本發(fā)明涉及藥用提取物，具體涉及白肉靈芝提取物用于神經(jīng)保護方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
靈芝(Ganodermalucidum(Leyss.exFr.)Karst.)隸屬于真菌門(Eumycota)、擔子菌亞門(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、靈芝科(Gamodermataceae)、靈芝屬(Ganoderma)類?！吨腥A本草》中記錄“其性甘；味平；無毒；歸肺、心、脾、腎經(jīng)。益氣血；安心神；健脾胃。主治虛勞、心悸、失眠、頭暈、神疲乏力、久咳氣喘、冠心病、矽肺、腫瘤?！薄吨袊幍洹分袑㈧`芝收錄為中藥材，其中的靈芝多糖、三萜、核苷、生物堿、氨基酸多肽、微量元素等成分是其藥效物質(zhì)的主要基礎(chǔ)，以三萜和多糖為其中主要活性成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，靈芝三萜類化合物具有保肝、抗腫瘤、抗HIV-4及HIV-4蛋白酶活性、抗組織胺釋放、抑制血管緊張素、抗氧化等作用。靈芝分類歷史悠久，歸類各有不同，《本草綱目》等古籍中以“六色”將靈芝歸為：青芝、赤芝、黃芝、白芝、黑芝、紫芝。近日廣東省微生物研究所李泰輝等人在真菌學(xué)雜志《Mycoscience,http://dx.doi.org/10.1016/j.myc.2014.03.005》發(fā)表文章宣布他們在西藏林芝地區(qū)發(fā)現(xiàn)了一個靈芝新種——白肉靈芝Ganodermaleucocontextum(LiTH,HuHP,DengWQ,etal.Ganodermaleucocontextum,anewmemberoftheG.lucidumcomplexfromsouthwesternChina；Mycoscience,2015,56(1)：81-85)。中國西藏新聞網(wǎng)2014年8月報道西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院研究人員白肉靈芝人工栽培獲得成功。針對白肉靈芝的食用及藥用價值急需進行系統(tǒng)研究和開發(fā)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明以白肉靈芝Ganodermaleucocontextum為研究對象，對其提取物進行了化學(xué)和生物活性研究，發(fā)現(xiàn)白肉靈芝提取物具有很好的神經(jīng)保護作用，具有很好的藥用和食用價值。為此，本發(fā)明的第一方面，提供白肉靈芝提取物在制備用于神經(jīng)保護的藥物中的應(yīng)用，所述提取物中含有式1和式2所示的化合物的組合，本發(fā)明的白肉靈芝Ganodermaleucocontextum提取物是按照如下的方法制備，所述方法包括如下步驟：用提取溶劑提取白肉靈芝的子實體至少一次；和去除溶劑以獲得所述提取物。所述提取溶劑可選自水、C1～C4烷基醇、甲酸C1～C3烷基酯、乙酸C1～C3烷基酯、鹵代C1～C3烷烴、R1C(O)R2中的一種，或者兩種或更多種的混合溶劑，其中R1和R2各自獨立地為C1～C3烷基。所述提取溶劑優(yōu)選選自水、甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、甲酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、丙酮、丁酮、戊酮中的一種或多種。特別優(yōu)選所述提取溶劑為20～98％(v/v)的乙醇水溶液，更優(yōu)選40～98％(v/v)、最優(yōu)選70～95％(v/v)的乙醇水溶液。白肉靈芝的子實體與所述提取溶劑的重量體積比(g:ml或kg:L)為1:3～10；優(yōu)選為1:2～5；最優(yōu)選為1:3。為提高提取效果，優(yōu)選事先將白肉靈芝的子實體碎化。所述提取方法可以是任何適宜的方法，例如但不限于浸漬提取、超聲提取、加熱回流提取等。提取溫度為室溫～105℃，優(yōu)選20～50℃。本文中所說室溫通常指18～30℃。