一種重組泛素化藍耳病疫苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種豬藍耳病(繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合癥，PRRSV)重組泛素化疫苗的制備與應用。所述疫苗以PRRSV主要結構蛋白GP5、GP6、GP7的體液和細胞免疫表位作為疫苗框架結構，通過柔性linker連接后再與泛素串聯(lián)，克隆入pRSETA載體后轉化大腸桿菌，經過發(fā)酵、純化、乳化等工藝，獲得具有理想免疫原性的重組藍耳病蛋白工程疫苗。本發(fā)明還涉及該疫苗的使用方法。動物實驗表明，藍耳病蛋白工程疫苗的攻毒保護力與弱毒苗相當，高于滅活苗，可以在細胞水平上刺激產生T淋巴細胞增殖免疫反應，體液水平上產生具有病毒中和活性的抗體免疫反應，能夠預防豬藍耳病。
【專利說明】一種重組泛素化藍耳病疫苗的制備

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術基因工程領域，主要涉及一種豬藍耳病的泛素化疫苗制備與 應用。具體地，利用基因重組技術，將主要結構蛋白GP5、GP6、GP7的表位與豬泛素蛋白串 聯(lián)，并克隆入載體，轉化宿主菌，經過發(fā)酵，純化、乳化工藝制備，得到重組藍耳病泛素化疫 苗以及該疫苗在預防重大動物疾病豬藍耳病中的應用。

【背景技術】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)引起的一種高度傳 染性疾病，主要引起母豬繁殖障礙、各年齡豬呼吸道癥狀、仔豬高死亡率等，同時還會導致 免疫抑制而繼發(fā)多種其他疾病。近年來，豬繁殖與呼吸綜合征病毒給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨 大的經濟損失。研宄表明從PRRSV基因組的變異、介導該病毒感染的細胞受體及劇烈炎癥 反應的產生等方面是PRRSV致病的關鍵。目前，我國已研制出針對該病不同流行毒株的滅 活苗和弱毒活疫苗。但滅活苗幾乎不能誘導細胞免疫，不能減少或阻止藍耳病病豬排毒，研 宄表明，滅活苗免疫與未免疫病豬在病毒血癥嚴重程度和持續(xù)時間上無顯著差異（Nilubol etal. ;2004);此外，滅活苗也不能阻止野毒感染，不能減少感染公豬精液排毒（Nielsen earl. ;1997);弱毒苗的效果明顯好于滅活疫苗，然而，其存在巨大的毒力返強及散毒的風 險。
[0003] 該病最早于1987年首先在美國發(fā)生，隨后在加拿大、德國、荷蘭等一些國家也先 后暴發(fā)了該病，至1989年達到高峰。1991年，wensvoort首次從感染豬體內分離到病原 (Wensvoort et al.，1991)。實際上，亞洲地區(qū)1988年已經有該病的存在，但分離出病毒是 5年之后的1993年（日本和中國臺灣）（Hiroseo etal.，1995;華健，2000)。目前，國內外 的獸醫(yī)工作者對PRRS都相當重視，進行了卓有成效的研宄，也分離到很多的毒株。
[0004] 位于病毒外區(qū)的S37H(F/L)QLIYN是病毒的中和表位（Ostrowski et al.，2002)。 在近年來的研宄中備受關注，后來該表位被證實為是病毒的首要中和表位（primary neutralizing epitope，PNE) (Ansari et al.，2006)。在我國大陸的養(yǎng)豬場以PRRSV CH-la 滅活苗和源自VR-2332的弱毒疫苗進行免疫為主。用這些疫苗免疫的豬即使能夠產生良好 的免疫應答，也產生了高水平的中和抗體，但是這些中和抗體卻不能有效地清除病毒。這對 疫苗的研制提出了新的挑戰(zhàn)。
