一種蛹蟲草多糖提取物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種蛹蟲草多糖提取物及其制備方法與應(yīng)用。所述的蛹蟲草多糖提取物的制備方法，包含如下步驟：深層發(fā)酵培養(yǎng)蛹蟲草菌絲體后，發(fā)酵產(chǎn)物通過離心分離除出菌絲體，獲得發(fā)酵液；發(fā)酵液超濾去除小分子物質(zhì)后，濃縮；濃縮后的發(fā)酵液通過去蛋白、乙醇沉淀、雙氧水脫色，透析最后經(jīng)真空冷凍干燥，制得蛹蟲草多糖提取物。本發(fā)明制備過程簡單、可高效高質(zhì)大量生產(chǎn)，制備得到的蛹蟲草多糖提取物對人體無毒害，具有良好降血脂的生理作用，可用于開發(fā)降血脂藥物或保健食品。
【專利說明】一種蛹蟲草多糖提取物及其制備方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種蛹蟲草多糖提取物及其制備方法與應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 通過液體深層發(fā)酵食藥用真菌菌絲體獲得發(fā)酵產(chǎn)物，一般可以分別提取菌絲體中 的胞內(nèi)多糖和發(fā)酵液中的胞外多糖。
[0003] 利用蛹蟲草（Cordyceps militaris)菌絲培養(yǎng)產(chǎn)生的活性物質(zhì)，與其子實(shí)體的活 性成分、藥理、毒理、臨床及安全性方面具有相似性（曾宏彬等，2011)?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為蟲 草多糖、蟲草素、蟲草酸等是蛹蟲草重要的功效成分（張仁堂等，2014)。蛹蟲草的液體發(fā) 酵成為快速獲得其菌絲體及其次生代謝產(chǎn)物的主要方法。房天琪等（2011)研宄了蛹蟲 草菌絲體的搖瓶發(fā)酵工藝研宄，得出最佳工藝參數(shù)為葡萄糖23. 34g/L，玉米漿12. 5mL/L， 接種量9%，發(fā)酵溫度25°C，KH2PO4 lg/L和MgSO4 · 7H20 lg/L，維生素 BI 2g/L、發(fā)酵轉(zhuǎn)速 150rpm，pH值7.0,菌絲生物量達(dá)到15. 59g/L。楊杰等（2011)以蛹蟲草菌絲生物量為指 標(biāo)，進(jìn)行了 60L發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件研宄，發(fā)現(xiàn)最佳裝液量為35L/罐，通氣量為0. 9m3/h，最 適的起始PH 6.4。以多糖等生理活性物質(zhì)產(chǎn)量為指標(biāo)的蛹蟲草發(fā)酵條件的研宄已有報道， 李春麗等（2010)發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草的最佳培養(yǎng)基配方為：葡萄糖4%，豆?jié){30% ,KH2PO4O. 15%， MnCl2O. 1%，液體發(fā)酵胞外多糖產(chǎn)量為5. 96g/L。Wang等（2011)將蛹蟲草發(fā)酵液濃縮，乙醇 沉淀多糖，用sevage法去蛋白，并透析冷凍干燥可得胞外粗多糖。一方面利用子實(shí)體獲得 多糖提取物，需耗費(fèi)大量資源，目前蛹蟲草子實(shí)體生長周期較長，且產(chǎn)量有限，自然環(huán)境生 長采集的野生子實(shí)體數(shù)量稀少，用來提取多糖成本高；另一方面利用半合成培養(yǎng)基深層發(fā) 酵對所得的多糖成分影響較大，不利于分離純化和生理功效鑒定。研宄發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草表現(xiàn)抗 腫瘤，抗菌，降血糖，提高免疫機(jī)能和清除氧自由基抗疲勞等藥理作用（葉晶晶等，2011 ;桂 仲爭等，2012)。從當(dāng)前的研宄可知，針對含蛹蟲草胞外多糖提取物的生物活性或藥效的研 宄大多體現(xiàn)在抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等領(lǐng)域。有關(guān)蛹蟲草液體深層發(fā)酵物降血脂作用的研宄尚 未見到有相關(guān)文獻(xiàn)報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足和缺點(diǎn)，本發(fā)明的首要目的在于提供一種蛹蟲草多糖提 取物的制備方法，該制備方法穩(wěn)定可靠、成本低。
[0005] 本發(fā)明的另一個目的在于提供上述制備方法制備得到的蛹蟲草多糖提取物。
[0006] 發(fā)明的另一個目的在于提供上述蛹蟲草多糖提取物的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述方案實(shí)現(xiàn)：
[0008] -種蛹蟲草多糖提取物的制備方法，包含如下步驟：
