天麻多糖在制備具有輔助抑制結腸癌功效的功能食品中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了天麻多糖在制備具有輔助抑制結腸癌功效的功能食品中的應用，其中天麻多糖優(yōu)選通過以下方法制備獲得：以天麻為原料，經(jīng)含沸水提取、去蛋白、透析和乙醇處理工序制備獲得，所述的天麻多糖具有調節(jié)腫瘤微環(huán)境的作用，本發(fā)明中的天麻多糖可以通過抑制腫瘤新生血管生成、免疫激活及抑制結腸癌成纖維細胞生長等多途徑調節(jié)腫瘤微環(huán)境，表明其具有良好的輔助抑制結腸癌腫瘤作用。
【專利說明】
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于多糖【技術領域】，具體涉及一種天麻多糖在制備具有輔助抑制結腸癌功 效的功能食品中的應用。 天麻多糖在制備具有輔助抑制結腸癌功效的功能食品中的 應用

【背景技術】
[0002] 免疫負調控研究為腫瘤治療提供了新策略。腫瘤微環(huán)境中，存在著大量的負調控 細胞，它們相互作用，相互影響，伴隨著腫瘤細胞和微環(huán)境的共進化。由于腫瘤細胞的免疫 原性改變和非正常生長，刺激成纖維細胞釋放炎癥因子，抗原提呈細胞傳遞腫瘤抗原信號， 共同招募免疫細胞浸潤到腫瘤局部，而且腫瘤細胞的異常增殖引起對鄰近細胞的壓迫，導 致缺血壞死等組織損傷，產生大量的炎性因子，因此腫瘤局部處于非可控性炎癥狀態(tài)，導致 微環(huán)境免疫負調控的形成，誘導腫瘤相關成纖維細胞（CAF)和髓樣抑制性細胞(MDSC)的形 成，ILKKTGF-β誘導巨噬細胞由殺傷性的Ml型轉變?yōu)槊庖咭种菩缘腗2型；調節(jié)性T細胞 在腫瘤局部顯著增加。其結果是抑制細胞毒性T細胞（CTL)、自然殺傷細胞（NK)的活性，維 持腫瘤局部的免疫耐受狀態(tài)。以腫瘤微環(huán)境中的免疫負調控細胞為靶點，抑制其生長，誘導 其分化，從而解除腫瘤微環(huán)境中的免疫負調控狀態(tài)，才能維持腫瘤細胞處于休眠狀態(tài)或者 逆轉激活狀態(tài)的腫瘤細胞重新回到休眠狀態(tài)，就能達到預防腫瘤發(fā)生的目的。
[0003] 近年來的研究發(fā)現(xiàn)，多糖就具有顯著地抗腫瘤活性并且對人體的毒副作用相對較 小，對多糖的生物活性研究在醫(yī)學領域已經(jīng)成為國內外專家學者研究的熱點。近年發(fā)現(xiàn)一 些多糖及其復合物對多種疾病，如免疫紊亂、癌癥、糖尿病、高血壓、肝炎、血栓、肺炎、病毒 等都具有顯著療效，并且參與細胞各種生命現(xiàn)象的調節(jié)。
[0004] 天麻為多年生草本植物，分布于全國大部分地區(qū)。其干燥塊莖亦稱天麻，是一味常 用而較名貴的中藥，臨床多用于頭痛眩暈、肢體麻木、小兒驚風、癲癇、抽搐、破傷風等癥。目 前尚無以天麻為原料制備多糖組分，開發(fā)具有輔助抑制結腸癌功效應用。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供天麻多糖在制備具有輔助抑制結腸癌功效的功能食品中 的應用。
[0006] 其中所述的輔助抑制結腸癌功效是指通過抑制結腸癌腫瘤新生血管生成、免疫激 活及抑制結腸癌成纖維細胞生長功效，調節(jié)結腸癌腫瘤微環(huán)境，從而起到輔助抑制結腸癌 功效。
[0007] 作為本發(fā)明的一種實施方式，本發(fā)明中的天麻多糖優(yōu)選通過以下方法制備獲得： 以天麻為原料，經(jīng)含沸水提取、去蛋白、透析和乙醇處理工序制備獲得，所述的天麻多糖具 有調節(jié)腫瘤微環(huán)境的作用。