[0005] PRRSV基因組中的結構蛋白基因可分為主要結構蛋白基因和次要結構蛋白基因， 主要結構蛋白基因包括由0RF5、0RF6、0RF7編碼的主要結構蛋白E、M蛋白和N蛋白，它們 都具有重要的經濟價值和開發(fā)前景（蔡家利等，2001 ;仇華吉等，1999 ;谷紅等，2004 ;秦春 圃，2003)。
[0006] GP5由0RF5編碼，為糖基化的囊膜蛋白，又稱E蛋白，26kDa，含有4個糖基化位點。 GP5是PRRSV的主要保護性抗原，含有中和表位，可以誘導細胞免疫和體液免疫（Pirzadeh etal. ，1997， Albina et al.，1998， Gonln et al.，1999， Goldberg et al.，2000)。 GP5 蛋白含有一個胞外結構域，該胞外域中間有一個主要的中和表位（印itope(B)，AA37-45) (Osstrowski et al.，2002)，還有一個非中和表位（epitope (A)，AA27-31)。HuM 株 GP5 基 因與CH-Ia株的GP5基因相比較氨基酸的同源性為93%。存在著一些關鍵氨基酸的差異， 在GP5的2個重要抗原性區(qū)域（胞外域27-41位AA，另一個是C末端180-197位AA)就存 在著5個氨基酸的突變，且39位氨基酸發(fā)生了突變，它位于主要的中和表位（印itope (B)， AA37-45位AA)中。已有的研宄表明，采用帶有GP5基因的DNA疫苗單獨免疫即可對同源 毒株產生足夠的保護效力，用高致病性藍耳病的GP5基因作為重組病毒的抗原。GP5蛋白 是誘導產生中和抗體的主要病毒抗原，與LDV，EAV相同，至少有兩種類型的中和表位（Yang et al.，2001 ;Rodriguez et al.，2001 ;0strowski et al.，2002)，其中和抗原表位包括線 性表位和構象表位，而位于其胞外區(qū)的表位是最重要的中和表位。單克隆抗體與病毒糖基 化的和非糖基化的膜蛋白都發(fā)生反應，這表明糖基化與中和表位無必然聯(lián)系，但其內部構 象對中和活性抗體的產生有重要作用（Weiland et al·，1999 ;Gonin et al·，1999 ;Zhang et al.，1998;Pirzadeh et al.1997)。經鑒定，GP5 在氨基酸 AA117-131 和 149-163 包含 兩個免疫顯性的T細胞表位（Vashisht et al.，2008。此外，GP5蛋白在體內外均能誘導細 胞凋亡（Suarez et al.，1996) 〇
[0007] M蛋白又稱基質蛋白，屬于非糖基化膜蛋白，由0RF6編碼而成，分子量大約是18? 19kDa(Meulenberg et al.，1995)。NA-type 和歐洲型的 PRRSV 都有一個N-糖基化位點，但 該位點不與寡聚糖相結合，因為無論是體外翻譯的還是天然的蛋白用內切糖基化酶消化， 其分子量都不減少。M蛋白在NA-type毒株間是高度保守的，也是歐美毒株結構蛋白中最 保守的蛋白（Meng et al.，1995)。該蛋白有一個重要的特征，即在其N端存在3個非常明 顯的疏水區(qū)，位于第17?88位氨基酸殘基，是蛋白的跨膜區(qū)（Mardassi et al.，1995)。M 蛋白有一段很短的氨基酸（僅有16個氨基酸）暴露在病毒表面，可能與病毒的聚集和結合 有關。M蛋白在感染細胞的滑面內質網（ER)中聚集，與25kD的主要糖蛋白GP5形成異源二 聚體（分子量分別約40和87kDa) (Snijder et al.，2003)。推測其可能在維持病毒形態(tài)、 病毒組裝和出芽中發(fā)揮作用。M蛋白是PRRSV三種重要的結構蛋白中最為保守的，也是感染 豬體液免疫的主要對象之一，研宄分析表明M蛋白是一種免疫原性很好的蛋白質，可誘導 產生抗體反應，且在感染后10天即可檢出。表達的重組M蛋白可以作為血清學實驗的靶抗 原。