[0009] (1)將蛹蟲草（Cordyceps militaris)發(fā)酵液超濾去除小分子物質(zhì)后，得到蛹蟲 草超濾液；
[0010] (2)將蛹蟲草超濾液濃縮，得到蛹蟲草超濾濃縮液；
[0011] (3)蛹蟲草超濾濃縮液采用胰蛋白酶和Sevage法去蛋白，得到去蛋白后的多糖提 取液；
[0012] (4)用乙醇沉降去蛋白后的多糖提取液中的多糖，離心得到沉淀，沉淀脫色、透析、 干燥后，制備得到蛹蟲草多糖提取物；
[0013] 步驟（1)中所述的蛹蟲草發(fā)酵液的體積優(yōu)選為150?250L ;所述的蛹蟲草超濾液 的體積優(yōu)選為10?30L ;
[0014] 步驟（1)中所述的超濾條件優(yōu)選為進(jìn)膜壓力為lObar，通量3?5L/min，物料溫度 22°C ;所述的超濾優(yōu)選為用1萬分子量PS超濾膜超濾；
[0015] 步驟（2)中所述的濃縮溫度優(yōu)選為50?70°C ;
[0016] 步驟（2)中所述的蛹蟲草超濾濃縮液的體積為蛹蟲草超濾液的體積的1/5? 1/10 ；
[0017] 步驟（4)中所述的乙醇用量為去蛋白后的多糖提取液體積的3?5倍；
[0018] 步驟⑷中所述的沉降的溫度為0?25 °C，沉降的時間為12?48h ;
[0019] 步驟⑷中所述的脫色、透析、干燥方法為：用水溶解沉淀并調(diào)節(jié)多糖溶液pH至 8. 0 ;然后滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H2O2溶液，于50?55°C水浴保溫2?3h，對其進(jìn)行氧化 脫色處理；然后將多糖溶液裝入截留分子量為8000?15000Da的透析袋中透析2?3d，每 8?IOh更換一次水；對透析完成后的溶液進(jìn)行濃縮，并真空冷凍干燥，獲得蛹蟲草多糖提 取物；所述的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 %的H2O2溶液的用量為每IOOmL多糖液滴加2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 30 %的H2O2溶液；
[0020] 步驟⑶中所述的采用胰蛋白酶和Sevage法，包含如下步驟：
[0021] ①將步驟（2)制備得到的蛹蟲草超濾濃縮液調(diào)pH至8. 0 ;然后將胰蛋白酶加入蛹 蟲草超濾濃縮液中充分混合并37°C振蕩30?60min，再水浴滅酶10?15min，冷卻至室溫， 得到去蛋白后的濃縮液；
[0022] ②去蛋白后的濃縮液加入0. 2倍體積的氯仿正丁醇混合液，劇烈振蕩30min? 40min ;然后離心，棄取蛋白層及有機(jī)溶液，回收上清液；
[0023] ③重復(fù)步驟②1?3次，得到去蛋白后的多糖提取液；
[0024] 步驟①所述的胰蛋白酶的初始濃度優(yōu)選為2% (W/V);所述的胰蛋白酶的用量為 蛹蟲草超濾濃縮液體積的（1:10)?（1:20);
[0025] 步驟①所述的滅酶溫度優(yōu)選為100°C ;
[0026] 步驟①所述的胰蛋白酶加入蛹蟲草超濾濃縮液充分混合的具體操作優(yōu)選為：配制 2% (W/V)的胰蛋白酶溶液，將步驟⑵制備得到的蛹蟲草超濾濃縮液調(diào)pH至8.0;然后將 胰蛋白酶溶液和發(fā)酵濃縮液分別37°C水浴預(yù)熱10?30min，將預(yù)熱后的胰蛋白酶溶液和發(fā) 酵濃縮液充分混合；
[0027] 步驟②所述的氯仿正丁醇混合液中氯仿和正丁醇的體積比為5:1 ;
[0028] 步驟②所述的離心轉(zhuǎn)速為8000rpm，所述的離心時間為IOmin ;
[0029] 步驟（1)中所述的蛹蟲草（C.militaris)發(fā)酵液是通過液體深層發(fā)酵培養(yǎng)，得到 發(fā)酵產(chǎn)物，再通過離心除去菌絲體，獲得蛹蟲草發(fā)酵液；
[0030] 所述的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)的方法，包含如下步驟：
[0031] ( I )將蛹蟲草斜面母種活化培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接至斜面固體培養(yǎng)基中，20?25°C培養(yǎng) 8?15d，至菌絲鋪滿斜面為止，得到蛹蟲草斜面菌種；
[0032] ( II )從步驟（I )制得的蛹蟲草斜面菌種上挑取4?6塊菌塊，接種至200mL 液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，室溫靜置24h，待菌塊傷口處愈合后在150rpm，24°C的條件下振蕩培養(yǎng) 6d，制得一級種子液；
[0033] (III)將步驟（II )制得的一級種子液轉(zhuǎn)入50L種子罐培養(yǎng)二級種子液，接種量 為7 %，培養(yǎng)溫度為24°C，轉(zhuǎn)速為150rpm，罐壓為0. 05?0. 07MPa，通氣量I. 5m3/h (V: V為 1:0. 6);培養(yǎng)3d后轉(zhuǎn)入500L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，初始培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速及罐壓與種子罐相 同，通氣量為12m3/h，培養(yǎng)3?4d ;
