA,淫羊藿苷；HC,氫化可的松。

圖2-2、2-3顯示了淫羊藿苷中、高劑量可明顯抑制TNF-α/IFN-γ(20ng/mL)誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞分泌IL-1β(p<0.05)、IL-8(p<0.05)，抗炎療效顯著；其中，圖2-2.是淫羊藿苷各濃度對(duì)HaCaT細(xì)胞分泌IL-1β的抑制作用，其中，#p<0.05vs正常組；*p<0.05vs TNF-α/IFN-γ組。ME，正常組；T，TNF-α；I,IFN-γ；ICA,淫羊藿苷；HC,氫化可的松；圖2-3是淫羊藿苷各濃度對(duì)HaCaT細(xì)胞分泌IL-8的抑制作用，其中，#p<0.05vs正常組；*p<0.05vs TNF-α/IFN-γ組，ME，正常組；T，TNF-α；I,IFN-γ；ICA,淫羊藿苷；HC,氫化可的松。

圖3是淫羊藿苷對(duì)MAPKs信號(hào)通路的影響，其中，ICA,Icariin；T，腫瘤壞死因子-α；I，干擾素γ；ME，正常組，#p<0.05vs正常組；*p<0.05vs TNF-α/IFN-γ組。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：淫羊藿苷抗皮炎的體外試驗(yàn)

一、材料與方法

1.細(xì)胞株：人角質(zhì)細(xì)胞株(HacaT)用含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％CO₂、完全飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，48h更換培養(yǎng)基，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)飽合狀態(tài)時(shí)，用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化傳代，2～3d傳代1次，實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

2.淫羊藿苷細(xì)胞毒性的檢測(cè)：

調(diào)整HacaT細(xì)胞株細(xì)胞懸液濃度為1×10⁵/mL，加入96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100μL，置37℃5％CO₂孵箱培養(yǎng)24h。吸除舊培養(yǎng)基，分別加入含淫羊藿苷的DMEM培養(yǎng)基(藥物濃度為5μM，10μM，30μM，50μM，70μM，100μM，150μM)，并設(shè)空白對(duì)照組和調(diào)零組，每組均設(shè)3復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h。加入10μL WST-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)0.5h、1h、2h、4h。在450nm處檢測(cè)各孔的吸光值。細(xì)胞增殖抑制率＝〔1-(加藥組OD平均值-調(diào)零孔OD平均值)/(空白對(duì)照組OD平均值-調(diào)零孔OD平均值)〕×100％。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍以上。

3.ELISA法檢測(cè)HacaT細(xì)胞IL-6、IL-8、IL-1β水平

調(diào)整HacaT細(xì)胞株細(xì)胞懸液濃度為1×10⁵/mL，加入48孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔400μL，置37℃5％CO2孵箱培養(yǎng)24h。吸除舊培養(yǎng)基，換成無(wú)血清培養(yǎng)基，并按以下分組方式給予刺激和干預(yù)：空白對(duì)照組、單純TNF-α+IFN-γ組(各20ng/ml)、TNF-α+IFN-γ+淫羊藿苷低、中、高劑量組(1、10、100μM)、、TNF-α+IFN-γ+氫化可的松組(0.01μM)、單純淫羊藿苷(100μM)組。繼續(xù)培養(yǎng)24h，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液。采用ELISA法，按照試劑盒說(shuō)明，檢測(cè)上清液IL-6、IL-8和IL-1β的含量。

4.ELISA法檢測(cè)HacaT細(xì)胞皮質(zhì)醇水平

細(xì)胞處理及分組同上，采用ELISA法，按照試劑盒說(shuō)明，檢測(cè)上清液皮質(zhì)醇的含量。

5.HacaT細(xì)胞MAPK通路的檢測(cè)

調(diào)整HacaT細(xì)胞懸液濃度為1×10⁶/mL，將細(xì)胞接種于6孔板，每孔1ml。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)融合狀態(tài)后，吸棄原培養(yǎng)基，更換無(wú)血清培養(yǎng)基。并按以下分組方式給予刺激和干預(yù)：空白對(duì)照組、單純TNF-α+IFN-γ組(各20ng/ml)、TNF-α+IFN-γ+淫羊藿苷100μM組。TNF-α+IFN-γ刺激30min和60min后收集細(xì)胞，抽提蛋白，定量后行SDS-PAGE電泳分離，待電泳完畢后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，在室溫下封閉，加入p-p38,p38,p-JNK,p-ERK,ERK和β-actin一抗,4℃過(guò)夜，加入HRP標(biāo)記二抗,室溫反應(yīng)1h,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色,X線(xiàn)底片曝光顯影。

二、結(jié)果顯示：

淫羊藿苷細(xì)胞毒性試驗(yàn)：CCK-8法測(cè)定淫羊藿苷對(duì)HaCaT細(xì)胞的細(xì)胞毒性，各時(shí)間段測(cè)試結(jié)果顯示從5μM至150μM濃度淫羊藿苷均為發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性，各 濃度淫羊藿苷均有輕度促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用(如圖1所示)；

淫羊藿苷對(duì)TNF-α/IFN-γ誘導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌的抑制作用，如圖2-1所示，TNF-α/IFN-γ20ng/mL刺激HaCaT細(xì)胞24h后，細(xì)胞上清IL-6濃度較正常組明顯升高，各濃度淫羊藿苷干預(yù)后，細(xì)胞上清中IL-6均降低，其中淫羊藿苷高劑量組與氫化可的松陽(yáng)性對(duì)照組IL-6顯著降低，p<0.05。如圖2-2、2-3所示淫羊藿苷中、高劑量可明顯抑制TNF-α/IFN-γ(20ng/mL)誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞分泌IL-1β(p<0.05)、IL-8(p<0.05)，抗炎療效顯著；

淫羊藿苷抑制HaCaT細(xì)胞P38MAPK、ERK的磷酸化反應(yīng)：為明確淫羊藿苷直接抗炎作用是否與MAPKs信號(hào)通路有關(guān)，本實(shí)施例采用western blot方法檢測(cè)MAPKs三條主要的信號(hào)通路在藥物干預(yù)前后的變化，在參照文獻(xiàn)基礎(chǔ)上,選擇了2個(gè)時(shí)間點(diǎn)(30min、60min),結(jié)果如(圖3)所示，TNF-α/IFN-γ(均為20ng/mL)30分鐘即可明顯誘導(dǎo)p38、ERK磷酸化反應(yīng)，淫羊藿苷100μM在30min、60min均可明顯抑制p38、ERK的磷酸化反應(yīng)(P<0.05)；然而TNF-α/IFN-γ刺激對(duì)于JNK通路在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯的激活作用。