[0008] 0RF7編碼核衣殼蛋白（N蛋白）（Meulenberg et al.，1995)是該病毒的主要結構 蛋白，位于基因組3'末端，是形成病毒衣殼的唯一蛋白。在PRRS病毒感染的細胞中N蛋白是 含量最豐富的蛋白，約占細胞中蛋白總量的20?40%左右（Mardassi et al.，1994)。N蛋 白是相對保守的結構蛋白，是PRRSV所有結構蛋白中免疫原性比較強的病毒蛋白（Yoon et al.，1995)，這在免疫學和診斷學上具有重要意義。N蛋白作為結構蛋白，通過與病毒RNA相 互作用形成核衣殼；N蛋白還可以調節(jié)宿主細胞功能（Yoo, 2005)。Lee等（2006)利用反向 遺傳學技術突變病毒N蛋白的NLS后，發(fā)現(xiàn)病毒仍然具有感染性，但病毒產量比野毒低100 倍。NLS突變株接種豬表現(xiàn)病毒持續(xù)性感染時間縮短、病毒含量下降，但其誘導產生的中和 抗體和ELISA抗體比野毒株高，從感染豬扁桃體分離到的病毒株的突變集中在NLS區(qū)，表明 NLS對于病毒體外復制是非必需的，可在PRRSV感染豬體內發(fā)揮重要的病理學作用。北美洲 型PRRSV的N蛋白的第23, 75和90位氨基酸處分別含有3個半胱氨酸，其中的第23位半 胱氨酸參與同源二聚體的形成（Wootton et al.，2003)。
[0009] 泛素（Ubiquitin，Ub)是一種高度保守的小肽（76個氨基酸），普遍存在于從單細 胞酵母到人類的所有真核細胞內，并且表達水平很高。泛素共價地結合于底物蛋白質的賴 氨酸殘基，被泛素標記的蛋白質將被特異性地識別并迅速降解，泛素的這種標記作用是非 底物特異性的，在蛋白質降解過程中泛素的樞紐作用越來越得到研宄者的重視。泛素依賴 性的蛋白質降解途徑是目前已知的重要的、有高度選擇性的蛋白質降解途徑之一。泛素與 靶抗原基因的融合表達，可以使泛素化的靶抗原經蛋白酶體降解后，迅速被加工、處理和遞 呈，刺激機體MHC-I類分子限制的特異性CD+8T淋巴細胞增殖、分化，增強疫苗的免疫應答 (Grant E P et al.，1995 ;Leachman S A et al.，2002)。泛素可以通過調節(jié)蛋白的周轉而 參與細胞的多種生命過程（Ciechanover A et al.，2000]，如熱休克反應、DNA損傷修復、細 胞周期調控等。泛素與蛋白連接后，可以促進內源性合成蛋白在蛋白酶體中的降解，從而增 強蛋白特異性的細胞免疫（Adams J et al.，2001 ;Lauren D W et al.，2003 ;M icheal B R et al.，2005) 〇
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 本發(fā)明以主要結構蛋白GP5T細胞表位以及GP6和GP7的中和抗原表位作為疫苗 框架結構，與泛素（Ub)基因串聯(lián)，在大腸桿菌中表達后，經過蛋白純化、乳化等工藝，獲得 具有理想免疫原性的重組泛素化藍耳病疫苗。本疫苗免疫靶動物后可誘導有效的體液免疫 和細胞免疫反應。
[0012] 本發(fā)明的目的之一在于提供了一種新的能用于預防藍耳病的重組泛素化疫苗多 肽及其疫苗組合物；本發(fā)明的目的之二在于提供了所述泛素化藍耳病疫苗的構建及獲得方 法；本發(fā)明的目的之三在于提供了能夠表達所述泛素化藍耳病疫苗的基因工程菌株；本發(fā) 明的目的之四在于提供了所述泛素化藍耳病疫苗的制備方法；本發(fā)明的目的之五在于提供 了所述泛素化藍耳病疫苗在預防藍耳病中的用途。
[0013] 在第一方面，本發(fā)明提供了一種用于預防藍耳病的重組泛素化疫苗多肽及其組合 物。其含有主要結構蛋白GP5 T細胞表位以及GP6和GP7的中和抗原表位及泛素（Ub)蛋 白。所述的泛素化藍耳病疫苗蛋白或多肽或藥學上可接受的鹽以及表達抗原表位蛋白所需 要的載體。載體也可以包括單獨編碼各抗原表位的序列，串聯(lián)可以通過遺傳工程方法進行。 所述疫苗也包括非免疫活性物質，即為各多肽的連接部分，不具有抗原表位的免疫原性，也 不具有任何佐劑活性，主要有純化標簽、接頭肽、化學修飾部分、N端信號肽和C端多聚腺苷 酸等。所述藥學上可接受的鹽是指無毒性、刺激和變態(tài)反應，適用于人或動物組織的鹽。非 活性物質和藥學上可接受的鹽為本領域技術人員所熟知。泛素化藍耳病疫苗多肽氨基酸序 列如下：