根據(jù)一種實施方式，提取可進行1～5次，優(yōu)選提取2～4次，最優(yōu)選為3次。提取時間為每次15min～2小時，優(yōu)選為30～70min。優(yōu)選地，所述提取溶劑可回收再利用。去除或回收提取溶劑的方法可根據(jù)不同溶劑靈活選取。例如可以進行蒸餾或減壓蒸餾等。根據(jù)本發(fā)明的另一種實施方式，所述方法進一步包括以下步驟：將所獲得的提取物分散于水中，用弱極性有機溶劑萃取以除去脂溶性雜質(zhì)；用萃取劑萃取水相；和取萃取劑層并去除萃取劑。所述萃取劑可選自乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷和正丁醇中的一種，優(yōu)選乙酸乙酯。用于除去脂溶性雜質(zhì)的弱極性有機溶劑可以是常用用萃取分離有機物的那些非極性溶劑。例如可選自C5～C12的烷烴、C5～C8的環(huán)烷烴、鹵代C1～C3烷烴、石油醚中的一種或多種。根據(jù)一種實施方式，所述有非極性機溶劑可選自正己烷、正庚烷、正辛烷、環(huán)己烷、氯仿、二氯乙烷、沸點60～90℃的石油醚中的一種或多種。優(yōu)選使用所述石油醚和/或環(huán)己烷?？捎盟鋈鯓O性有機溶劑進行多次萃取以盡量除去脂溶性雜質(zhì)。例如可萃取2～5次。用萃取劑的萃取也同樣可進行多次。例如可為2～5次。所述弱極性有機溶劑以及所述萃取劑的用量分別為每次為水相體積的50～200％；優(yōu)選用與水相等體積的弱極性有機溶劑(或萃取劑)進行萃取。根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，所述提取溶劑為水、或選自C1～C4烷基醇、甲酸C1～C3烷基酯、乙酸C1～C3烷基酯中的一種或多種溶劑的40％(v/v)以下(例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％(v/v))的水溶液，所述方法進一步包括以下步驟：將所獲得的提取物分散于水中，用萃取劑萃取所獲得的提取液；和取萃取劑層并去除萃取劑，所述萃取劑可為選自乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷和正丁醇中的一種，優(yōu)選乙酸乙酯。同樣的，用萃取劑的萃取可進行多次。例如可為2～5次。所述萃取劑的用量分別為每次為水相體積的50～200％；優(yōu)選用與水相等體積的萃取劑進行萃取。該實施方式可獲得水溶性更好的提取物，以便制備水溶劑或茶飲等產(chǎn)品。所述神經(jīng)保護可以是選自如下的至少一種：預(yù)防和/或治療神經(jīng)退行性疾病、抗疲勞、鎮(zhèn)靜、催眠和健腦益智，但不限于此。其中所述神經(jīng)退行性疾病是指阿爾茨海默癥、帕金森癥、早老性癡呆和老年性癡呆等疾病。所述鎮(zhèn)靜是指可預(yù)防和/或治療神經(jīng)衰弱、狂躁和抑郁等疾病。所述健腦益智是指提高記憶力、提高智力等。本發(fā)明的第二方面提供含有上述白肉靈芝提取物的可食用的產(chǎn)品用于神經(jīng)保護的用途。其中白肉靈芝提取物中含有下式1和式2所示的化合物的組合。所述神經(jīng)保護作用是指預(yù)防和/或輔助治療神經(jīng)退行性疾病、抗疲勞、鎮(zhèn)靜、催眠和健腦益智等。所述神經(jīng)退行性疾病例如阿爾茨海默癥、帕金森癥、早老性癡呆和老年性癡呆等，所述鎮(zhèn)靜是指可預(yù)防和/或治療神經(jīng)衰弱、狂躁和抑郁等。所述健腦益智是指提高記憶力、提高智力等。所述可食用的產(chǎn)品具體形式可為口服液、茶飲、含片、膠囊、飲品、泡騰片等等。本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)，白肉靈芝可采用任何常規(guī)的溶劑，包括水進行提取，提取方法簡單，提取物可溶于水。提取物中含有較大量的三萜類化合物，并對阿爾茨海默癥、鎮(zhèn)靜催眠、抗衰益智、抗疲勞等神經(jīng)保護方面有顯著效果。因此，白肉靈芝的提取物具有廣闊的藥用和食用的應(yīng)用前景。附圖說明圖1為用不同有機溶劑提取白肉靈芝粗提物的HPLC指紋圖譜；和圖2為根據(jù)本發(fā)明一種實施方式獲得的白肉靈芝提取物的HPLC圖譜。