[0008] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明所述的天麻多糖具體通過以下方法制 備獲得：以天麻為原料，用沸水多次提取后，合并提取液，將提取液濃縮得濃縮液，在濃縮液 中加入三氯乙酸水溶液進行去蛋白處理，去蛋白后將反應液進行中和、扎袋透析處理，將透 析袋內反應液進行濃縮、離心處理，取上清液加入乙醇進行醇沉、干燥處理，即得天麻多糖。
[0009] 本發(fā)明在天麻多糖的制備過程中，各工序的具體參數(shù)優(yōu)選如下： 沸水提取時，提取次數(shù)為1飛次，每次提取時沸水的用量為天麻總質量的5~20倍，每 次提取時間為1.5~5 h。
[0010] 沸水提取時，沸水的用量優(yōu)選為天麻總質量的5~20倍，提取次數(shù)較佳為3次，其 中第一次提取時，沸水的用量優(yōu)選為原料天麻總質量的ΚΓ20倍，提取2~5 h;第二次提取 時，沸水的用量優(yōu)選為原料天麻總質量的ΚΓ20倍，提取1.5?5h;第三次提取時，沸水的 用量優(yōu)選為原料天麻總質量的ΚΓ20倍，提取1. 5~ 5 h。 toon] 將提取液優(yōu)選濃縮至原提取液總體積的約1/10得濃縮液。
[0012] 本發(fā)明所述的三氯乙酸水溶液的質量百分含量優(yōu)選為35%，去蛋白處理時間優(yōu)選 為：Γ6 h，三氯乙酸水溶液的體積優(yōu)選與濃縮液的體積相同。
[0013] 中和處理時可以采用質量百分含量為10%的氫氧化鈉水溶液。
[0014] 扎袋透析處理時優(yōu)選采用截留分子量3500Da的透析袋進行透析處理。
[0015] 乙醇進行醇沉處理時優(yōu)選采用體積百分含量優(yōu)選為70?95%的乙醇水溶液。
[0016] 濃縮可以采用多種現(xiàn)有技術中的濃縮方式，其中以真空濃縮最佳。真空濃縮時溫 度優(yōu)選為40°c。
[0017] 本發(fā)明中的天麻多糖，可以直接口服，也可以制成藥劑學上所說的多種劑型，如膠 囊型、片劑、粉劑、顆粒劑或口服液等，食用后具有輔助抑制結腸癌腫瘤的功效。
[0018] 因此，本發(fā)明所述功能食品的劑型優(yōu)選為膠囊型、片劑、粉劑、顆粒劑或口服液等。
[0019] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點： (1) 本發(fā)明中的天麻多糖，其純度和活性高，可以通過抑制腫瘤新生血管生成、免疫激 活及抑制結腸癌成纖維細胞生長等多途徑調節(jié)腫瘤微環(huán)境，其具有良好的輔助抑制結腸癌 腫瘤作用； (2) 本發(fā)明中的天麻多糖的制備方法，工藝簡單穩(wěn)定高效，適合工業(yè)化生產，成本低； (3) 本發(fā)明中的天麻多糖，可以用于制備具有輔助抑制結腸癌腫瘤功效的功能食品。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1是本發(fā)明實施例4中天麻多糖可抑制BMP2誘導的帶有BRE報告基因的熒光 素酶的活性； 圖2是本發(fā)明實施例5中天麻多糖能激活帶有NF- κ B報告基因的熒光素酶的活性； 圖3是本發(fā)明實施例6中天麻多糖可抑制結腸癌成纖維細胞的生長。

【具體實施方式】
[0021] 下面結合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步說明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
[0022] 以下實施例中采用的各原料，如無特殊說明，均為市售產品。
