專利名稱：：用于乳腺癌治療的hcap18/ll-37抑制劑的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及癌癥治療中使用的試劑(agent)。特別地，本發(fā)明提供了能夠抑制癌細胞轉移的試劑。
背景技術：
：抗菌蛋白是先天性免疫系統(tǒng)中的重要效應物。人cathdicidin抗菌蛋白hCAP18是人體中唯一已知的cathelicidin，由保守的cathelin域和稱為LL-37的可變C末端組成(Gudmundsson等，1996，￡wr/祝oc/^w1238:325-32;Zanetti箏,1995,374:1-5)。對全蛋白進行細胞外蛋白水解處理釋放LL-37肽，LL-37肽具有廣泛的抗菌活性(Gudmundsson等，1995，iVocAto/^cWSc/92:7085-9;Agerberth等，1995，PraciVa//JcadC/5^92:195-99)和對宿主細胞的作用，其中一些作用由G蛋白偶聯(lián)受體甲酰化肽樣受體1(FPRL1)介導(Yang等，2000,JEx/MW192:1069-74;Koczulla等，2003，J/"veW111:1665-72)。hCAP18存在于白細胞中(Cowland等，1995，丄欲368:173-76)并在對其上調的皮膚和其它上皮細胞中表達，這種上調與炎癥(Cowland等，1995,F五5S丄e"368:173-76;Frohm等，1997,J說WC/zem272:15258-63)和損傷(Dorschner等，2001,J/"veMDermato/117:91-97;Heilbom等,2003，J/m^/Z)emato/120:379-89)相關并與先天性屏障保護中的作用一致。最近，已經(jīng)提出包括cathelicidin的抗菌蛋白還在對抗腫瘤的非特異性宿主防御中起作用(Winder等，1998，所oc/zem所o;/^及esCow附w"242:608-12;Ohtake等，1999，5rJC薦w181:393-403.)。發(fā)明概述本發(fā)明的第一個方面提供了抑制癌細胞轉移的試劑，其中所述試劑抑制(即能夠在體內抑制)hCAP18/LL-37的生物活性。所述"轉移"表示癌細胞從受試者體內的原發(fā)腫瘤位點到受試者體內的一個或多個其它區(qū)域(隨后所述細胞可以在所述區(qū)域形成次生腫瘤)的運動或移動(即，擴散性)。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了在患有癌癥的受試者體內完全地或部分地抑制次生腫瘤形成的試劑和方法。技術人員能夠理解，本文所闡述的試劑對"轉移"的作用不同于這種試劑對癌細胞增殖(即癌細胞的數(shù)量)的可能有或可能沒有的任何作用。所述"試劑"包括所有化學物質，例如寡核苷酸、多核苷酸、多肽、模擬肽和小的化合物。因此，本發(fā)明提供了能夠直接(例如，通過降低蛋白質的生物活性)或間接(例如，通過降低hCAP18/LL-37的表達)抑制hCAP18/LL-37的生物活性的試劑。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述試劑通過改變hCAP18/LL-37的轉錄、翻譯、剪切和/或結合特性抑制hCAP18/LL-37的生物活性。這種試劑可以利用本領域熟知的方法進行鑒定，例如(a)通過例如Northern雜交或定量RT-PCR測定測試試劑對hCAP18/LL-37mRNA的表達水平的影響；(b)通過例如使用抗hCAP18/LL-37抗體的免疫測定來測定測試試劑對hCAP18/LL-37蛋白質水平的影響；和(c)通過測定測試試劑對hCAP18/LL-37活性的功能標志物(例如，ErbB2的磷酸化)的影響。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述試劑為hCAP18/LL-37轉錄的抑制劑。在本發(fā)明的另一實施方案中，所述試劑為hCAP18/LL-37翻譯的抑制劑。在本發(fā)明的再一實施方案中，所述試劑為hCAP18/LL-37結合特性的抑制劑。例如，所述試劑可以改變hCAP18/LL-37的構象使其不再能夠與其受體結合。本領域的技術人員能夠理解所述試劑還可以通過直接阻斷hCAP18/LL-37受體的功能，即作為hCAP18/LL-37受體拮抗劑來抑制hCAP18/LL-37的生物活性。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述試劑通過調節(jié)(如降低)hCAP18/LL-37或其mRNA的穩(wěn)定性來抑制hCAP18/LL-37的生物活性。例7如，所述試劑可以為cathelicidin蛋白水解處理的抑制劑，如蛋白酶抑制劑(例如，蛋白酶3)。所述試劑能夠選擇性地抑制hCAP18/LL-37的生物活性是有利的。所述"選擇性地"表示所述試劑在癌細胞中以大于其調節(jié)其它蛋白質活性的程度抑制hCAP18/LL-37的生物活性?？梢岳斫?，雖然作為hCAP18/LL-37選擇性抑制的下游結果，癌細胞內其它蛋白質的表達和活性也會改變，但所述試劑僅優(yōu)選地抑制hCAP18/LL-37的生物活性。因此，我們排除了對基因表達和/或癌細胞轉移具有非特異性作用的試劑。本領域的技術人員可以理解本發(fā)明的試劑可以完全地或部分地抑制hCAP18/LL-37的生物活性。例如，與沒有接觸所述試劑的癌細胞內hCAP18/LL-37的生物活性相比，所述試劑可以抑制hCAP18/LL-37的生物活性的至少10%，優(yōu)選至少20%、30°/。、40%、50%、60%、70%、80%或90%，并且最優(yōu)選100%。在優(yōu)選實施方案中，與沒有接觸所述試劑的癌細胞中hCAP18/LL-37的生物活性相比，所述試劑能夠抑制hCAP18/LL-37的生物活性50%或更多。優(yōu)選地，所述試劑選自以下類型的試劑(a)小干擾RNA(siRNA)分子；(b)反義寡核苷酸；和(c)對hCAP18/LL-37具有結合親和力的化合物，例如多肽。所述試劑也可以是小的抑制劑化合物，例如維生素D的拮抗劑(例如ZK159222(ScheringAG)禾QTEI-9647(TejinInstituteforMedicalResearch,Tokyo))和維生素A的拮抗齊!J(例如AGN193109(AllergenPharmaceuticals))。在本發(fā)明的第一個方面的優(yōu)選實施方案中，所述試劑為小干擾RNA(siRNA)分子。RNA干擾是一個具有兩個步驟過程。第一個步驟稱為起始步驟，可能通過dsRNA特異性核糖核酸酶RnaseIII家族成員Dicer的作用將輸入dsRNA降解成21-23個核苷酸(nt)的小干擾RNA(siRNA)，所述Dicer以ATP依賴的方式加工(剪切)dsRNA(直接引入或通過轉基因或病毒引入)。連續(xù)的剪切將所述RNA降解成19-21bp的雙鏈(siRNA)，每條雙鏈帶有長度為2個核苷酸的3'-懸端(Hutvagner&Zamore，2002,CwrQp/".(7e"eri"aw<i8Z)eve/o;me"f12:225-232;Bernstein,2001,iVafw409:363-366)。在效應步驟中，siRNA雙鏈與核酸酶復合體結合形成RNA誘導沉默復合體(RISC)。RISC的激活需要ATP依賴的siRNA雙鏈的解螺旋。隨后，活性RISC通過堿基配對相互作用靶向同源轉錄本并從siRNA的3'末端將mRNA剪切成12個核苷酸的片段(Hutvagner&Zamore，2002,如上文;Hammond等，2001，2:110-119(2001);Sharp,2001,Dev.15:485-90)。雖然剪切的機制尚未被闡明，但研究表明每一個RISC都包含單個siRNA和RNase(Hutvagner&Zamore,2002,如上文)。考慮到RNAi的超凡能力，現(xiàn)已提出RNAi通路中存在放大步驟。放大作用可能通過復制輸入dsRNA以產(chǎn)生更多siRNA，或者通過復制所形成的siRNA而產(chǎn)生?？蛇x擇地或另外地，可能通過RISC的多個周轉實現(xiàn)放大作用(Hammond等，2001，如上文；Hutvagner&Zamore，2002,如上文)。關于RNAi的其它信息可以在以下綜述中找到Tuschl,2001,C/2em.B/oc/zem.2:239-245,Cullen,2002,淑/m附腳/.3:597-599禾口Brantl,2002,B/oc/zem.Bz'—j^Zcf.1575:15-25?？梢詤⒖枷挛耐瓿蛇m合本發(fā)明使用的RNAi分子的合成。首先，掃描hCAP18/LL-37mRNA序列中AUG起始密碼子的下游得到AA二核苷酸序列。記錄出現(xiàn)的每一個AA和3'相鄰的19個核苷酸作為潛在的siRNA靶位點。因為非翻譯區(qū)(UTR)更富含調控蛋白質的結合位點，優(yōu)先從開放閱讀框中選擇siRNA靶位點。UTR結合蛋白質和/或翻譯起始復合體可能干擾siRNA核酸內切酶復合體的結合(Tuschl，C/2ew歷0c/zem.2:239-245)。然而可以理解，靶向非翻譯區(qū)的siRNA也可以起作用。第二，利用如BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)等序列比對軟件比較潛在的耙位點和適當?shù)幕蚪M數(shù)據(jù)庫(如人、小鼠、大鼠等)。選出與其它編碼序列具有顯著同源性的推定靶位點。選擇合格的靶序列作為siRNA合成的模板。優(yōu)選序列是那些包括低G/C含量的序列，因為己經(jīng)證明與那些具有大于55。/。的G/C含量的序列相比，這些低G/C含量的序列在介導基因沉默中更有效。優(yōu)選沿靶基因長度選擇多個靶位點進行評估。為了更好的評價所選擇的siRNA,優(yōu)選同時使用陰性對照。陰性對照siRNA優(yōu)選包括與所述siRNA相同的核苷酸組成但缺少與基因組的顯著同源性。因此，優(yōu)選使用所述siRNA的置亂核苷酸序列(scrambledmileotidesequence),前提是所述置亂核苷酸序列與任何其它基因都不具有顯著的同源性。優(yōu)選地，所述siRNA分子包含核苷酸序列SEQIDNO:1的片段或此片段的變體。