用于肟鍵聯(lián)的親核性催化劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于使水溶性聚合物與治療性蛋白質(zhì)的氧化型碳水化合物部分綴合的材料和方法，所述方法包括在允許綴合的條件下使所述氧化型碳水化合物部分與活化的水溶性聚合物接觸。更具體地說，本發(fā)明涉及上述材料和方法，其中所述水溶性聚合物含有活性氨氧基并且其中在所述氧化型碳水化合物部分與所述水溶性聚合物上的活性氨氧基之間形成肟或腙鍵聯(lián)，并且其中所述綴合在親核性催化劑存在下進(jìn)行。
【專利說明】用于肟鍵聯(lián)的親核性催化劑 發(fā)明領(lǐng)域
[0001 ] 本發(fā)明涉及用于使水溶性聚合物與蛋白質(zhì)綴合的材料和方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 通過在水溶性聚合物與治療性蛋白質(zhì)之間形成共價(jià)鍵聯(lián)來制備綴合物可通過多 種化學(xué)方法進(jìn)行。多肽藥物的聚乙二醇化在循環(huán)中對(duì)其進(jìn)行保護(hù)并且改良其藥效學(xué)和藥物 動(dòng)力學(xué)特征（Harris和Chess，NatRevDrugDiscov. 2003 ;2 :214-21)。聚乙二醇化過程 將乙二醇的重復(fù)單元（聚乙二醇（PEG))連接至多肽藥物。PEG分子具有大的流體動(dòng)力學(xué)體 積（為球狀蛋白質(zhì)大小的5-10倍），水溶性高并且可被水合，無毒，非免疫原性并且自身體 快速清除。分子的聚乙二醇化可使得藥物對(duì)酶降解的抗性增加，體內(nèi)半衰期延長，給藥頻率 降低，免疫原性降低，物理和熱穩(wěn)定性增加，溶解性增加，液體穩(wěn)定性增加和聚集減少。第一 個(gè)聚乙二醇化藥物由FDA在二十世紀(jì)九十年代早期批準(zhǔn)。自此以后，F(xiàn)DA已批準(zhǔn)若干種聚 乙二醇化藥物用于口服、注射和局部施用。
[0004] 聚唾液酸（PSA)也稱為聚乙酰神經(jīng)氨酸（colominicacid，CA)，為天然產(chǎn)生的多 糖。其為具有a(2 -8)酮苷鍵的N-乙?；窠?jīng)氨酸的均聚物，并且在其非還原末端含有 鄰位二醇基。其帶負(fù)電荷并且為人體的天然成分。其可以容易地由細(xì)菌大量地以預(yù)定物理 特征產(chǎn)生（美國專利號(hào)5, 846, 951)。因?yàn)榧?xì)菌產(chǎn)生的PSA在化學(xué)上和在免疫學(xué)上與在人體 中產(chǎn)生的PSA相同，因此細(xì)菌PSA不具免疫原性，甚至在偶合至蛋白質(zhì)時(shí)也是如此。不同于 一些聚合物，PSA酸可生物降解。聚乙酰神經(jīng)氨酸與過氧化氫酶（catalase)和天冬酰胺酶 (asparaginase)的共價(jià)偶合已顯示會(huì)增強(qiáng)在蛋白水解酶或血衆(zhòng)存在下的酶穩(wěn)定性。與聚唾 液酸化和未修飾天冬酰胺酶的體內(nèi)比較研宄揭示，聚唾液酸化增加酶的半衰期（Fernandes 和Gregoriadis，IntJPharm. 2001;217 :215-24)〇
[0005] PEG-衍生物與肽或蛋白質(zhì)的偶合由Roberts等（AdvDrugDelivRev2002 ; 54:459-76)綜述。一種用于偶合水溶性聚合物與治療性蛋白質(zhì)的方法為通過蛋白質(zhì)的 碳水化合物部分來綴合聚合物。蛋白質(zhì)中碳水化合物的鄰位羥基（OH)可容易地用高碘 酸鈉（NaIO4)氧化形成活性醛基（RothfusetSmith，JBiolChem1963 ;238 :1402-10 ; vanLentenetAshwell，JBiolChem1971 ;246 :1889-94)。隨后可以通過使用含有例如 活性酰肼基的試劑將聚合物偶合至碳水化合物的醛基（WilchekM和BayerEA，Methods Enzymol1987;138:429-42)。最近的技術(shù)為使用含有氨氧基的試劑，所述氨氧基與醛反應(yīng) 形成肟鍵聯(lián)（W0 96/40662、TO2008/025856)。
[0006] 描述水溶性聚合物與治療性蛋白質(zhì)的綴合的其它實(shí)例描述于以下文獻(xiàn)中：WO 06/071801，其教導(dǎo)氧化馮威里氏因子（VonWillebrandfactor)中的碳水化合物部分 并隨后使用酰肼化學(xué)反應(yīng)與PEG偶合；美國公布號(hào)2009/0076237,其教導(dǎo)氧化rFVIII并 隨后使用酰肼化學(xué)反應(yīng)與PEG和其它水溶性聚合物（例如PSA、HES、葡聚糖）偶合；WO 2008/025856,其教導(dǎo)氧化不同凝血因子（例如rFIX、FVIII和FVIIa)并隨后使用氨氧基化 學(xué)反應(yīng)通過形成肟鍵聯(lián)而與例如PEG偶合；和美國專利號(hào)5, 621，039,其教導(dǎo)氧化FIX并隨 后使用酰肼化學(xué)反應(yīng)與PEG偶合。
[0007] 最近描述了一種改進(jìn)的方法，其包括唾液酸的溫和高碘酸鹽氧化以生成醛，隨后 在催化量苯胺的存在下與含有氨氧基的試劑反應(yīng)（DirksenA?和DawsonPE，Bioconjugate Chem. 2008 ;19, 2543-8 ;和ZengY等，NatureMethods2009 ;6 :207-9)。苯胺催化顯著 加速肟連接，從而允許使用極低濃度的試劑。親核性催化劑的使用還描述于以下文獻(xiàn)中： Dirksen，A?等，JAmChemSoc.，128 :15602-3(2006) ;Dirksen，A?等，Angewchem?國際版， 45 :7581-4(2006) ;Kohler，J.J.，ChemBioChem.，10 :2147-50(2009) ;Gius印pone，N?等，J AmChemSoc.，127 :5528-39(2005);和Thygesen，M.B?等，JOrgChem.，75 :1752-5(2010)〇 [0008] 盡管苯胺催化可加速肟連接，從而允許短反應(yīng)時(shí)間和使用低濃度的氨氧基試 劑，但苯胺具有毒性，當(dāng)例如綴合的治療性蛋白質(zhì)形成藥物基礎(chǔ)時(shí)，此必須加以考慮。例 如，已顯示苯胺誘發(fā)高鐵血紅蛋白血癥（Harrison，J.H..和Jollow，D.J.，Molecular Pharmacology，32(3)423-431，1987)。已顯示對(duì)大鼠進(jìn)行長期膳食處理會(huì)誘發(fā)脾腫瘤 (Goodman，DG?等，JNatlCancerInst.，73(1) :265_73，1984)。體外研宄還已顯不苯胺具 有誘發(fā)染色體突變的可能性并且具有可能的基因毒性活性（BombhardE.M.etHerboldB， CriticalReviewsinToxicology35,783-835,2005)。
[0009] 仍然存在對(duì)用于將水溶性聚合物與蛋白質(zhì)綴合的材料和方法的需要，所述綴合改 善所述蛋白質(zhì)的藥效學(xué)和/或藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，同時(shí)最小化與各種試劑相關(guān)的成本并且最 小化對(duì)人類接受者的健康風(fēng)險(xiǎn)。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 本發(fā)明提供用于使聚合物與蛋白質(zhì)綴合的材料和方法，其改進(jìn)所述蛋白質(zhì)的藥效 學(xué)和/或藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，同時(shí)使與各種試劑相關(guān)的成本和當(dāng)由親核性催化劑催化綴合反 應(yīng)時(shí)患者接受者的健康風(fēng)險(xiǎn)降至最小。在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，提供取代苯胺的替代 性催化劑。
[0012] 本公開還提供用于制備各種水溶性聚合物-氨氧基接頭試劑的優(yōu)化程序，所述接 頭試劑可用于綴合如本文所述的治療性蛋白質(zhì)。最近的NMR研宄顯示如果在室溫下進(jìn)行 PSA-氨氧基試劑的制備，則可能在PSA的還原端發(fā)生副反應(yīng)。因此，在本公開的各種實(shí)施 方案中，在2°C-8°C之間的溫度下進(jìn)行新的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法在 4°C下制備PSA-氨氧基試劑。此外，本發(fā)明還涵蓋在2°C-8°C之間的溫度下使用色譜純化 步驟（例如IEX)對(duì)所述試劑的純化。當(dāng)在2°C-8°C之間的溫度下進(jìn)行整個(gè)方法（化學(xué)反 應(yīng)和通過IEX對(duì)綴合物的純化）時(shí)，在PSA的還原端處的不想要副反應(yīng)得到實(shí)質(zhì)性減少。