具體實施方式參照附圖及以下詳細描述的優(yōu)選實施方式和具體實施例，更加詳細地說明本發(fā)明的各個方面和上述的及其他的優(yōu)點。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，下面描述的這些內(nèi)容是為了更好地理解本發(fā)明，本發(fā)明的范圍并不受限于此。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。白肉靈芝由西藏自治區(qū)農(nóng)科院蔬菜研究所提供。實施例1白肉靈芝乙醇提取物的制備將白肉靈芝子實體剪碎，稱重5000克。用15L體積百分含量95％乙醇的水溶液回流提取3次，每次1小時。合并提取液，減壓濃縮干燥得到170克提取物，將提取物記作GL-1。進一步將提取物用蒸餾水600ml溶解，用等體積的正己烷萃取三次，棄去有機相。再用等體積乙酸乙酯萃取水相三次，棄去水相，合并乙酸乙酯萃取液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干乙酸乙酯獲得浸膏54g，記作GL-1E。實施例2純化及鑒定實施例1GL-1E提取物中的主要化合物取40g實施例1制備的提取物GL-1E，通過硅膠柱色譜分離，以正己烷:乙酸乙酯體系和二氯甲烷:甲醇體系依次進行梯度洗脫，每個梯度洗3個保留體積，每個體積500ml。在二氯甲烷:甲醇(體積比為100:1)中得到餾分19，命名為GL-E19。GL-E19(10.5g)利用ODS反相硅膠柱分離，用體積百分含量為10％～100％甲醇的水溶液依次進行洗脫，每個洗脫體系3個保留體積，每個保留體積為500ml，每300ml收集一個餾分。體積百分含量為40％的甲醇水溶液系統(tǒng)的第三個餾分和體積百分含量為50％的甲醇水溶液系統(tǒng)的第三個餾分，分別命名為GL-E19-23和GL-E19-27。對GL-E19-23以體積百分含量40％乙腈的酸水(此處的酸水為體積百分含量為0.01％三氟乙酸的水溶液)溶液為洗脫劑進行HPLC制備，流速為2ml/min，收集28min的色譜峰，得到化合物1。對GL-E19-27以體積百分含量42％乙腈酸水(此處的酸水為體積百分含量為0.01％三氟乙酸的水溶液)溶液為洗脫劑進行HPLC制備，流速為2ml/min，收集25.2min的色譜峰得到化合物2。上述HPLC色譜條件如下：以色譜純的甲醇將樣品配制為10mg/ml的溶液，上樣量為15ul每次，色譜柱為Kromasil10×250mmC18半制備柱，柱溫為25℃，210nm波長進行檢測?；衔?和化合物2通過鑒定，結(jié)構(gòu)式如下式1、式2所示，數(shù)據(jù)歸屬見表1和2。表1化合物1和化合物2的13CNMR數(shù)據(jù)(125MHz，CDCl3)Carbon化合物1化合物2Carbon化合物1化合物2134.934.21919.118.6234.534.32031.935.73219.1211.82120.918.5450.351.62226.525.8549.550.52333.134.5627.039.524143.8144.5765.6198.725127.6127.58157147.026172.2173.09140.9149.92712.112.21037.539.52822.022.511192.4199.62965.565.81279.744.13024.521.61360.557.31'170.4171.61449.749.12'20.744.815216.7208.03'69.91637.737.14'44.71746.145.35'175.21813.616.26'27.3表2化合物1和化合物2的1HNMR數(shù)據(jù)(JinHz,500MHz，CDCl3)實施例3提取物GL-1的指紋圖譜檢測高效液相化學(xué)指紋圖譜分析條件如下：使用Agilent1200高效液相色譜儀，四元梯度泵，DAD檢測器，Agilent色譜工作站。色譜柱YMCC8分析柱(4.6mm×150mm，5μm)，流動相為乙腈-體積百分含量0.04％的三氟乙酸的水溶液，溫度室溫(20～30℃)的條件下進行梯度洗脫(洗脫程序以及各成分的體積百分含量如下所示)，流速1.00mL/min。