ZfC4i^S/LL-37miWv4(登記號MV0似W5)1taaagcaaaccccagcccacaccctggcaggcagccagggatgggtggatcaggaaggct61cctggttgggcttttgcatcaggctcaggctgggcataaaggaggctcctgtgggctaga121gggaggcagacatggggaccatgaagacccaaagggatggccactccctggggcggtggt181cactggtgctcctgctgctgggcctggtgatgcctctggccatcattgcccaggtcctca241gctacaaggaagctgtgcttcgtgctatagatggcatcaaccagcggtcctcggatgcta301acctctaccgcctcctggacctggaccccaggcccacgatggatggggacccagacacgc361caaagcctgtgagcttcacagtgaaggagacagtgtgccccaggacgacacagcagtcac421cagaggattgtgacttcaagaaggacgggctggtgaagcg卿atggggacagtgaccc481tcaaccaggccaggggctcctttgacatcagttgtgataaggataacaagagatttgccc541tgctgggtgatttcttccggaaatctaaagagaagattggcaaagagtttaaaagaattg601tccagagaatcaaggattttttgcggaatcttgtacccaggacagagtcetagtgtgtgc661cctaccctggctcaggcttctgggctctgagaaataaactatgagagcaatttcaaaaaa721[SEQIDNO:1]所述siRNA分子也可包含轉錄自ENSG00000164047(基因組序列)的核苷酸序列的片段。所述"片段"表示至少10個核苷酸，例如至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸。所述"變體"表示與SEQIDNO:1的片段具有至少90%序列一致性或者與SEQIDNO:1的片段具有至少95%序列一致性，例如至少95°/。、96%、97%、98°/。或99%序列一致性的核苷酸序列?？梢岳煤线m的電腦程序(例如，WisconsinUniversityofGeneticComputingGroup的GAP程序)確定兩個多核苷酸間序列一致性的百分比，并且可以理解，一致性的百分比是由序列已經(jīng)進行最佳比對的多核苷酸計算的?；蛘?，可以利用ClustalW程序(如Thompson等，1994,A^i仏22:4673-4680中的闡述)進行比對。所使用的參數(shù)可以如下快速兩兩比對參數(shù)K-tuple(字)大小(K-tuple(word)size):1;窗口大小(windowsize):5;空位開放罰分(gapopenpenalty):3;頂部對角線的數(shù)量(numberoftopdiagonals):5。打分方法x百分數(shù)。多重比對參數(shù)空位開放罰分(gapopenpenalty):10，空位延伸罰分(gapextensionpenalty)，0.05。打分矩陣BLOSUM.或者，可以使用BESTFIT程序測定局部序列比對。siRNA分子的長度為19至23個核苷酸是有利的。在本發(fā)明的第一方面的可選擇優(yōu)選實施方案中，試劑為反義寡核苷酸。設計能夠用于有效降低hCAP18/LL-37水平/活性的反義分子需要考慮反義方法中關鍵的兩個方面。第一個方面是寡核苷酸向癌細胞細胞質中的遞送，第二個方面是寡核苷酸的設計，所述寡核苷酸在細胞中以抑制指定mRNA翻譯的方式與其特異結合?，F(xiàn)有技術公開了一些遞送方式，這些方式可以用于將寡核苷酸有效遞送至多種細胞類型中(例如，參見Luft，1998,/Mo/76:75-6;Kronenwett等，1998,祝ood91:852-62;Rajur等，1997,5z'oco">gC/zem8:935-40;Lavigne等，1997,所oc/2^w說o;/^sCommw"237:566-71;Aoki等，1997,丑/oc/ze附i&sCommww231:540-5)。此外，可以利用基于熱動力學循環(huán)鑒定與其靶mRNA具有最高預測結合親和性的序列的算法，其中所述熱動力學循環(huán)表明了靶mRNA和寡核苷酸結構改變的熱力學(例如，參見Walton等，1999,歷ofec/mo/說oe"g65:1-9)。己知還有一些利用體外系統(tǒng)設計和預測特定寡核苷酸功效的方法(如，參見Matveeva等，1998,淑,16:1374-1375)。一些臨床試驗已經(jīng)證明反義寡核苷酸的安全性、可行性和活性。例如，已經(jīng)成功地使用了適合癌癥治療的反義寡核苷酸(Holmlund等，1999,CWrQpz."Afo/TTzer1:372-85;Gerwitz,1999,0#rOp/wAfo/7%er1:297-306)。最近，報道了反義介導的人肝素酶基因表達的抑制可在小鼠模型中抑制人癌細胞的胸膜擴散(Uno等，2001,Ozm^及es61:7855-60)。因此，本領域的技術人員能夠容易地設計和實施適合于下調hCAP18/LL-37表達的反義方法。優(yōu)選地，反義寡核苷酸包含核苷酸SEQIDNO:l的片段或此片段的變/丄1平。反義寡核苷酸的長度為15至35個堿基是有利的。例如，現(xiàn)已證明20-mer寡核苷酸可抑制表皮生長因子受體mRNA的表達(Witters等，Owe"iM7>ew53:41-50(1999))，并證明25-mer寡核苷酸可將促腎上腺皮質激素的表達降低90%以上(Frankel等/iVewnswrg91:261-7(1999))。然而可以理解，也可以使用長度超出此范圍的寡核苷酸，例如IO、11、12、13或者14個堿基，或者36、37、38、39或40個堿基的寡核苷酸。本領域的技術人員還可以理解，寡核苷酸可以被細胞內源的核酸酶降解或失活。為了解決這個問題，可以使用修飾寡核苷酸v如改變核苷酸間連接的修飾核苷酸，在所述核苷酸中，天然磷酸二酯鍵連接已經(jīng)被其它連接所代替。例如，Agrawal等(1988)尸rac.A^f/.^cad5W.t/5L485，7079-7083證實使用寡核苷酸氨基磷酸酯和硫代磷酸酯可使HIV-1的組織培養(yǎng)中的抑制提高。Sarin等(1988)A^/.Arad85,7448-7451證明利用寡核苷酸甲基磷酸酯對HIV-1的抑制提高。Agrawa等(1989)Ato/.JcW.5W.C/W86,7790-7794證實可使用核苷酸序列特異性寡核苷酸硫代磷酸酯抑制早期感染和慢性感染的細胞培養(yǎng)物中的HIV-1復制。Leither等(1990)尸rac.A^/.5W.t/^X487，3430-3434報道了通過寡核苷酸硫代磷酸酯抑制組織培養(yǎng)中流感病毒的復制。具有人工連接的寡核苷酸已經(jīng)顯示對體內降解的抗性。例如，Shaw等(1991)在7Vwc/e/c」c/^i仏19，747-750中報道當通過某些加帽結構封閉未修飾的寡核苷酸的3'末端時，使其變得更能抵抗體內核酸酶，并且未加帽的寡核苷酸硫代磷酸酯在體內不被降解。在Agrawal和Tang(1990)T^ra/zedra"31，7541-7544中提供了關于合成寡核苷硫代磷酸酯的H-硫酸酯方法的詳細闡述，其公開通過引用并入本文。寡核苷甲基磷酸酯、二硫代磷酸酯、氮基磷酸酯、磷酸酯、橋聯(lián)氨基12磷酸酯、橋聯(lián)硫代磷酸酯的合成是本領域已知的技術。參見例如Agrawal和Goodchild(1987)7kra/zedra"28,3539;Nielsen等(1988)Tfefra/z^ra"29,2911;Jager等(1988)歷oc/2e/m's^27,7237;Uznanski等(1987)Te加/^謂28,3401;Bannwarth(1988)i/e/v.C/zz'm.勿a.71,1517;Crosstick和Vyle(1989)Tfe/ra/zedra"丄e"^s30,4693;Agrawal等(1990)戶rac.Ato/.jc^/.5W.1401-1405，其公開通過引用并入本文。也可能使用其它的合成或生產(chǎn)方法。雖然也可以合成并使用核糖核酸(RNA)序列，但在優(yōu)選實施方案中所述寡核苷酸為脫氧核糖核酸(DNA)。優(yōu)選本發(fā)明中使用的寡核苷酸經(jīng)過設計使其能夠抵抗內源性核酸水解酶的降解。寡核苷酸的體內降解產(chǎn)生長度減小的寡核苷酸斷裂產(chǎn)物。與其全長的對應物相比，這種斷裂產(chǎn)物更有可能參與非特異雜交且更不可能有效。因此，期望使用抵抗體內降解并能夠到達靶細胞的寡核苷酸?？梢酝ㄟ^用一個或多個分子內人工核苷酸間的連接取代天然的磷酸二酯連接(例如，通過將連接的磷酸酯替換成硫)從而使本發(fā)明的寡核苷酸更能夠抵抗體內降解?？梢允褂玫倪B接的實例包括硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、砜、硫酸酯、羰自由基、二硫代磷酸酯、多種氨基磷酸酯、磷酸酯、橋聯(lián)硫代磷酸酯和橋聯(lián)氨基磷酸酯。因為其它核苷酸間連接是本領域熟知的，所以這些實例是說明性的而非限制性的。合成具有一個或多個用于取代核苷酸間磷酸二酯連接的所述連接的寡核苷酸是本領域熟知的技術，包括用于產(chǎn)生具有混合的核苷酸間連接的寡核苷酸的合成途徑?？梢酝ㄟ^在5，或3，末端核苷酸上"加帽"或引入類似基團使寡核苷酸抵抗內源酶的延伸。加帽試劑可商購自如AppliedBioSystemsInc,FosterCity，CA的Amino-LinkII。加帽方法闡述于如Shaw等(1991)A^c/e/cJc/Ai饑19,747-750和Agrawal等(1991)A/fl漢爿cad88(17),7595-7599。使寡核苷酸抵抗核酸酶攻擊的另一個方法是其"自穩(wěn)定"，如Tang等(1993)Wwc/.Ar/A及"21，2729-2735的闡述。自穩(wěn)定的寡核苷酸在其3'末端具有發(fā)夾環(huán)結構，并且顯示提高的對蛇毒磷酸二酯酶、DNA聚合酶I和胎牛血清降解的抗性。