[0013] 在根據(jù)本公開的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了將水溶性聚合物與治療性蛋白質(zhì)的氧化 型碳水化合物部分綴合的方法，其包括使氧化型碳水化合物部分與活化的水溶性聚合物在 允許綴合的條件下接觸；所述水溶性聚合物含有活性氨氧基并且選自由以下組成的組：聚 乙二醇（PEG)、支鏈PEG、PolyPtXi.?(WarwickEffectPolymers;Coventry，UK)、聚唾液酸 (PSA)、淀粉、羥烷基淀粉（HAS)、羥乙基淀粉（HES)、碳水化合物、多糖、普魯蘭糖、殼聚糖、 透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚環(huán)氧烷（PAO)、聚烷 二醇（PAG)、聚丙二醇（PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯?；鶈徇⒕垡蚁┐迹≒VA)、聚羧酸酯、聚乙 烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-馬來酸酐、聚苯乙烯-共-馬來酸酐、聚（1-羥 甲基亞乙基羥甲基縮甲醛）（PHF)、2-甲基丙烯酰氧基-2'-乙基三甲基磷酸銨（MPC);其 中含有活性氨氧基的水溶性聚合物通過包括以下的方法制備：a)在允許在氧化型水溶性 聚合物與活化的氨氧基接頭之間形成穩(wěn)定肟鍵聯(lián)的條件下將包含氧化型水溶性聚合物的 溶液與包含活性氨氧基的氨氧基接頭一起孵育，所述條件包含介于約1分鐘與約24小時(shí) 之間的時(shí)段；介于約2°C與約8°C之間的溫度；在光存在或不存在下；和在攪拌或不攪拌下； 從而形成含有活性氨氧基的水溶性聚合物；和b)在介于約2°C與約8°C之間的溫度下，通過 選自由色譜、過濾、透析和沉淀組成的組的方法來純化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合 物；所述碳水化合物部分通過與包含選自由以下組成的組的氧化劑的緩沖液一起孵育而氧 化：高碘酸鈉（NaIO4)、四乙酸鉛（Pb(OAc)4)和高釕酸鉀（KRuCM);其中在所述氧化型碳水 化合物部分與所述水溶性聚合物上的活性氨氧基之間形成肟鍵聯(lián)；并且其中所述肟鍵聯(lián)形 成由選自由以下組成的組的親核性催化劑催化：鄰氨基苯甲酸、間氨基苯甲酸、對(duì)氨基苯甲 酸、對(duì)氨基苯磺酸、鄰氨基苯甲酰胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、對(duì)甲苯胺、鄰茴香胺、間茴香胺和 對(duì)茴香胺。
[0014] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供上述方法，其中在光不存在下，在攪拌下將包含氧化型 水溶性聚合物的溶液和包含活性氨氧基的氨氧基接頭在4°C下孵育1小時(shí)。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，提供上述方法，其中通過在4°C溫度下的陰離子交換色譜來純化含有活性氨氧基的 水溶性聚合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供上述方法，其中氧化型水溶性聚合物為PSA并且 通過與NaIO4-起孵育進(jìn)行氧化。
[0015] 在本公開的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了將水溶性聚合物與治療性蛋白質(zhì)的氧化型 碳水化合物部分綴合的方法，其包括使氧化型碳水化合物部分與活化的水溶性聚合物在允 許綴合的條件下接觸；所述水溶性聚合物含有活性氨氧基并且選自由以下組成的組：聚乙 二醇（PEG)、支鏈PEG、P〇lyPE(丨 (WarwickEffectPolymers;Coventry，UK)、聚唾液酸 (PSA)、淀粉、羥烷基淀粉（HAS)、羥乙基淀粉（HES)、碳水化合物、多糖、普魯蘭糖、殼聚糖、 透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚環(huán)氧烷（PAO)、聚烷 二醇（PAG)、聚丙二醇（PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯?；鶈徇?、聚乙烯醇（PVA)、聚羧酸酯、聚乙 烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-馬來酸酐、聚苯乙烯-共-馬來酸酐、聚（1-羥 甲基亞乙基羥甲基縮甲醛）（PHF)、2-甲基丙烯酰氧基-2'-乙基三甲基磷酸銨（MPC);其 中含有活性氨氧基的水溶性聚合物通過包括以下的方法制備：a)在允許在水溶性聚合物 與活化的氨氧基接頭之間形成穩(wěn)定肟鍵聯(lián)的條件下將包含水溶性聚合物的溶液與包含活 性氨氧基的氨氧基接頭一起孵育，所述條件包含介于約1分鐘與約24小時(shí)之間的時(shí)段；介 于約22°C與約37°C之間的溫度；在光存在或不存在下；和在攪拌或不攪拌下；從而形成含 有活性氨氧基的水溶性聚合物；和b)通過選自由色譜、過濾、透析和沉淀組成的組的方法 來純化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物；所述碳水化合物部分通過與包含選自由以下 組成的組的氧化劑的緩沖液一起孵育而氧化：高碘酸鈉（NaIO4)、四乙酸鉛（Pb(OAc)4)和高 釕酸鉀（KRuCM);其中在所述氧化型碳水化合物部分與所述水溶性聚合物上的活性氨氧基 之間形成肟鍵聯(lián)；并且其中所述肟鍵聯(lián)形成由選自由以下組成的組的親核性催化劑催化： 鄰氨基苯甲酸、間氨基苯甲酸、對(duì)氨基苯甲酸、對(duì)氨基苯磺酸、鄰氨基苯甲酰胺、鄰甲苯胺、 間甲苯胺、對(duì)甲苯胺、鄰茴香胺、間茴香胺和對(duì)茴香胺。
[0016] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供上述方法，其中在光不存在下，在攪拌下將包含水溶性 聚合物的溶液和包含活性氨氧基的氨氧基接頭在22°C下孵育2小時(shí)。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，提供上述方法，其中在光不存在下，在攪拌下將包含水溶性聚合物的溶液和包含活性氨 氧基的氨氧基接頭在22°C下孵育2小時(shí)；所述方法還包括將溶液的溫度增加到介于約32°C與約37°C之間的溫度并孵育另外12-24小時(shí)的步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供上述方法， 其包括就在增加溫度之前添加另外量的包含活性氨氧基的氨氧基接頭的另外步驟。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，提供上述方法，其中在22°C溫度下通過選自由透析、超濾/滲濾（UF/DF)和 色譜組成的組的方法純化含有活性氨氧基的水溶性聚合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供上 述方法，其進(jìn)一步包括在4°C下通過選自由透析、UF/DF或色譜組成的組的方法純化含有活 性氨氧基的水溶性聚合物的步驟。
[0017] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供上述方法，其中治療性蛋白質(zhì)是選自由以下組成的 組：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威勒布蘭德因子（VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶（FII)、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、tPA、 PAI-1、組織因子（TF)、ADAMTS13 蛋白酶、IL-Ia、IL-I0、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-Il、集落刺激因子-I(CSF-I)、M-CSF、SCF、GM-CSF、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF)、EPO、 干擾素 _a(IFN-a)、復(fù)合干擾素、IFN-13、IFN-y、IFN-w、IL-7、IL-8、IL-9、IL-KKIL-12、 IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、 IL-31、IL-32a、IL-33、血小板生成素（TPO)、Ang-I、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、血管生成素樣 多肽I(ANGPTL1)、血管生成素樣多肽2 (ANGPTL2)、血管生成素樣多肽3 (ANGPTL3)、血管生 成素樣多肽4(ANGPTL4)、血管生成素樣多肽5(ANGPTL5)、血管生成素樣多肽6(ANGPTL6)、 血管生成素樣多肽7(ANGPTL7)、玻粘蛋白、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)、血管生成素、活化素 