[0014] NASSNGSSCELNGTDWLIRLAKNCMSWRYSCTRYTNFLLDTKGRLYRWRSSVIVEKGGKVEVEGHLIDL KRVVLDGSAGSGGSSLDDFCNDSTAPKVSRGRLVVRRPGSTTVVLGGRKAVKQGGGKQQKKKKGNGQPVNQLCQMLG KIIAQQNQSRGKGPGKKNRKKNPEKPHFPLATEDDVRHHFTPSERQLCAAYTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQD KEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGGMQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDK EGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGGMQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKE GIPPDQQRLIFAGKQLEDGRT
[0015] 在第二方面，本發(fā)明提供了一種核苷酸分子，其編碼本發(fā)明第一方面所述的泛素 化藍耳病疫苗多肽。本發(fā)明中核苷酸可以是RNA形式，DNA形式，通過人工合成方式合成多 抗原表位串聯(lián)序列和泛素序列，然后經過基因工程操作連接后克隆入載體，轉化入大腸桿 菌，篩選、發(fā)酵、純化后獲得藍耳病泛素化藍耳病疫苗多肽。在本發(fā)明中可以對該核酸進行 常規(guī)的分子生物學操作，如：PCR、限制性內切酶酶切、連接等，核酸設計5'端和3'端均加入 酶切位點。優(yōu)選本發(fā)明中的核苷酸序列如下：
[0016] AACGCCAGCAGCAACGGCAGCTCTTGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGCTGATTAGGCTTGCGAAGAAC TGCATGTCCTGGCGCTACTCTTGTACCAGATATACCAACTTCCTTCTGGACACTAAGGGCAGACTCTATCGTTGGCG GTCGTCCGTCATTGTGGAGAAGGGGGGTAAGGTTGAGGTCGAAGGTCACCTAATCGACCTCAAGAGAGTTGTGCTTG ATGGTTCCGCGGGTTCTGGTGGGTCGTCTCTAGACGACTTCTGCAATGATAGCACAGCTCCAAAGGTAAGTCGCGGT CGACTGGTCGTCCGGCGTCCCGGCTCCACTACGGTCGTGTTGGGTGGCAGAAAAGCTGTTAAGCAGGGAGGTGGTAA GCAGCAAAAGAAAAAGAAGGGGAATGGCCAGCCAGTCAATCAGCTGTGCCAAATGCTGGGTAAGATCATCGCCCAAC AAAACCAGTCCAGAGGCAAGGGACCGGGGAAGAAAAATAGGAAGAAAAACCCGGAGAAGCCCCATTTCCCTCTAGCG ACTGAAGATGACGTCAGGCATCACTTTACCCCTAGTGAGCGGCAATTGTGTGCAGCATACACCTTGACCGGCAAGAC CATCACCCTGGAGGTGGAGCCCAGTGACACCATCGAGAATGTGAAGGCCAAGATCCAGGATAAGGAGGGCATTCCCC CCGACCAGCAGAGGCTCATCTTTGCAGGCAAGCAGCTGGAGGATGGCCGCACTCTTTCTGATTACAACATCCAGAAA