一種全人源her2抗體、其編碼基因及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥物化學領域，具體涉及一種全人源HER2抗體、其編碼基因及應用。本發(fā)明提供了一種全人源HER2抗體，其中重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO:1，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO:2。全人源HER2抗體可降低輸液反應和免疫原性，提高藥物安全性，具有更好的藥物動力學特征。
【專利說明】一種全人源HER2抗體、其編碼基因及應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及抗體【技術領域】，具體涉及一種全人源HER2抗體、其編碼基因及應用。

【背景技術】
[0002] HER2/neu (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2,人表皮生長因子受體 2)，又稱erbB-2,是生長因子受體家族成員之一。該受體蛋白通常只在胎兒時期表達，成年 以后只在極少數(shù)正常組織內(nèi)低水平表達，然而在多種人類腫瘤組織中（如乳腺癌、胃癌、卵 巢癌、肺癌、原發(fā)性腎細胞癌、子宮內(nèi)膜癌等）卻過度表達，并提示預后不良。HER2/neu的過 度表達可導致腫瘤細胞過度增殖和新生血管的形成，造成腫瘤高復發(fā)率、高轉移率和高死 亡率。研宄表明，HER2/neu的過度表達會出現(xiàn)在約30%的乳腺癌和16%的胃癌患者中，是 乳腺癌患者預后差的指征，同時在胃癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲性/轉移性上也發(fā)揮著重要作 用。
[0003] 針對HER2/neu靶點的單克隆抗體藥物治療是繼手術和放、化療后較為有效的治 療手段。赫賽?。℉erceptin)是美國Genentech公司（現(xiàn)屬Roche公司）研制，于1998年 上市的以HER2/neu為靶點的拮抗性人源化單克隆抗體藥物，被批準用于HER2/neu高表達 的乳腺癌和胃癌的治療。該抗體抑制了 HER2/neu的信息傳遞活性，從而阻斷了下游信號傳 導，導致癌細胞增殖停滯和新生血管形成的抑制。赫賽汀作為一線用藥在乳腺癌術后與化 療合用已在臨床中被證實可使病人生存期延長，并使復發(fā)率下降50%。
[0004] 赫賽汀的分子藥理機制通常被認為是通過抑制HER2磷酸化、阻斷細胞增殖周期、 加速受體內(nèi)化及抗體Fc段誘導的效應器作用（如抗體介導的細胞殺傷作用，ADCC)的共同 結果。
[0005] 盡管相當多的HER2陽性乳腺癌病人在赫賽汀治療的起始階段對抗體藥物有良好 的反應，但最終疾病還會進展和惡化，有約70 %病例對赫賽汀治療無效和產(chǎn)生耐藥狀況。因 此，尋求更為有效的抗HER2/neu抗體是目前臨床迫切需要解決的問題。
[0006] 赫賽汀的耐藥機制目前尚不完全清楚，有HER2受體以下信號傳遞通路異常，如持 續(xù)激活的PI3K途徑、磷酸化PTEN失去作用等。針對HER2分子上不同的表位產(chǎn)生的可抑制 HER2和HER3形成異源性二聚體的單克隆抗體帕妥珠單抗（Pertuzumab)與赫賽汀聯(lián)合應 用，在最近的臨床實驗中被證實與單用赫賽汀相比其對病人生存期的延長有更加明顯的作 用，說明抗體通過赫賽汀表位以外的結合位點可以產(chǎn)生不同于赫賽汀的拮抗機制，從而與 赫賽汀產(chǎn)生相加或協(xié)同效應。T-DMl是免疫抗體結合物（antibody-drug conjugate，ADC)， 是將高效價細胞毒素 DMl與單克隆抗體曲妥珠單抗（Trastuzumab，即赫賽?。┩ㄟ^共價鍵 結合，利用抗體結合HER2后的受體內(nèi)吞作用，將毒素帶入HER2陽性的腫瘤細胞，從而起到 對腫瘤細胞的殺傷作用。在之前接受過赫賽汀和化療的HER2陽性晚期或轉移性乳腺癌病 人中，與標準治療聯(lián)合使用，T-DMl可顯著延長無進展生存期。該臨床實驗數(shù)據(jù)表明，利用 HER2抗體對HER2陽性腫瘤細胞的特異免疫反應性，攜載細胞毒素進入癌細胞，可能是克服 赫賽汀藥效不足的有效途徑。臨床前實驗還顯示，利用細胞工程方法制備的去巖藻糖的曲 妥珠單抗，通過加強與效應器細胞上Fe受體的結合，獲得了更強的抗體介導的細胞殺傷作 用，在相關動物模型中展示了比赫賽汀更強的抑制腫瘤的效果。該項研宄結果提示，加強抗 體介導的細胞殺傷作用，也可能是優(yōu)化抗HER2抗體的可能途徑之一。