A、活化素B、活化素C、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-1、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-2、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-3、骨型態(tài) 發(fā)生蛋白-4、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-5、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-6、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-7、骨型態(tài)發(fā)生蛋 白-8、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-9、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-10、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-11、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-12、 骨型態(tài)發(fā)生蛋白-13、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-14、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-15、骨型態(tài)發(fā)生蛋白受體IA、 骨型態(tài)發(fā)生蛋白受體IB、骨型態(tài)發(fā)生蛋白受體II、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、心臟營養(yǎng)素-1、睫 狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子受體、畸胎癌源性生長因子、潛伏蛋白、細(xì)胞因子誘導(dǎo) 的嗜中性粒細(xì)胞趨化因子1、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞趨化因子2a、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的 嗜中性粒細(xì)胞趨化因子20、0內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、內(nèi)皮素1、表皮生長因子、表皮素、表皮 調(diào)節(jié)素、上皮源性嗜中性粒細(xì)胞引誘劑、成纖維細(xì)胞生長因子4、成纖維細(xì)胞生長因子5、成 纖維細(xì)胞生長因子6、成纖維細(xì)胞生長因子7、成纖維細(xì)胞生長因子8、成纖維細(xì)胞生長因子 8b、成纖維細(xì)胞生長因子8c、成纖維細(xì)胞生長因子9、成纖維細(xì)胞生長因子10、成纖維細(xì)胞 生長因子11、成纖維細(xì)胞生長因子12、成纖維細(xì)胞生長因子13、成纖維細(xì)胞生長因子16、成 纖維細(xì)胞生長因子17、成纖維細(xì)胞生長因子19、成纖維細(xì)胞生長因子20、成纖維細(xì)胞生長 因子21、酸性成纖維細(xì)胞生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營 養(yǎng)因子受體a1、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體a2、生長相關(guān)蛋白、生長相關(guān)蛋 白a、生長相關(guān)蛋白0、生長相關(guān)蛋白Y、肝素結(jié)合表皮生長因子、肝細(xì)胞生長因子、肝細(xì) 胞生長因子受體、肝細(xì)胞瘤源性生長因子、胰島素樣生長因子I、胰島素樣生長因子受體、胰 島素樣生長因子II、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白、角化細(xì)胞生長因子、白血病抑制因子、白 血病抑制因子受體a、神經(jīng)生長因子、神經(jīng)生長因子受體、神經(jīng)生成素、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、 神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4、制瘤素M(OSM)、胎盤生長因子、胎盤生長因子2、血小板源性內(nèi)皮細(xì)胞生 長因子、血小板源性生長因子、血小板源性生長因子A鏈、血小板源性生長因子AA、血小板 源性生長因子AB、血小板源性生長因子B鏈、血小板源性生長因子BB、血小板源性生長因子 受體a、血小板源性生長因子受體|3、前B細(xì)胞生長刺激因子、干細(xì)胞因子（SCF)、干細(xì)胞 因子受體、TNF、TNFO、TNF1、TNF2、轉(zhuǎn)化生長因子a、轉(zhuǎn)化生長因子0、轉(zhuǎn)化生長因子0 1、 轉(zhuǎn)化生長因子0 1. 2、轉(zhuǎn)化生長因子0 2、轉(zhuǎn)化生長因子0 3、轉(zhuǎn)化生長因子0 5、潛伏轉(zhuǎn)化 生長因子M、轉(zhuǎn)化生長因子e結(jié)合蛋白I、轉(zhuǎn)化生長因子e結(jié)合蛋白II、轉(zhuǎn)化生長因子 0結(jié)合蛋白III、胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP)、腫瘤壞死因子受體I型、腫瘤壞死因子 受體II型、尿激酶型纖溶酶原活化因子受體、磷脂酶活化蛋白（PUP)、胰島素、植物凝集素 蓖麻毒素、催乳素、絨毛膜促性腺激素、卵泡刺激素、促甲狀腺素、組織纖溶酶原活化因子、 IgG、IgE、IgM、IgA和IgD、a-半乳糖苷酶、0 -半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黃體化激 素、雌激素、胰島素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、血小板生成素、尿激酶、整合素、凝 血酶、瘦素、修美樂（Humira)(阿達(dá)木單抗（adalimumab))、普羅利亞（Prolia)(迪諾賽單 抗（denosumab))、恩利（Enbrel)(依那西普（etanercept))、表1中的蛋白質(zhì)、或其生物活 性片段、衍生物或變體。
[0018] 在又一實(shí)施方案中，提供上述方法，其中在與活化的水溶性聚合物接觸之前，包含 初始濃度介于約〇. 3mg/ml與約3.Omg/ml之間的治療性蛋白質(zhì)的溶液被調(diào)整至介于約5. 0 與約8. 0之間的pH值。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療性蛋白質(zhì)的初始濃度為約I.Omg/ml并且 pH為約6. 0。
[0019] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供上述方法，其中治療性蛋白質(zhì)接觸期望的過量濃度的 活化的水溶性聚合物，其中所述過量濃度介于約1摩爾濃度與約300摩爾濃度過量之間。在 一個(gè)實(shí)施方案中，過量濃度為約50倍摩爾濃度過量。
[0020] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供上述方法，其中治療性蛋白質(zhì)在包含以下的條件下與 活化的水溶性聚合物一起孵育：介于約0. 5小時(shí)與約24小時(shí)之間的時(shí)段；介于約2°C與約 37°C之間的溫度；在光存在或不存在下；和在攪拌或不攪拌下。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述條 件包含約120分鐘的時(shí)段、約22°C的溫度、不存在光；和在攪拌下。
[0021] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種上述方法，其中親核性催化劑在包含以下的條件 下以使得親核性催化劑的最終濃度介于約I.OmM與約50mM之間的量添加：介于約0. 1分鐘 與約30分鐘之間的時(shí)段；介于約2°C與約37°C之間的溫度；在光存在或不存在下；和在攪 拌或不攪拌下。在一個(gè)實(shí)施方案中，親核性催化劑的最終濃度為約10mM，并且所述條件包含 至多約15分鐘的時(shí)段、約22°C的溫度、不存在光；和在攪拌下。
[0022] 在又一實(shí)施方案中，提供上述方法，其中氧化劑在包含以下的條件下以使得氧化 劑的最終濃度介于約50yM與約1000yM之間的量添加：介于約0. 1分鐘與120分鐘之間 的時(shí)段；介于約2°C與約37°C之間的溫度；在光存在或不存在下；和在攪拌或不攪拌下。在 一個(gè)實(shí)施方案中，氧化劑的最終濃度為約400yM，并且所述條件包含約10分鐘的時(shí)段、約 22 °C的溫度、不存在光和在攪拌下。