GAGTCCACCCTCCATCTGGTTCTGCGTCTGAGGGGTGGTATGCAGATCTTCGTGAAGACCTTGACCGGCAAGACCAT CACTCTGGAGGTGGAGCCCAGTGACACCATCGAGAATGTGAAGGCCAAGATCCAGGATAAGGAAGGCATTCCCCCCG ACCAGCAGAGGCTCATCTTTGCAGGCAAGCAGCTGGAAGATGGCCGCACTCTTTCTGATTACAACATCCAGAAAGAG TCCACTCTCCATCTGGTTCTGCGTCTGAGGGGTGGTATGCAGATCTTCGTGAAGACCTTGACCGGCAAGACCATCAC CCTGGAGGTGGAGCCCAGTGACACCATCGAGAATGTGAAGGCCAAGATCCAGGATAAGGAAGGCATTCCCCCTGACC AGCAGAGGCTCATCTTTGCAGGCAAGCAGCTGGAAGATGGCCGCACT
[0017] 在第三方面，本發(fā)明提供了一種載體，其除了含有本發(fā)明第二方面所述的編碼泛 素化藍耳病疫苗核苷酸分子，還含有與該核苷酸序列可操作的連接，在原核細胞表達（轉 錄和翻譯）所需的表達控制元件。最基本的表達控制元件包括啟動子、轉錄終止子、增強 子，選擇性標記等，這些調控元件為本領域所熟知。本發(fā)明中優(yōu)選大腸桿菌BL21 (DE3, Plys) 作為表達載體。
[0018] 在第四方面，本發(fā)明提供了一種宿主細胞，其含有本發(fā)明第三方面所述的載體。宿 主細胞經轉化或轉染含有本發(fā)明所述編碼蛋白的基因序列，而后經檢測具有良好的的遺傳 和表達穩(wěn)定性后，可用于發(fā)酵表達生產所需的泛素化藍耳病疫苗多肽。
[0019] 在第五方面，本發(fā)明提供了一種泛素化藍耳病疫苗的制備方法，其包括以下步驟： 工程菌發(fā)酵表達泛素化藍耳病疫苗多肽，經過粗純化與精細純化工藝以及后續(xù)乳化工藝， 獲得所需要的多肽。其中涉及的方法包括但不限制于菌體破碎、包涵體洗滌、離心、變性、親 和層析、疏水層析、陰離子交換色譜、反相色譜、復性、乳化等。本發(fā)明中涉及的制備方法為 本領域技術人員所熟知。
[0020] 在第六方面，本發(fā)明提供了一種用于預防豬藍耳病的重組泛素化藍耳病疫苗，其 包括本發(fā)明第一方面所述的多肽以及藥學上可接受的載體。所述泛素化藍耳病疫苗能夠預 防豬藍耳病的爆發(fā)。本發(fā)明所述的藥學上可接受的載體為免疫增強劑或免疫佐劑，優(yōu)選免 疫佐劑為進口白油佐劑。
[0021] 在第七方面，本發(fā)明提供了第六方面所述的重組泛素化藍耳病疫苗的應用。疫苗 可以一定有效劑量肌肉注射，皮內或皮下注射或鼻內接種注射動物，能夠產生足夠量的抗 體及細胞因子（如IFN等）提供抗病毒活性，保護動物免于藍耳病流行毒株的攻擊。此外， 在本發(fā)明的實施方案中，通過對疫苗進行靶動物攻毒對比試驗、實驗室安全性試驗等，表明 本發(fā)明所述的重組泛素化藍耳病疫苗是安全的（見實施例四），能夠保護動物免受藍耳病 病毒感染（見實施例五）。
[0022] 另外，需要指出的是，在本申請的上下文的公開內容的基礎上，本發(fā)明的其他具有 實質性特點的方面對本領域的普通技術人來說是顯而易見的。此外，本發(fā)明亦使用了公開 文獻，他們的全文內容均納入本文進行參考。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的 本發(fā)明范圍。圖1重組藍耳病蛋白工程疫苗表達載體pRSETA-PRRSV(GP5/6/7/Ub)構建圖； 圖2pRSETA-PRRSV(GP5/6/7/Ub)載體質粒酶切圖，其中泳道1為DNAmarker，從上至下分子 量依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，泳道2為未酶切對照，泳道3為質粒 酶切圖，泳道4為陰性對照；圖3SDS-PAGE檢測圖，其中泳道1為蛋白Marker，從上至下依 次為97. 