[0007] 赫賽汀是人源化的抗體藥產(chǎn)品，受到技術發(fā)展的制約。患者接受抗體治療后產(chǎn)生 的抗藥抗體，可能是抗體耐藥的機制之一。人源化抗體臨床常見的副作用是輸液反應。高 容量全人源抗體單鏈可變區(qū)片段（scFv)噬菌體展示文庫，是近十幾年來被國際各大生物 制藥公司利用來篩選全人源抗體的平臺之一。過去十幾年來，有利用該文庫篩選得到高親 和力全人源抗體的先例（如Abbott公司的阿達木單抗（Humira))及豐富經(jīng)驗。全人源抗 體可降低輸液反應和免疫原性，提高藥物安全性，具有更好的藥代動力學特征。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供了一種全人源的HER2抗體，其中重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO: 2。
[0009] 本發(fā)明的全人源HER2抗體，其是Fab、Fab'、F(ab'）2、Fv或scFv的形式。所述 Fab、Fab'、F(ab'）2、Fv或scFv具有本領域所慣常理解的含義。
[0010] 本發(fā)明的全人源HER2抗體，還可以包括人IgG的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)。在一 個具體的實施方案中，所述人IgG為IgGl。在一個具體的實施方案中，所述人IgG重鏈恒定 區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID N0:5,所述人IgG輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID N0:6。
[0011] 本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明全人源HER2抗體的核苷酸序列。
[0012] 在一個具體的實施方案中，編碼所述重鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID N0:3,編 碼所述輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID N0:4。在一個具體的實施方案中，當本發(fā)明的全 人源HER2抗體為全長抗體時，在本發(fā)明的核苷酸序列中，編碼所述重鏈恒定區(qū)的核苷酸序 列為SEQ ID N0:7,編碼所述輕鏈恒定區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID N0:8。
[0013] 本發(fā)明提供了一種表達載體，其中本發(fā)明的核苷酸序列與表達載體的表達控制序 列可操作地連接。在具體的實施方案中，所述表達載體是pGEM-Τ載體或293載體。
[0014] 本發(fā)明提供了一種細胞，其包含本發(fā)明的表達載體。所述細胞可以是原核或真核 的。在具體的實施方案中，所述細胞可以哺乳動物細胞，例如FreeStyle 293F細胞。
[0015] 本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的全人源HER2抗體和可藥用載體。
[0016] 此外發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的全人源HER2抗體與赫賽汀的作用機制不同，因此本 發(fā)明的全人源HER2抗體可用于對赫賽汀耐藥或對赫賽汀無反應的患者。
[0017] 本發(fā)明提供了一種聯(lián)合藥物，其包含本發(fā)明的全人源HER2抗體和赫賽汀。
[0018] 本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包含本發(fā)明的全人源HER2抗體。所述試劑盒可用于 檢測樣品中的HER2蛋白。所述試劑盒還可包含本領域檢測HER2試劑盒中的其他常用組分。
[0019] 本發(fā)明提供了本發(fā)明的全人源HER2抗體用于制備用于治療受試者中的HER2陽性 腫瘤的藥物的用途。
