一種膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜、制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜的制備方法，包括以下步驟：（1）以豬腿肌腱為原料，經(jīng)剪切、酶解、離心、過濾、溶解，得到Ⅰ型膠原溶液；（2）用1M碳酸氫鈉溶液對步驟（1）得到的Ⅰ型膠原溶液進(jìn)行中和；（3）將步驟（2）中中和后的Ⅰ型膠原溶液倒入模具，于30~40℃干燥35~54h，在模具內(nèi)形成Ⅰ型膠原基質(zhì)膜；（4）將步驟（3）得到的Ⅰ型膠原基質(zhì)膜浸泡于20~200ug/mL甲狀旁腺激素相關(guān)肽溶液中，于30~40℃孵育0.5~2h，得到復(fù)合甲狀旁腺激素相關(guān)肽的Ⅰ型膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜。本發(fā)明還公開了一種膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜及其應(yīng)用。本發(fā)明的軟骨修復(fù)膜對軟骨損傷面有一定的粘附性，適宜軟骨損傷修復(fù)。
【專利說明】—種膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜、制備方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物材料制備領(lǐng)域，特別涉及一種含活性因子的膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜的快速制備方法與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]關(guān)節(jié)軟骨能減少相鄰兩骨間的摩擦，緩沖運(yùn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的震動(dòng)，所以由體育運(yùn)動(dòng)造成的軟骨損傷極為普遍。有數(shù)據(jù)表明，單美國的軟骨相關(guān)手術(shù)每年就有超過40萬例。由于軟骨無血管、無神經(jīng)，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為軟骨損傷無法自發(fā)修復(fù)，如果不采取外加手段干預(yù)治療，會(huì)導(dǎo)致進(jìn)一步的軟骨磨損，甚至引發(fā)骨關(guān)節(jié)炎，對其結(jié)構(gòu)和功能造成不可逆的損害，嚴(yán)重影響患者的生活工作質(zhì)量。目前臨床治療表層軟骨損傷的保守治療方法包括關(guān)節(jié)腔灌洗清創(chuàng)術(shù)，微骨折術(shù)等只能減輕關(guān)節(jié)疼痛和暫時(shí)緩解臨床癥狀，并不能有效地促進(jìn)軟骨組織的修復(fù)再生，阻止病程的發(fā)展。因此，尋找新型的、可有效促進(jìn)軟骨生理性再生修復(fù)的方法具有極其重要的臨床意義。
[0003]近年來，隨著組織工程和再生醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷成熟，為提高軟骨的修復(fù)質(zhì)量帶來嶄新的機(jī)會(huì)。天然生物材料I型膠原，由于其免疫原性低，生物相容性好，降解速率可控等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于軟骨組織工程支架的制備。如德國Arthro Kinetics公司的CaReS產(chǎn)品是由鼠尾I型膠原構(gòu)成的3D支架，用于治療3.5-14 cm2大小的軟骨缺損；中國發(fā)明專利(ZL200710068762.5 ) “一種軟骨組織工程支架及其應(yīng)用”中，用I型膠原構(gòu)建含有致密層與疏松層的雙層海綿支架，用于骨軟骨損傷修復(fù)。
[0004]此外，有研究者發(fā)現(xiàn)軟骨修復(fù)過程中會(huì)出現(xiàn)軟骨鈣化的跡象。軟骨鈣化一般發(fā)生于生理性生長板軟骨內(nèi)骨化過程，在此過程中，軟骨細(xì)胞肥大、軟骨基質(zhì)礦化、降解，骨基質(zhì)增多，鈣化層上移，雙重潮線出現(xiàn)，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)面受力改變，軟骨結(jié)構(gòu)和功能受損甚至骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。