[0034] 步驟（I )所述的斜面固體培養(yǎng)基的配方為：馬鈴薯（去皮）200g，葡萄糖20g，蛋 白胨18，（順4) 250428，1%504*7!120 18，腿2?0418，瓊脂2(^，加水定容至 10001^，？!1調(diào)至6.5;
[0035] 步驟（II )和（III)中用于一級種子液和二級種子液培養(yǎng)以及發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基 配方為：鹿糖 50g、KN034g、KH2P04lg、MgSO4 · 7H20 lg、維生素 BIO. 05g、水 IOOOmU pH 值為 6. 5 ；
[0036] 一種蛹蟲草多糖提取物，根據(jù)上述制備方法制備得到；
[0037] 所述的蛹蟲草多糖提取物可以應(yīng)用于制備降血脂藥物或保健食品，具有良好的降 血脂作用；
[0038] 所述的蛹蟲草多糖提取物在降血脂藥物與保健食品中的使用劑量為IOOmg/ kg · d ；
[0039] 與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0040] (1)本發(fā)明的蛹蟲草發(fā)酵液胞外多糖提取物，可采用發(fā)酵罐生產(chǎn)，從發(fā)酵液中獲得 胞外多糖提取物，不但制備過程簡單，條件易控制，而且可大批量工廠化生產(chǎn)。
[0041] (2)本發(fā)明使用蔗糖和硝酸鉀作為碳氮源的合成培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，不但培養(yǎng)基成 分精確，重復(fù)性強(qiáng)，發(fā)酵效率高，而且多糖質(zhì)量穩(wěn)定、易于分離純化，特別重要的是發(fā)酵的多 糖測定不受培養(yǎng)基中糖含量的影響。
[0042] (3)使用不同蛹蟲草菌株液體發(fā)酵，多糖產(chǎn)率和活性有所差異。本發(fā)明采用蛹蟲草 (Cordyceps militaris)菌株，性狀優(yōu)良，適宜用于液體發(fā)酵產(chǎn)多糖，其產(chǎn)率高。
[0043] (4)本發(fā)明采用活化的斜面菌塊接種于液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)獲得一級種子液，可以縮 短液體種制備周期，簡化生產(chǎn)工藝，而不需另外制備菌液。
[0044] (5)本發(fā)明先用乙醇沉淀濃縮液中的多糖，再少量水溶解多糖，進(jìn)行脫色處理，針 對性和目的性更強(qiáng)，不需要消耗較多雙氧水，工藝簡單易操作且效果好。
[0045] (6)本發(fā)明所得蛹蟲草發(fā)酵液胞外多糖提取物，來源于蛹蟲草液體深層發(fā)酵液，而 且提取過程中安全可控，具有對人體無毒害的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所得蛹蟲草發(fā)酵液胞外多糖提 取物溶解性好，具有良好的降血脂作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0046] 圖1為蛹蟲草多糖提取物對小鼠血清TC的影響圖。
[0047] 圖2為蛹蟲草多糖提取物對小鼠血清TG的影響圖。
[0048] 圖3為蛹蟲草多糖提取物對小鼠血清LDL-C的影響圖。

【具體實(shí)施方式】
[0049] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0050] 實(shí)施例中涉及到的培養(yǎng)基配方：
[0051] 斜面固體培養(yǎng)基配方：馬鈴薯（去皮）200g，葡萄糖20g，蛋白胨lg，（NH4) 2S042g， MgSO4 · 7H20 lg，KH2PO4Ig,瓊脂 20g，加蒸餾水定容至 1000mL，pH 調(diào)至 6· 5 ;
[0052] 液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方：蔗糖50g、KN034g、KH2P0 4lg、MgSO4 · 7H20 lg、維生素 BIO. 05g、水 IOOOmU pH 值為 6· 5 ;
[0053] 蛹蟲草（C.militaris)菌株由華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供（Ma L，Zhang S，et al.Hypouricemic Actions of Exopolysaccharide Produced by Cordyceps militaris in Potassium Oxonate-Induced Hyperuricemic Mice.Current Microbiology，69(6):852-857, 2014.);