[0020] 所述"HER2陽性腫瘤"是指如果IHC〔免疫組化法〕檢查結果為3個加號（+++)， 即，大于30%的腫瘤細胞的胞膜呈現(xiàn)完整的強著色，就表明為HER2陽性；如果是2個加號 (++)，即，至少10%的腫瘤細胞呈現(xiàn)弱至中度完整的胞膜染色，那么進一步做FISH〔熒光原 位雜交法〕或CISH〔顯色原位雜交法〕檢查，倘若結果為陽性〔發(fā)生基因擴增〕，就可以確診 為HER2陽性。優(yōu)選地，HER2陽性腫瘤檢測結果是使用我國食品藥品監(jiān)督管理總局認證的 檢測試劑盒（IHC，F(xiàn)ISH和CISH檢測試劑盒）獲得的結果。執(zhí)業(yè)醫(yī)師熟知如何判定腫瘤是 否為HER2陽性腫瘤。
[0021] 所述HER2陽性的腫瘤可以選自HER2陽性的乳腺癌、胃癌、肺癌、非小細胞肺癌、 骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸癌、皮膚或眼內(nèi)黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區(qū)癌、 結腸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金病、食道癌、小腸 癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀芳腺癌、腎上腺癌、軟組織癌、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、 膀胱癌、腎或尿道癌、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽囊癌、慢性或急性白血病、淋 巴細胞淋巴瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)癌、脊柱腫瘤、腦干神經(jīng)膠質瘤、多形性成膠質細胞瘤 (glioblastoma multiforme)、星形細胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、室管膜瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、腦膜瘤、 鱗狀細胞瘤和垂體腺瘤。
[0022] 優(yōu)選地，所述受試者是人。
[0023] 優(yōu)選地，所述受試者是對赫賽汀耐藥或對赫賽汀無反應的人。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖IA顯示了重組全長抗人HER2抗體GB235-049重鏈表達載體（293-VH-CH)的結 構示意圖；圖IB顯示了重組全長抗人HER2抗體GB235-049輕鏈表達載體（293-VL-CL)的 結構示意圖。以PCR方法，利用相應模板和引物（詳見實施例5)分別獲得含5'端EcoRI 酶切位點的信號肽、重鏈可變區(qū)（VH)、含TGA終止密碼子和3'端BamH I酶切位點的重鏈恒 定區(qū)（CH)基因片段，并以over-lapping PCR方法將三段聯(lián)接，獲得GB235-049抗體的重鏈 全長基因片段。以相同方法獲得GB235-049抗體含信號肽、輕鏈可變區(qū)（VL)和輕鏈恒定區(qū) (CL)的輕鏈全長基因片段。利用EcoRI和BamH I酶切形成的粘性末端分別將重鏈和輕鏈 全長基因片段克隆至PGEM-T載體。
[0025] 圖2顯示了重組全長抗人HER2抗體GB235-049的SDS-PAGE電泳結果圖。將純化 得到的68235-049抗體和赫賽汀對照樣品在50禮二硫蘇糖醇還原條件下經(jīng)10%聚丙烯酰 氨凝膠電泳解析，結果顯示GB235-049抗體和赫賽汀均呈現(xiàn)分子量為50KDa和25KDa的兩 條帶，分別為抗體的重鏈和輕鏈。
[0026] 圖3顯示了重組全長抗人HER2抗體GB235-049與人HER2抗原的結合結果圖。以 重組人HER2抗原包被ELISA板，以不同濃度的GB235-049抗體和赫賽汀與包被于板上的抗 原分子結合，并以HRP標記的羊抗人IgG Fc抗體測定結合的抗體。結果顯示與赫賽汀一樣， GB235-049抗體可結合于人HER2,并呈現(xiàn)出濃度依賴性和可飽和性。