寡核苷酸的自穩(wěn)定區(qū)域不干擾與互補核酸的雜交，并且小鼠的藥代動力學和穩(wěn)定性研究表明與其線性對應物相比，自穩(wěn)定的寡核苷酸在體內的持久性增強。例如，本發(fā)明的siRNA分子和/或反義寡核苷酸可以包含選自于下表中的序列或由選自于下表中的序列組成(所述序列也描述于隨后的實施例中):<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>在本發(fā)明試劑的另一個優(yōu)選實施方案中，所述試劑是對hCAP18/LL-37具有結合親和力的化合物，例如蛋白質和碳水化合物。"具有結合親和力的化合物"表示在體內，即在hCAP18/LL-37存在于癌細胞內的生理條件下，能夠與hCAP18/LL-37結合的化合物。例如，所述化合物可以與hCAP18/LL-37的活性位點基本可逆或基本不可逆地結合。在另一個實施例中，所述化合物可以與hCAP18/LL-37的一部分(其是非活性位點)結合從而干擾hCAP18/LL-37與配體或受體的結合。在另一個實施例中，所述化合物可以與hCAP18/LL-37的一部分結合從而通過變構效應降低所述蛋白質的活性。這種變構效應可能是參與hCAP18/LL-37活性的自然調控的變構效應，如通過"上游活化劑"對hCAP18/LL-37激活。檢測測試化合物和hCAP18/LL-37間相互作用的方法是本領域熟知的。例如，可以使用帶有離子噴霧質譜/HPLC的超濾方法或其它物理或分析方法。此外，可以使用熒光能量共振轉移(FRET)方法，其中當兩個熒光標記部分彼此緊密靠近時，可以通過測定熒光標記的相互作用測定所述熒光標記部分的結合。檢測多肽與大分子(例如DNA、RNA、蛋白質和磷脂)結合的可選擇方法包括表面等離子共振試驗，如在Plant等，1995,^"a/^歷oc/^m226(2),342-348中闡述的。所述方法可以使用標記有如具有放射標記或熒光標記的多肽。另一個鑒定能夠結合多肽的化合物的方法是將多肽與化合物接觸并檢測和/或測定化合物與所述多肽的任何結合。可以測定化合物與多肽結合的結合常數(shù)。本領域技術人員熟知并可以實施適用于檢測和/或測定(定量)化合物與多肽結合的方法，例如利用能夠高通量操作的方法，如基于芯片的方法。稱為VLSIPSTM的新技術已經(jīng)實現(xiàn)含數(shù)十萬個或更多不同分子探針的極小芯片的生產(chǎn)。這些生物芯片或陣列具有排列在陣列中的探針，每一個探針具有指定的一個特定位點。現(xiàn)己生產(chǎn)出每個位點是例如10微米的尺度的生物芯片。所述芯片可以用于測定靶分子是否與芯片上的任一探針相互作用。在所選擇的試驗條件下將陣列與耙分子接觸后，掃描設備可以檢測陣列中的每一個位點，并測定靶分子是否與在所述位點上的探針相互作用。另一種鑒定對hCAP18/LL-37具有結合親和力的化合物的方法是酵母雙雜交系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中可以使用本發(fā)明的多肽"捕獲"結合hCAP18/LL-37的蛋白質。在Fields&Song，A^w^340:245-246(1989)闡述了所述酵母雙雜交系統(tǒng)。在本發(fā)明的此方面的一個優(yōu)選實施方案中，試劑為對hCAP18/LL-37具有配體結合能力的化合物。例如，所述試劑可以是hCAP18/LL-37受體(如FPRL1)的可溶片段?；蛘?，所述試劑可以是模仿抗體的高親和力分子(所謂"親和體"(affibody))(例如參見，US5，831，012和www.affibody.se)。這些配體是由基于蛋白A(金黃色葡萄球菌的表面蛋白質)中一個IgG結合域的支架結構的三螺旋束組成的小而簡單的蛋白質。這種支架結構具有作為親和配體的優(yōu)秀特征，并且可以進行設計使其以高親和力與任一給定靶蛋白結合。有利地，對hCAP18/LL-37具有高結合親和力的化合物是多肽或包含多肽。例如，所述化合物可以為抗體，如單克隆抗體或多克隆抗體或其抗原結合片段。所述"抗體"包含基本完整的抗體分子，以及嵌合抗體、人源化抗體、人抗體(其中相對于天然產(chǎn)生的人抗體至少一個氨基酸被突變)、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈和/或輕鏈的同源二聚體或異源二聚體和其抗原結合部分和其衍生物。所述"抗原結合片段"表示抗體中能夠結合hCAP18/LL-37的功能性片段。優(yōu)選地，抗原結合片段選自以下構成組Fv片段(例如，單鏈Fv和通過有二硫鍵結合的Fv)、Fab樣片段(例如，F(xiàn)ab片段、Fab'片段和F(ab)2片段)、單個可變區(qū)(例如，Vh和Vl域)和域抗體(dAbs，包括單域形式和雙域形式(即dAb-連接子-dAb))。使用抗體片段而不是整個抗體可產(chǎn)生數(shù)倍的優(yōu)勢。較小體積的片段可以引起藥學特性的提高，例如，對固體組織更好的滲透性。此外，抗原結合片段(例如Fab、Fv、ScFv和dAb抗體片段)可以在大腸桿菌中表達并分泌，這樣可以容易地生產(chǎn)大量的所述片段?？贵w與其抗原結合片段的修飾形式(例如，通過聚乙二醇或其它合適聚合物進行的共價結合修飾)也包括在本發(fā)明范圍內。產(chǎn)生抗體和抗體片段的方法是本領域熟知的。例如，可以通過多個方法中的任一個產(chǎn)生抗體，在所述方法中利用了體內誘導產(chǎn)生抗體分子、篩選免疫球蛋白庫(Orlandi.等，1989.7V^/.」c"d5W.86:3833-3837;Winter爭，1991,Atowe349:293-299)或通過培養(yǎng)細胞系產(chǎn)生單克隆抗體。這些方法包括但不限于雜交瘤技術、人B細胞雜交瘤技術和Epstein-Barr病毒(EBV)-雜交瘤技術(Kohler等，1975.Atowe256:4950497;Kozbor等，1985.J/國,/.MefWs81:31-42;Cote等，1983.iVoc.胸/.加dScf.固80:2026-2030;Cole等，1984.Mo/.Ce〃.編.62:109-120)?？梢酝ㄟ^已知技術制備抗所選抗原的合適單克隆抗體，例如那些公開在"Mowoc/owa/v4油'ZjWwJma"wa/o/fec/zw/《was",HZola(CRCPress,1988)禾口"Mowoc/owa//^nWomaJw"Zo血s..7fec/2m々was朋d^p//z'c加'ows",JGRHurrell(CRCPress,1982)中的技術?？梢岳帽绢I域熟知的方法獲取抗體片段(參見，例如Harlow&Lane,1988，"Jwri6oc/z'es:爿丄a6on3to;^ColdSpringHarborLaboratory,NewYork)。例如，可以通過抗體的蛋白水解或通過在大腸桿菌或哺乳動物細胞(例如，中國倉鼠卵巢細胞培養(yǎng)或其它蛋白質表達系統(tǒng))中表達編碼本發(fā)明的片段的DNA來制備本發(fā)明的所述抗體片段。或者，可以通過常規(guī)方法由胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完全抗體獲取抗體片段。本領域的技術人員可以理解為了用于人類的治療和診斷，優(yōu)選使用人源化的抗體。非人(如小鼠)抗體的人源化形式是基因工程加工的嵌合抗體或優(yōu)選具有衍生自非人抗體的最小部分的抗體片段。人源化抗體包括這樣的抗體，在所述抗體中人抗體(recipientantibody,受者抗體)互補決定區(qū)被替換成來自于具有期望功能的非人種屬(donorantibody,供者抗體)如小鼠、大鼠或兔的互補決定區(qū)的殘基。在一些實例中，人抗體的Fv骨架殘基被相應的非人殘基取代。人源化抗體還可以包含這樣的殘基，所述殘基既沒有在受者抗體中發(fā)現(xiàn)也沒有在引入的互補決定區(qū)或骨架序列中發(fā)現(xiàn)。通常，人源化抗體包含基本上所有的至少一個并且通常為兩個的可變域，在所述可變域中所有或基本上所有互補決定區(qū)均對應于相應的非人類抗體的互補決定區(qū)，并且所有或基本上所有骨架區(qū)均相對于相應的人共有序列的骨架區(qū)。人源化抗體最好還包含通常衍生自人抗體的抗體恒定區(qū)的至少一部分，例如Fc區(qū)(參見，例如Jones等，1986.A^ww321:522-525;Riechma皿等，1988,Atowe332:323-329;Presta，1992，Cw/r.Op.S/rw",歷o/.2:593-596)。用于非人抗體人源化的方法是本領域熟知的。通常，人源化的抗體具有一個或多個從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基(通常稱為引入殘基)通常從所引入的可變域獲取。基本上可以根據(jù)文獻所述(參見，如，Jones等，1986,淑,321:522-525;Reichnmnn等，1988.淑置332:323-327;Verhoeyen等，1988,239:1534-15361;US4,816,567)，通過用相應的嚙齒動物互補決定區(qū)取代人的互補決定區(qū)進行人源化。因此，這種人源化抗體是嵌合抗體，其中基本上小于完整的人可變域的部分被來自非人類物種的相應序列取代。在實踐中，人源化抗體可以通常是人抗體，在所述抗體中一些互補決定區(qū)殘基以及可能的一些骨架殘基被來自嚙齒動物抗體中的類似位點取代。還可以利用本領域已知的多種技術鑒定人抗體，包括噬菌體展示庫(參見，例如Hoogenboom&Winter,1991,Mo/.所o/.227:381;Marks等，1991，/jWb/.5/o/.222:581;Cole等,1985,In:Afowoc/owa/awriZ)oc^&sa"<iCa"cerT7zera/y，AlanR.Liss,pp.77;Boerner等,1991.//m附""o/.147:86-95)。一旦獲得合適的抗體，就可以通過例如ELISA等檢測其活性。在本發(fā)明的第一方面的特別優(yōu)選的實施方案中，所述試劑能夠選擇性地遞送至癌細胞或選擇性地由癌細胞激活。所述"選擇性地"表示所述試劑對hCAP18/LL-37生物活性的抑制作用17優(yōu)先發(fā)揮在癌細胞上或癌細胞內(而不是所述試劑局部施予癌細胞位點)。