[0023] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供上述方法，其中水溶性聚合物與治療性蛋白質(zhì)的氧化 型碳水化合物部分的綴合通過添加選自由以下組成的組的淬滅劑而終止：L-半胱氨酸、甲 硫氨酸、谷胱甘肽、甘油、偏亞硫酸氫鈉（Na2S2O5)、色氨酸、酪氨酸、組氨酸或其衍生物、甲 酚、咪唑和其組合；其中所述淬滅劑在包含以下的條件下以使得淬滅劑的最終濃度介于約 ImM與約IOOmM之間的量添加：介于約5分鐘與約120分鐘之間的時(shí)段；介于約2°C與約 37°C之間的溫度；在光存在或不存在下；和在攪拌或不攪拌下。在一個(gè)實(shí)施方案中，淬滅劑 為L-半胱氨酸。在又一實(shí)施方案中，L-半胱氨酸添加成使得最終濃度為約IOmM并且所述 條件包含約60分鐘的時(shí)段、約22°C的溫度、不存在光和在攪拌下。
[0024] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種上述方法，其包括：a)第一步驟，其包括將包含治 療性蛋白質(zhì)的溶液的pH值調(diào)整至介于約5. 0與約8. 0之間的pH值，其中治療性蛋白質(zhì)濃 度介于約0. 3mg/ml與約3.Omg/ml之間；b)第二步驟，其包括氧化治療性蛋白質(zhì)上的一個(gè) 或多個(gè)碳水化合物，其中氧化劑在包含以下的條件下添加至所述第一步驟中的溶液中以使 得最終濃度介于約50yM與約1000yM之間：介于約0. 1分鐘與約120分鐘之間的時(shí)段；介 于約2°C與約37°C之間的溫度；在光存在或不存在下；和在攪拌或不攪拌下；c)第三步驟， 其包括在包含以下的條件下使治療性蛋白質(zhì)與期望的過量濃度的活化的水溶性聚合物接 觸，其中所述過量濃度介于約1摩爾濃度過量與約300摩爾濃度過量之間：介于約0. 5小時(shí) 與約24小時(shí)之間的時(shí)段；介于約2°C與約37°C之間的溫度；在光存在或不存在下；和在攪 拌或不攪拌下；d)第四步驟，其包括將親核性催化劑添加至所述第三步驟的溶液中，其中 所述親核性催化劑在包含以下的條件下添加成使得最終濃度介于約ImM與約50mM之間：介 于約0. 1分鐘與約30分鐘之間的時(shí)段；介于約2°C與約37°C之間的溫度；在光存在或不存 在下；和在攪拌或不攪拌下；e)第五步驟，其中治療性蛋白質(zhì)在允許活化的水溶性聚合物 與治療性蛋白質(zhì)上的一個(gè)或多個(gè)氧化型碳水化合物綴合的條件下與活化的水溶性聚合物 和親核性催化劑一起孵育，所述條件包含介于約〇. 5小時(shí)與約24小時(shí)之間的時(shí)段、介于約 2°C與約37°C之間的溫度；在光存在或不存在下；和在攪拌或不攪拌下；和f)第六步驟，其 中所述第五步驟中水溶性聚合物與治療性蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)氧化型碳水化合物的綴合 通過添加選自由以下組成的組的淬滅劑而終止：L-半胱氨酸、甲硫氨酸、谷胱甘肽、甘油、 Na2S205(偏亞硫酸氫鈉）、色氨酸、酪氨酸、組氨酸或其衍生物、甲酚、咪唑和其組合；其中所 述淬滅劑在包含以下的條件下添加成使得最終濃度為約ImM和約IOOmM:介于約5分鐘與 約120分鐘之間的時(shí)段；介于約2°C與約37°C之間的溫度；在光存在或不存在下；和在攪拌 或不攪拌下。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一步驟中治療性蛋白質(zhì)的初始濃度為約lmg/ml并且 pH為約6. 0 ;其中第二步驟中氧化劑的最終濃度為約400yM，并且第五步驟中的條件包含 約10分鐘的時(shí)段、約22°C的溫度、不存在光和在攪拌下；其中第三步驟中的過量濃度為約 50摩爾濃度過量；其中第三步驟中的條件包含約15分鐘的時(shí)段、約22°C的溫度、不存在光 和在攪拌下；其中第四步驟中親核性催化劑的最終濃度為約10mM，并且第四步驟中的條件 包含約15分鐘的時(shí)段、約22°C的溫度、不存在光和在攪拌下；其中第五步驟中將治療性蛋 白質(zhì)與活化的水溶性聚合物和親核性催化劑一起孵育的條件包含約2小時(shí)的時(shí)段；約22°C 的溫度；不存在光；和在攪拌下；并且其中第六步驟中的淬滅劑為L-半胱氨酸；并且其中 L-半胱氨酸添加成使得最終濃度為約IOmM并且第六步驟中的條件包含約60分鐘的時(shí)段、 約22°C的溫度、不存在光和在攪拌下。在又一實(shí)施方案中，水溶性聚合物為PSA。在一個(gè)實(shí) 施方案中，水溶性聚合物為PEG。在另一個(gè)實(shí)施方案中，水溶性聚合物為HES。在又一實(shí)施 方案中，水溶性聚合物為HAS。在另一個(gè)實(shí)施方案中，PSA由約10-300個(gè)唾液酸單元構(gòu)成。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，治療性蛋白質(zhì)為FIX。在另一個(gè)實(shí)施方案中，治療性蛋白質(zhì)為FVIIa。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，治療性蛋白質(zhì)為FVIII。
[0025] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種上述方法，其中氧化劑為高碘酸鈉（NaIO4)。
[0026] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供上述方法，其中治療性蛋白質(zhì)的氧化型碳水化合物部 分位于凝血蛋白的活化肽中。
[0027] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供上述方法，其中PSA包含選自由以下組成的組的活化 的氨氧基接頭：a)下式的3_氧雜-戊燒_1，5-二氧基胺接頭：
【權(quán)利要求】
1. 一種使水溶性聚合物與治療性蛋白質(zhì)的氧化型碳水化合物部分綴合的方法，其包括 在允許綴合的條件下使所述氧化型碳水化合物部分與活化的水溶性聚合物接觸； 所述水溶性聚合物含有活性氨氧基并且選自由以下組成的組：聚乙二醇（PEG)、支鏈PEG、PolyPEG?(WarwickEffectPolymers;Coventry，UK)、聚唾液酸（PSA)、淀粉、輕燒 基淀粉（HAS)、羥乙基淀粉（HES)、碳水化合物、多糖、普魯蘭糖、殼聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟 骨素、硫酸皮膚素、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚環(huán)氧烷（PA0)、聚烷二醇（PAG)、聚丙二醇 (PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯?；鶈徇?、聚乙烯醇（PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚 噁唑啉、聚乙烯-共-馬來酸酐、聚苯乙烯-共-馬來酸酐、聚（1-羥甲基亞乙基羥甲基縮 甲醛）（PHF)、2_甲基丙烯酰氧基-2' -乙基三甲基磷酸銨（MPC); 其中所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物通過以下方法制備，所述方法包括： a) 在允許在氧化型水溶性聚合物與包含活性氨氧基的氨氧基接頭之間形成穩(wěn)定肟鍵 聯(lián)的條件下將包含所述氧化型水溶性聚合物的溶液與所述活化的氨氧基接頭一起孵育，所 述條件包含介于約1分鐘與約24小時(shí)之間的時(shí)段；介于約2°C與約8°C之間的溫度；在光存 在或不存在下；和在攪拌或不攪拌下；從而形成含有活性氨氧基的水溶性聚合物；和 b) 在介于約2°C與約8°C之間的溫度下，通過選自由色譜、過濾、透析和沉淀組成的組 的方法來純化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物； 所述碳水化合物部分通過與包含選自由以下組成的組的氧化劑的緩沖液一起孵育而 氧化：高碘酸鈉（NaI04)、四乙酸鉛（Pb(0Ac)4)和高釕酸鉀（KRu04); 其中在所述氧化型碳水化合物部分與所述水溶性聚合物上的活性氨氧基之間形成肟 鍵聯(lián)；并且 其中所述肟鍵聯(lián)形成由選自由以下組成的組的親核性催化劑催化：鄰氨基苯甲酸、間 氨基苯甲酸、對(duì)氨基苯甲酸、對(duì)氨基苯磺酸、鄰氨基苯甲酰胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、對(duì)甲苯 胺、鄰茴香胺、間茴香胺和對(duì)茴香胺。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在光不存在下，在攪拌下將包含所述氧化型水溶 性聚合物的所述溶液和所述包含活性氨氧基的氨氧基接頭在4°C下孵育1小時(shí)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中通過在4°C溫度下的陰離子交換色譜來純化所述 含有活性氨氧基的水溶性聚合物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述氧化型水溶性聚合物為PSA并且通過與NaI04 一起孵育而氧化。