[0027] 圖4A顯示了重組全長抗人HER2抗體GB235-049與猴HER2抗原的結合結果圖。以 猴HER2抗原包被ELISA板，以不同濃度的GB235-049抗體和赫賽汀與包被于板上的抗原分 子結合，并以HRP標記的羊抗人IgG Fc抗體測定結合的抗體。結果顯示GB235-049與赫賽 汀一樣，GB235-049抗體可結合于猴HER2,并呈現(xiàn)出濃度依賴性和可飽和性。
[0028] 圖4B顯示了重組全長抗人HER2抗體GB235-049與小鼠 HER2抗原的結合結果圖。 在用ELISA測定GB235-049抗體與猴HER2免疫反應性的同時，以重組小鼠 HER2抗原被 ELISA板，以不同濃度的GB235-049抗體和赫賽汀與包被于板上的抗原分子結合，并以HRP 標記的羊抗人IgG Fc抗體測定結合的抗體。結果顯示GB235-049抗體、赫賽汀與小鼠 HER2 均無交叉反應。
[0029] 圖5顯示了重組全長抗人HER2抗體GB235-049與人HER家族其它成員人HER1、 HER3、HER4抗原的結合實驗結果圖。以重組人HERl、HER2、HER3和HER4抗原分別包被ELISA 板，以GB235-049抗體和赫賽汀（均為10 μ g/mL)與包被于板上的抗原分子結合，并以HRP 標記的羊抗人IgG Fc抗體測定結合的抗體。結果顯示與赫賽汀一樣，GB235-049抗體可結 合于人的HER2,并且與其他HER家族成員分子沒有免疫反應性。
[0030] 圖6顯示了重組全長抗人HER2抗體GB235-049與赫賽汀表位競爭的結果圖。用 ELISA方法，以重組人HER2抗原包被ELISA板，以不同濃度的GB235-049抗體和赫賽汀分別 與生物素標記的赫賽?。?. 005 μ g/mL固定濃度）共同室溫孵育2小時后和HER2包被的板 結合，并用HRP標記的抗生物素抗體檢測結合的抗體。結果顯示，隨赫賽汀濃度增加，生物 素標記的赫賽汀在HER2抗原上的結合受到抑制；而GB235-049抗體即使是在實驗涉及的最 高濃度（10 μ g/mL)時，仍對生物素標記的赫賽汀在HER2上的結合無抑制作用。
[0031] 圖7顯示了重組全長抗人HER2抗體GB235-049與BT-474細胞的結合曲線結果圖。 將表達中等水平的HER2和表達高水平的P-HER2的BT-474乳腺癌細胞在96-孔U型板中 分別與不同濃度的GB235-049抗體和赫賽汀孵育，在充分洗滌后，以HRP標記的羊抗人Fc 抗體檢測結合抗體。結果顯示，GB235-049抗體和赫賽汀一樣可結合于表達HER2的細胞表 面，且呈現(xiàn)出濃度依賴性和可飽和性，提示GB235-049抗體對HER2有高度選擇性。
[0032] 圖8顯示了重組全長抗人HER2抗體GB235-049體外抑制BT-474細胞增殖活性的 實驗結果。將表達中等水平的HER2和表達高水平的P-HER2的BT-474乳腺癌細胞在96-孔 平底型板中分別與2和10 μ g/mL的GB235-049抗體和赫賽汀孵育72小時后用Alamar Blue 測定細胞活性。結果顯示，兩個抗體在兩種濃度下均能明顯抑制BT-474細胞增殖。
[0033] 圖9顯示了重組全長抗人HER2抗體GB235-049體外抑制BT-474細胞增殖活性可 被可溶性人HER2抗原翻轉。將HER2高表達的BT-474乳腺癌細胞在96-孔平底板中分別 與不同濃度的GB235-049抗體和赫賽汀孵育72小時，或在各抗體濃度條件下加入100 μ g/ mL的重組人HER2抗原，并孵育72小時，用Alamar Blue測定細胞活性。結果顯示，與空白 對照相比，兩個抗體在兩種濃度下均能明顯抑制BT-474細胞增殖。在存在可溶性HER2抗 原的條件下，高濃度赫賽汀抗體對細胞增殖的抑制作用部分被翻轉，低濃度赫賽汀抗體對 細胞增殖的作用完全被翻轉，而GB235-049抗體無論是在高濃度還是低濃度條件下均被翻 轉，提示抗體對腫瘤細胞增殖的抑制作用是HER2特異性的。