[0023] 實施例1 本實施例中的天麻多糖，通過以下方法制備獲得：取天麻原料，采用沸水提取，第一次 提取時，水的用量為原料總質量的20倍，煮沸5 h過濾；第二次提取時，水的用量為原料總 質量的20倍，煮沸3 h過濾；第三次提取時，水的用量為原料總質量的10倍，煮沸2 h過濾， 合并濾液，真空濃縮至原來體積的大約1/10,下同。將濃縮液進行三氯乙酸除蛋白處理，力口 入同體積(下同）的30%三氯乙酸（質量百分比），處理時間為4 h后，用10% NaOH (質量 百分比）中和，下同，中和后將反應液置于透析袋中扎袋透析，透析時透析袋的截留分子量 通常約為3500Da，下同，然后將透析袋內液濃縮，離心，取上清液加入：Γ4倍體積的85%乙醇 水溶液(體積百分含量）進行醇沉淀處理，取沉淀物經(jīng)含真空干燥(約40°C，下同）處理得天 麻多糖組分。
[0024] 實施例2 本實施例中的天麻多糖，通過以下方法制備獲得：取天麻原料，采用沸水提取，第一次 提取時，水的用量為天麻原料總質量的15倍，煮沸5 h過濾；第二次提取時，水的用量為天 麻原料總質量的15倍，煮沸3 h過濾；第三次提取時，水的用量為天麻原料總質量的10倍， 煮沸3 h過濾，合并濾液，真空濃縮。將濃縮液進行三氯乙酸除蛋白處理，加入同體積的25% 三氯乙酸（質量百分比），處理時間為3 h后，用10% NaOH (質量百分比）中和，中和后將 反應液置于透析袋中扎袋透析，然后將透析袋內液濃縮，離心，取上清液加入:Γ4倍體積的 70%乙醇水溶液(體積百分含量）進行醇沉淀處理，取沉淀物經(jīng)含真空干燥處理得天麻多糖 組分。
[0025] 實施例3 本實施例中的天麻多糖，通過以下方法制備獲得：取天麻原料，采用沸水提取，第一次 提取時，水的用量為天麻原料總質量的10倍，煮沸3 h過濾；第二次提取時，水的用量為 天麻原料總質量的20倍，煮沸3過濾h;第三次提取時，水的用量為天麻原料總質量的10 倍，煮沸5 h過濾，合并濾液，真空濃縮，將濃縮液進行三氯乙酸除蛋白處理，加入同體積的 15%三氯乙酸（質量百分比），處理時間為5 h后，用10% NaOH (質量百分比)中和，中和后 將反應液置于透析袋中扎袋透析，然后將透析袋內液濃縮，離心，取上清液加入:Γ4倍體積 的95%乙醇水溶液(體積百分含量）進行醇沉淀處理，取沉淀物經(jīng)含真空干燥處理得天麻多 糖組分。
[0026] 制成藥劑學上所說的多種劑型，如膠囊劑、片劑、粉劑、顆粒或口服液等。
[0027] 實施例4天麻多糖可抑制BMP2誘導的帶有BRE報告基因的熒光素酶的活性 C2C12細胞株購自中科院細胞庫，C2C12- pGFl-BRE細胞株由中國科學院上海藥物研究 所丁侃實驗室構建，保存于液氮中。C2C12- pGFl-BRE細胞用含10 % Gibco胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37°C飽和濕度、含5% C02的恒溫箱中培養(yǎng)，以1 X 104細胞/孔的密度接 種于96孔板內，每孔100 μ L。貼壁24 h后吸去60 μ L培養(yǎng)基，加配置好相應濃度的樣品 (實施例1中的天麻多糖樣品）50 μ L，終濃度分別為0· 5 mg/mL、0. 1 mg/mL、0. 02 mg/mL， 10 ULBMP2調整至終濃度200 ng/mL。同時設空白組和BMP2組對照。給藥16 h后吸去培 養(yǎng)基，加20 μ LR印orter Lysis IX Buffer，將溶解的細胞裂解液20 μ L轉移至白板，加入 40 yL luciferase底物，于3分鐘內讀板，讀取RLU值。采用SPSS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學 處理。數(shù)據(jù)均以均數(shù)土標準差（.Z ±s)表示，兩組間比較采用獨立樣本?檢驗，多組間 比較采用單因素方差分析。
[0028] 實驗結果如圖1所示，天麻多糖在0.02 mg/mL低濃度下具有抑制ΒΜΡ2誘導的帶有 BRE報告基因的熒光素酶的活性，且該活性隨多糖濃度增加而顯著增加，表明該多糖在該活 性方面具有劑量依賴性。已知腫瘤新生血管生成在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著關鍵作用， 而BMP2信號通路在腫瘤新生血管生成過程中起關鍵作用。該多糖可顯著抑制BMP2信號通 路，表明該多糖具有潛在的抑制腫瘤活性。