[0054] 實(shí)施例I
[0055] (I)蛹蟲草（C. militaris)經(jīng)斜面或平板菌種培養(yǎng)、液體振蕩培養(yǎng)和液體深層發(fā) 酵培養(yǎng)，獲得發(fā)酵液，具體方法如下：
[0056] ①斜面或平板菌種培養(yǎng)：將活化后的蛹蟲草斜面母種菌絲塊接入新的斜面固體培 養(yǎng)基中，24°C培養(yǎng)10d，備用；
[0057] ②一級液體菌種培養(yǎng)：取200mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基裝入500mL三角瓶，121°C滅菌 20min，接入4?6個黃豆大小的的蛹蟲草母種菌絲塊；室溫靜置24h，待菌塊傷口處愈合后 在24°C，轉(zhuǎn)速150rpm條件下避光恒溫振蕩培養(yǎng)6天，得到一級種子液；
[0058] ③二級液體菌種培養(yǎng)：50L種子罐裝入液體發(fā)酵培養(yǎng)基35L，125°C滅菌20min ;冷 卻后接入2. 45L培養(yǎng)好的一級種子液，培養(yǎng)溫度為24°C，轉(zhuǎn)速為150rpm，罐壓為0. 05? 0.07MPa，通氣量1.5m3/h(V:V為1:0.6)培養(yǎng)3天，取樣觀察可發(fā)現(xiàn)到種子液清澈透亮，菌 絲體豐富，大小均勻，得到二級種子液；
[0059] ④液體深層發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的二級種子液轉(zhuǎn)入500L發(fā)酵罐培養(yǎng)，初始培養(yǎng)條 件溫度，轉(zhuǎn)速及罐壓與種子罐相同，通氣量約為12m 3/h，培養(yǎng)4d ;
[0060] (2)將發(fā)酵產(chǎn)物通過高速離心獲得發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)1萬分子量PS超濾膜超濾去 除小分子物質(zhì)后，濃縮至20L，得到蛹蟲草超濾液；其中，超濾條件為：進(jìn)膜壓力約為lObar， 通量3L/min，物料溫度22°C ;
[0061] (3)濃縮：用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將超濾液在60°C的恒溫水浴鍋中減壓濃縮至原體積的 1/5,得到蛹蟲草超濾濃縮液；
[0062] (4)胰蛋白酶和sevage法去蛋白、離心：稱取2. Og胰蛋白酶溶于IOOmL蒸餾水中， 再把IOOOmL的蛹蟲草超濾濃縮液調(diào)pH至8. 0,將酶液及蛹蟲草超濾濃縮液同時放入37°C 水浴鍋中預(yù)熱l〇min，然后把兩者充分混合，并振蕩保持30min后放入100°C水浴鍋中滅酶 10min，冷卻至室溫；加入0.2倍體積的氯仿正丁醇混合液（氯仿：正丁醇（V:V) = 5:1)， 劇烈震蕩30min。然后8000rpm離心10min，棄取蛋白層及有機(jī)溶液，回收上清液，此過程重 復(fù)2次，得到去蛋白后的多糖提取液；
[0063] (5)在去蛋白后的多糖提取液中加入4倍體積的乙醇，放于4°C冰箱冷藏2d，待析 出粗多糖，離心得到沉淀；用少量蒸餾水溶解沉淀，調(diào)節(jié)多糖溶液pH至8. 0,然后滴加質(zhì)量 分?jǐn)?shù)為30 %的H2O2 (每IOOmL多糖液滴加2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 %的H2O2溶液），在50°C下水 浴保溫2h，對其進(jìn)行脫色素處理；之后，將多糖溶液裝入截留分子量為8000?15000Da的 透析袋中以蒸餾水透析約3d，每8h更換一次蒸餾水。最后，對透析完成后的溶液進(jìn)行濃縮， 并真空冷凍干燥，獲得蛹蟲草多糖提取物（EPCM)。
[0064] 蛹蟲草多糖提取物經(jīng)苯酚硫酸法測定含總糖為58. 26%，經(jīng)DNS比色法測定含還 原糖7. 21%，經(jīng)考馬斯亮蘭法測定含蛋白0. 96%。
[0065] 實(shí)施例2
[0066] (1)蛹蟲草（C. militaris)經(jīng)斜面或平板菌種培養(yǎng)、液體振蕩培養(yǎng)和液體深層發(fā) 酵培養(yǎng)，獲得發(fā)酵液，具體方法如下：
[0067] ①斜面或平板菌種培養(yǎng)：將活化后蛹蟲草斜面母種菌絲塊接入新的斜面固體培養(yǎng) 基中，20°C培養(yǎng)15d，備用；
[0068] ②一級液體菌種培養(yǎng)：取200mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基裝入500mL三角瓶，121°C滅菌 20min，接入4?6個黃豆大小的的蛹蟲草母種菌絲塊；室溫靜置24h，待菌塊傷口處愈合后 在24°C，轉(zhuǎn)速150rpm條件下避光恒溫振蕩培養(yǎng)6天，得到一級液體菌種；