將粗提物G1用乙腈溶解，配成10mg/mL的溶液，進樣量10μl，紫外檢測波長為210nm。梯度洗脫步驟如下表3：表3按照上述洗脫條件得到提取物GL-1的色譜圖如圖1所示，并對實施例2分離得到的2個化合物進行指認，這兩個化合物的峰面積占總峰面積的10.82％。實施例4用甲醇提取白肉靈芝將所述白肉靈芝子實體剪碎，按照子實體:甲醇＝1g:3ml的量加入甲醇，浸泡超聲提取3次，每次30分鐘，將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干獲得浸膏，得到提取物GL-2。甲醇純度為分析純，購自北京化學(xué)試劑公司。將GL-2進行高效液相色譜檢測，分析條件同實施例3所述。如圖1所示，1和2標示的峰與從GL-1E中分離得到的2個化合物一致，這兩個化合物的峰面積占總峰面積的6.58％。實施例5:用乙酸乙酯提取白肉靈芝將所述白肉靈芝子實體剪碎，按照子實體:乙酸乙酯＝1g:3ml的量加入乙酸乙酯，浸泡超聲提取3次，每次30分鐘，將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干獲得浸膏，即提取物GL-3。乙酸乙酯純度為分析純，購自北京化學(xué)試劑公司。將GL-3進行高效液相色譜檢測，分析條件同實施例3所述。如圖1所示，1和2標示的峰與從GL-1E中分離得到的2個化合物一致，這兩個化合物的峰面積占總峰面積的8.45％。實施例6:用二氯甲烷提取白肉靈芝將所述白肉靈芝子實體剪碎，按照子實體:二氯甲烷＝1g:3ml的量加入二氯甲烷，浸泡超聲提取3次，每次30分鐘，將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干獲得浸膏，得到粗提物GL-4。所述二氯甲烷純度為分析純，購自北京化學(xué)試劑公司。將GL-4進行高效液相色譜檢測，分析條件同實施例3所述。如圖1所示，1和2標示的峰與從GL-1E中分離得到的2個化合物一致，這兩個化合物的峰面積占總峰面積的12.38％。實施例7:用丙酮提取白肉靈芝將所述白肉靈芝子實體剪碎，按照子實體:丙酮＝1g:3ml的量加入丙酮，浸泡超聲提取3次，每次30分鐘，將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干獲得浸膏，得到提取物GL-5。所述丙酮純度為分析純，購自北京化學(xué)試劑公司。將GL-5進行高效液相色譜檢測，分析條件同實施例3所述。如圖1所示，1-2標示的峰與從GL-1E中分離得到的2個化合物一致，這兩個化合物的峰面積占總峰面積的6.31％。實施例8:用水提取白肉靈芝將所述白肉靈芝子實體剪碎，按照子實體:水＝1g:3ml的量加入去離子水，浸泡超聲提取3次，每次30分鐘，將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干獲得浸膏，得到提取物GL-6。將GL-6提取物浸膏用適量蒸餾水混懸，然后用等量乙酸乙酯萃取三次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶液獲得水提物的乙酸乙酯浸膏GL-6E。所述水為去離子水。將GL-6E進行高效液相色譜檢測，分析條件同實施例3所述。如圖2所示，1-2標示的峰與從GL-1E中分離得到的2個化合物一致，這兩個化合物的峰面積占總峰面積的12.24％。實施例9白肉靈芝提取物對退行性疾病的作用(一)白肉靈芝提取物能夠抑制H2O2對神經(jīng)細胞株P(guān)C12的毒性兩種常見的退行性疾病帕金森和阿爾茨海默病，其病理過程中的氧化應(yīng)激被認為是其中的主要因素之一。材料：被測樣品溶液為實施例1和實施例4～8所述的8個提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。準確稱取各樣品，用DMSO(二甲亞砜)配制成50mg/ml溶液(制備時溶于少量DMSO后，再用蒸餾水稀釋至相應(yīng)濃度，控制DMSO的最終體積百分含量<1％)，用DMEM培養(yǎng)基進行2倍梯度稀釋，共8個濃度，供活性測試。DMEM、胎牛血清和馬血清購自Gibco公司。