2KD、66. 4KD、44. 3KD、29. 0KD、20. 1KD、14. 3KD，泳道2為未誘導樣品，泳道3為陽性 對照，泳道4為誘導樣品，箭頭所指為表達的目的蛋白；圖4 Westemblot檢測圖，其中泳道 1為預染marker，從上至下依次為120KD、85KD、60KD、40KD、22KD，泳道2為陽性對照，泳道3 為陰性對照，泳道4為目的蛋白。圖5為免疫小鼠血清ELISA檢測GP5特異性抗體檢測結 果；圖6為PRRSV刺激鼠腎細胞T淋巴細胞增殖反應檢測結果；圖7為PRRSV刺激PBMC T 淋巴細胞增殖反應檢測結果。

【具體實施方式】
[0024] 實施例中所述的具體試驗方法描述僅是示例性描述，用于詳細闡述本發(fā)明，但并 不構成對本發(fā)明范圍的限制，依據(jù)本發(fā)明的許多變化為本領域的技術人員所熟知。
[0025] 實施例一大腸桿菌表達載體與表達菌株的構建
[0026] 將設計好的多肽編碼核苷酸送上海英俊生物技術公司合成，核苷酸片段兩端分別 設計了 BamH 1(5'端）和HindIII (3'端）限制性酶切位點，把這片段合成后分別克隆到 PMD18T載體上，序列測定證實插入基因片段與設計序列一致（見序列表）。將重組質粒分 別命名為pMD18T-PRRSV(GP5/6/7/Ub)。用相應的限制性內切酶將兩種質粒進行酶切處理， 大腸桿菌表達載體選用Invitrogen公司的pRSETA質粒，也使用相同的限制性內切酶處 理，酶切條件：1〇μ1反應體系，體系內加入2μ1質粒，限制性內切酶為5個活性單位（New England biolabs)，加入IOX緩沖液1 μ 1，去離子水補齊，37°C酶切1.5小時。酶切結束 后加入Ιμ? 200mM EDTA終止反應。在1%瓊脂糖凝膠電泳中，電泳30分鐘。紫外燈下將 2. 86kb pRSETA質粒和1201bp PRRSV (GP5/6/7/Ub)片段切下，按照Qiagen公司凝膠回收試 劑盒說明書進行膠回收。按照載體：片段1 : 2-3的比例將多表位核苷酸片段單獨和表達 載體混合，反應體系15 μ 1，由T4 DNA連接酶進行連接，16°C連接過夜，獲得重組質粒分別 命名為 pRSETA-PRRSV(GP5/6/7/Ub)，（見圖 1)，轉化感受態(tài)大腸桿菌 BL21(DE3)pLysS。
[0027] 轉化：將pRSETA-PRRSV (GP5/6/7/Ub)置冰上融化，加入2 μ 1鏈接反應液，再次混 勻，冰水浴30分鐘，42 °C 30秒，然后迅速放回冰浴1. 5分鐘，加入Iml LB培養(yǎng)液，37 °C，靜 置培養(yǎng)1小時，4000g低溫離心10秒鐘棄上清，用200 μ ILB培養(yǎng)基重懸菌體；將菌液均勻 涂布于含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)板上，倒置于37°C恒溫箱中培養(yǎng)12-16小 時，直至克隆形成。
[0028] 鑒定：挑取平板上的單克隆至LB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm震蕩培養(yǎng)12小時，提取 質粒，分別使用內切酶BamH I和HindIII進行雙酶切，可以切出相應藍耳病疫苗基因大小 片段的克隆，1200bp，可初步確定為陽性克?。ㄒ妶D2);陽性克隆進行DNA序列測定進一步 驗證其正確性（見序列表）。
[0029] 誘導表達。即將陽性克隆過夜培養(yǎng)，次日早上按1 : 100轉接，培養(yǎng)3小時 后，加入0. 5mM IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)3小時，制備樣品；常規(guī)SDS-PAGE檢測目的蛋白表達情 況--在49KD(見圖3)，見到特異性條帶為正確克?。蝗≌_克隆，放大培養(yǎng)，SDS-PAGE 證實表達正確后，使用常規(guī)Western-blot進一步證實其表達準確性（見圖4);經過上述 構建及鑒定程序后，可將挑選的陽性克隆作為工程菌進行原始種子庫的建立，菌種命名 pRSETB-PRRSV(GP5/6/7/Ub)/BL21(DE3, Plys)。