[0069] ③二級液體菌種培養(yǎng)：50L種子罐裝入液體發(fā)酵培養(yǎng)基35L，125°C滅菌20min ;冷 卻后接入2. 45L培養(yǎng)好的一級種子液，培養(yǎng)溫度為24°C，轉(zhuǎn)速為150rpm，罐壓為0. 05? 0.07MPa，通氣量1.5m3/h(V:V為1:0.6)培養(yǎng)3天，取樣觀察可發(fā)現(xiàn)到種子液清澈透亮，菌 絲體豐富，大小均勻，得到二級種子液；
[0070] ④液體深層發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的二級種子液轉(zhuǎn)入500L發(fā)酵罐培養(yǎng)，初始培養(yǎng)條 件溫度，轉(zhuǎn)速及罐壓與種子罐相同，通氣量約為12m 3/h，培養(yǎng)3d ;
[0071] (2)將發(fā)酵產(chǎn)物通過高速離心獲得發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)1萬分子量PS超濾膜超濾去 除小分子物質(zhì)后，濃縮至20L，得到蛹蟲草超濾液；其中，超濾條件為：進(jìn)膜壓力約為lObar， 通量4L/min，物料溫度22°C ;
[0072] (3)濃縮：用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將超濾液在50°C的恒溫水浴鍋中減壓濃縮至原體積的 1/7,得到蛹蟲草超濾濃縮液；
[0073] (4)胰蛋白酶和sevage法去蛋白、離心：稱取2. Og胰蛋白酶溶于IOOmL蒸餾水中， 再把IOOOmL的蛹蟲草超濾濃縮液調(diào)pH至8. 0,將酶液及蛹蟲草超濾濃縮液同時放入37°C 水浴鍋中預(yù)熱l〇min，然后把兩者充分混合，并振蕩保持45min后放入100°C水浴鍋中滅酶 12min，冷卻至室溫；加入0. 2倍體積的氯仿正丁醇混合液（氯仿：正丁醇=5:1)，劇烈震蕩 35min。然后6000rpm離心15min，棄取蛋白層及有機(jī)溶液，回收上清液，此過程重復(fù)3次，得 到去蛋白后的多糖提取液；
[0074] (5)在去蛋白后的多糖提取液中加入3倍體積的乙醇，置于25°C沉降ld，待析出粗 多糖，離心得到沉淀。用少量蒸餾水溶解沉淀，調(diào)節(jié)多糖溶液PH至8. 0,然后滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為30 %的H2O2 (每IOOmL多糖液滴加2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 %的H2O2溶液），在55 °C下水浴保 溫3h，對其進(jìn)行脫色素處理。之后，將多糖溶液裝入截留分子量為8000?15000Da的透析 袋中以蒸餾水透析約2d，每8h更換一次蒸餾水。最后，對透析完成后的溶液進(jìn)行濃縮，并真 空冷凍干燥，獲得蛹蟲草多糖提取物（EPCM)。
[0075] 蛹蟲草多糖提取物經(jīng)苯酚硫酸法測定含總糖為60. 3%，經(jīng)DNS比色法測定含還原 糖8. 21%，經(jīng)考馬斯亮蘭法測定含蛋白0.93%。
[0076] 實(shí)施例3
[0077] (1)蛹蟲草（C. militaris)經(jīng)斜面或平板菌種培養(yǎng)、液體振蕩培養(yǎng)和液體深層發(fā) 酵培養(yǎng)，獲得發(fā)酵液，具體方法如下：
[0078] ①斜面或平板菌種培養(yǎng)：將活化后蛹蟲草斜面母種菌絲塊接入新的斜面固體培養(yǎng) 基中，25°C培養(yǎng)8d，備用；
[0079] ②一級液體菌種培養(yǎng)：取200mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基裝入500mL三角瓶，121°C滅菌 20min，接入4?6個黃豆大小的的蛹蟲草母種菌絲塊；室溫靜置24h，待菌塊傷口處愈合后 在24°C，轉(zhuǎn)速150rpm條件下避光恒溫振蕩培養(yǎng)6天，得到一級液體菌種；
[0080] ③二級液體菌種培養(yǎng)：50L種子罐裝入液體發(fā)酵培養(yǎng)基35L，125°C滅菌20min ;冷 卻后接入2. 45L培養(yǎng)好的一級種子液，培養(yǎng)溫度為24°C，轉(zhuǎn)速為150rpm，罐壓為0. 05? 0.07MPa，通氣量1.5m3/h(V:V為1:0.6)培養(yǎng)3天，取樣觀察可發(fā)現(xiàn)到種子液清澈透亮，菌 絲體豐富，大小均勻，得到二級種子液；
[0081 ] ④液體深層發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的二級種子液轉(zhuǎn)入500L發(fā)酵罐培養(yǎng)，初始培養(yǎng)條 件溫度，轉(zhuǎn)速及罐壓與種子罐相同，通氣量約為12m3/h，培養(yǎng)4d ;
