錳超氧化物歧化酶模擬物在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種錳超氧化物歧化酶模擬物（MnSODm）的醫(yī)藥新用途——在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用。通過考察錳超氧化物歧化酶模擬化合物對2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎（UC）的治療作用，表明MnSODm 對TNBS誘導(dǎo)的大鼠UC有明顯的治療作用，因此，可用于治療UC藥物的制備，即以錳超氧化物歧化酶模擬物為活性成分，按常規(guī)工藝和輔料制備成藥劑學可接受的制劑。
【專利說明】錳超氧化物歧化酶模擬物在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物中 的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種錳超氧化物歧化酶模擬物（MnSODm)的醫(yī)藥 新用途--在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis, UC)，又稱非特異性潰瘍性結(jié)腸炎，是一種原 因未明的直腸和結(jié)腸慢性炎性疾病。病變主要位于結(jié)腸的粘膜層，且以潰瘍?yōu)橹?，多累及?腸和遠端結(jié)腸，也可遍及整個結(jié)腸。近年來，隨著人民生活水平的不斷提高、飲食結(jié)構(gòu)的變 化、工作壓力增大、生活節(jié)奏加快，UC的發(fā)病率逐年提高。該病與結(jié)腸癌的發(fā)病有關(guān)，且病 程長、病變程度輕重各異，由于病因不明，臨床上常表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作且治愈難度大，被世界 衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一。
[0003] 現(xiàn)有治療UC的藥物5-氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素類和免疫抑制劑副作用大，而正 在研究中的生物治療藥物，如抗腫瘤壞死因子抗體、干擾素等在治療過程中常產(chǎn)生抗藥體， 難以長期應(yīng)用，還有部分病人對現(xiàn)有藥物不產(chǎn)生應(yīng)答，因而迫切需要研究新作用機制的藥 物，開辟藥物治療UC的新途徑。
[0004] 超氧化物歧化酶（SOD)是生物抗氧化酶類的重要成員，是生物體有效清除活性氧 的重要酶類之一。SOD分為三種：含銅與鋅的超氧化物歧化酶（CuZnSOD)，含錳的超氧化物 歧化酶（MnSOD)和含鐵的超氧化物歧化酶（FeSOD)，三種SOD都有催化超氧化物陰離子自 由基（CV)發(fā)生歧化反應(yīng)的作用。MnSOD主要存在于真核細胞、原核細胞及線粒體的基質(zhì)中， 它作為一種重要的抗氧化劑在機體防御疾病的過程中起著重要的作用。天然的MnSOD具 有分子質(zhì)量大、在體內(nèi)半衰期短、穩(wěn)定性差、易被蛋白酶水解，且長期注射使用可誘發(fā)免疫 和過敏反應(yīng)等不足，限制了其臨床應(yīng)用。為了解決這一問題，國內(nèi)外學者主要應(yīng)用分子工程 方法對SOD進行分子修飾或制成脂質(zhì)體。對MnSOD的化學模擬已成為認識天然酶的有利 工具，以合成的錳超氧化物歧化酶模擬物替代天然SOD應(yīng)用于臨床已成為新的研究熱點。
[0005] 錳超氧化物歧化酶模擬物（MnSODm)是以水溶性較好的柔性脂肪胺和具有 良好生物相溶性的鄰香草醛合成的含有雙核結(jié)構(gòu)的MnSOD模擬化合物，分子式為 (C 4tlH57Mn2N9O21),結(jié)構(gòu)式見圖 1。
[0006] MnSODm的結(jié)構(gòu)特征是：在一個配合物分子中含有兩個錳活性中心，增加了同一 位點的活性濃度，具有較高的活性。與天然MnSOD相比有性質(zhì)穩(wěn)定、分子量小、水脂兼溶、 易跨膜和活性高的特點，并且合成方法簡便，成本低廉，純度高，產(chǎn)率高，較好地克服了天然 MnSOD的局限性。我們前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MnSODm具有極強的抗氧化、清除氧自由基作 用和抗炎活性，其對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷有明顯的保護作用，而MnSODm對大鼠 潰瘍性結(jié)腸炎是否有治療作用，目前尚未見報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種錳超氧化物歧化酶模擬物MnSODm的醫(yī)藥新用途-- 在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用。
[0008] 下面擬采用2, 4, 6-三硝基苯磺酸（TNBS)誘導(dǎo)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，觀察 MnSODm對大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用，探討錳超氧化物歧化酶模擬物治療潰瘍性結(jié)腸 炎的作用機制。
[0009] 材料 1. 1動物 Wistar大鼠，體重180?200 g，L購自蘭州大學實驗動物中心，動物合格證號：醫(yī) 動字第 SCXK (甘）2009-0006。
[0010] 1. 2 藥物 錳超氧化物歧化酶模擬化合物（MnSODm，C4tlH63Cl3Mn具O 16，純度：98%)，由蘭州大學化工 學院竇偉教授提供；柳氮磺吡啶（SASP):上海信誼嘉華藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號011213。
