用組織因子抗體提高乳腺癌內(nèi)分泌藥物治療效果的方法
【專利摘要】一種通過組織因子拮抗劑提高乳腺癌內(nèi)分泌藥物治療療效的方法，該組織因子拮抗劑通過細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，提升或者重鑄雌激素受體在乳腺癌細(xì)胞中的表達，從而對以阻斷雌激素類的乳腺癌內(nèi)分泌藥物的療效起到提升和輔助作用。
【專利說明】用組織因子抗體提高乳腺癌內(nèi)分泌藥物治療效果的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及使用組織因子拮抗劑對于乳腺癌或者手術(shù)后防止癌癥擴算的效果，通 過組織因子拮抗劑提升雌激素受體在乳腺癌細(xì)胞中的表達，從而提高以雌激素受體抑制劑 類的內(nèi)分泌藥物的治療效果。所述的組織因子拮抗劑如針對組織因子的抗體，包括針對至 少一種組織因子的蛋白或者其片段特異性的所述抗體或者其變體。

【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌的發(fā)病率在整個癌癥中排名第二，是我國女性最常見的惡性腫瘤，且發(fā)病 率呈逐年上升趨勢。目前對于乳腺癌的治療手段包括手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療、內(nèi)分 泌治療和分子靶向治療。目前仍以手術(shù)切除為主，在科學(xué)和人文結(jié)合的現(xiàn)代乳腺癌治療新 理念指導(dǎo)下，乳腺癌的治療趨勢包括保留乳房和腋窩的微創(chuàng)手術(shù)、更為精確的立體定向放 療和選擇性更好的靶向藥物治療。分子靶向治療是近年來乳腺癌治療研究領(lǐng)域最為活躍的 部分，并有可能成為今后乳腺癌藥物研發(fā)的主要方向。同時根據(jù)乳腺癌的不同分型，體內(nèi)雌 激素受體（Estrogen receptor，ER)、孕激素受體（Progesterone receptor，PR)和人類表 皮生長因子受體2(HER2)都呈現(xiàn)陰性的患者，內(nèi)分泌治療和靶向用藥都受到極大的限制， 只能以化療為主。因此，探索對于腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移起作用的信號傳導(dǎo)通路，為新的分 子靶向藥物和改善內(nèi)分泌用藥提供理論基礎(chǔ)，對于提高乳腺癌臨床治療效果具有極其重要 的意義。
[0003] 組織因子（tissue factor, TF)是一個由263個氨基酸殘基組成的跨膜單鏈糖蛋 白，分子量約為47kDa。其中氨基端219個氨基酸殘基位于細(xì)胞膜外，緊隨其后的23個氨 基酸殘基則穿過細(xì)胞膜，其余21個氨基酸殘基位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。正常情況下，組織因子位于 血管壁外膜細(xì)胞，包繞血管的成纖維細(xì)胞，肝、脾、腎等器官的纖維囊，及皮膚外層的表皮細(xì) 胞、腎小球上皮細(xì)胞、腦皮質(zhì)、心肌細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、胃腸道壁、部分生殖泌尿道和子宮 內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中，而在血管中膜或內(nèi)膜層卻很稀少。因此在正常情況下組織因子不存在于 循環(huán)中或不與循環(huán)血液接觸，只有當(dāng)血管壁的完整性遭到破壞時TF才暴露于循環(huán)血液，通 過激活凝固級聯(lián)反應(yīng)發(fā)揮止血作用。組織因子通過與因子VII/VIIa結(jié)合而啟動血液凝固 級聯(lián)反應(yīng)。而且TF依靠其與細(xì)胞膜的緊密結(jié)合發(fā)揮"錨"作用，使生理性凝血過程局限于 損傷部位，而不從血液凝固的起始部位向遠(yuǎn)處播散。當(dāng)細(xì)胞表面表達的TF暴露于血漿蛋白 時，TF就會與其有高親和力的因子VII (factor VII，F(xiàn) VII)相粘連。而且TF2 Vila復(fù)合 物可進一步激活游離F VII。TF2 Vila復(fù)合物可迅速催化因子X的激活，這些過程最終導(dǎo) 致凝血酶產(chǎn)生。凝血酶進而催化纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白并聚合成纖維蛋白血塊，在血 栓形成過程中起著重要作用。TF除了在正常生理狀態(tài)下表現(xiàn)的功能外，越來越多的證據(jù)表 明TF在腫瘤的發(fā)展過程中起著重要的作用，TF的過度表達經(jīng)常與腫瘤的發(fā)生相關(guān)聯(lián)。