5. -種使水溶性聚合物與治療性蛋白質(zhì)的氧化型碳水化合物部分綴合的方法，其包括 在允許綴合的條件下使所述氧化型碳水化合物部分與活化的水溶性聚合物接觸； 所述水溶性聚合物含有活性氨氧基并且選自由以下組成的組：聚乙二醇（PEG)、支鏈PEG、PolyPEG?(WarwickEffectPolymers;Coventry，UK)、聚唾液酸（PSA)、淀粉、輕 烷基淀粉（HAS)、羥乙基淀粉（HES)、碳水化合物、多糖、普魯蘭糖、殼聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸 軟骨素、硫酸皮膚素、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚環(huán)氧烷（PA0)、聚烷二醇（PAG)、聚丙二醇 (PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基嗎啉、聚乙烯醇（PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚 噁唑啉、聚乙烯-共-馬來酸酐、聚苯乙烯-共-馬來酸酐、聚（1-羥甲基亞乙基羥甲基縮 甲醛）（PHF)、2_甲基丙烯酰氧基-2' -乙基三甲基磷酸銨（MPC); 其中所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物通過以下方法制備，所述方法包括： a) 在允許在水溶性聚合物與包含活性氨氧基的氨氧基接頭之間形成穩(wěn)定肟鍵聯(lián)的條 件下將包含所述水溶性聚合物的溶液與所述活化的氨氧基接頭一起孵育，所述條件包含介 于約1分鐘與約24小時(shí)之間的時(shí)段；介于約22°C與約37°C之間的溫度；在光存在或不存在 下；和在攪拌或不攪拌下；從而形成所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物；和 b) 通過選自由色譜、過濾、透析和沉淀組成的組的方法來純化所述含有活性氨氧基的 水溶性聚合物； 所述碳水化合物部分通過與包含選自由以下組成的組的氧化劑的緩沖液一起孵育而 氧化：高碘酸鈉（NaI04)、四乙酸鉛（Pb(OAc)4)和高釕酸鉀（KRu04); 其中在所述氧化型碳水化合物部分與所述水溶性聚合物上的活性氨氧基之間形成肟 鍵聯(lián)；并且 其中所述肟鍵聯(lián)形成是由選自由以下組成的組的親核性催化劑催化：苯胺、鄰氨基苯 甲酸、間氨基苯甲酸、對(duì)氨基苯甲酸、對(duì)氨基苯磺酸、鄰氨基苯甲酰胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、 對(duì)甲苯胺、鄰甲氧基苯胺、間甲氧基苯胺和對(duì)甲氧基苯胺。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中在光不存在下，在攪拌下將包含所述水溶性聚合 物的所述溶液和所述包含活性氨氧基的氨氧基接頭在22°C下孵育2小時(shí)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中在光不存在下，在攪拌下將包含所述水溶性聚合 物的所述溶液和所述包含活性氨氧基的氨氧基接頭在22°C下孵育2小時(shí)；所述方法還包括 將所述溶液的溫度增加到介于約32°C與約37°C之間的溫度并孵育另外12-24小時(shí)的步驟。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其包括就在增加所述溫度之前添加另外量的包含活性 氨氧基的氨氧基接頭的另外步驟。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中在22°C溫度下通過選自由透析、超濾 /滲濾（UF/DF)和色譜組成的組的方法純化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其還包括在4°C下通過選自由透析、UF/DF或色譜組 成的組的方法純化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物的步驟。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述治療性蛋白質(zhì)選自由以下組成 的組：因子^$^)、因子￥111$￥111)、因子￥11 &$￥11&)、馮威勒布蘭德因子（胃?)、因子 FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶（FII)、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、tPA、 PAI-1、組織因子（TF)、ADAMTS13 蛋白酶、IL-1a、IL-1 0、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-11、集落刺激因子-1 (CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF)、EPO、 干擾素 _a (IFN-a)、復(fù)合干擾素、IFN-13、IFN-y、IFN-w、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、 IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、 IL-31、IL-32a、IL-33、血小板生成素（TPO)、Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、血管生成素樣 多肽1 (ANGPTL1)、血管生成素樣多肽2 (ANGPTL2)、血管生成素樣多肽3 (ANGPTL3)、血管生 成素樣多肽4(ANGPTL4)、血管生成素樣多肽5(ANGPTL5)、血管生成素樣多肽6(ANGPTL6)、 血管生成素樣多肽7(ANGPTL7)、玻粘蛋白、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)、血管生成素、活化素 A、活化素B、活化素C、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-1、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-2、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-3、骨型態(tài) 發(fā)生蛋白-4、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-5、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-6、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-7、骨型態(tài)發(fā)生蛋 白-8、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-9、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-10、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-11、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-12、 骨型態(tài)發(fā)生蛋白-13、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-14、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-15、骨型態(tài)發(fā)生蛋白受體IA、 骨型態(tài)發(fā)生蛋白受體IB、骨型態(tài)發(fā)生蛋白受體II、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、心臟營養(yǎng)素-1、睫 狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子受體、畸胎癌源性生長因子、潛伏蛋白、細(xì)胞因子誘導(dǎo) 的嗜中性粒細(xì)胞趨化因子1、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞趨化因子2a、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的 嗜中性粒細(xì)胞趨化因子2 0、0內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、內(nèi)皮素1、表皮生長因子、表皮素、表皮 調(diào)節(jié)素、上皮源性嗜中性粒細(xì)胞引誘劑、成纖維細(xì)胞生長因子4、成纖維細(xì)胞生長因子5、成 纖維細(xì)胞生長因子6、成纖維細(xì)胞生長因子7、成纖維細(xì)胞生長因子8、成纖維細(xì)胞生長因子 8b、成纖維細(xì)胞生長因子8c、成纖維細(xì)胞生長因子9、成纖維細(xì)胞生長因子10、成纖維細(xì)胞 生長因子11、成纖維細(xì)胞生長因子12、成纖維細(xì)胞生長因子13、成纖維細(xì)胞生長因子16、成 纖維細(xì)胞生長因子17、成纖維細(xì)胞生長因子19、成纖維細(xì)胞生長因子20、成纖維細(xì)胞生長 