[0082] (2)將發(fā)酵產(chǎn)物通過高速離心獲得發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)1萬分子量PS超濾膜超濾去 除小分子物質(zhì)后，濃縮至20L，得到蛹蟲草超濾液；其中，超濾條件為：進(jìn)膜壓力約為lObar， 通量5L/min，物料溫度22°C ;
[0083] (3)濃縮：用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將超濾液在70°C的恒溫水浴鍋中減壓濃縮至原體積的 1/10,得到蛹蟲草超濾濃縮液；
[0084] (4)胰蛋白酶和sevage法去蛋白、離心：稱取2. Og胰蛋白酶溶于IOOmL蒸餾水中， 再把IOOOmL的蛹蟲草超濾濃縮液調(diào)pH至8. 0,將酶液及蛹蟲草超濾濃縮液同時放入37°C 水浴鍋中預(yù)熱l〇min，然后把兩者充分混合，并振蕩保持60min后放入100°C水浴鍋中滅酶 15min，冷卻至室溫；加入0. 2倍體積的氯仿正丁醇混合液（氯仿：正丁醇=5:1)，劇烈震蕩 40min。然后7000rpm離心12min，棄取蛋白層及有機(jī)溶液，回收上清液，此過程重復(fù)1次，得 到去蛋白后的多糖提取液；
[0085] (5)在去蛋白后的多糖提取液中加入5倍體積的乙醇，置于8°C沉降12h，待析出粗 多糖，離心得到沉淀。用少量蒸餾水溶解沉淀，調(diào)節(jié)多糖溶液PH至8. 0,然后滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為30 %的H2O2 (每IOOmL多糖液滴加2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 %的H2O2溶液），在52 °C下水浴保 溫2. 5h，對其進(jìn)行脫色素處理。之后，將多糖溶液裝入截留分子量為8000?15000Da的透 析袋中以蒸餾水透析約3d，每IOh更換一次蒸餾水。最后，對透析完成后的溶液進(jìn)行濃縮， 并真空冷凍干燥，獲得蛹蟲草多糖提取物（EPCM)。
[0086] 蛹蟲草多糖提取物經(jīng)苯酚硫酸法測定含總糖為57. 49%，經(jīng)DNS比色法測定含還 原糖7. 03%，經(jīng)考馬斯亮蘭法測定含蛋白0. 95%。
[0087] 實(shí)施例4蛹蟲草多糖提取物（EPCM)(實(shí)施例1制備得到）降血脂實(shí)驗
[0088] (1)蛹蟲草多糖提取物（EPCM)降血脂作用的實(shí)驗（高劑量）
[0089] ①昆明種小鼠，SPF級別，雄性，體重18?22g，購自中山大學(xué)實(shí)驗動物中心。許可 證號：SCK(粵）2011-0029 ;高脂飼料（配方為：10%豬油、1.0%膽固醇、0.3%膽鹽、88. 7% 普通飼料），購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗動物中心。許可證號：SCK(粵）2008-0002。小鼠用普通 飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)4d后，根據(jù)小鼠體重隨機(jī)分為正常對照組，高脂模型組，陽性對照組（辛伐 他汀，IOmgAkg ·d))，200mgAkg ·d)多糖提取物高劑量組，每組小鼠數(shù)為10只。實(shí)驗期間 小鼠自由飲水，定量給食。所有小鼠飼養(yǎng)于溫度為18?22°C，相對濕度為50%?60%，有 自然光照的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗動物房。除正常對照組小鼠給予普通飼料外，其他各實(shí)驗組給予高脂 飼料，每只小鼠5g/d(后兩周增至6g/d)。采取預(yù)防模式給藥：即高脂飼料建模與給藥同時 進(jìn)行。每天上午定時對實(shí)驗處理組小鼠灌胃各藥物一次，每只小鼠灌胃量均為〇.5mL，正常 對照組和高脂模型組灌胃等體積的蒸餾水。實(shí)驗進(jìn)行28d。實(shí)驗期間每周稱量一次體重，每 日觀察小鼠攝食，自主活動情況。
[0090] ②最后一天灌胃后，小鼠禁食不禁水12h，斷頸取血，分離得血清后分別檢測血脂 四項指標(biāo)TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量。取血后迅速解剖小鼠，取其心臟，肝臟、腎臟、脾臟， 并計算心指數(shù)、肝指數(shù)、腎指數(shù)和脾指數(shù)（以臟器鮮重/體重表示）。
[0091] (2)蛹蟲草多糖提取物（EPCM)降血脂作用的實(shí)驗（中劑量）