使試劑靶向于特定細胞類型(例如，癌細胞)的方法是本領域熟知的(例如，參見Vasir&Labhasetwar，2005，rec/wo/C薩wh7>^.4(4):363-74;Brannon-Peppas&Blanchette,2004,i>wgZ)e//v及ev.56(11):1649-59andZhao&Lee,2004，柚DragDe/fviev.56(8):1193-204)。例如，所述試劑可以包含靶細胞特異性部分。所述"靶細胞特異性"部分表示所述試劑中包含一個或多個結合位點的部分，所述結合位點識別并結合靶癌細胞上的實體。一旦與靶細胞接觸，所述靶細胞特異性部分就可以與抑制劑部分一起被內化。'由靶細胞特異性部分識別的實體主要且優(yōu)選專有地在靶癌細胞上表達。靶細胞特異性部分可以包含一個或多個用于同一靶細胞類型上表達的不同實體的結合位點，或者一個或多個用于一種或多種不同靶細胞類型上表達的不同實體的結合位點。優(yōu)選地，靶細胞特異性部分以高親和力識別靶細胞。所述"高親和力"表示靶細胞特異性部分識別靶細胞的結合常數(shù)至少為Kd=10_6M，優(yōu)選至少為Kd-10力M，合適地為Kd-1(T1QM，更合適地為Kd-1(T"M，再合適地為Kd=1(T12M，并且更優(yōu)選Kd=1(T15M乃至Kd=1(T18M。所述被識別的實體可以是在腫瘤細胞上表達的任意合適實體。通常，所述被識別的實體為抗原?？乖膶嵗ū?中列出的抗原。表l腫瘤相關抗原<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>多形上皮細胞粘蛋白(人乳脂肪小球)HMFG1(Taylor-Papadimitriou，ICRF)(Antisomaplc)卵巢癌、胸腔積液、乳腺癌、肺癌和其它常見上皮腫瘤的成像和治療。人乳粘蛋白核心蛋白SM國3(IgGl)1乳腺癌的成像和治療p-人絨毛促性腺激素W14使酶(CPG2)靶向裸鼠中的人異種移植物絨毛癌。(Searie等(1981)Br,J.Cancer44,137-144)人癌瘤上的碳水化合物L6(IgG2a)2堿性磷酸酶的耙向。(Senter等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85,4842-4846B淋巴細胞(正常和癌變B淋巴細胞)上的CD20抗原1F5(IgG2a)3堿性磷酸酶的靶向。(Senter等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85，4842-4846Burchell等(1987)Ca"ceri饑47，5476-5482Hellstr6m等(1986)Ca"cwi饑46,3917-3923Clarke等(1985)/Voc.Ato/.JcW.5W.82，1766-1770其它抗原包括甲胎蛋白、Ca-125、前列腺特異性抗原和表皮生長因子受體家族的成員，艮卩EGFR、erbB3、erbB2禾nerbB4。有利地，所述靶細胞特異性部分是抗體(例如，單克隆抗體)或其抗原結合部分。優(yōu)選地，所述抗體為人源化抗體。便利地，所述靶細胞特異性部分包含針對耙細胞的兩個或多個結合位點，其中所述靶細胞特異性部分為抗體或其二價片段。所述靶細胞特異性部分可以分別具有相互識別同一實體或識別不同實體的"臂"。在本發(fā)明試劑的一個實施方案中，靶細胞特異性部分具有識別相同靶細胞上的不同分子的兩個"臂"，其中所述相同靶細胞上的不同分子并不局限于所述細胞類型，其還可以存在于其它一些細胞類型上。例如，靶細胞特異性部分的一個"臂"可以識別細胞類型i、n和m上的分子，而另一個"臂"可以識別細胞類型i、iv和v上的分子。因此，與細胞類型n、m和iv相19比，包含這種靶細胞特異性部分的本發(fā)明試劑對細胞類型I具有更大的特異性。本發(fā)明的這個方面尤其有用，原因是發(fā)現(xiàn)的完全靶細胞特異性分子極少，而存在于一些細胞類型上并在本發(fā)明的這個方面有用的分子是熟知的。這種分子通常為細胞表面抗原，針對所述細胞表面抗原的交叉反應抗體是已知的。已經(jīng)知道與表1中所列的多個抗原結合的單克隆抗體，在任何情況下，都可以利用與單克隆抗體技術有關的現(xiàn)有技術制備抗大多數(shù)抗原的抗體(參見上文)。被識別的實體可以是也可以不是抗原性的，但可以通過一些其它方式被識別并被選擇性地結合。例如，它可以是特征性細胞表面受體如在黑素瘤細胞中大量表達的促黑素細胞激素(MSH)受體?；蛘撸鰧嶓w可以是引入至靶細胞的實體。那么所述細胞特異性部分可以是以一種非免疫方式與所述實體結合的化合物或其一部分，例如，作為細胞表面酶的底物或其類似物或者作為信使與所述實體結合。優(yōu)選地，高親和力耙細胞特異性部分包含針對靶細胞的兩個或多個不同結合位點。針對耙細胞的不同結合位點可以是也可以不是靶向所述耙細胞上表達的不同實體的兩個或多個不同抗體或其片段?？蛇x地，針對靶細胞的所述不同結合位點可以以其它一些非免疫方式識別并選擇性地結合所述細胞?？梢岳斫?，靶向部分可以通過保留兩個部分的功能活性的任何合適方式連接到本發(fā)明的抑制劑試劑上。例如，當靶向部分和抑制劑部分都為多肽時，它們可以彼此融合產(chǎn)生融合多肽。這種融合的實例是本領域技術人員熟知的。在本發(fā)明的選擇性抑制試劑的其它實施方案中，所述試劑是由癌細胞選擇性激活的前藥。本申請中使用的術語"前藥"指藥學活性物質的前體或衍生形式，與母藥相比，其對腫瘤細胞的毒性較小并能夠被酶活化或轉化成活性更高的母體形式(參見，例如D.E.V.Wilman"ProdrugsinCancerChemotherapy"腸c/ze/m'ca/5bc/砂rram^Wom114，375-382(615thMeeting,Belfast1986)禾口V.J.Stella等"Prodrugs:AChemicalApproachtoTargetedDrugDelivery"DzVecWZ>wgZ)e/iv"R.Borchardt等(ed.)第247-267頁(HumanaPress1985))。用于產(chǎn)生這種前藥試劑的合適方法是本領域熟知的(例如，參見Denny,2004,O臟"騰W.22(4):604-19;Rooseboom禁2004,尸/z謹腳/L200456(1):53-102;WO03/106491)。在選擇用于前藥活化的酶時需要考慮一些因素。這些因素包括所述酶的分子量和物理特性，其在生理條件下的活性和穩(wěn)定性，以及由所述酶所產(chǎn)生的藥物的性質。所述策略適應多種酶的應用，從而具有釋放大量機制不同的抗腫瘤劑的潛能。尤其有價值的事實是單個Mab-酶偶聯(lián)物可以產(chǎn)生治療有效量的機制不同但具有增效作用的抗腫瘤劑。由于免疫原性的原因，這應該很重要。在這些方面，很多(3-內酰胺酶因為其有利的動力學和寬泛的底物特異性以及其消除頭孢霉素底物3，-位置附加取代物的能力，具有很大潛能(參見Svensson等(1992)"Mab-|3-lactamaseconjugatesfortheactivationofacephalosporinmustardprodrug"所oco"jf'wgateCTzew.3,176-181)。已經(jīng)將源于哺乳動物和非哺乳動物的酶用于多種前藥的活化(Senter等,1993.Generationofcytotoxicagentsbytargetedenzymes.Bioconjugate4，3-9;Senter等,1991.Activationofprodrugsbyantibody-enzymeconjugates,inImmunobiologyofProteinsandPeptidesVI，ed.M.Z.Atassi.PlenumPress,NewYork,pp97-105)。源于哺乳動物的酶的優(yōu)勢在于其減少的免疫原性，而它們作用的前藥可能是相應內源酶的底物。本領域的技術人員可以理解，本發(fā)明的試劑可以用于抑制不同類型癌細胞的轉移。然而，在一個優(yōu)選實施方案中，所述癌細胞為上皮細胞或鱗狀細胞。有利地，癌細胞選自由以下癌細胞組成的組乳腺癌細胞、膽管癌細胞、腦癌細胞、結腸癌細胞、胃癌細胞、生殖器官癌細胞、肺和氣管癌細胞、皮膚癌細胞、膽囊癌細胞、肝癌細胞、鼻咽癌細胞、神經(jīng)細胞癌細胞、腎癌細胞、前列腺癌細胞、淋巴腺癌細胞和胃腸道癌細胞。優(yōu)選地，所述癌細胞為乳腺癌細胞。更優(yōu)選地，所述乳腺癌細胞為ElstonIII級細胞。最優(yōu)選地，所述乳腺癌細胞為轉移性的癌細胞。本發(fā)明的第二方面提供了一種藥物組合物，該藥物組合物包含本發(fā)明第一方面的試劑和藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。因此，本發(fā)明還提供了抑制癌細胞轉移的藥物。本文所使用的"藥物制劑"表示本發(fā)明的治療有效制劑。本文中所使用的"治療有效量"或"有效量"或"對治療有效"指對給定病情和施藥方案產(chǎn)生治療效果的量。這是經(jīng)過計算以使所述活性物質和所需的添加劑和稀釋劑(即載體或施藥載體或溶劑)聯(lián)合產(chǎn)生期望的治療效果的預定量。進一步，還表示足以降低(優(yōu)選為預防)宿主在機能、功能和響應方面的臨床性顯著不足的量?；蛘?，治療有效量足以引起宿主臨床顯著病情的改善。本領域的技術人員可以理解，可以根據(jù)其具體功能改變化合物的量。合適的劑量數(shù)可以包含預定量的活性成分，所述預定量經(jīng)過計算以使所述活性成分和所需的稀釋劑聯(lián)合產(chǎn)生期望的治療效果。在本發(fā)明組合物的生產(chǎn)方法和使用中，提供了治療有效量的活性成分。可以根據(jù)本領域熟知的患者特征，例如年齡、體重、性別、病情、并發(fā)癥和其它疾病等由普通醫(yī)生或獸醫(yī)確定治療有效量。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明試劑和藥學上可接受的載體的藥物制劑，其中所述本發(fā)明試劑的量足以抑制癌細胞中hCAP18/LL-37的活性。本領域的技術人員可以理解，可以以單次大劑量(即急性施藥)或更優(yōu)選以一段時間內的系列劑量(即慢性施藥)遞送這種有效量的所述試劑或其制劑。可以根據(jù)所使用化合物的功效/毒性以及其用于治療的適應癥，以多種濃度配制本發(fā)明的試劑。優(yōu)選地，所述制劑包含濃度在0.1pM和lmM之間的本發(fā)明的試劑，更優(yōu)選1^M和100pM之間、5liM和50pM之間、10pM和50pM之間、20pM和40nM之間，最優(yōu)選約30^M。