[0030] 實施例三工程菌的發(fā)酵、純化與乳化
[0031] 發(fā)酵取生產菌種，接種于2ml LB液體培養(yǎng)基中（含100 μ g/ml氨芐青霉素）， 37°C，180rpm振蕩培養(yǎng)12小時活化菌種。再以1 : 100的接種量接入搖瓶，37°C振蕩培養(yǎng) 至0D600 = 3,可按10%比例接種入發(fā)酵罐。發(fā)酵用培養(yǎng)基為半合成培養(yǎng)基，用蒸餾水配制， 其中不含有任何抗生素。校正溶氧和PH值電極，開啟罐體攪拌，轉數(shù)為300rpm，罐體在線滅 菌，待罐內培養(yǎng)液溫度降至37. (TC時，標定pH及溶氧（OD)零點。發(fā)酵溫度為37. 0±0. 1°C， 溶氧控制在40 %左右，pH控制在7.0,接種后培養(yǎng)菌體0D600 = 1.0?1.2時流加補料 500ml，補料后1小時加入IPTG (終濃度為0. 5mM)誘導表達，連續(xù)誘導5個小時后發(fā)酵結束， 取樣做SDS-PAGE檢定表達情況。
[0032] 純化將收集到的菌體，用包含體洗液1(1% Triton X-100,20mMTris-cl PH8. 0) 混懸后進行超聲，2000W超聲裂解1小時。4°C，12000rpm離心收集包含體，并用包含體洗液 11(1% D0C，4M尿素，20mMTris-cl PH8.0)混懸二次超聲洗滌包含體，二次低溫離心收集包 含體。包含體沉淀用8M尿素，0. 3% β -ME，20mM Tris-cl (pH = 8. 00)混勻，室溫攪拌4小 時，8000rpm低溫離心30min，棄去沉淀。變性蛋白1 : 100稀釋，復性液用Tris(PHS. 0)緩 沖體系，加入0. 3M精氨酸，4°C攪拌復性24小時。復性液用pH = 8. 0的20mM磷酸緩沖液， 0. 5M氯化鈉，20mM咪唑，平衡上親和層析柱，用pH = 8. 0的20mM磷酸緩沖液，0. 5M氯化鈉， 0.5M咪唑洗脫；即得重組泛素化藍耳病疫苗半成品原液。做SDS-PAGE以及Western blot 印記檢定純化產物是否為目標蛋白。
[0033] 乳化將純化的半成品用滅菌的PBS稀釋至200 yg/ml。取法國賽比克公司的 Montanide ISA 50V2佐劑，經過121 °C，滅菌15分鐘，備用。按油相：水相=50 : 50的比 例配制，先將油相加入乳化缸內，開動攪拌機以80-100r/min的速度緩慢攪拌，緩緩加入水 相，加完后再攪拌2min，然后以5500r/min高速循環(huán)乳化9min，制成油包水單相疫苗。
[0034] 實施例四重組泛素化藍耳病疫苗安全性試驗
[0035] 疫苗對小白鼠的安全性
[0036] 皮下注射18-22g Balb/C小白鼠，每只注射0. 5ml，每批疫苗注射5只，共三個批 次，注射15只小白鼠，同時設定2只陰性對照，連續(xù)觀察10天，觀測小白鼠的健康狀況。
[0037] 疫苗對仔豬的安全性
[0038] 選擇30日齡健康三元雜交仔豬，每頭耳后肌肉注射重組泛素化藍耳病疫苗，每批 次5頭，共三個批次，注射15頭仔豬，同時設立陰性對照2頭，每頭注射生理鹽水白油乳化 液2ml，臨床觀察10天。
[0039] 結果
[0040] 疫苗對小白鼠的安全性試驗
[0041] 結果如表1，20120208免疫組1只受試動物第二天體溫略有升高，第三天恢復正 常，食欲和健康狀況無異常，與對照組一致，無死亡發(fā)生，可見重組泛素化藍耳病疫苗對小 白鼠是安全的，見表1。
[0042] 表1疫苗對小白鼠的安全性試驗結果
[0043]