[0011] 1. 3藥物的配制：MnSODm低劑量溶液的配制：按10mg/kg給藥，用注射用水配成 濃度為1%的MnSODm溶液；MnSODm中劑量溶液的配制：按20mg/kg給藥，用注射用水配 成濃度為2%的MnSODm溶液；MnSODm高劑量溶液的配制：按40mg/kg給藥，用注射用水 配成濃度為度為4%的MnSODm溶液；SASP溶液的配制：按500 mg/kg給藥，用生理鹽水 配成濃度為5%的SASP溶液。
[0012] 1.4 試劑 2,4,6-三硝基苯橫酸（2,4,6-1'1'：[11；[1：1'(^611261168111;1^011；[。3(^(1801111:;[011，1他3)水 溶液（Sigma公司，5% (w/v));髓過氧化物酶（ΜΡ0)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-Px)、超氧化物歧化酶（S0D)、一氧化氮合酶（iNOS)和一氧化氮（NO)及考馬斯亮蘭蛋 白試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；無水乙醇(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，分析 純)。
[0013] 1.5主要儀器 高速低溫離心機（TGL-16G-A，上海安亭科學儀器廠制造）；臺式離心機（KA-1000,上海 安亭科學儀器廠制造);電動玻璃勻漿機（DY-2,寧波新芝生物科技股份有限公司制造);稱結(jié) 腸重用電子天平（〇.〇〇〇1~200 g，F(xiàn)A1604S，上海天平儀器廠）；可見分光光度計（722S，上海 精密科學儀器有限公司制造）；稱體重用電子天平（0. 1~600 g，SPS2001F，梅特勒-托利多 常州稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司）；SPX-250B-D型振蕩培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè) 備廠；SPX-250B-D型振蕩培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。
[0014] 實驗方法 2. 1分組 Wistar大鼠，體重180-220 g，L按體重隨機分為6組，分別為：正常對照組；模型 對照組；柳氮磺吡啶組做為陽性對照組（500 mg/kg) ;MnS0Dm低劑量組（10 mg/kg)、中劑量 組（20 mg/kg)及高劑量組（40 mg/kg)。
[0015] 2. 2大鼠 UC模型的制備 各組大鼠禁食不禁水48 h，記錄體重，腹腔注射（ip)戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉。 手提大鼠尾部，使大鼠倒立，將16號灌胃針頭輕揉插入大鼠結(jié)腸距肛門8 cm，緩慢注入 100 mg/kg TNBS乙醇溶液（25 mg/mL，0.4 mL/100g)，把大鼠放歸籠中，待其自然蘇醒，給予 水和飼料。正常對照組緩慢注入相應(yīng)生理鹽水。
[0016] 2.3 給藥 致炎24 h后，正常對照組、模型對照組用生理鹽水水灌胃（I mL/100 g)，柳氮磺吡啶 組給予SASP溶液按500 mg/kg灌胃（按I mL/100 g)，MnS0Dm低、中、高劑量組分別用 MnSODm的溶液按10、20、40 mg/kg灌胃（均按I mL/100 g)，l次/d,連續(xù)給藥7 d。每日 稱體重，記錄腹瀉及糞便性狀，觀察食量的變化及動物的活動情況和外觀等。
[0017] 2. 4取材、腸組織損傷大體形態(tài)及組織學評分 連續(xù)給藥7 d的大鼠，于第7 d給藥24 h后全部處死。其具體步驟：（1)各組大鼠 腹腔注射（i.P.)戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉，迅速剖腹，腹主動脈取血5 mL，4 °C放置2 h后，以3000 r/min離心10 min,分離血清，放于-20 11C冰箱保存，嚴格按試劑盒說明 書檢測血清中MPO、SOD、GSH-Px及iNOS活力和MDA及NO含量。（2)取出肛門至盲腸 末端的整個結(jié)腸和直腸段，沿腸系膜剪開腸腔，用冷的生理鹽水沖洗腸內(nèi)容物，再用濾紙拭 干，將整個腸段平鋪于塑料板上，拍照，按表.1進行大體觀察損傷評分。（3)稱量整個腸段， 取各組大鼠結(jié)腸病變最明顯處部分組織，用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，HE染色，按表1 所列評分標準進行組織病理學損傷評分。（4)再剪取部分病變組織塊，準確稱重后，用眼科 剪剪碎，加冷生理鹽水，低溫制成10%組織勻漿，取部分未離心的勻漿測定MPO活性，余 下的勻漿組織用低溫離心機以4000 r/min離心10 min，取上清液，-20 °C冰箱保存，嚴 格按試劑盒說明書檢測組織中SOD、GSH-Px及iNOS活力和MDA及NO含量。

【權(quán)利要求】
1. 錳超氧化物歧化酶模擬物在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1所述錳超氧化物歧化酶模擬物在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物中的應(yīng) 用，其特征在于：以錳超氧化物歧化酶模擬物為活性成分，按常規(guī)工藝和輔料制備成藥劑學 可接受的制劑。
3. 如權(quán)利要求2所述錳超氧化物歧化酶模擬物在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物中的應(yīng) 用，其特征在于：所述制劑為顆粒、膠囊、滴丸、注射液。
【文檔編號】A61P1/04GK104490860SQ201410701343
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月28日
【發(fā)明者】李紅玲, 王艷紅 申請人:甘肅省人民醫(yī)院