[0005]甲狀旁腺激素相關(guān)肽(PTHrP)是甲狀腺激素家族中的一員，作為鈣化抑制因子參與生長板發(fā)育過程。甲狀旁腺激素相關(guān)肽由173個(gè)氨基酸組成，其活性片段1-34與甲狀旁腺激素(PTH) —致。美國禮來制藥研發(fā)的藥物特立帕肽(商品名Forteo)為人重組蛋白PTH(1-34)，用于有骨折高發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥的治療。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明是提供一種膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜的制備方法，預(yù)先制備的膠原基質(zhì)膜可在使用時(shí)與活性因子PTHrP (1-34)(甲狀旁腺激素相關(guān)肽)迅速復(fù)合，保證了甲狀旁腺激素相關(guān)肽的生物活性，其可以解決現(xiàn)有技術(shù)中的軟骨修復(fù)過程中會(huì)出現(xiàn)軟骨鈣化的缺點(diǎn)。
[0007]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
一種膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜的制備方法，包括以下步驟:(1)以新鮮豬腿肌腱為原料，經(jīng)剪切、酶解、離心、過濾、溶解，獲得I型膠原溶液；(2)用IM碳酸氫鈉溶液對步驟(I)得到的5?20 mg/mL I型膠原溶液進(jìn)行中和；(3)將步驟2得到的中和后的I型膠原溶液倒入模具，于3(T40°C干燥48h，在模具內(nèi)形成I型膠原基質(zhì)膜；(4)手術(shù)前，將步驟3得到的I型膠原基質(zhì)膜浸泡于2(T200 ug/mL甲狀旁腺激素相關(guān)肽溶液中，于3(T40°C孵育0.5?2h，得到復(fù)合甲狀旁腺激素相關(guān)肽的I型膠原基質(zhì)膜材料。
[0008]進(jìn)一步，步驟(I)所述I型膠原溶液的制備方法為:A)從二月齡健康白豬豬腿處剝?nèi)〖‰?，去除筋膜和脂肪，剪碎浸泡于體積濃度75%的乙醇水溶液中，4 °C過夜；B)將步驟A的肌腱碎片用蒸餾水沖洗5遍，加入0.5mol/L的乙酸水溶液中，調(diào)節(jié)pH至I，加入胃蛋白酶，4 °C放置3天，獲得膠原溶膠液；所述乙酸水溶液的體積用量以肌腱碎片質(zhì)量計(jì)為18.9mL/g，所述胃蛋白酶質(zhì)量用量以肌腱碎片質(zhì)量計(jì)為94.7mg/g ;C)將步驟B獲得的膠原溶膠液于4°C、4000rpm水平離心25分鐘，棄上層脂肪層，將沉淀a用0.5mol/L乙酸水溶液稀釋3倍體積，在超凈臺(tái)中用4層紗布過濾，將濾液與0.9mol/L的NaCl水溶液以體積比1:10混合，間歇震蕩，4 °C過夜，再在4 °C、4000rpm水平離心25分鐘，棄上清液及懸浮物，獲得沉淀b ;D)將沉淀b按下述方式之一處理，制備水溶性I型膠原:a )將沉淀b用0.5mol/L的乙酸水溶液在4 1:溶解過夜，所述乙酸水溶液與沉淀b的體積比為4:1，獲得所述水溶性I型膠原；b )將沉淀b置于直徑0.25 μ m的再生纖維素透析袋中，以三蒸水作為透析液，每天換水Γ 6次，透析3天，將透析袋中透析后的沉淀置于培養(yǎng)皿中-80 °C過夜，再于凍干機(jī)中抽干2?3天，獲得所述水溶性I型膠原。
[0009]進(jìn)一步，步驟(2)中，用IM碳酸氫鈉溶液對步驟(I)得到的I型膠原溶液進(jìn)行中和，其中I型膠原溶液的濃度為10 mg/mL。
[0010]進(jìn)一步，步驟(2)所述碳酸氫鈉溶液與I型膠原水溶液的體積比是廣4:1。
[0011]進(jìn)一步，步驟(2)所述碳酸氫鈉溶液與I型膠原水溶液的體積比是2.3:1。
[0012]進(jìn)一步，步驟(3)所述模具可以為表面平整光滑的各種形狀、各種材質(zhì)的模具，通常采用塑料材質(zhì)的方形皿、圓形皿或孔板容器。
[0013]進(jìn)一步，步驟(4)所述甲狀旁腺激素相關(guān)肽溶液選用商品化的人重組蛋白甲狀旁腺激素相關(guān)肽粉末配制。
[0014]進(jìn)一步，步驟(4)所述甲狀旁腺激素相關(guān)肽溶液由滅菌PBS緩沖液(pH=7.4)配制成的水溶液。
[0015]進(jìn)一步，步驟(4)所述甲狀旁腺激素相關(guān)肽溶液的體積用量是I型膠原基質(zhì)膜體積的10?20倍。
[0016]本發(fā)明還公開了一種膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜，其通過上述制備方法制備得到。
[0017]本發(fā)明還公開了膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜在制備軟骨損傷的修復(fù)治療或聯(lián)合其他全層軟骨損傷或骨軟骨損傷修復(fù)治療的支架材料中的應(yīng)用。
[0018]本發(fā)明所述的軟骨修復(fù)膜，顏色半透明、表面光滑，對軟骨損傷面有一定的粘附性，適宜軟骨損傷修復(fù)。