[0004] 雌激素受體（Estrogen receptor，ER)位于細(xì)胞核內(nèi)，介導(dǎo)雌激素的基因型效應(yīng)， 即通過調(diào)節(jié)特異性靶基因的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮"基因型"調(diào)節(jié)效應(yīng)，ER在乳腺癌的發(fā)生和治療中 起到重要作用。如果ER信號通路失調(diào)，可導(dǎo)致相關(guān)基因表達失衡或改變胞質(zhì)內(nèi)蛋白功能， 促使乳腺細(xì)胞過度增殖或乳腺細(xì)胞凋亡受阻，從而導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生；另一方面目前針對 乳腺癌的內(nèi)分泌治療，大多以雌激素受體靶向，臨床上約有70%的乳腺癌患者為雌激素受 體陽性，雌激素受體陽性者應(yīng)用內(nèi)分泌治療的有效率為50%?60%，而受體陰性者有效率 低于10%。Giacinti等嘗試去甲基化藥物可以使乳腺癌細(xì)胞的ER恢復(fù)表達，提高腫瘤對 抗雌激素藥物的敏感性，從而改善治療效果。Plescia等根據(jù)HSP90是乳腺癌疾病進程及 耐藥機制中許多關(guān)鍵蛋白的分子伴侶，影響ER的穩(wěn)定和結(jié)合激素的生物學(xué)功能，而嘗試用 HSP90的抑制劑sh印herdin進行乳腺癌治療。
[0005] W094/05328中公開了使用組織因子抗體抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移的發(fā)作和發(fā)展，通過消除 微脈管系統(tǒng)中轉(zhuǎn)移細(xì)胞的長期粘著從而實現(xiàn)抑制轉(zhuǎn)移。但是并未公開是否通過和內(nèi)分泌藥 物聯(lián)合使用，并通過調(diào)控雌激素受體的表達而達到提升雌激素受體抑制劑類的內(nèi)分泌藥物 治療效果，從而達到抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移發(fā)作。
[0006] 專利1829531中公開了用抗組織因子抗體來抑制腫瘤生長的方法，主要通過組織 因子抗體抑制腫瘤血管形成，從而對于乳腺癌、胰腺癌等腫瘤移植到小鼠后檢測組織因子 抗體對于腫瘤的生長的影響。但是并未公開組織因子抗體對于腫瘤生長影響的機制的研 究，也并未嘗
[0007] 試對于組織因子抗體對于雌激素受體表達的影響的研究，并未公開組織因子抗體 和雌激素受體拮抗劑聯(lián)用對于雌激素受體陰性的腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的：研究組織因子拮抗劑對于雌激素受體α的表達的影響情況，提升 針對ER α的內(nèi)分泌藥物的藥效作用。
[0009] 本發(fā)明所述的抗體是一種Fab抗體，可以是鼠源、人源、以及嵌合式的人單克隆抗 體或者他們的片段。所述抗體具備防止組織因子通過其細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的信號傳導(dǎo)的特 性。此類抗體應(yīng)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，并且可以用于本發(fā)明的方法中。
[0010] 本發(fā)明所述的組織因子抑制劑提升了乳腺癌細(xì)胞中的雌激素受體的表達。
[0011] 本發(fā)明所述的組織因子抑制劑能夠和乳腺癌激素內(nèi)分泌藥物聯(lián)合使用，包括但不 限于他莫昔芬（三苯氧胺）、托瑞米芬（法樂通）、氟維司群（fulvestrant)、雷洛昔芬等藥 物，針對雌激素受體陰性和雌激素受體陽性的乳腺癌患者，能夠提升治療效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 下面結(jié)合附圖和具體的實施例對本發(fā)明做進一步詳細(xì)的說明。
[0013] 圖1圖示了 ERa在不同乳腺癌細(xì)胞中受TF及其抗體的影響情況。
[0014] 圖2圖示說明了在不同的乳腺癌細(xì)胞中TF及其抗體的影響腫瘤細(xì)胞增生及侵潤 情況。
[0015] 圖3圖示說明了皮下植入小鼠的人乳腺癌細(xì)胞的腫瘤生長速率（體積改變），從第 〇天到每周施用一次TF抗體，以及陰性對照PBS的情況。

【具體實施方式】
[0016] 以下結(jié)合具體實施例對上述方案作進一步說明，應(yīng)理解，這些實施例是用于說明 本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實施例中所采用的實施條件可以根據(jù)具體廠家的條件 做進一步調(diào)整，未注明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。
[0017] 具體實施方案一，體外實驗