對于體外施用，所述制劑可以包含更低濃度的本發(fā)明化合物，例如濃度在0.0025nM和lpM之間。本領域的技術人員可以理解，本發(fā)明的試劑通常與合適的藥物賦形劑、稀釋劑或載體混合進行施予，所述藥物賦形劑、稀釋劑或載體根據(jù)所需施藥途徑和標準藥物實踐(如，參見Wem/"gto":7TzeScfewceawJ尸racft'ceo/尸/2a，acy，19thedition,1995,Ed.AlfonsoGe皿aro,MackPublishingCompany,Pennsylvania,USA)進行選擇。例如，本發(fā)明的試劑可以以片劑、膠囊、ovules、酏劑、溶液或懸液的22形式口部經(jīng)口、口腔或舌下服用，所述膠囊、ovules、酏劑、溶液或懸液可以含芳香劑或著色劑，用于即釋、緩釋或控釋。本發(fā)明的試劑還可以通過陰莖海綿體內注射給藥。片劑可以包含賦形劑，例如微晶纖維素、乳糖、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸氫鈣和甘氨酸，崩解劑，例如淀粉(優(yōu)選玉米、馬鈴薯、或木薯淀粉)、淀粉乙醇酸鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉和某些復雜的硅酸鹽，以及制粒粘合劑，例如聚乙烯吡咯垸酮、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥丙基纖維素(HPC)、蔗糖、明膠和阿拉伯膠。此外，可以包含潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸、山崳酸甘油酯和滑石。類似類型的固體組合物還可以用作明膠膠囊的填充物。本發(fā)明中優(yōu)選的賦形劑包括乳糖、淀粉、纖維素、乳糖或高分子量的聚乙二醇。對于水懸液和/或酏劑，本發(fā)明的化合物可以與多種甜味劑或芳香劑、著色物質或染料，與乳化劑和/或助懸劑，與稀釋劑如水、乙醇、聚乙二醇和甘油，及其組合進行組合。本發(fā)明的試劑還可以腸胃外施予，如經(jīng)靜脈、關節(jié)內、動脈內、腹腔內、鞘內、心室內、胸腔、顱腔、肌內或皮下施予，或者可以通過輸注技術施予。最好以無菌水溶液的形式使用，所述無菌水溶液可以包含其它物質，如足以使所述溶液與血液等滲的鹽或葡萄糖。如果需要，所述水溶液應被適當?shù)鼐彌_(優(yōu)選從3至9的pH)。通過本領域技術人員熟知的標準制藥技術很容易在無菌條件下實現(xiàn)合適胃腸外制劑的制備。適合腸胃外施藥的制劑包括水或非水無菌注射溶液，所述溶液可以包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使制劑與期望接受者的血液等滲的溶質；以及水和非水的無菌懸液，所述懸液可以包含助懸劑和增稠劑。所述制劑可以存在于單位劑量或多劑量容器中，例如密封的針劑或小瓶，并且可以儲存在冷凍干燥(凍干)條件下，僅需要在臨使用前加入無菌液態(tài)載體，例如注射水?？梢愿鶕?jù)上述種類的無菌粉末、顆粒和片劑制備即用的注射溶液和懸液。為了給人類患者口服和腸胃外施藥，本發(fā)明的試劑的日劑量水平通常為每個成人l至1000mg(即約0.015至15mg/kg)，單次或分次劑量給藥。本發(fā)明的試劑還可以經(jīng)鼻腔或通過吸入給藥，并且以來自高壓容器、泵、噴霧器或霧化器的干粉吸入劑或氣溶膠噴霧的形式方便地遞送，所述干粉吸入劑或氣溶膠噴霧使用合適的推進劑，例如二氯二氟甲垸，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，氫氟烷烴(例如l,l,l,2-四氟乙烷(HFA134A3)或1，1,1,2,3,3,3-七氟丙垸(HFA227EA3))，二氧化碳或其它合適的氣體。在高壓氣溶膠的情況下，可以通過提供可計量閥門確定遞送的劑量單位。高壓容器、泵、噴霧器或霧化器可包含所述活性化合物的溶液或懸液，例如使用乙醇和推進劑的混合物用作溶劑的溶液或懸液，還可以包含潤滑劑，例如失水山梨醇三油酸酯。在吸氣器或吸藥器中使用的膠囊(capsule)和筒(cartridge)(如由明膠制備)可經(jīng)配制以包含本發(fā)明化合物與合適粉末基質(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。優(yōu)選安排氣溶膠或干粉制劑以使每個計量劑量或每次"噴施"都包含至少lmg遞送給患者的本發(fā)明化合物。可以理解，氣溶膠每天的全部劑量根據(jù)患者的不同而不同，并且可以在全天內以單次劑量或更常見的多次劑量施藥。本發(fā)明的試劑還可以以栓劑或陰道栓的形式施予，或者以洗劑、溶液、乳霜、藥膏或散粉的形式局部施用。本發(fā)明的化合物還可以透皮施予，如通過使用皮膚貼片。本發(fā)明的化合物還可以通過經(jīng)眼途徑給藥。針對眼科使用，本發(fā)明的試劑可以配制成等滲、調節(jié)了pH的無菌生理鹽水的微粉化懸液，或者優(yōu)選地，配制成等滲、調節(jié)了pH的無菌生理鹽水的溶液，任選與防腐劑如苯扎氯銨聯(lián)合?？蛇x地，將其配制在如凡士林等藥膏中。針對皮膚的局部應用，可以將本發(fā)明的試劑配制成含活性化合物的合適藥膏，所述活性化合物懸浮或溶解在例如具有以下一種或多種物質的混合物中礦物油、液態(tài)凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蠟和水。本發(fā)明的試劑還可被配制成合適的洗劑或乳膏，活性成分懸浮或溶解在例如以下一種或多種物質的混合物中礦物油、失水山梨醇單硬脂酸酯、聚乙二醇、液態(tài)石蠟、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蠟、棕櫚醇、2-辛基十二碳醇、苯甲醇和水。適合在口腔局部施藥的制劑包括在芳香基質(通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠)中包含所述活性成分的糖啶劑；在惰性基質(例如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠)中包含所述活性成分的啶劑；以及在合適液態(tài)載體中包含所述活性成分的漱口劑。當所述試劑為多肽時，可以優(yōu)選使用緩釋給藥系統(tǒng)，如微球。這些系統(tǒng)經(jīng)特別設計以減少注射的頻率。這種系統(tǒng)的一個實例是NutropinDepot,其將重組人生長激素(rhGH)包裹到可生物降解的微球中，這樣一旦注射就在持續(xù)的時間內緩慢釋放rhGH。還可以通過將所述藥物直接釋放到期望位點的手術植入設備施予本發(fā)明的多肽試劑。還可以將電穿孔治療(EPT)系統(tǒng)應用于蛋白質或多肽的施藥。向細胞施加脈沖電場的設備提高了細胞膜對藥物的滲透性，從而導致細胞內藥物遞送的顯著增強。蛋白質和多肽也可以通過電結合(EI)遞送。當皮膚表面上直徑達30微米的小顆粒受到電穿孔中使用的相同或相似的電脈沖時，發(fā)生EI。在EI中，這些顆粒被驅動通過角質層并進入皮膚的更深層。所述顆粒可以負載或包被有藥物或基因，或者可以簡單地作為"子彈"在皮膚中產(chǎn)生所述藥物能夠進入的小孔。蛋白質和多肽遞送的一個可選方法是熱敏性可注射ReGel。低于體溫時，ReGel是可注射的液態(tài)，然而在體溫時它立即形成凝膠儲藏器，緩慢地消耗并溶解成已知的安全、可生物分解的聚合物。在生物聚合物溶解的時間過程中遞送所述活性藥物。蛋白質和多肽藥物還可以口服遞送。一種此類系統(tǒng)將體內口服吸收維生素B12的天然過程應用于共遞送蛋白質和多肽。所述蛋白質或多肽可以依靠維生素B12的吸收系統(tǒng)通過腸壁。由維生素B12類似物和所述藥物制備的所述復合體在其維生素B12部分中保留了對內在因子(IF)的顯著親和力并且保留了所述復合體藥物部分的顯著生物活性。施予本發(fā)明的寡核苷酸或多核苷酸試劑的方法也是本領域熟知的(參見，Dass,2002,JPharmPharmacol.54(1):3-27;Dass,2001，DrugDeliv.8(4):191-213;Lebedeva等，2000，EurJPh謹Bioph證.50(1):101-19;Pierce等,2005，MiniRevMedChem.5(1):41-55;Lysik&Wu-Pong,2003,JPh謹Sci.20032(8):1559-73;Dass,2004,BiotechnolApplBiochem.40(Pt2):113-22;Medina,2004，CurrPh腿Des.10(24):2981-9)。例如，通過利用逆轉錄病毒的方法可以將本發(fā)明的構建體引入到細胞中，從而使所述構建體插入到細胞的基因組中。例如，在Kuriyama等(1991)CellStruc.andFunc.16，503-510中施予純化的逆轉錄病毒?？梢岳帽绢I域熟知的方法制備包含上述多核苷酸的逆轉錄病毒DNA構建體。通常使用生長在含10%胎牛血清(FCS)的Dulbecco'smodifiedEagle's培養(yǎng)基(DMEM)中的親嗜性psi2包裝細胞系從此類構建體產(chǎn)生活性逆轉錄病毒?？赏ㄟ^硫酸鈣共轉染方便地轉染所述細胞系，并且通過加入終濃度為lmg/ml的G418選擇穩(wěn)定的轉染株(假定逆轉錄病毒構建體含^^基因)。分離并放大單獨的克隆，移出培養(yǎng)上清、濾過0.45,孔徑的濾器并在-7(TC儲存。通過直接注射添加有10嗎/ml聚凝胺(polybrene)的逆轉錄病毒上清簡便地將逆轉錄病毒引入到腫瘤細胞中。對于直徑超過IOmm的腫瘤，適合注射O.lml的逆轉錄病毒上清，優(yōu)選0.5ml。也可以如Culver等(1992)5We"ce256,1550-1552中所述，注射產(chǎn)生逆轉錄病毒的細胞。對產(chǎn)生逆轉錄病毒的細胞進行改造以使其主動產(chǎn)生逆轉錄病毒載體顆粒，從而在原位腫瘤塊內持續(xù)產(chǎn)生所述載體。因此，如果與產(chǎn)生逆轉錄病毒載體的細胞混合，增殖細胞就可以成功地在體內被轉導。靶向性逆轉錄病毒也可用于本發(fā)明，例如可將賦予特異性結合親和力的序列插入到預先存在的病毒e"v基因中(參見，Miller&Vile(1995)9，190-199forareviewofthisandothertargetedvectorsforgenetherapy)。