[0034] 圖10A、圖10B、圖IOC分別顯示了重組全長抗人HER2抗體GB235-049體外作用 BT-474細胞2小時、24小時、72小時后的P-HER2、P-Akt、P-ERK1/2蛋白表達結果圖。將 表達中等水平的HER2和表達高水平的P-HER2的BT-474在含10%胎牛血清培養(yǎng)基中與2 和20 μ g/mL赫賽汀和GB235-049抗體孵育，并分別于2、24和72小時取樣。以細胞裂解 液做免疫印跡，以相應抗體分別探測全部和磷酸化的HER2、ERK1/2和Akt。圖IOA的結果 顯示，在抗體作用2小時的情況下，與對照組相比，20 μ g/ml和2 μ g/ml的赫賽汀均可引起 P-HER2和P-Akt的下調(diào)，而GB235-049抗體對P-HER2和P-Akt的下調(diào)作用均不明顯，對 P-HER2有輕微的上調(diào)作用。圖IOB的結果顯示，在24小時的作用條件下，赫賽汀對P-HER2 和P-Akt的下調(diào)作用與2小時的一致，而GB235-049抗體對P-HER2有上調(diào)作用，但對P-Akt 無明顯作用。圖IOC的結果顯示，在作用72小時的條件下，20 μ g/ml和2 μ g/ml的赫賽汀 對P-HER2、P-Akt和P-ERK1/2都產(chǎn)生了明顯的下調(diào)作用，而GB235-049抗體主要活性體現(xiàn) 在對P-ERK1/2的下調(diào)作用上，無論是在20 μ g/ml還是2 μ g/ml，其下調(diào)作用都很明顯。

【具體實施方式】
[0035] 本文所用的術語"抗體"是能夠通過至少一個抗原識別位點，和靶分子（包括糖、 多聚核酸、脂類、多肽等）特異結合的免疫球蛋白。完整的抗體由兩個相同的輕鏈（L)和兩 個相同的重鏈（H)組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵和重鏈相連，而不同免疫球蛋白同 種型的重鏈間的二硫鍵數(shù)目不同。每條重鏈和輕鏈也有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈 的一端有可變區(qū)（VH)，其后是多個恒定區(qū)。每條輕鏈的一端有可變區(qū)（VL)，另一端有恒定 區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一個恒定區(qū)相對，輕鏈的可變區(qū)和重鏈的可變區(qū)相對。特殊的 氨基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區(qū)之間形成界面。
[0036] 本文所用的術語"可變區(qū)"表示抗體中可變區(qū)的某些部分在序列上有所不同，它形 成了各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，可變性并不均勻地分布在整個可 變區(qū)中。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中稱為互補決定區(qū)（CDR)或超變區(qū)中的三個片段中。 可變區(qū)較保守的部分稱為構架區(qū)（FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)中各自包括四個FR區(qū)，它 們大致上呈β-折疊構型，由形成連接環(huán)的三個⑶R區(qū)相連，在某些情況下可形成部分β 折疊結構。每條鏈中的CDR通過FR區(qū)緊密地靠在一起并與另一鏈的CDR -起形成抗體的 抗原結合部位（參見Kabat等，NIH Publ. No. 91-3242,卷I，647-669頁（1991)。恒定區(qū)不 直接參與抗體與抗原的結合，但是它們表現(xiàn)出不同的效應功能，例如參與抗體的依賴于抗 體的細胞毒性。
[0037] 脊椎動物抗體（免疫球蛋白）的"輕鏈"可根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列歸為明顯 不同的兩類（稱為κ和λ)中的一類。根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以 分為不同的種類，主要有5類免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些還可進一步 分為亞類（同類型），如IgGl，IgG2, IgG3, IgG4, IgAl和IgA2。對應于不同免疫球蛋白重 鏈恒定區(qū)分別稱為α、β、ε、μ、γ。不同免疫球蛋白的亞單位結構和三維構型是眾所周 知的。
[0038] 本文所用的"全人源抗體"是指抗體基因來源于人類的抗體。