[0018] 1、乳腺癌細(xì)胞株MC F-7 cells(TF陰性表達，ER陽性表達）和MDA-MB-231 (TF陽 性表達，ER陰性表達）購自ATC C，分別在5% C02培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)液中，MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染 wild type TF(WTF)、切除了胞質(zhì)域部分TF片段TF ACT (購自美國Rockville公司）。轉(zhuǎn)染 后的MCF-7細(xì)胞，通過PCR、ELISA和Western blotting技術(shù)檢測，ERa的m RNA和蛋白的 表達。轉(zhuǎn)染后的MCF-7細(xì)胞加入TF抑制劑MAB-5G9抗體lmg/ml，48小時后，同樣用ELISA， RT-PCR以及Western blotting檢測ERa的表達情況。
[0019] ELISA :取IX 106MCF-7細(xì)胞，破碎后離心1200rpm 8分鐘，取上清作為待測樣品。 ER a抗原3ug/ml，100ul/孔，4°C包被過夜，PBS洗板3次，5分鐘/次；第二天加入2% BSA 的PBS，37°C封閉1. 5小時；洗板后加入100ul每孔的待測樣品37°C，孵育lh ;再次洗板后 加入100ul/孔的HRP標(biāo)記的anti-humanER，37°C，孵育lh ;洗板，每孔加入100ul顯色液， 靜止5分鐘待顯色后，每孔加入2M H2S04終止顯色，0D280mn讀數(shù)分析。
[0020] RT-PCR :取2X 106/ml MCF-7細(xì)胞，放到1. 5ml EP管中，加0. 2ml氯仿，劇烈搖動 30s，室溫3min。12000 X g，4°C離心，15min。吸上層無色水相，移入另一 EP管中（約0· 5ml)。 加等體積異丙醇，-20°C，30min。12000Xg，4°C離心，10min。在管底部可見微量RNA沉淀。 棄上清，加75%乙醇lml，振蕩7500Xg，4°C離心，10min。棄上清，用濾紙小心吸取殘留液 體，室溫干燥5-10min。沉淀溶于20μ 1 DEPC水，取1μ 1加入79μ 1 DEPC水測0D260/0D280 計算濃度與純度。
[0021] 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA
[0022] 反應(yīng)體系如表1 :
[0023] 表 1
[0024]

【權(quán)利要求】
1. 組織因子的拮抗劑對于針對乳腺癌內(nèi)分泌藥物起到提高療效作用。
2. 權(quán)利要求1中所指的組織因子拮抗劑可以是鼠源、人源、以及嵌合式的人單克隆抗 體或者他們的片段。所述抗體具備防止組織因子通過其細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的信號傳導(dǎo)的特 性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2中，該抗體是一種Fab，F(xiàn)ab'，F(xiàn)(ab'）2的片段或者衍生物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2中，該抗體具備防止組織因子通過其細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的信號傳導(dǎo) 的特性。
5. 該抗體可以和乳腺癌激素內(nèi)分泌藥物聯(lián)合使用，包括但不限于他莫昔芬（三苯氧 胺）、托瑞米芬（法樂通）、氟維司群（fulvestrant)、雷洛昔芬等藥物聯(lián)合使用。
6. 該抗體對于乳腺癌細(xì)胞中的雌激素受體的表達起到促進作用。
7. 該抗體和乳腺癌激素內(nèi)分泌藥物聯(lián)合使用，對于雌激素受體陽性或者陰性的乳腺癌 患者都有效果。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5,該抗體對于乳腺癌細(xì)胞包括但不限于MDA-MB-231。
9. 組織因子拮抗劑可用于腫瘤治療藥物，特指為乳腺癌內(nèi)分泌藥物的輔助治療藥物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9,該抗體對于以雌激素受體為靶向，或者以阻滯或者降低雌激素為 目的的乳腺癌內(nèi)分泌藥物起到良性的輔助作用。
【文檔編號】A61K31/565GK104056267SQ201310084936
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年3月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月18日
【發(fā)明者】李超, 夏志道 申請人:蘇州納諾康生物技術(shù)有限公司