其它方法包括只將構建物遞送到細胞中以在有限的時間內表達，或隨后整合到基因組以在更長的時間內表達。后一種方法的實例包括脂質體(N汪ssander等(1992)Cfl"cw及饑52,646-653)。為了制備免疫脂質體，根據(jù)Martin&Papahadjopoulos(1982)/257,286-288的方法合成MPB-PE(N-4-(對-馬來酰亞胺苯基)丁酰磷脂酰乙醇胺)。將MPB-PE引入脂質體雙分子層中以使抗體或其片段共價偶聯(lián)到脂質體表面。例如，通過在所述試劑溶液中形成脂質體，隨后在達0.8Mpa的氮氣壓力下將其連續(xù)擠出通過帶有0.6pm和0.2nm孔徑的聚碳酸酯膜濾器，從而將本發(fā)明的試劑(如DNA或其它基因構建體)方便地負載到用于向靶細胞遞送的所述脂質體上。在擠出后，于80000Xg超離心45min從而將捕獲的DNA構建體和游離的DNA構建體分離。新制備的MPB-PE-脂質體與新制備的抗體(或其片段)在脫氧緩沖液中混合，并在4°C、氮氣氛中進行偶聯(lián)反應，持續(xù)旋轉過夜。通過80000Xg超速離心45min將免疫脂質26體與未偶聯(lián)的抗體分離。免疫脂質體可以注射到腹腔內或直接注射到腫瘤中。其它遞送方法包括通過抗體-聚賴氨酸橋攜帶外源DNA的腺病毒(參見CuridKra/.40，1-18)和作為載體的運鐵蛋白-聚陽離子偶聯(lián)物(Wagner等(1990)尸rac.7VW/.^c^/.5W.87，3410-3414)。在這些方法中，首先，使用本發(fā)明的寡核苷酸試劑形成聚陽離子-抗體復合體，其中所述抗體是野生型腺病毒或腺病毒變體特異性的，在所述腺病毒變體中引入了結合所述抗體的新表位。聚陽離子部分通過與磷脂骨架的靜電相互作用結合寡核苷酸試劑。因為含未改變的纖突(fibre)和腺病毒亞單位蛋白，腺病毒被內化到細胞中并隨之將本發(fā)明的寡核苷酸試劑運送到細胞中。優(yōu)選聚陽離子為聚賴氨酸。所述寡核苷酸試劑還可以通過腺病毒遞送，其中所述試劑存在于腺病毒顆粒內部，例如，如下文中所述。在一個可選方法中，應用了由受體介導的細胞內吞作用將DNA大分子遞送到細胞中的高效核酸遞送系統(tǒng)。通過將運送鐵的蛋白質運鐵蛋白與結合核酸的聚陽離子共軛結合得到這種系統(tǒng)。通過二硫鍵將人運鐵蛋白或雞同系物伴清蛋白或其組合物共價連接到結合DNA的小蛋白質精蛋白或連接到多種大小的聚賴氨酸上。這些修飾的運鐵蛋白分子保持了結合其同源受體的能力和介導向細胞有效轉運鐵的能力。運鐵蛋白-聚陽離子分子與本發(fā)明的DNA構建體或其它基因構建體(無論核酸大小，如從短寡核苷酸至21k堿基對的DNA)形成電泳穩(wěn)定的復合體。當運鐵蛋白-聚陽離子和本發(fā)明DNA構建體或其它基因構建體的復合體應用于腫瘤細胞時，期望在細胞中由所述構建體產(chǎn)生高水平表達。也可以利用由Cotten等(1992)尸roc.Ato/.爿cad5W.t/W89,6094-6098的方法產(chǎn)生的缺陷或化學失活腺病毒顆粒的內體破壞活性，進行由受體介導的本發(fā)明DNA構建體或其它基因構建體的高效遞送。這種方法似乎依賴于以下事實使腺病毒適合于不經(jīng)過溶酶體途徑而在內體釋放其DNA，并且在存在有例如與本發(fā)明DNA構建體或其它基因構建體連接的運鐵蛋白的情況下，所述構建體通過與腺病毒顆粒相同途徑被細胞吸收。這種方法具有以下優(yōu)勢不需要使用復雜的逆轉錄構建體，沒有如逆轉錄病毒感染時發(fā)生的基因組的持久修飾，使靶向表達系統(tǒng)與靶向遞送系統(tǒng)偶27聯(lián)從而降低對其它細胞類型的毒性。可以理解，"裸DNA"和與陽離子和中性脂質形成復合體的DNA還可以用于將本發(fā)明的DNA引入到待治療個體的細胞中。在Ledley(1995)T72em/^6,1129-1144中闡述了基因治療的非病毒方法。還已知其它可選的靶向遞送系統(tǒng)，如WO94/10323中闡述的修飾的腺病毒系統(tǒng)，其中通常在腺病毒或類腺病毒顆粒內載有所述DNA。Michael等(1995)772erap_y2，660-668闡述了將細胞選擇性部分加入到纖突蛋白而對腺病毒進行修飾。選擇性地在p53缺陷型人腫瘤細胞中復制的突變腺病毒，如Bischoff等(1996)5We"ce274,373-376中闡述的那些突變腺病毒，也可以用于將本發(fā)明的基因構建體遞送到細胞中。因此，可以理解，本發(fā)明的另一個方面提供了包含本發(fā)明的基因構建體的病毒或類病毒顆粒。其它合適的病毒或類病毒顆粒包括HSV、AAV、痘苗病毒和細小病毒(parvovirus)。在另一個實施方案中，選擇性地抑制hCAP18/LL-37功能的試劑為能夠靶向剪切hCAP18/LL-37mRNA或DNA的核酶?？梢园磁c反義分子基本相同的方式并利用基本相同的載體施予表達所述核酶的基因。在US5,180,818、US5,168，053、US5,149，796、US5，116，742、US5,093,246和US4,987,071中闡述了可以在本文所公開的病毒或類病毒顆粒中編碼的核酶?？梢岳斫猓赡芷谕眉毎禺愋詥幼釉磉_所述反義分子或核酶。在本發(fā)明制劑的一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述制劑能夠向癌細胞靶向遞送本發(fā)明的試劑。本領域的技術人員還將理解，本發(fā)明的試劑和藥物制劑可應用于醫(yī)藥(medicine)和獸醫(yī)領域中。因此，本發(fā)明的試劑可以用于人和非人動物(如馬、狗和貓)的治療。然而，優(yōu)選地，患者為人。本發(fā)明的第三方面提供了用于抑制患者體內癌細胞轉移的方法，所述方法包括向所述患者施予本發(fā)明的第一方面的試劑或本發(fā)明的第二方面的藥物制劑。優(yōu)選地，患者為人。所述試劑被選擇性地遞送到癌細胞或被癌細胞選擇性地激活是有利的。因此，本發(fā)明還提供了本發(fā)明第一方面的試劑在醫(yī)藥中的用途。優(yōu)選地，所述試劑用于癌癥治療。所述"治療"包括患者的治療性處理和預防性處理。術語"預防性"包括使用本文所闡述的多肽或制劑防止或降低患者或受試者體內發(fā)生癌癥的可能性，特別是發(fā)生轉移性腫瘤的可能性。如上文所述，術語"有效量"在本文中用于闡述本發(fā)明化合物的濃度或量，所述濃度或量可以使所治療的疾病或病情的產(chǎn)生有利改變，取決于所治療的疾病或病癥，所述改變可以是所治療的疾病狀況或病情的好轉、產(chǎn)生有利的生理結果、逆轉或消弱，或防止或降低所述病情或疾病狀況發(fā)生的可能性。當本發(fā)明的試劑聯(lián)合使用時，所述每一種試劑都可以以有效量使用，其中所述有效量可包含增效量。本發(fā)明的另一方面提供本發(fā)明的第一方面的試劑用于在制備抑制癌細胞轉移藥物中的應用。有利地，所述癌細胞(cancercells或carcinomacells)為上皮細胞或鱗狀細胞。便利地，所述癌細胞選自以下癌細胞組成的組乳腺癌細胞、膽管癌細胞、腦癌細胞、結腸癌細胞、胃癌細胞、生殖器官癌細胞、肺和氣管癌細胞、皮膚癌細胞、膽囊癌細胞、肝癌細胞、鼻咽癌細胞、神經(jīng)細胞癌細胞、腎癌細胞、前列腺癌細胞、淋巴腺癌細胞和胃腸道癌細胞。優(yōu)選地，所述癌細胞為乳腺癌細胞。更優(yōu)選地，所述乳腺癌細胞為ElstonIII級細胞。最優(yōu)選地，所述乳腺癌細胞為轉移性的。參考以下附圖，在下文非限制性實施例中闡述了本發(fā)明的優(yōu)選方面。圖l:hCAP18/LL-37在乳腺癌中髙表達(a)III級乳腺導管癌(7號患者，表2)的切片顯示對基質島(st)周邊腫瘤細胞(紅色沉淀)中的hCAP18蛋白質的強免疫反應性。(b)原位雜交顯示來自同一組織的切片中與hCAP18mRNA匹配的信號。在暗視野光源下強烈的放射自顯影信號顯示為白色顆粒。(c)在高倍下觀察癌細胞，顯示出與缺乏免疫反應性的腫瘤細胞相鄰的強免疫反應性細胞。(d)血管內的hCAP18免疫反應性乳腺癌細胞。(e)利用cathelin重組肽的免疫吸附完全消除了hCAP18免疫反應性(與圖la相同的組織)。(f)在免疫吸附過程中作為陽性對照的hCAP18的常規(guī)染色(與圖la相同的組織)。(g)正常乳腺上皮細胞顯示弱的hCAP18免疫反應性。使用用1:500稀釋的抗hCAP18抗體獲得顯示于顯微照片(a、c-g)的結果。比例尺(a，b)=100nm;(c，d)=25拜；(e，f，g)=10pm。圖2:通過免疫印跡在乳腺癌中檢測hCAP-18/LL-37患者的臨床數(shù)據(jù)在表2中顯示(樣本1-10)。重組cathelin(C)和LL-37肽(L)用作分子大小參照(sizereference)。第1道表示正常乳房組織。第2、4和5道表示ElstonI級腫瘤。第3道表示II級腫瘤，第6-10道表示III級腫瘤。在所有組織中都有與完整的未處理18kDa全蛋白相對應的免疫反應條帶。5個III級腫瘤(第7-10號)中有4個可以觀察到經(jīng)處理的LL-37肽(4kD)。圖3:上皮細胞中hCAP18的轉基因表達提高了細胞增殖(a)左資/欲邀利用抗LL-37抗血清對HEK293提取物的免疫印跡。轉染雙順反子載體hCAP18+EGFP(hCAP18/E)的細胞顯示hCAP18蛋白質的表達。丄瓶^W妖邀僅轉染EGFP(E)的HEK293細胞。^教與對照細胞(E)相比，HEK293細胞(hCAP18/E)顯示顯著升高的增殖速率(用流式細胞術評價)。麗春紅染色作為上樣對照。(b)左資/妖if:如(a)所述轉染HaCaT細胞。7教與對照細胞相比，轉染了hCAP18的HaCaT細胞顯示顯著升高的增殖速率(用3H-胸苷摻入法評價)。圖4:利用合成的LL-37肽處理提髙了上皮細胞的細胞增殖與沒有處理的(對照)HaCaT細胞相比，通過72小時血清饑餓隨后用10嗎/ml合成的生物活性LL-37肽處理36小時被同步化的HaCaT細胞(在DMEM+5%FCS+PEST中)顯示顯著提高的細胞增殖。用卩H]-胸苷摻入法評價增殖速率。.圖5:LL-37受體FPRL在乳腺癌和正常乳腺上皮細胞中的表達(a)對腫瘤細胞中FPRL1受體具有突出免疫反應性(紅色沉淀)的Elston2級乳腺導管癌的切片(第12號患者，表2)。(b)正常乳腺上皮細胞切片在導管區(qū)(紅色沉淀)顯示對FPRL1的免疫反應性。