[0039] 本文中，所謂"抗體"不但包括完整的多克隆或者單克隆抗體，也包括各種抗體片 段（如Fab、Fab'、F(ab'） 2、Fv)，單鏈抗體（scFv)，由抗體片段形成的多特異性抗體，含有抗 體片段的融合蛋白，以及任何經(jīng)過改造但包含所需特異性識別位點的免疫球蛋白分子?？?體的來源或者制備方法并不受限制，例如通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達、轉基因動物 等。
[0040] 下面將結合實施例進一步詳細地描述本發(fā)明，然而應該理解，列舉這些實施例只 是為了說明本發(fā)明，而不是用來限制本發(fā)明。下列實施例中未特別指明的濃度為質量百分 比濃度；未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，《分子克隆 實驗指南》（New York :Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按 照制造廠商所建議的條件。
[0041] 實施例1從全人源scFv B莖菌體文庫中篩選scFv的陽性克隆
[0042] 人HER2 (胞外域）-Fc融合蛋白（下文稱為hHER2-Fc)抗原（購自Sino Biological 公司，貨號：10004-H02H)用磷酸鹽緩沖液PBS (0· OlM Na2HPO4 ·12Η20+0· 002MKH 2Ρ04+0· 14Μ NaCl+0. 002Μ KC1，pH = 8. 6)稀釋至 5 μ g/ml，按照 100 μ 1/ 孔加入酶標板中， 4°C包被過夜。PBST(含0. 05%吐溫20的PBS緩沖液）洗板4次后加入5% BSA(牛血清 白蛋白，貨號：A7030,購自Sigma公司）300 μ1/孔，37°C封閉1小時。再用PBST洗板2次。 將含有7 X IOltl個獨立克隆的全人源scFv噬菌體抗體文庫（此抗體庫由優(yōu)瑞科（北京）生 物技術有限公司以多個健康人淋巴細胞的抗體可變區(qū)基因與人工合成的重鏈CDR3基因組 合構建而成）的懸液按照100 μ 1/孔加入酶標板中，在37°C條件下孵育2小時。吸出噬菌 體懸液，加入PBST充分吹打5分鐘。在第一輪淘選過程中，PBST吹打一遍，在第二輪和第三 輪淘選中，PBST分別進行五遍和十遍的吹打，以去除非特異性的結合。加入含0. 1 % BSA的 0. 2M甘氨酸-鹽酸（pH = 2. 2)洗脫液，室溫孵育10分鐘后，充分地吹打，洗脫陽性克隆的 噬菌體。將洗脫下的陽性克隆的噬菌體懸液用I MTris-HCUpH = 9. 1)緩沖液中和至中性， 感染對數(shù)期的大腸桿菌（購自Lucigen公司，貨號：60502-1)并擴增，用于下一輪淘選（第 一、二輪）。第三輪淘選時，需將洗脫液進行梯度稀釋并感染對數(shù)期宿主菌，在帶氨芐（Amp) 抗性的LB瓊脂培養(yǎng)皿上分離出單克隆來，用于單克隆鑒定及質粒保存。
[0043] 實施例2 scFv噬菌體陽性克隆的酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)鑒定
[0044] hHER2-Fc抗原用PBS (pH = 8. 6)稀釋至2 μ g/ml，按照100 μ 1/孔加入酶標板中， 4°C包被過夜。PBST洗板4次后加入5% BSA 300 μ 1/孔，37°C封閉1小時。再用PBST洗板 2次，加入100 μ 1/孔噬菌體陽性克隆懸液，在37°C條件下孵育2小時。PBST洗板4次，加 入HRP(辣根過氧化物酶）標記的抗M13噬菌體抗體（購自GE公司，貨號：27-9421-01，用 PBSTl: 5000稀釋，100 μ 1/孔），室溫孵育1小時。PBST洗板4次，加入100 μ 1/孔顯色液 (可溶型單組分TMB底物溶液，購自Tiangen公司，貨號：ΡΑ107-01)，室溫孵育15分鐘顯色， 加入50 μ 1/孔終止液（1Μ硫酸），在多功能酶標儀（Model 680Micro reader，購自Bio-Rad 公司）上450/630nm的波長下讀出吸光值。
[0045] 結果顯示，經(jīng)過三輪篩選，共獲得1312種全人源scFv，可與hHER2-Fc抗原特異性 結合的scFv噬菌體陽性克隆有499種。經(jīng)DNA測序，這些陽性克隆中有102種核苷酸/氨 基酸序列均不相同的scFv (如表1所示）。
[0046] 表 L
[0047]

【權利要求】