PC12細胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。H2O2和DMSO購自北京化工廠。CCK8購自日本同仁化學(xué)研究所。方法：PC12細胞采用含10％胎牛血清、5％馬血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，37攝氏度，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將PC12細胞接種于96孔板上，加入不同濃度待測化合物處理16小時，然后加入H2O2處理24小時，加入CCK8再次孵育4小時，450nm測定吸光度并計算細胞存活率。結(jié)果：如表4所示，上述提取物對PC12具有保護作用，能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的細胞毒性，能顯著高于未加藥物處理組。結(jié)果證明，白肉靈芝提取物能夠抑制活性氧H2O2產(chǎn)生的神經(jīng)細胞的毒性，能夠用于神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防和治療。表4提取物EC50，μg/ml提取物EC50，μg/mlGL-1E24.6GL554.3GL159.8GL-649.8GL276.3GL-6E31.3GL388.2維生素E0.9GL467.9(二)白肉靈芝提取物的神經(jīng)生長因子樣作用研究神經(jīng)細胞受損是阿爾茨海默病發(fā)生的主要原因。用腦中現(xiàn)有的星形膠質(zhì)細胞“更新”因傷或疾病而受損的腦細胞將為阿爾茨海默病或中風(fēng)等疾病治療提供全新方法。材料：被測樣品溶液為實施例1和實施例4～8所述的8個提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。準確稱取各樣品，用DMSO(二甲亞砜)配制成50mg/ml溶液(制備時溶于少量DMSO后，再用蒸餾水稀釋至相應(yīng)濃度，控制DMSO的最終體積百分含量<1％)，用DMEM培養(yǎng)基進行2倍梯度稀釋，共8個濃度，供活性測試。DMEM、胎牛血清和馬血清購自Gibco公司。H2O2和DMSO購自北京化工廠。方法：參照PeterJ.Meberg與ToshihideTabata建立的方法進行乳鼠大腦皮層細胞原代培養(yǎng)(MethodsCellBiol,2003,71:111；JNerosciMethods,2000,104(1):45)。將2天新生乳鼠放入500mL碘伏中，窒息而死并消毒5min后取出乳鼠，用75％酒精消毒頭部，在無菌條件下取出大腦皮層，并去除腦膜、血管、海馬等，將腦細胞剪碎成1mm3小塊，加入等體積的0.25％含EDTA的Typsin液中消化，37攝氏度水浴鍋中消化30min，每隔2min輕輕搖蕩1次。加入10％FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化；70μm尼龍網(wǎng)篩過濾，離心(800r/min,6min)，棄上清液。用10％FBS的DMEM培養(yǎng)液輕輕吹打制成細胞懸液1×106個/mL接種于24孔板中，置于CO2培養(yǎng)箱(5％CO2、37度)培養(yǎng)。培養(yǎng)2～3天半量換液1次，10～12天用于實驗研究。將細胞接種于96孔板上，各給藥組加入不同濃度待測化合物處理72小時，對照組加入等量的DMSO(DMSO用培養(yǎng)基稀釋，使含量小于總體積的1％)，然后用倒置相差顯微鏡觀察神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元細胞的生長情況。結(jié)果如表5所示，上述提取物可以有效地促進神經(jīng)膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元細胞的轉(zhuǎn)化，具有研發(fā)治療阿爾茨海默病的藥物的巨大潛力。