顯微照片顯示使用h400稀釋的FPRL1抗血清獲取的結果。比例尺(a)=5(Him;(b)=10pm。(c)免疫印跡顯示在正常(N)和乳腺癌(T)組織中都表達LL-37受體FPRL1。(d)通過實時PCR證明轉染雙順反子載體hCAP18+EGFP(hCAP18/E)的細胞中FPRL1受體mRNA的表達顯著增加。使用僅轉染EGFP(E)的HaCaT細胞作為對照。圖6:在雌激素受體(ER)和淋巴結(N)陽性的乳腺腫瘤中hCAP18/LL-37的表達提高(顯示為對數(shù)比例)從140個乳腺腫瘤和4個未患病的乳房組織樣本中提取RNA，并用隨機六聚體作為引物反轉錄。根據(jù)標準方法利用10ngcDNA通過實時PCR測定hCAP18轉錄本的表達。樣本通過18S-RNA的定量進行標準化。將未患病樣本的平均表達設定為l。通過方差統(tǒng)計評價平均值和偏差。圖7:LL-37在HEK細胞(A)和HaCat細胞(B)中抑制喜樹堿誘導的凋亡A.用不同濃度的LL-37(lpM、2nM和4pM)處理半?yún)R合的細胞。單獨用培養(yǎng)基處理的細胞為對照細胞(a)。隨后在有(a至d)或沒有(e至h)6pM喜樹堿存在的情況下將所得細胞進一步培養(yǎng)24小時。對所收集的細胞進行兩種顏色的凋亡試驗和流式細胞術并根據(jù)熒光強度進行四象限分析分類存活(沒有或幾乎沒有熒光)，凋亡(FL-1YOPRO染料陽性)和壞死(FL-1和PI熒光陽性)。該圖顯示了代表性的三個獨立試驗，且每個試驗都一式作三份。B.凋亡細胞的定量分析圖8:HEKii細胞的流式細胞術分析表明使用LL-37預處理HEKn細胞可防止喜樹堿誘導的凋亡31通過24小時的喜樹堿處理(d-f)來誘導1jaM或2|iMLL-37處理24小時的細胞(b、c、e、f)和未處理的細胞(a、d)進行凋亡。隨后通過流式細胞術分析細胞以檢測非凋亡(2N至4N)和凋亡細胞群(小于2N)。該圖是3個試驗的代表性結果，且每次試驗一式作三份。圖9:LL-37降低HEKn細胞中caspase-3的喜樹堿激活在存在或沒有LL-37和喜樹堿的情況下培養(yǎng)細胞，隨后收集所述細胞并通過VDVAD-AMC的體外水解分析caspase-3的活性。通過用LL-37處理細胞降低了用喜樹堿溫育24小時誘導的Caspase活性。數(shù)值是三個不同試驗的平均值，每一次試驗都一式作三份。圖10:LL-37處理提高了IAP2的表達用2LL-37處理HEKn細胞并在刺激后的不同時間點收集。對來自這些細胞的RNA進行反轉錄并通過實時PCR測定IAP-2的表達。每個時間點IAP-2的轉錄水平相對于18SRNA標準化并是相對于未處理細胞(每個時間點的對照設定為1)進行顯示。圖ll:LL-37提高了HEK細胞中前列腺素內過氧化物合酶2(COX-2)的表達用2pMLL-37處理HEKn細胞并在刺激后的第6、12和24小時收集。在每個時間點都將未處理的細胞作為對照(淺灰色柱)。對來自這些細胞的RNA進行反轉錄并通過上述qPCR確定相對于對照的COX-2的相對表達。圖12:對COX-2的抑制阻礙了LL-37誘導的IAP-2的增加使用或不用COX-2特異性抑制劑SC-791(25nM)處理HEKn細胞并進一步用或不用LL-37(2|iM)溫育6小時。通過RT-PCR分析IAP-2mRNA基因的水平并以相對與未處理對照樣本的方式顯示。圖13:LL-37通過Heregulin增強EGFR信號系統(tǒng)的激活如圖所示，對乳腺癌系ZR75-1提取物進行磷酸化蛋白質的Western印跡分析。圖14:通過蛋白質印跡分析定量ERBB2磷酸化(第1248位酪氨酸)在相對于麗春紅染色標準化后對化學發(fā)光信號進行定量。圖15:LL-37通過EGFR家族激活MAPKLL-37通過EGFP家族激活MAPK，并且所述激活可以被酪氨酸激酶抑制劑PD153035完全阻斷。完全抑制所需要的濃度為2.5|nM，高于EGFR所需要的濃度但卻是阻斷ERBB2活性所必需的。圖16:LL-37引起乳腺癌細胞非錨定生長的表型改變利用乳腺癌系ZR75-1在群落形成試驗中研究了LL-37的致瘤潛能。在低血清濃度下，LL-37獨自降低了群落數(shù)，然而LL-37與Heregulin的聯(lián)合提高了群落數(shù)(見圖A)。表型的改變更為顯著。在有LL-37存在的情況下，群落的緊密結構被破壞并且出現(xiàn)了單個的細胞衛(wèi)星(見圖B)。Heregulin恢復了所述群落的密度，但當存在LL-37時不阻止單個細胞的脫離。圖17:hCAP18表達載體的構建將來自Imageclone305793119的Bfal片段亞克隆至雙順反子載體pIRES2-EGFP(BDBiosciences,Bedford,MA)的Smal位點中以構建hCAP18表達載體，所述Bfal片段包含具有16bp的5'非翻譯區(qū)的完整編碼序列。圖18:體內次生腫瘤的形成(A)用親本MCF7注射的SCID小鼠中的原發(fā)腫瘤。(B)用MCF7-hCAP18轉基因注射的SCID小鼠具有多個轉移瘤。(C)LL-37在從注射有乳腺癌細胞的SCID小鼠收集的腹水轉染細胞中的表達，所述乳腺癌細胞中轉染并過量表達hCAP18。通過綠色熒光蛋白標記物(下圖)的共表達確定hCAP18在MCF7腹水細胞中的活性轉錄(上圖)。圖19:通過siRNA對腫瘤中hCAP18/LL-37蛋白質表達的抑制在將其它情況下過表達hCAP18/LL-37蛋白質的MCF7-hCAP18轉基因細胞處理48小時后發(fā)現(xiàn)由hCAP18mRNA特異性小干擾RNA(siRNA)引起的劑量依賴性強抑制(參見實施例G中材料與方法"hCAP18在MCF7衍生細胞中的轉基因表達"一節(jié))。經(jīng)HPLC純化、雙鏈化的即用型陰性對照siRNA和四個hCAPl8/LL-37特異性siRNA購自(Ambion，Austin,USA)，包括用于優(yōu)化轉染效率和增殖率的siPORTNeoFX轉染試劑。將所有四個siRNA-CAMP(siRNA-CAMPl-4，在實施例H中闡述)混合成混合物以將非特異性作用減至最小，并對所述陰性siRNA對照進行類似的操作。在與siPORT轉染試劑配套的詳細方案中提供了用于優(yōu)化轉染的說明書。所有試驗過程均根據(jù)生產(chǎn)商的說明進行。SiRNA的終濃度為10nM、25nM或100nM。根據(jù)實施例C材料與方法中的闡述，在蛋白質印跡中利用1/2000稀釋的抗hCAP18抗體分析經(jīng)處理的乳腺癌細胞的細胞提取物中的hCAP18/LL-37蛋白質。通過CCD相機(Fujifilm,Tokyo,Japan)捕獲增強的化學發(fā)光(ECL)信號(AmershamBiosciences,Piscataway，NJ)，并在相對于麗春紅染色標準化后進行定量。圖20:人抗菌蛋白hCAP18/LL-37誘導乳腺癌轉移的表型，其可被hCAP18特異性siRNA逆轉(A)綠嚴斜離教/2，/祖-37導辦細游存微更微表差《進行Matrigel侵襲力試驗(MatrigelInvasionAssay)以評估與不表達hCAP18/LL-37的MCF7-IRES轉基因對照細胞相比，過表達hCAP18/LL-37蛋白質的MCF7-hCAP18轉基因細胞的轉移潛能(參見實施例G中材料與方法"hCAP18在MCF7衍生細胞中的轉基因表達"一節(jié))。完全根據(jù)生產(chǎn)商的說明書使用BioCoatMatrigelInvasionChamber試劑盒(BectonDickinsonBioscience,Bedford,MA，USA)。在將細胞轉移至Matrigel濾膜前，細胞在不含F(xiàn)CS的DMEM(Gibco-BRL)中饑餓24h。在使用當天，用0.25%Tryp-EDTA(Invitrogen，cat#25200-056)胰酶消化細胞并通過加入50^1胰酶抑制劑和lOOplDMEM終止胰酶消化。將200^1220,000個細胞/ml的細胞懸液接種至具有Matrigel包被濾膜的Transwell插入小室(transwellinsertchamber)中，并放置在裝有750W包含5%FCS的DMEM的下室中。將小室在37。C、5%C02氣氛下溫育48h。隨后，移去插入小室并除去留在濾膜上方的非侵襲癌細胞。將已經(jīng)侵襲至濾膜下方的細胞染色，在相差顯微鏡下觀察并計數(shù)。癌細胞的侵襲能力用已經(jīng)侵襲至濾膜下方的平均細胞數(shù)量表示。所述試驗一式作三份。(B)if過^/2C4戶7S/LU7錄,絲^A^必麥萬虜蘼潘應,劍7^/zC4尸/組扁37誘孕離激絲教。為了證明其通過減少腫瘤表達的hCAP18/LL-37抑制癌細胞轉移潛能的能力，使用了RNA干擾。將全部四個siRNA-CAMP—起作為10nM的混合物使用以使非特異性作用減至最小，并對陰性siRNA對照進行同樣操作以進行RNA干擾。在進行如(A)中所闡述的Matrigel侵襲試驗前40小時進行siRNA處理(見圖19)。siRNA的RNA干擾證明通過減少侵襲腫瘤細胞數(shù)量能夠明顯抑制癌細胞轉移潛能。(詳情也可見實施例C，"轉錄后抑制研究和侵襲性誘導"一節(jié))實施例實施例A:抗菌蛋白hCAP18/LL-37在乳腺癌中髙表達，并推定其為上皮細胞生長因子在此實施例中，研究了hCAP18/LL-37在一系列乳腺癌中的表達譜，證明hCAP18mRNA和蛋白質在所述腫瘤細胞中而沒有在其相鄰基質中顯著上調。有趣的是，在具有最高組織學分級的腫瘤中檢測到最高水平的hCAP18蛋白質，然而在一些低級別腫瘤中，hCAP18水平等于正常乳房組織。這些發(fā)現(xiàn)與針對抗菌肽提出的假定的抗腫瘤作用明顯相反，但卻與新近提出的hCAP18/LL-37在上皮細胞修復和血管產(chǎn)生中起作用的發(fā)現(xiàn)相一致5，1G。在本文中我們證明通過合成的生物活性LL-37肽的處理以及通過hCAP18的轉基因表達顯著增強了上皮細胞的增殖，這進一步支持hCAP18/LL-37是生長促進因子。材料和方法鄉(xiāng)從瑞典斯德哥爾摩Danderyd醫(yī)院的病理科獲取28個乳腺癌患者的冷凍腫瘤組織(表2)。所述腫瘤根據(jù)Elston和EllisI-III按照建立的指導方針13進行分級。使用細胞周期蛋白A作為增殖標記(Nova-CastraLaboratories,NewcastleuponTyne,UK)。