因子21、酸性成纖維細(xì)胞生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營 養(yǎng)因子受體a1、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體a2、生長相關(guān)蛋白、生長相關(guān)蛋 白a、生長相關(guān)蛋白0、生長相關(guān)蛋白丫、肝素結(jié)合表皮生長因子、肝細(xì)胞生長因子、肝細(xì) 胞生長因子受體、肝細(xì)胞瘤源性生長因子、胰島素樣生長因子I、胰島素樣生長因子受體、胰 島素樣生長因子II、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白、角化細(xì)胞生長因子、白血病抑制因子、白 血病抑制因子受體a、神經(jīng)生長因子、神經(jīng)生長因子受體、神經(jīng)生成素、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、 神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4、制瘤素M(OSM)、胎盤生長因子、胎盤生長因子2、血小板源性內(nèi)皮細(xì)胞生 長因子、血小板源性生長因子、血小板源性生長因子A鏈、血小板源性生長因子AA、血小板 源性生長因子AB、血小板源性生長因子B鏈、血小板源性生長因子BB、血小板源性生長因子 受體a、血小板源性生長因子受體|3、前B細(xì)胞生長刺激因子、干細(xì)胞因子（SCF)、干細(xì)胞因 子受體、TNF、TNFO、TNF1、TNF2、轉(zhuǎn)化生長因子a、轉(zhuǎn)化生長因子0、轉(zhuǎn)化生長因子0 1、轉(zhuǎn) 化生長因子0 1. 2、轉(zhuǎn)化生長因子0 2、轉(zhuǎn)化生長因子0 3、轉(zhuǎn)化生長因子0 5、潛伏轉(zhuǎn)化生長 因子0 1、轉(zhuǎn)化生長因子0結(jié)合蛋白I、轉(zhuǎn)化生長因子0結(jié)合蛋白II、轉(zhuǎn)化生長因子0結(jié) 合蛋白III、胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP)、腫瘤壞死因子受體I型、腫瘤壞死因子受體 II型、尿激酶型纖溶酶原活化因子受體、磷脂酶活化蛋白（PUP)、胰島素、植物凝集素蓖麻 毒素、催乳素、絨毛膜促性腺激素、卵泡刺激素、促甲狀腺素、組織纖溶酶原活化因子、IgG、 IgE、IgM、IgA和IgD、a-半乳糖苷酶、0 -半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黃體化激素、雌激 素、胰島素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、血小板生成素、尿激酶、整合素、凝血酶、瘦 素、修美樂（阿達(dá)木單抗）、普羅利亞（迪諾賽單抗）、恩利（依那西普）、表1中的蛋白質(zhì)、 或其生物活性片段、衍生物或變體。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中在與所述活化的水溶性聚合物接觸之前，包含 初始濃度介于約〇. 3mg/ml與約3.Omg/ml之間的所述治療性蛋白質(zhì)的溶液被調(diào)整至介于約 5.0與約8.0之間的pH值。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述治療性蛋白質(zhì)的初始濃度為約1.Omg/ml并 且所述pH值為約6.0。
14. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述治療性蛋白質(zhì)是與期望的過量濃度的活化 的水溶性聚合物接觸，其中所述過量濃度介于約1摩爾濃度與約300摩爾濃度過量之間。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述過量濃度為約50倍摩爾濃度過量。
16. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述治療性蛋白質(zhì)在包含以下的條件下與所述 活化的水溶性聚合物一起孵育：介于約0. 5小時(shí)與約24小時(shí)之間的時(shí)段；介于約2°C與約 37°C之間的溫度；在光存在或不存在下；和在攪拌或不攪拌下。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述條件包含約120分鐘的時(shí)段、約22°C的溫 度、不存在光；和在攪拌下。
18. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述親核性催化劑在包含以下的條件下以使得 親核性催化劑的最終濃度介于約1.OmM與約50mM之間的量添加：介于約0. 1分鐘與約30 分鐘之間的時(shí)段；介于約2°C與約37°C之間的溫度；在光存在或不存在下；和在攪拌或不攪 拌下。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述親核性催化劑的最終濃度為約10mM，并且 所述條件包含至多約15分鐘的時(shí)段、約22°C的溫度、不存在光；和在攪拌下。
20. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述氧化劑在包含以下的條件下以使得氧化劑 的最終濃度介于約50yM與約1000yM之間的量添加：介于約0. 1分鐘與120分鐘之間的 時(shí)段；介于約2°C與約37°C之間的溫度；在光存在或不存在下；和在攪拌或不攪拌下。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述氧化劑的最終濃度為約400yM，并且所述 條件包含約10分鐘的時(shí)段、約22°C的溫度、不存在光和在攪拌下。
22. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述水溶性聚合物與所述治療性蛋白質(zhì)的氧 化型碳水化合物部分的綴合通過添加選自由以下組成的組的淬滅劑而終止：L-半胱氨酸、 甲硫氨酸、谷胱甘肽、甘油、偏亞硫酸氫鈉（Na2S205)、色氨酸、酪氨酸、組氨酸或其衍生物、甲 酚、咪唑和其組合； 其中所述淬滅劑在包含以下的條件下以使得淬滅劑的最終濃度介于約ImM與約lOOmM之間的量添加：介于約5分鐘與約120分鐘之間的時(shí)段；介于約2°C與約37°C之間的溫度； 在光存在或不存在下；和在攪拌或不攪拌下。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述淬滅劑為L-半胱氨酸。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述L-半胱氨酸添加成使得最終濃度為約 10mM并且所述條件包含約60分鐘的時(shí)段、約22°C的溫度、不存在光和在攪拌下。
25. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其包括： a) 第一步驟，其包括將包含所述治療性蛋白質(zhì)的溶液的pH值調(diào)整至介于約5. 0與約 8. 0之間的pH值，其中所述治療性蛋白質(zhì)濃度介于約0? 3mg/ml與約3. 0mg/ml之間； b) 第二步驟，其包括氧化所述治療性蛋白質(zhì)上的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物，其中所述氧 化劑在包含以下的條件下添加至所述第一步驟中的溶液中以使得最終濃度介于約50yM 與約1000yM之間：介于約0. 1分鐘與約120分鐘之間的時(shí)段；介于約2°C與約37°C之間的 溫度；在光存在或不存在下；和在攪拌或不攪拌下； c) 第三步驟，其包括在包含以下的條件下使所述治療性蛋白質(zhì)與期望的過量濃度的活 化的水溶性聚合物接觸，其中所述過量濃度介于約1摩爾濃度過量與約300摩爾濃度過量 之間：介于約〇. 5小時(shí)與約24小時(shí)之間的時(shí)段；介于約2°C與約37°C之間的溫度；在光存 在或不存在下；和在攪拌或不攪拌下； d) 第四步驟，其包括將親核性催化劑添加至所述第三步驟的溶液中，其中所述親核性 催化劑在包含以下的條件下添加成使得最終濃度介于約ImM與約50mM之間：介于約0. 1分 鐘與約30分鐘之間的時(shí)段；介于約2°C與約37°C之間的溫度；在光存在或不存在下；和在 攪拌或不攪拌下； e) 第五步驟，其中所述治療性蛋白質(zhì)在允許所述活化的水溶性聚合物與所述治療性蛋 白質(zhì)上的一個(gè)或多個(gè)氧化型碳水化合物綴合的條件下與所述活化的水溶性聚合物和親核 性催化劑一起孵育，所述條件包含介于約〇. 5小時(shí)與約24小時(shí)之間的時(shí)段、介于約2°C與約 37°C之間的溫度；在光存在或不存在下；和在攪拌或不攪拌下；和 f) 第六步驟，其中所述第五步驟中所述水溶性聚合物與所述治療性蛋白質(zhì)的一個(gè)或多 個(gè)氧化型碳水化合物的綴合通過添加選自由以下組成的組的淬滅劑而終止：L-半胱氨酸、 甲硫氨酸、谷胱甘肽、甘油、Na2S205 (偏亞硫酸氫鈉）、色氨酸、酪氨酸、組氨酸或其衍生物、甲 酚、咪唑和其組合；其中所述淬滅劑在包含以下的條件下添加成使得最終濃度為約ImM和 約lOOmM:介于約5分鐘與約120分鐘之間的時(shí)段；介于約2°C與約37°C之間的溫度；在光 存在或不存在下；和在攪拌或不攪拌下。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述第一步驟中所述治療性蛋白質(zhì)的初始濃度 為約lmg/ml并且所述pH值為約6. 0 ; 其中所述第二步驟中所述氧化劑的最終濃度為約400yM，并且所述第五步驟中的條件 包含約10分鐘的時(shí)段、約22°C的溫度、不存在光和在攪拌下； 其中所述第三步驟中的過量濃度為約50摩爾濃度過量；其中所述第三步驟中的條件 包含約15分鐘的時(shí)段、約22°C的溫度、不存在光和在攪拌下； 其中所述第四步驟中所述親核性催化劑的最終濃度為約10mM，并且所述第四步驟中的 條件包含約15分鐘的時(shí)段、約22°C的溫度、不存在光和在攪拌下； 其中所述第五步驟中將所述治療性蛋白質(zhì)與所述活化的水溶性聚合物和親核性催化 劑一起孵育的條件包含約2小時(shí)的時(shí)段；約22°C的溫度；不存在光；和在攪拌下；并且 其中所述第六步驟中的淬滅劑為L-半胱氨酸；并且其中所述L-半胱氨酸添加成使得 最終濃度為約10mM并且所述第六步驟中的條件包含約60分鐘的時(shí)段、約22°C的溫度、不存 在光和在攪拌下。
27. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述水溶性聚合物為PSA。
28. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述水溶性聚合物為PEG。
29. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述水溶性聚合物為HES。
30. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述水溶性聚合物為HAS。
31. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述PSA由約10-300個(gè)唾液酸單元構(gòu)成。
32. 根據(jù)權(quán)利要求11-31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述治療性蛋白質(zhì)為FIX。
33. 根據(jù)權(quán)利要求11-31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述治療性蛋白質(zhì)為FVIIa。
34. 根據(jù)權(quán)利要求11-31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述治療性蛋白質(zhì)為FVIII。
35. 根據(jù)權(quán)利要求11-34中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述氧化劑為高碘酸鈉（NalO4)。
36. 根據(jù)權(quán)利要求32-34中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述治療性蛋白質(zhì)的氧化型碳水 化合物部分位于凝血蛋白的活化肽中。
37. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述PSA包含選自由以下組成的組的活化的氨 氧基接頭： a)下式的3_氧雜-戊燒_1，5-二氧基胺接頭：
其中所述PSA通過與氧化劑一起孵育而氧化以在所述PSA的非還原端形成末端醛基。
38. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述氨氧基接頭為3-氧雜-戊烷-1，5-二氧基 胺。
39. 根據(jù)權(quán)利要求11-38中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述親核性催化劑以介于約ImM與 約50mM之間的濃度提供。
40. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述親核性催化劑為間甲苯胺。
41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述間甲苯胺以約10mM的濃度存在于所述綴合 反應(yīng)中。
42. 根據(jù)權(quán)利要求11-41中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括純化所述綴合的治療性蛋白 質(zhì)的步驟。
43. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述綴合的治療性蛋白質(zhì)通過選自由色譜、過 濾和沉淀組成的組的方法來純化。
44. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述色譜選自由以下組成的組：疏水性相互作 用色譜（HIC)、離子交換色譜（IEC)、尺寸排阻色譜（SEC)、親和色譜和反相色譜。
45. 根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中于色譜加載步驟和色譜洗滌步驟中使用抗離液 鹽。
46. 根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述色譜在柱中進(jìn)行。
47. 根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述柱包含選自由苯基-瓊脂糖FF和丁基-瓊 脂糖FF組成的組的色譜樹脂。
48. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述樹脂以介于約5cm與約20cm之間的床高度 存在于所述柱中。
49. 根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述床高度為約10cm。
50. 根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其包括一個(gè)或多個(gè)洗滌步驟，其中流動(dòng)方向設(shè)定為 向上流動(dòng)并且其中流速介于約0. 2cm/min與約6. 7cm/min之間。
51. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述流速為約2cm/min。
52. 根據(jù)權(quán)利要求47-52中任一項(xiàng)所述的方法，其包括一個(gè)或多個(gè)洗脫步驟，其中流動(dòng) 方向設(shè)定為向下流動(dòng)并且其中流速介于約〇.lcm/min與約6. 7cm/min之間。
53. 根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述流速為約lcm/min。
54. 根據(jù)權(quán)利要求42-53中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括通過超濾/滲濾（UF/DF)濃縮 所述綴合的治療性蛋白質(zhì)。
55. 根據(jù)權(quán)利要求42-54中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述治療性蛋白質(zhì)的最終濃度介 于約0. 5mg/ml與約3mg/ml之間。
56. 根據(jù)權(quán)利要求42-55中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述治療性蛋白質(zhì)包含約5個(gè)至約 11個(gè)水溶性聚合物部分。
57. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述綴合的治療性蛋白質(zhì)使用色譜純化；其中 于加載步驟和洗滌步驟使用抗離液鹽；所述方法包括一個(gè)或多個(gè)洗滌步驟，其中流動(dòng)方向 設(shè)定為向上流動(dòng)并且其中流速介于約〇. 2cm/min與約6. 7cm/min之間；和一個(gè)或多個(gè)洗脫 步驟，其中流動(dòng)方向設(shè)定為向下流動(dòng)并且其中流速介于約〇. 2cm/min與約6. 7cm/min之間； 所述方法還包括通過超濾/滲濾（UF/DF)濃縮所述綴合的治療性蛋白質(zhì)。
58. 根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中所述色譜為疏水性相互作用色譜（HIC);其中 所述一個(gè)或多個(gè)洗滌步驟流速為約2cm/min;并且其中所述一個(gè)或多個(gè)洗脫步驟流速為約 lcm/min〇
59. -種修飾的治療性蛋白質(zhì)，其通過根據(jù)權(quán)利要求1至58中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生。