[0019]本發(fā)明所述的軟骨修復(fù)膜，制備工藝中不接觸有毒物質(zhì)，未使用變性劑、促凝劑和交聯(lián)劑等添加劑。
[0020]本發(fā)明所述的軟骨修復(fù)膜，制備工藝簡單，手術(shù)操作前將預(yù)先制備的膠原基質(zhì)膜在使用前與甲狀旁腺激素相關(guān)肽溶液復(fù)合，避免預(yù)先復(fù)合甲狀旁腺激素相關(guān)肽溶液的支架滅菌時(shí)造成的活性因子失活，最大程度保證了甲狀旁腺激素相關(guān)肽溶液的生物活性。
[0021]本發(fā)明所述的軟骨修復(fù)膜，I型膠原基質(zhì)膜可以有效的緩釋甲狀旁腺激素相關(guān)肽，因而能夠抑制軟骨鈣化，從而提高軟骨損傷的修復(fù)質(zhì)量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1實(shí)施例3中新西蘭大白兔軟骨損傷造模照片及修復(fù)6周后的結(jié)果。圖1A為新西蘭大白兔造模為4_X4_的表層軟骨缺損，圖1B為軟骨修復(fù)膜，圖1C為修復(fù)6周空白對照組大體圖片，圖1D為修復(fù)6周軟骨修復(fù)膜組大體圖片。
[0023]圖2實(shí)施例9中新西蘭大白兔軟骨損傷修復(fù)6周后的組織學(xué)結(jié)果。圖2A為4倍鏡下空白對照組SO染色圖片，圖2B為4倍鏡下軟骨修復(fù)膜組SO染色圖片，圖2C為40倍鏡下軟骨修復(fù)膜組SO染色圖片。
[0024]【具體實(shí)施方式】:
下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，詳細(xì)描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施方式僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0025]實(shí)施例1:
A)從二月齡健康白豬豬腿處剝?nèi)〖‰?，去除筋膜和脂肪，剪?20g，浸泡于500mL體積濃度75%的乙醇水溶液中，4 °C過夜；B)將步驟A的肌腱碎片95g用蒸餾水沖洗5遍，力口入0.5mol/L的乙酸水溶液1800mL中，用6M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至I，加入胃蛋白酶(Sigma-ALDRICH) 9g，4 °C放置3天，獲得膠原溶膠液1800mL ； C)將步驟B獲得的膠原溶膠液于4°C、4000rpm水平離心25分鐘,棄上層脂肪層,將沉淀a用0.5mol/L乙酸水溶液稀釋3倍體積，在超凈臺(tái)中用4層紗布過濾，將濾液與0.9mol/L的NaCl水溶液以體積比1:10混合，間歇震蕩，4 °C過夜，再在4 °C、4000rpm水平離心25分鐘，棄上清液及懸浮物，獲得沉淀b ;D)將沉淀b按下述方式之一處理，制備水溶性I型膠原:a )將沉淀b用0.5mol/L的乙酸水溶液在4 1:溶解過夜，所述乙酸水溶液與沉淀b的體積比為4:1，獲得所述水溶性I型膠原；b )將沉淀b置于直徑0.25 μ m的再生纖維素透析袋中，以三蒸水作為透析液，每天換水Γ 6次，透析3天，將透析袋中透析后的沉淀置于培養(yǎng)皿中-80°C過夜，再于凍干機(jī)中抽干2?3天，獲得所述水溶性I型膠原62g。
[0026]實(shí)施例2:
將實(shí)施例1方法提取的水溶性I型膠原溶于去離子水中配制成濃度為10mg/mL膠原水溶液10mL，加入40mL濃度為IM的碳酸氫鈉溶液進(jìn)行中和。取出4.3mL中和后的I型膠原溶液，倒入直徑6cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning)。將培養(yǎng)皿放置在溫度為37°C的烘箱，干燥48h，在模具內(nèi)形成I型膠原膜。將干燥的I型膠原膜取出，剪切成5mmX5mm大小。取10張剪切后的膜片，置于直徑1cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning)，加入5mL由PBS (pH=7.4)配制的濃度為100 ug/mL的甲狀旁腺激素相關(guān)肽(Bachem)溶液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中于37°C浸泡lh，得到復(fù)合甲狀旁腺激素相關(guān)肽的I型膠原膜材料，即含活性因子的膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜，甲狀旁腺激素相關(guān)肽溶液的體積用量是I型膠原基質(zhì)膜體積的15倍。
[0027]實(shí)施例3:
將實(shí)施例1方法提取的水溶性I型膠原溶于去離子水中配制成濃度為5mg/mL膠原水溶液10mL，加入1mL濃度為IM的碳酸氫鈉溶液進(jìn)行中和。取出4.3mL中和后的I型膠原溶液，倒入直徑6cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning)。將培養(yǎng)皿放置在溫度為37°C的烘箱，干燥48h，在模具內(nèi)形成I型膠原膜。將干燥的I型膠原膜取出，剪切成5mmX5mm大小。取10張剪切后的膜片，置于直徑1cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning)，加入5mL由PBS (pH=7.4)配制的濃度為100 ug/mL的甲狀旁腺激素相關(guān)肽(Bachem)溶液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中于37°C浸泡lh，得到復(fù)合甲狀旁腺激素相關(guān)肽的I型膠原膜材料，即含活性因子的膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜。甲狀旁腺激素相關(guān)肽溶液的體積用量是I型膠原基質(zhì)膜體積的10倍。
[0028]實(shí)施例4:
將實(shí)施例1方法提取的水溶性I型膠原溶于去離子水中配制成濃度為20mg/mL膠原水溶液10mL，加入23mL濃度為IM的碳酸氫鈉溶液進(jìn)行中和。取出4.3mL中和后的I型膠原溶液，倒入直徑6cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning)。將培養(yǎng)皿放置在溫度為37°C的烘箱，干燥48h，在模具內(nèi)形成I型膠原膜。將干燥的I型膠原膜取出，剪切成5mmX5mm大小。取10張剪切后的膜片，置于直徑1cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning)，加入5mL由PBS (pH=7.4)配制的濃度為100 ug/mL的甲狀旁腺激素相關(guān)肽(Bachem)溶液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中于37°C浸泡lh，得到復(fù)合甲狀旁腺激素相關(guān)肽的I型膠原膜材料，即含活性因子的膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜。甲狀旁腺激素相關(guān)肽溶液的體積用量是I型膠原基質(zhì)膜體積的20倍。
[0029]實(shí)施例5:
將實(shí)施例1方法提取的水溶性I型膠原溶于去離子水中配制成濃度為10mg/mL膠原水溶液10mL，加入23mL濃度為IM的碳酸氫鈉溶液進(jìn)行中和。取出4.3mL中和后的I型膠原溶液，倒入直徑6cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning)。將培養(yǎng)皿放置在溫度為30°C的烘箱，干燥54h，在模具內(nèi)形成I型膠原膜。將干燥的I型膠原膜取出，剪切成5mmX5mm大小。取10張剪切后的膜片，置于直徑1cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning)，加入5mL由PBS (pH=7.4)配制的濃度為20 ug/mL的甲狀旁腺激素相關(guān)肽(Bachem)溶液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中于30°C浸泡2h，得到復(fù)合甲狀旁腺激素相關(guān)肽的I型膠原膜材料，即含活性因子的膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜。
[0030]實(shí)施例6:
將實(shí)施例1方法提取的水溶性I型膠原溶于去離子水中配制成濃度為10mg/mL膠原水溶液10mL，加入23mL濃度為IM的碳酸氫鈉溶液進(jìn)行中和。取出4.3mL中和后的I型膠原溶液，倒入直徑6cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning)。將培養(yǎng)皿放置在溫度為40°C的烘箱，干燥35h，在模具內(nèi)形成I型膠原膜。將干燥的I型膠原膜取出，剪切成5mmX5mm大小。取10張剪切后的膜片，置于直徑1cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning)，加入5mL由PBS (pH=7.4)配制的濃度為200 ug/mL的甲狀旁腺激素相關(guān)肽(Bachem)溶液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中于40°C浸泡0.5h，得到復(fù)合甲狀旁腺激素相關(guān)肽的I型膠原膜材料，即含活性因子的膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜。
[0031]實(shí)施例7:
將實(shí)施例1方法提取的水溶性I型膠原溶于去離子水中配制成濃度為10mg/mL膠原水溶液10mL，加入23mL濃度為IM的碳酸氫鈉溶液進(jìn)行中和。取出4.3mL中和后的I型膠原溶液，倒入直徑6cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning)。將培養(yǎng)皿放置在溫度為40°C的烘箱，干燥35h，在模具內(nèi)形成I型膠原膜。將干燥的I型膠原膜取出，剪切成5mmX5mm大小。取10張剪切后的膜片，置于直徑1cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning)，加入5mL由PBS (pH=7.4)配制的濃度為50 ug/mL的甲狀旁腺激素相關(guān)肽(Bachem)溶液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中于40°C浸泡0.5h，得到復(fù)合甲狀旁腺激素相關(guān)肽的I型膠原膜材料，即含活性因子的膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜。
[0032]實(shí)施例8:
將實(shí)施例1方法提取的水溶性I型膠原溶于去離子水中配制成濃度為10mg/mL膠原水溶液10mL，加入23mL濃度為IM的碳酸氫鈉溶液進(jìn)行中和。取出4.3mL中和后的I型膠原溶液，倒入直徑6cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning)。將培養(yǎng)皿放置在溫度為40°C的烘箱，干燥35h，在模具內(nèi)形成I型膠原膜。將干燥的I型膠原膜取出，剪切成5mmX5mm大小。取10張剪切后的膜片，置于直徑1cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning)，加入5mL由PBS (pH=7.4)配制的濃度為100 ug/mL的甲狀旁腺激素相關(guān)肽(Bachem)溶液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中于40°C浸泡0.5h，得到復(fù)合甲狀旁腺激素相關(guān)肽的I型膠原膜材料，即含活性因子的膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜。
[0033]實(shí)施例9:
(I)軟骨損傷造模:取體重2.5?3 kg成年雄性新西蘭大白兔，術(shù)前10%水合氯醛(劑量4mL/kg)耳緣靜脈注射和腹腔注射各半總量的方式給藥麻醉。膝關(guān)節(jié)周圍5cm范圍剪毛，將兔仰臥在手術(shù)手術(shù)臺(tái)上，四肢固定，碘伏消毒，鋪無菌洞巾。取膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切口，切開皮膚、皮下筋膜，經(jīng)髕骨內(nèi)側(cè)緣切開兔膝關(guān)節(jié)，向外側(cè)牽開髕腱和股四頭肌肌腱，顯露膝關(guān)節(jié)，在膝關(guān)節(jié)股骨滑車處，用手術(shù)刀片制造一個(gè)4mmX4mm的方形表層軟骨缺損區(qū)，不穿透軟骨下骨。
[0034](2)應(yīng)用軟骨修復(fù)膜:將實(shí)施例2中的膜片修剪后覆蓋在(I)中所造軟骨損傷處，自然干燥5分鐘后，將脫位的髕骨從膜上方小心歸位，避免接觸膜片使其移動(dòng)。嚴(yán)密縫合膝關(guān)節(jié)囊和肌肉筋膜組織，縫合皮膚切口。切口碘伏消毒，肌肉注射青霉素鈉40萬單位后，放回兔籠。術(shù)后抗生素護(hù)理，肌注青霉素40萬單位，每天一次，連續(xù)3天。標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼料喂養(yǎng)。
[0035](3)修復(fù)效果評估:術(shù)后6周，使用耳緣靜脈空氣針將兔處死。取材包括股骨下端在內(nèi)的關(guān)節(jié)面。大體觀察發(fā)現(xiàn)軟骨損傷處有大量白色新生軟骨形成，與周圍組織連接平滑，無炎癥反應(yīng)。組織學(xué)切片結(jié)果顯示軟骨修復(fù)膜能夠誘導(dǎo)軟骨微環(huán)境中的原位細(xì)胞遷移粘附至損傷部位，并促進(jìn)軟骨損傷的修復(fù)再生。新生軟骨SO染色深，細(xì)胞呈橢圓形，基本為透明軟骨組織，表現(xiàn)出較好的修復(fù)效果。如圖2所示，圖2中新西蘭大白兔軟骨損傷修復(fù)6周后的組織學(xué)結(jié)果。SO染色結(jié)果表明使用軟骨修復(fù)膜的實(shí)驗(yàn)組表層軟骨損傷有明顯的修復(fù)，軟骨面更為光滑平整，能檢測到軟骨微環(huán)境原位細(xì)胞參與新生軟骨的形成。而空白對照組軟骨表面切痕明顯，凹凸不平，未見明顯修復(fù)痕跡。A為4倍鏡下空白對照組SO染色圖片，B為4倍鏡下軟骨修復(fù)膜組SO染色圖片，C為40倍鏡下軟骨修復(fù)膜組SO染色圖片。