[0092] ①昆明種小鼠，SPF級別，雄性，體重18?22g，由中山大學(xué)實(shí)驗動物中心提供。 許可證號：SCK(粵）2011-0029 ;高脂飼料（配方為：10%豬油、LO%膽固醇、0.3%膽鹽、 88. 7%普通飼料），由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗動物中心提供。許可證號：SCK(粵）2008-0002。小鼠 用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)4d后，根據(jù)小鼠體重隨機(jī)分為正常對照組，高脂模型組，陽性對照 組（辛伐他汀，IOmgAkg · d))，IOOmgAkg · d)多糖提取物中劑量組，每組小鼠數(shù)為10只。 實(shí)驗期間小鼠自由飲水，定量給食。所有小鼠飼養(yǎng)于溫度為18?22°C，相對濕度為50%? 60%，有自然光照的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗動物房。除正常對照組小鼠給予普通飼料外，其他各實(shí)驗組 給予高脂飼料，每只小鼠5g/d(后兩周增至6g/d)。采取預(yù)防模式給藥：即高脂飼料建模 與給藥同時進(jìn)行。每天上午定時對實(shí)驗處理組小鼠灌胃各藥物一次，每只小鼠灌胃量均為 0.5mL，正常對照組和高脂模型組灌胃等體積的蒸餾水。實(shí)驗進(jìn)行28d。實(shí)驗期間每周稱量 一次體重，每日觀察小鼠攝食，自主活動情況。
[0093] ②最后一天灌胃后，小鼠禁食不禁水12h，斷頸取血，分離得血清后分別檢測血脂 四項指標(biāo)TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量。取血后迅速解剖小鼠，取其心臟，肝臟、腎臟、脾臟， 并計算心指數(shù)、肝指數(shù)、腎指數(shù)和脾指數(shù)（以臟器鮮重/體重表示）。
[0094] (3)蛹蟲草多糖提取物（EPCM)降血脂作用的實(shí)驗（低劑量）
[0095] ①昆明種小鼠，SPF級別，雄性，體重18?22g，由中山大學(xué)實(shí)驗動物中心提供。 許可證號：SCK(粵）2011-0029 ;高脂飼料（配方為：10%豬油、LO%膽固醇、0.3%膽鹽、 88. 7%普通飼料），由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗動物中心提供。許可證號：SCK(粵）2008-0002。小 鼠用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)4d后，根據(jù)小鼠體重隨機(jī)分為正常對照組，高脂模型組，陽性對 照組（辛伐他汀，IOmgAkg ·(!))，50mgAkg ·(!)多糖提取物低劑量組，每組小鼠數(shù)為10只。 實(shí)驗期間小鼠自由飲水，定量給食。所有小鼠飼養(yǎng)于溫度為18?22°C，相對濕度為50%? 60%，有自然光照的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗動物房。除正常對照組小鼠給予普通飼料外，其他各實(shí)驗組 給予高脂飼料，每只小鼠5g/d(后兩周增至6g/d)。采取預(yù)防模式給藥：即高脂飼料建模 與給藥同時進(jìn)行。每天上午定時對實(shí)驗處理組小鼠灌胃各藥物一次，每只小鼠灌胃量均為 0.5mL，正常對照組和高脂模型組灌胃等體積的蒸餾水。實(shí)驗進(jìn)行28d。實(shí)驗期間每周稱量 一次體重，每日觀察小鼠攝食，自主活動情況。
[0096] ②最后一天灌胃后，小鼠禁食不禁水12h，斷頸取血，分離得血清后分別檢測血脂 四項指標(biāo)TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量。取血后迅速解剖小鼠，取其心臟，肝臟、腎臟、脾臟， 并計算心指數(shù)、肝指數(shù)、腎指數(shù)和脾指數(shù)（以臟器鮮重/體重表示）。
[0097] 上述（1)、（2)、（3)的實(shí)驗數(shù)據(jù)如表1，表2和表3所示。
[0098] 表1蛹蟲草多糖提取物（EPCM)對小鼠血清TC及TG的影響
[0099]

【權(quán)利要求】
1. 一種蛹蟲草多糖提取物的制備方法，其特征在于包含如下步驟： (1) 將蛹蟲草（Cordyceps militaris)發(fā)酵液超濾去除小分子物質(zhì)后，得到蛹蟲草超 濾液； (2) 將蛹蟲草超濾液濃縮，得到蛹蟲草超濾濃縮液； (3) 蛹蟲草超濾濃縮液采用胰蛋白酶和Sevage法去蛋白，得到去蛋白后的多糖提取 液； (4) 用乙醇沉降去蛋白后的多糖提取液中的多糖，離心得到沉淀，沉淀脫色、透析、干燥 后，制備得到蛹蟲草多糖提取物； 步驟（3)中所述的采用胰蛋白酶和Sevage法，包含如下步驟： ① 將步驟（2)制備得到的蛹蟲草超濾濃縮液調(diào)pH至8.0 ;然后將胰蛋白酶加入蛹蟲草 超濾濃縮液充分混合并37°C振蕩30?60min，再水浴滅酶10?15min，冷卻至室溫，得到去 蛋白后的濃縮液； ② 去蛋白后的濃縮液加入0. 