1. 一種全人源的HER2抗體，其中重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1，輕鏈可變 區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID N0:2。
2. 權利要求1的全人源HER2抗體，其是Fab、Fab'、F(ab'）2、Fv或scFv的形式。
3. 權利要求1的全人源HER2抗體，還包括人IgG的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)；優(yōu)選地， 所述人IgG為IgGl;更優(yōu)選地，所述人IgG重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID N0:5,所述 人IgG輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID N0:6。
4. 編碼權利要求1-3任一項的全人源HER2抗體的核苷酸序列；優(yōu)選地，在所述核苷酸 序列中，編碼所述重鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID N0:3,編碼所述輕鏈可變區(qū)的核苷酸 序列為 SEQ ID N0:4。
5. 權利要求4的編碼全人源HER2抗體的核苷酸序列，其中當所述全人源HRE2抗體包 含重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)時，編碼所述重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID N0:7,編碼所 述輕鏈恒定區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID N0:8。
6. -種包含權利要求4的核苷酸序列的表達載體，所述核苷酸序列與所述表達載體的 表達控制序列可操作地連接；優(yōu)選地，所述表達載體為PGEM-T載體或293載體。
7. -種藥物組合物，其包含權利要求1-3任一項的全人源HER2抗體和可藥用載體。
8. -種聯(lián)合藥物，其包含權利要求1-3任一項的全人源HER2抗體和赫賽汀。
9. 一種檢測人HER2的試劑盒，其包含權利要求1-3任一項的全人源HER2抗體。
10. 權利要求1-3任一項的全人源HER2抗體用于制備用于治療受試者中的HER2陽性 腫瘤的藥物的用途；優(yōu)選地，所述HER2陽性的腫瘤選自HER2陽性的乳腺癌、胃癌、肺癌、非 小細胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸癌、皮膚或眼內(nèi)黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、 肛門區(qū)癌、結腸癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金病、食道癌、小腸 癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀芳腺癌、腎上腺癌、軟組織癌、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、 膀胱癌、腎或尿道癌、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽囊癌、慢性或急性白血病、淋 巴細胞淋巴瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)癌、脊柱腫瘤、腦干神經(jīng)膠質瘤、多形式成膠質細胞瘤 (glioblastoma multiforme)，星形細胞瘤，神經(jīng)鞘瘤，室管膜瘤，成神經(jīng)管細胞瘤，腦膜 瘤、鱗狀細胞瘤和垂體腺瘤；優(yōu)選地，所述受試者是人；更優(yōu)選地，所述受試者是對赫賽汀 耐藥或對赫賽汀無反應的人。
【文檔編號】A61K39/395GK104497140SQ201410704632
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年11月26日 優(yōu)先權日:2014年11月26日
【發(fā)明者】周清, 舒孟軍, 石姝, 言蘇, 譚濤超 申請人:嘉和生物藥業(yè)有限公司