[0036]本發(fā)明所述的軟骨修復(fù)膜，以I型膠原蛋白為原料，現(xiàn)有的研究表明膠原蛋白及其降解產(chǎn)物(氨基酸)擁有良好的生物相容性，無免疫原性和細(xì)胞毒性。
[0037]本發(fā)明所述的軟骨修復(fù)膜，除了可以直接應(yīng)用于軟骨損傷的修復(fù)治療，也可聯(lián)合其他全層軟骨損傷或骨軟骨損傷修復(fù)支架材料，對不同深度的軟骨損傷進(jìn)行治療，具有廣闊的應(yīng)用前景，預(yù)先制備的膠原基質(zhì)膜可在使用時(shí)與活性因子甲狀旁腺激素相關(guān)肽迅速復(fù)合，保證了甲狀旁腺激素相關(guān)肽的生物活性，該復(fù)合物用于軟骨缺損治療時(shí)，能夠提高軟骨修復(fù)質(zhì)量，抑制軟骨鈣化的發(fā)生，從而有效促進(jìn)軟骨損傷的修復(fù)再生。
[0038]應(yīng)理解，這些實(shí)施方式僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明的配方作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)以豬腿肌腱為原料，經(jīng)剪切、酶解、離心、過濾、溶解，得到I型膠原溶液； (2)用IM碳酸氫鈉溶液對步驟(I)得到的I型膠原溶液進(jìn)行中和； (3)將步驟(2)中中和后的I型膠原溶液倒入模具，于3(T40°C干燥35飛4h，在模具內(nèi)形成I型膠原基質(zhì)膜； (4)將步驟(3)得到的I型膠原基質(zhì)膜浸泡于2(T200ug/mL甲狀旁腺激素相關(guān)肽溶液中，于3(T40°C孵育0.5?2h，得到復(fù)合甲狀旁腺激素相關(guān)肽的I型膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中I型膠原溶液的濃度為5?20 mg/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中干燥的溫度為37°C，且干燥的時(shí)間為48h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中I型膠原基質(zhì)膜在甲狀旁腺激素相關(guān)肽溶液中孵育的溫度3(T40°C，且孵育的時(shí)間為0.5?2h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)所述膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜的制備方法，其特征在于，步驟(I)中剪切為將豬腿肌腱去除筋膜和脂肪，剪切成肌腱碎片，并浸泡于75%的乙醇中。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜的制備方法，其特征在于，步驟(I)中酶解為將浸泡于乙醇溶液中的肌腱碎片用蒸餾水沖洗五次，然后加入0.5 mol/L的乙酸溶液，并用6M氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至1，加入胃蛋白酶，4 °C放置3天，獲得膠原溶膠液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜的制備方法，其特征在于，步驟(I)中離心和過濾為將膠原溶膠液于4°C、4000rpm水平離心25分鐘，棄上層脂肪層，將沉淀用0.5mol/L乙酸水溶液稀釋3倍體積，在超凈臺(tái)中用4層紗布過濾，將濾液與0.9mol/L的NaCl水溶液以體積比1:10混合，間歇震蕩，4 °C過夜，再在4 °C、4000rpm水平離心25分鐘，棄上清液及懸浮物，獲得沉淀。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜的制備方法，其特征在于，步驟(I)溶解為將離心和過濾步驟中得到的沉淀用0.5mol/L的乙酸水溶液在4 1:溶解過夜，所述乙酸水溶液與沉淀的體積比為4:1，獲得所述水溶性I型膠原。
9.一種膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜，其特征在于，通過如I至8任意一項(xiàng)所述的膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜的制備方法制備得到。
10.一種如權(quán)利要求9所述的膠原基質(zhì)軟骨修復(fù)膜在制備軟骨損傷的修復(fù)治療或聯(lián)合其他全層軟骨損傷或骨軟骨損傷修復(fù)治療的支架材料中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61L27/54GK104368043SQ201410499517
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月25日
【發(fā)明者】張薇, 謝淑君, 陳隆坤 申請人:浙江星月生物科技股份有限公司