表5提取物神經(jīng)膠質(zhì)細胞％提取物神經(jīng)膠質(zhì)細胞％GL-1E15％GL545％GL146％GL-639％GL253％GL-6E22％GL351％對照組90％GL432％實施例10白肉靈芝提取物的鎮(zhèn)靜催眠作用(一)對戊巴比妥鈉睡眠時間的影響材料：被測樣品溶液為實施例1和實施例4～8所述的8個提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。準確稱取各樣品，用0.5％CMC-Na配制100mg/ml溶液，供活性測試。小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，溫度20～24攝氏度，恒濕50～60％，光照12小時(8:00～20:00)，隔音，自由攝食、飲水，適應(yīng)環(huán)境一周后進行實驗。戊巴比妥鈉為Serva產(chǎn)品，上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)站試劑廠分裝，批號110812。方法：選取體重18～22g小鼠，雌雄不限，隨機分為8組，每組10只，每只灌胃0.1ml的100mg/ml提取物溶液(相當于500mg/kg)，空白對照組以等量的0.5％CMC-Na溶液。給藥30分鐘后，腹腔注射給藥戊巴比妥鈉50mg/kg，以翻正反射消失至恢復(fù)時間作為睡眠時間。結(jié)果：與對空白照組比較，上述提取物可以顯著延長戊巴比妥鈉致小鼠睡眠時間，結(jié)果見表6。表6提取物睡眠時間(分鐘)提取物睡眠時間(分鐘)GL-1E202.0±22.3**GL5159.4±22.3**GL1180.6±19.6**GL6167.5±25.69**GL2160.7±25.3**GL-6E189.4±21.6**GL3182.9±15.6**空白對照組100.4±13.7GL4173.8±19.7***P<0.05，**P<0.01與空白對照組相比(二)對士的寧致小鼠驚厥的影響材料：被測樣品溶液為實施例1和實施例4～8所述的8個提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。準確稱取各樣品，用0.5％CMC-Na溶液配制100mg/ml溶液，供活性測試。小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，溫度20～24攝氏度，恒濕50～60％，光照12小時(8:00～20:00)，隔音，自由攝食、飲水，適應(yīng)環(huán)境一周后進行實驗。硝酸士的寧注射液(上海禾豐制藥有限公司，批號121112)。方法：選取體重18～22g小鼠，雌雄不限，隨機分為8組，每組10只，實驗前禁食12小時，自由飲水。每只灌胃0.1ml的100mg/ml提取物溶液(相當于500mg/kg)，空白對照組以等量的0.5％CMC-Na溶液。給藥30分鐘后，腹腔注射給藥硝酸士的寧2mg/kg，以雙后肢強直性驚厥與否為觀察指標，記錄小鼠驚厥數(shù)，計算驚厥率。驚厥率＝給藥組小鼠驚厥次數(shù)/空白對照組驚厥次數(shù)×100％結(jié)果：與空白對照組比較，上述提取物可以顯著抵抗士的寧致小鼠驚厥作用，結(jié)果見表7。表7提取物驚厥率％提取物驚厥率％GL-1E30％**GL552％**GL153％**GL-655％**GL265％*GL-6E41％**GL350％**空白對照組100％GL448％***P<0.05，**P<0.01與空白對照組相比實施例11白肉靈芝提取物的抗衰益智作用白肉靈芝提取物對大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響(Morris水迷宮法)材料：被測樣品溶液為實施例1和實施例4～8所述的6個提取物(GL-1E、GL-1～GL-5和GL-6E)。準確稱取各樣品，用0.5％CMC-Na溶液配制100mg/ml溶液，供活性測試。雄性清潔級SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，溫度20～24攝氏度，恒濕50～60％，光照12小時(8:00～20:00)，隔音，自由攝食、飲水，適應(yīng)環(huán)境一周后進行實驗。大鼠Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)：上海吉量JLBehv-MWMG型，包括1大鼠Morris水迷宮，1套視頻攝像系統(tǒng)，無線遙控器，1大鼠水迷宮視頻分析軟件及加密狗。