[0029] 實施例5天麻多糖能激活帶有NF- κ B報告基因的熒光素酶的活性 THP-1細胞株購自中科院細胞庫，THP-l/pGFl-NF-κΒ細胞株由中國科學院上海藥 物研究所丁侃實驗室構建，保存于液氮中。THP-l/pGFl-NF-κΒ細胞用含10%胎牛血清 RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。置于37 °C飽和濕度、含5% 0)2的恒溫箱中培養(yǎng)，以5X104細胞/ 孔的密度接種于96孔板內，每孔50 μ L容積。加入受試樣品50 μ?(實施例1中的天麻多 糖樣品），終濃度分別為0.5 mg/mL、0.1 mg/mL、0.02 mg/mL，同時設立空白組和LPS對照組。 加入LPS溶液10 μ L，終濃度為1 μ g/mL，置于37°C飽和濕度、含5% C02的恒溫箱中培養(yǎng) 過夜。培養(yǎng)過夜后，每空加入1〇〇 yL Bright-Glo? Luciferase Assay System底物，于酶 標儀讀板，讀取RLU值。

【權利要求】
1. 天麻多糖在制備具有輔助抑制結腸癌功效的功能食品中的應用。
2. 根據(jù)權利要求1所述的天麻多糖在制備具有輔助抑制結腸癌功效的功能食品中的 應用，其特征是：所述的輔助抑制結腸癌功效是指通過抑制結腸癌腫瘤新生血管生成、免疫 激活及抑制結腸癌成纖維細胞生長功效，調節(jié)結腸癌腫瘤微環(huán)境，從而起到輔助抑制結腸 癌功效。
3. 根據(jù)權利要求1所述的天麻多糖在制備具有輔助抑制結腸癌功效的功能食品中的 應用，其特征是：所述的天麻多糖通過以下方法制備獲得：以天麻為原料，經(jīng)含沸水提取、 去蛋白、透析和乙醇處理工序制備獲得，所述的天麻多糖具有調節(jié)腫瘤微環(huán)境的作用。
4. 根據(jù)權利要求3所述的天麻多糖在制備具有輔助抑制結腸癌功效的功能食品中的 應用，其特征是：所述的天麻多糖具體通過以下方法制備獲得：以天麻為原料，用沸水多次 提取后，合并提取液，將提取液濃縮得濃縮液，在濃縮液中加入三氯乙酸水溶液進行去蛋白 處理，去蛋白后將反應液進行中和、扎袋透析處理，將透析袋內反應液進行濃縮、離心處理， 取上清液加入乙醇進行醇沉、干燥處理，即得天麻多糖。
5. 根據(jù)權利要求4所述的天麻多糖在制備具有輔助抑制結腸癌功效的功能食品中的 應用，其特征是：沸水提取時，提取次數(shù)為1飛次，每次提取時沸水的用量為天麻總質量的 5~20倍，每次提取時間為1.5~5 h。
6. 根據(jù)權利要求4所述的天麻多糖在制備具有輔助抑制結腸癌功效的功能食品中的 應用，其特征是：去蛋白時采用三氯乙酸水溶液，所述三氯乙酸水溶液的質量百分含量為 35%，處理時間為：Γ6 h。
7. 根據(jù)權利要求4所述的天麻多糖在制備具有輔助抑制結腸癌功效的功能食品中的 應用，其特征是：乙醇處理時采用體積百分含量為7(Γ95%的乙醇水溶液。
8. 根據(jù)權利要求4所述的天麻多糖在制備具有輔助抑制結腸癌功效的功能食品中的 應用，其特征是：透析時透析袋的截留分子量為3500Da。
9. 根據(jù)權利要求1所述的天麻多糖在制備具有輔助抑制結腸癌功效的功能食品中的 應用，其特征是：所述功能食品的劑型為膠囊型、片劑、粉劑、顆粒劑或口服液。
【文檔編號】A61P35/00GK104116023SQ201410273706
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年6月19日 優(yōu)先權日:2014年6月19日
【發(fā)明者】胡明華, 王培培, 馬方勵, 梁明 申請人:無限極（中國）有限公司