60. -種制備含有活性氨氧基的水溶性聚合物的方法，其包括： a) 在允許在氧化型水溶性聚合物與包含活性氨氧基的氨氧基接頭之間形成穩(wěn)定肟鍵 聯(lián)的條件下將包含所述氧化型水溶性聚合物的溶液與所述活化的氨氧基接頭一起孵育，所 述條件包含介于約1分鐘與約24小時(shí)之間的時(shí)段；介于約2°C與約8°C之間的溫度；在光存 在或不存在下；和在攪拌或不攪拌下；從而形成含有活性氨氧基的水溶性聚合物；和 b) 在介于約2°C與約8°C之間的溫度下，通過選自由色譜、過濾、透析和沉淀組成的組 的方法來純化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物； 所述水溶性聚合物選自由以下組成的組：聚乙二醇（PEG)、支鏈PEG、P〇lyPEG?(WarwickEffectPolymers;Coventry,UK)、聚唾液酸（PSA)、輕燒基淀粉（HAS)、輕乙基 淀粉01ES)、碳水化合物、多糖、普魯蘭糖、殼聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、淀 粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚環(huán)氧烷（PA0)、聚烷二醇（PAG)、聚丙二醇（PPG)、聚噁唑 P林、聚丙烯酰基嗎啉、聚乙烯醇（PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙 烯-共-馬來酸酐、聚苯乙烯-共-馬來酸酐、聚（1-羥甲基亞乙基羥甲基縮甲醛）（PHF)、 2-甲基丙烯酰氧基-2' -乙基三甲基磷酸銨（MPC); 從而在所述水溶性聚合物與所述氨氧基接頭之間形成肟鍵聯(lián)。
61. 根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中所述肟鍵聯(lián)形成由選自由以下組成的組的親核 性催化劑催化：鄰氨基苯甲酸、間氨基苯甲酸、對(duì)氨基苯甲酸、對(duì)氨基苯磺酸、鄰氨基苯甲酰 胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、對(duì)甲苯胺、鄰茴香胺、間茴香胺和對(duì)茴香胺。
62. 根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中所述水溶性聚合物為PSA。
63. 根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中所述水溶性聚合物為PEG。
64. 根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中在光不存在下，在攪拌下將包含所述氧化型水 溶性聚合物的所述溶液和所述包含活性氨氧基的氨氧基接頭在4°C下孵育1小時(shí)。
65. 根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中通過在4°C溫度下的陰離子交換色譜來純化所 述含有活性氨氧基的水溶性聚合物。
66. -種制備含有活性氨氧基的水溶性聚合物的方法，其包括： a)在允許在水溶性聚合物與包含活性氨氧基的氨氧基接頭之間形成穩(wěn)定肟鍵聯(lián)的條 件下將包含所述水溶性聚合物的溶液與所述活化的氨氧基接頭一起孵育，所述條件包含介 于約1分鐘與約24小時(shí)之間的時(shí)段；介于約22°C與約37°C之間的溫度；在光存在或不存在 下；和在攪拌或不攪拌下；從而形成所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物；和 b)通過選自由色譜、過濾、透析和沉淀組成的組的方法來純化所述含有活性氨氧基的 水溶性聚合物； 從而在所述水溶性聚合物與氨氧基接頭之間形成肟鍵聯(lián)。
67. 根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中所述肟鍵聯(lián)形成由選自由以下組成的組的親核 性催化劑催化：鄰氨基苯甲酸、間氨基苯甲酸、對(duì)氨基苯甲酸、對(duì)氨基苯磺酸、鄰氨基苯甲酰 胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、對(duì)甲苯胺、鄰茴香胺、間茴香胺和對(duì)茴香胺。
68. 根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中在光不存在下，在攪拌下將包含所述水溶性聚 合物的所述溶液和所述包含活性氨氧基的氨氧基接頭在22°C下孵育2小時(shí)。
69. 根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中在光不存在下，在攪拌下將包含所述水溶性聚 合物的所述溶液和所述包含活性氨氧基的氨氧基接頭在22°C下孵育2小時(shí)；所述方法還包 括將所述溶液的溫度增加到介于約32°C與約37°C之間的溫度以及孵育另外12-24小時(shí)的 步驟。
70. 根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其包括就在增加所述溫度之前添加另外量的包含活 性氨氧基的氨氧基接頭的另外步驟。
71. 根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中在22°C溫度下通過選自由透析、超濾/滲濾 (UF/DF)和色譜組成的組的方法純化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物。
72. 根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，其還包括在4°C下通過選自由透析、UF/DF或色譜組 成的組的方法純化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物的步驟。
73. -種制備PSA-氨氧基試劑氨氧基的方法，其包括： a) 在允許在氧化型PSA與包含活性氨氧基的氨氧基接頭之間形成穩(wěn)定肟鍵聯(lián)的條件 下將包含所述氧化型PSA的溶液與所述活化的氨氧基接頭一起孵育，所述條件包含1小時(shí) 的時(shí)段；4°C的溫度；在光不存在下，和在攪拌下；從而形成含有活性氨氧基的PSA;和 b) 在4°C的溫度下通過陰離子交換色譜純化所述含有活性氨氧基的PSA; 所述活化的氨氧基接頭為下式的3-氧雜-戊烷-1，5-二氧基胺接頭：
從而在所述PSA與所述氨氧基接頭之間形成肟鍵聯(lián)。
74. -種制備PSA-氨氧基試劑氨氧基的方法，其包括： a) 在允許在非氧化型PSA與包含活性氨氧基的氨氧基接頭之間形成穩(wěn)定肟鍵聯(lián)的條 件下將包含所述非氧化型PSA的溶液與所述活化的氨氧基接頭一起孵育，所述條件包含2 小時(shí)的時(shí)段；22°C的溫度；在光不存在下，和在攪拌下；從而形成含有活性氨氧基的PSA;和 b) 在22°C的溫度下通過透析純化所述含有活性氨氧基的PSA; 所述活化的氨氧基接頭為下式的3-氧雜-戊烷-1，5-二氧基胺接頭：
從而在所述非氧化型PSA與所述氨氧基接頭之間形成肟鍵聯(lián)。
75.-種使水溶性聚合物與血凝蛋白的氧化型碳水化合物部分綴合的方法，其包括在 允許綴合的條件下使所述氧化型碳水化合物部分與活化的水溶性聚合物接觸； 所述凝血蛋白選自由以下組成的組：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威里氏因子（VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子 XII(FXII)、凝血酶（FII)、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、組織因子（TF)和ADAMTS13蛋白酶 或其生物活性片段、衍生物或變體； 所述水溶性聚合物含有活性氨氧基并且選自由以下組成的組：聚乙二醇（PEG)、支鏈PEG、聚唾液酸（PSA)、碳水化合物、多糖、普魯蘭糖、殼聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮 膚素、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚環(huán)氧烷（PAO)、聚烷二醇（PAG)、聚丙二醇（PPG)、聚噁唑 P林、聚丙烯?；鶈徇⒕垡蚁┐迹≒VA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙 烯-共-馬來酸酐、聚苯乙烯-共-馬來酸酐、聚（1-羥甲基亞乙基羥甲基縮甲醛）（PHF)、 2-甲基丙烯酰氧基-2' -乙基三甲基磷酸銨（MPC);并且 所述碳水化合物部分通過與包含選自由以下組成的組的氧化劑的緩沖液一起孵育而 氧化：高碘酸鈉（NaI04)、四乙酸鉛（Pb(OAc)4)和高釕酸鉀（KRu04);其中在所述氧化型碳 水化合物部分與所述水溶性聚合物上的活性氨氧基之間形成肟鍵聯(lián)。
【文檔編號(hào)】A61K47/48GK104487095SQ201380037823
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2013年5月16日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月16日
【發(fā)明者】J·西克曼, S·海德爾, H·羅滕斯滕, P·圖雷切克 申請人:巴克斯特國際公司, 巴克斯特保健股份有限公司