方法：Morris水迷宮直徑1.65m，內(nèi)壁及底為全黑色，水迷宮區(qū)域分成四個象限，選擇在第二象限中央水面2cm下放一直徑12cm黑色平臺，水迷宮實驗每次換水后，添加一定量黑色染料，使水變?yōu)楹谏煌该?，實驗期間水溫保持在20±2℃。選取體重200～220g雄性清潔級SD大鼠，雌雄不限，隨機分為8組，每組10只，實驗前禁食12小時，自由飲水。每只灌胃1ml的100mg/ml提取物溶液(相當于500mg/kg)；對照組給予等量0.5％CMC-Na溶液。給藥第11～14天，給藥完畢后立刻進行定位航行實驗。在定位航行實驗過程中，每只大鼠每天訓(xùn)練4次，間隔10min。訓(xùn)練時，隨機選擇一個入水點，將大鼠面向池壁放入水中。4次訓(xùn)練分別從4個不同入水點入水。記錄每只鼠分別從4個不同點入水開始找到水下平臺所需時間即逃避到平臺上的潛伏期(escapinglatency)。允許動物在60s內(nèi)找到平臺，找到后在平臺上保持15s。如果在60s內(nèi)找不到平臺，則將大鼠引導(dǎo)到平臺上，并保持15s，潛伏期按60s計算。每次訓(xùn)練結(jié)束后擦干大鼠身體，放入各自的鼠籠內(nèi)并適當給予保暖。第一天每次訓(xùn)練前要先將大鼠放在平臺上15s，使其熟悉環(huán)境，從第二天開始則直接進行定向游泳訓(xùn)練。大鼠在每個入水點第一次探索時，由于時間和空間的改變，不能與上一次探索形成順序性關(guān)系，而只能依照環(huán)境的參照來確定水下平臺的位置，因此其記憶屬性為參考記憶。本實驗即參考Youngblood等[YoungbloodBD,ZhouJ,SmaginGNetal.Sleepdeprivationbythe“flowerpot”techniqueandspatialreferencememory.PhysiolBehav1997；61(2)249-56.]的設(shè)計方法，以每天四個入水點的潛伏期的算術(shù)平均值作為該天的定向游泳成績，參與最終結(jié)果的統(tǒng)計。水迷宮試驗期間，水迷宮周圍燈光等參照物必須保持不變。在本實驗中，將水迷宮周圍圍一圓形簾子，以避免實驗人員對實驗的干擾。水迷宮內(nèi)壁，水面上方在每個象限的固定位置貼有不同幾何圖形，作為實驗動物記憶的參照物。結(jié)果：與對照組比較，上述提取物可以顯著提高大鼠記憶力，結(jié)果見表8。表8*P<0.05，**P<0.01與空白對照組相比實施例12白肉靈芝提取物抗疲勞作用(爬桿實驗)材料：被測樣品溶液為實施例1和實施例4～8所述的8個提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。準確稱取各樣品，用0.5％CMC-Na溶液配制100mg/ml溶液，供活性測試。雄性清潔級昆明種小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，溫度20～24攝氏度，恒濕50～60％，光照12小時(8:00～20:00)，隔音，自由攝食、飲水，適應(yīng)環(huán)境一周后進行實驗。方法：選取體重18～22g雄性小鼠，隨機分為9組，每組10只，實驗前禁食12小時，自由飲水。每只灌胃0.1ml的100mg/ml提取物溶液(相當于500mg/kg)，對照組給予等量0.5％CMC-Na溶液，連續(xù)10天，末次給藥30分鐘后，將小鼠放在垂直懸掛的玻璃桿上，使其肌肉處于緊張狀態(tài)，記錄小鼠由于肌肉疲勞從玻璃桿上跌落下來的時間，第三次跌落終止實驗，累計3次的時間作為爬桿時間。結(jié)果：與對照組比較，上述提取物可以顯著延長小鼠爬桿時間，有一定的抗疲勞作用，結(jié)果見表9。表9提取物爬桿時間分鐘提取物爬桿時間分鐘GL-1E14.25±5.67GL513.03±6.01GL112.99±4.98GL612.01±5.74GL210.43±4.26GL-6E13.42±5.28GL313.14±6.27對照組9.63±3.61GL412.42±3.50*P<0.05，**P<0.01與空白對照組相比。