【權利要求】
1. 一種重組泛素化藍耳病疫苗融合蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID No. 2。
2. -種核酸分子，其編碼權利要求1項所述融合蛋白。
3. -種載體，其含有權利要求2所述的核酸分子。
4. 一種宿主細胞，其含有權利要求3所述的載體。
5. 權利要求2所述的核酸分子，其具體序列如下： AACGCCAGCAGCAACGGCAGCTCTTGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGCTGATTAGGCTTGCGAAGAACTG CATGTCCTGGCGCTACTCTTGTACCAGATATACCAACTTCCTTCTGGACACTAAGGGCAGACTCTATCGTTGGCGG TCGTCCGTCATTGTGGAGAAGGGGGGTAAGGTTGAGGTCGAAGGTCACCTAATCGACCTCAAGAGAGTTGTGCTTGA TGGTTCCGCGGGTTCTGGTGGGTCGTCTCTAGACGACTTCTGCAATGATAGCACAGCTCCAAAGGTAAGTCGCGGTC GACTGGTCGTCCGGCGTCCCGGCTCCACTACGGTCGTGTTGGGTGGCAGAAAAGCTGTTAAGCAGGGAGGTGGTAAG CAGCAAAAGAAAAAGAAGGGGAATGGCCAGCCAGTCAATCAGCTGTGCCAAATGCTGGGTAAGATCATCGCCCAACA AAACCAGTCCAGAGGCAAGGGACCGGGGAAGAAAAATAGGAAGAAAAACCCGGAGAAGCCCCATTTCCCTCTAGCGA CTGAAGATGACGTCAGGCATCACTTTACCCCTAGTGAGCGGCAATTGTGTGCAGCATACACCTTGACCGGCAAGACC ATCACCCTGGAGGTGGAGCCCAGTGACACCATCGAGAATGTGAAGGCCAAGATCCAGGATAAGGAGGGCATTCCCCC CGACCAGCAGAGGCTCATCTTTGCAGGCAAGCAGCTGGAGGATGGCCGCACTCTTTCTGATTACAACATCCAGAAAG AGTCCACCCTCCATCTGGTTCTGCGTCTGAGGGGTGGTATGCAGATCTTCGTGAAGACCTTGACCGGCAAGACCATC ACTCTGGAGGTGGAGCCCAGTGACACCATCGAGAATGTGAAGGCCAAGATCCAGGATAAGGAAGGCATTCCCCCCGA CCAGCAGAGGCTCATCTTTGCAGGCAAGCAGCTGGAAGATGGCCGCACTCTTTCTGATTACAACATCCAGAAAGAGT CCACTCTCCATCTGGTTCTGCGTCTGAGGGGTGGTATGCAGATCTTCGTGAAGACCTTGACCGGCAAGACCATCACC CTGGAGGTGGAGCCCAGTGACACCATCGAGAATGTGAAGGCCAAGATCCAGGATAAGGAAGGCATTCCCCCTGACCA GCAGAGGCTCATCTTTGCAGGCAAGCAGCTGGAAGATGGCCGCACT
6. -種用于預防高致病性藍耳病的疫苗，其包含權利要求1所述的融合蛋白以及藥學 上可接受的載體。
7. 權利要求1所述的融合蛋白在制備重組泛素化藍耳病疫苗中的應用。
【文檔編號】A61K39/12GK104497148SQ201410856372
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月17日 優(yōu)先權日:2014年12月17日
【發(fā)明者】李殿明, 蒲勤, 張毓金, 齊春梅, 田春輝, 劉甜甜, 任百亮, 張導春, 黨將將, 吳啟凡 申請人:廣州譜泰生物技術有限公司