2倍體積的氯仿正丁醇混合液，劇烈振蕩30min?40min ; 然后離心，棄取蛋白層及有機(jī)溶液，回收上清液； 重復(fù)步驟②1?3次，去蛋白后的多糖提取液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛹蟲草多糖提取物的制備方法，其特征在于： 步驟（1)中所述的超濾條件為進(jìn)膜壓力為l〇bar，通量3?5L/min，物料溫度22°C。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛹蟲草多糖提取物的制備方法，其特征在于： 步驟（2)中所述的濃縮溫度為50?70°C。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛹蟲草多糖提取物的制備方法，其特征在于： 步驟（4)中所述的沉降的溫度為0?25°C，沉降的時間為12?48h。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛹蟲草多糖提取物的制備方法，其特征在于： 步驟（4)中所述的脫色、透析、干燥方法為：用水溶解沉淀并調(diào)節(jié)多糖溶液pH至8. 0 ; 然后滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H202溶液，于50?55°C水浴保溫2?3h，對其進(jìn)行氧化脫色處 理；然后將多糖溶液裝入截留分子量為8000?15000Da的透析袋中透析2?3d，每8?10h 更換一次水；對透析完成后的溶液進(jìn)行濃縮，并真空冷凍干燥，獲得蛹蟲草多糖提取物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛹蟲草多糖提取物的制備方法，其特征在于： 步驟（1)中所述的蛹蟲草發(fā)酵液是通過液體深層發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵產(chǎn)物，再通過離 心除去菌絲體，獲得蛹蟲草發(fā)酵液； 所述的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)的方法，包含如下步驟： (I )將蛹蟲草斜面母種活化培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接至斜面固體培養(yǎng)基中，20?25°C培養(yǎng)8? 15d，至菌絲鋪滿斜面為止，得到蛹蟲草斜面菌種； (II )從步驟（I )制得的蛹蟲草斜面菌種上挑取4?6塊菌塊，接種至200mL液體發(fā) 酵培養(yǎng)基中，室溫靜置24h，待菌塊傷口處愈合后在150rpm，24°C的條件下振蕩培養(yǎng)6d，制 得一級種子液； (III)將步驟（II )制得的一級種子液轉(zhuǎn)入50L種子罐培養(yǎng)二級種子液，接種量為7%， 培養(yǎng)溫度為24°C，轉(zhuǎn)速為150rpm，罐壓為0. 05?0. 07MPa，通氣量1. 5m3/h，培養(yǎng)3d后轉(zhuǎn)入 500L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，初始培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速及罐壓與種子罐相同，通氣量約為12m3/h， 培養(yǎng)3?4d。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的蛹蟲草多糖提取物的制備方法，其特征在于： 步驟（II )和（III)中用于一級種子液和二級種子液培養(yǎng)以及發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方 為：蔗糖5(^、謂0348、腿2?041 8、]\%504.71120 18、維生素810.058、水 10001^、？11值為6.5。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的蛹蟲草多糖提取物的制備方法，其特征在于： 步驟（I )所述的斜面固體培養(yǎng)基的配方為：馬鈴薯（去皮）200g，葡萄糖20g，蛋白胨 lg，（NH4)2S042g，MgS04 ? 7H20 lg，KH2P04lg，瓊脂 20g，加水定容至 lOOOmL，pH 調(diào)至 6. 5。
9. 一種蛹蟲草多糖提取物，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求1?9任一項所述的制備方法制 備得到。
10. 權(quán)利要求9所述的蛹蟲草多糖提取物在制備降血脂藥物或保健食品中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P3/06GK104497160SQ201410856801
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月31日
【發(fā)明者】張松, 張命龍 申請人:華南師范大學(xué)