在常規(guī)處理的石蠟切片上評估雌激素受體的狀況。使用來自8位乳腺癌患者和來自兩位經(jīng)受了乳房縮減手術的健康個體的無腫瘤乳房組織(uninvolvedmammarytissue)作為對照。所有樣本都由同一位病理學家(及S.)檢査并按常規(guī)分類(表2)。所有患者均給出了書面知情同意書。本研究由地方倫理委員會(RegionalCommitteeofEthics)核準。/zC4渭嚴泣染玄使用亞克隆至pBluescript中的435bp全長hCAP18cDNA以體外轉錄["S]標記的反義和正義探針，并基本按照闡述8對樣本0-17進行原位雜交(表2)。對樣本0-17進行免疫組化試驗(表2)。如前文所述10，根據(jù)間接過氧化物酶方法利用Vectastain試齊!]盒(VectorLaboratories,Burlingame，USA)，使用1:500稀釋的Cathdin-親和純化的兔抗重組hCAP1814抗血清。為了確定染色的特異性，根據(jù)之前的報道1()進行免疫吸收試驗。根據(jù)間接過氧化物酶方法，使用1:400稀釋的親和純化山羊多克隆抗體(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA)檢測FPRLl受體。歪，微贈頗伊砂橋利用電動勻漿儀在裂解緩沖液中將冷凍的16-60mg腫瘤組織勻漿。根據(jù)標準方法15在含SDS的樣本緩沖液中提取來自腫瘤組織和細胞系的蛋白質。通過分光光度試驗測定蛋白質的濃度并用含SDS的樣本緩沖液將蛋白質濃度調整至相等16。將所述提取液在16.5%Tris-TricineReady凝膠(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)上分離以檢測hCAP18/LL-37。重組cathelin17和合成的LL-37肽作為分子大小的參照(sizereferenced將蛋白質分別在12%和8°/。的Tris-甘氨酸凝膠上分離以檢測ERKl/2和FPRLl。為了證實各樣本中被印記蛋白質的量大致相等，在與一抗溫育前，使用含3%麗春紅S溶液(SigmaAldrich,USA)的3%TCA對濾膜進行可逆染色。所有親和純化的抗cathelin抗血清17、親和純化的抗LL-37抗血清1Q、抗FPRL1抗血清(scl8191,SantaCruzBiotechnology,CA)和單克隆抗ERK1/2抗體(CellSignalingTechnology,BeverlyMA)都以1:1000稀釋后使用。在電印跡至硝酸纖維素濾膜(Schleicher&Schuell，Dassel,Germany)并隨后與一抗和辣根過氧化物酶共軛結合的IgG(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz，CA)溫育后，用CCD相機(LAS1000,Fujifilm,Tokyo,Japan)捕獲來自增強的化學發(fā)光(ECL,AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)的信號。利用之前闡述17的夾心ELISA對來自正常乳腺和腫瘤組織的蛋白質提取物中的hCAP18進行定量。ifH^^C及^^#/C^P/<§^^《用QiagenRNeasy試齊[J盒(OperonBiotechnologies,Cologne,Germany)提取四個正常樣本和四個腫瘤樣本的RNA并使用第一鏈合成試劑盒(AmershamBiosciences,Norwalk，CT)進行反轉錄。利用10ngcDNA根據(jù)標準方法在ABIPrism7700(AppliedBiosystems)上通過實時PCR對RNA進行定量。所述樣本一式作三份進行評價。序列為引物序列5'-GTCACCAGAGGATTGTGACTTCAA國3，[SEQIDNO:2]和5，-TTGAGGGTCACTGTCCCCATA-3，[SEQIDNO:3]，熒光探針序列6-FAM誦5，誦CCGCTTCACCAGCCCGTCCTT-3，-BHQl[SEQIDNO:4]。樣本通過18S-RNA的定量進行標準化(在Demand,AppliedBiosystems上進行試驗)。將正常樣本中的平均表達設定為1。會虜游丄丄-37,合成LL-37肽并通過HPLC純化至純度為98%(PolypeptideLaboratoriesA/S,Hiller0d，Denmark)。在抗菌試驗18中確認所述肽的生物活性。丄微蕭丄丄-37嚴微在補充有10。/。FCS(胎牛血清，Hy-Clone，BouleNordicABHuddinge，Sweden)和抗生素(PEST=50U/l青霉素和50mg/ml鏈霉素，GibcoBRL)的DMEM(Dulbecco，smodifiedEagle's培養(yǎng)基，GibcoBRL，LifeTechnologies,Scotland)中培養(yǎng)自發(fā)永生化的人角化細胞系(HaCaT)19。在70%匯合時收集細胞并接種在96孔板中，每孔為含2000個細胞的100pi培養(yǎng)基(DMEM十10。/。FCS和PEST)。12小時后，將培養(yǎng)基更換成無血清的培養(yǎng)基(DMEM+PEST)，通過72小時的血清饑餓將細胞同步化到G0/G1期，隨后用100pl含10pg/ml合成的生物活性LL-37肽的培養(yǎng)基(DMEM+5%FCS+PEST)處理。使用僅經(jīng)過DMEM+5。/。FCS和PEST處理的細胞作為對照。所述試驗一式做四份。通過[3印-胸苷摻入試驗評價細胞增殖。用1^iCi/孔的[3H]-胸苷(20.00Ci/mmol，PerkinElmerLifeSciencesInc.Boston,MA)處理細胞12小時并收集到玻璃纖維濾膜(WallacOyTurku,Finland)上。所述試驗重復進行兩次，每次做六份。/2C4，在服03浙/^0^謝應柳存基歷表這將來自Imageclone30579312G的Bfal片段亞克隆至雙順反子載體pIRES2畫EGFP(BDBiosciences,Bedford,MA)的Smal位點中，所述Bfal片段包含具有16bp的5'非翻譯區(qū)的完整編碼序列。在標準條件下利用Fugene(RocheDiagnostics,Indianapolis,IN)轉染HEK293和HaCaT細胞，并用400ng/mlG418(Invitrogen,Paisley,UK)選擇培養(yǎng)兩周。根據(jù)EGFP的表達，用MoFk^高速細胞分選流式細胞儀(DakoCytomation,FortCollins,CO)使用SummitTM數(shù)據(jù)分析軟件分選細胞，通過免疫印跡定量所述細胞的CAP18表達。同樣通過轉染僅表達EGFP的載體建立對照細胞系。在沒有任何選擇的連續(xù)數(shù)月培養(yǎng)過程中所述細胞系保持穩(wěn)定的CAP18表達。所述試驗重復兩次，每次做30份。惹定薦染7^C4，游服房3/組aOr潘應游潛屋微在70%匯合時收集轉染hCAP18的HEK293細胞并接種至24孔板中。24小時后，更換培養(yǎng)基并將細胞培養(yǎng)在2ml補充有5%FCS和PEST的培養(yǎng)基(Optimem，GibcoBRL，LifeTechnologies,Scotland)中。在第6天收集細胞并通過流式細胞儀(BectonDickinson,Bedford,MA)計數(shù)。利用臺盼藍測定細胞存活率，在所有試驗中都有少于5%的細胞是臺盼藍陽性的。所有試驗都一式作三份。使用轉染僅表達EGFP的載體的HEK293細胞為對照細胞。在70%匯合時收集轉染了hCAP18的HaCaT細胞并以每孔2000個細胞接種至96孔板含10%FCS+PEST的DMEM中。12小時后將培養(yǎng)基更換成補充有5。/。FCS+PEST的DMEM。培養(yǎng)24小時后，如上所述，用1^Ci/孔的[3司-胸苷處理細胞12小時、收集并進行分析。使用轉染僅表達EGFP的載體的HaCaT細胞為對照。尸淮7游表達分界使用RNeasy試劑盒(Qiagen)從HaCaT細胞提取RNA并使用第一鏈合成試劑盒(Amersham-Pharmacia)進行反轉錄。如上所述，通過實時PCR對RNA進行定量并相對于18S-RNA進行標準化。序列為引物序列5，-TCTGCTGGCTACACTGTTCTGC-3，[SEQIDNO:2]和5，-GACCCCGAGGACAAAGGTG-3，[SEQIDNO:3]，熒光探針序列6-FAM陽5，-CCCAAGCACCACCAATGGGAGGA-3，匪BHQl[SEQIDNO:4]。麗鍵氣素縱為了評估FPRL在介導由hCAP18/LL-37誘導的上皮細胞增殖刺激中的參與作用，使用G蛋白偶聯(lián)受體抑制劑百日咳毒素處理HaCaT細胞。在LL-37處理前，將細胞與毒素終濃度為20ng/ml的百日咳毒素(Sigma-Aldrich,Switzerland)—起預溫育24h。細胞接種48小時后更換培養(yǎng)基，使用分別含5或10嗎/ml合成的、具生物活性的LL-37的100^1培養(yǎng)基(DMEM+5%FCS和PEST)處理HaCaT細胞。使用僅經(jīng)DMEM+5%FCS和PEST處理的細胞為對照。丄丄-37炎遭游i^ar潘^^游鏵麼眾五欣7/2試驗以10%的匯合接種HaCaT細胞并在含0.2%FCS的DMEM中培養(yǎng)36小時。在其后48小時中，在含有或不含10pg/mlLL-37的情況下，在分別含1%或5%FCS的DMEM中培養(yǎng)細胞，并且每天更換培養(yǎng)基。使用10ng/mlEGF作為陽性對照。利用小鼠單克隆抗體(CdlSignalingTechnology,BeverlyMA)通過蛋白質印記分析評價磷酸化ERK1/2的表達。淑分#數(shù)值用每分鐘計數(shù)細胞的平均數(shù)士SD表示。用雙向t檢驗分析組間比較。P值O.05認為結果具有統(tǒng)計顯著性。為了分析腫瘤中的表達，對hCAP18蛋白質水平進行單側t檢驗，顯著性水平為<0.05。結果/zC4，/iZ-37敘糜蘑中表這在表2中顯示了患者的詳細信息。通過原位雜交，在健康對照(圖lg)和與乳腺癌無關(uninvolvedbreastcancer)(未顯示)的乳房組織中有低的/2C4尸MmRNA信號(未顯示)和對hCAPl蛋白質的微弱免疫反應性。所有乳腺癌組織都在腫瘤細胞中而未在基質中顯示出對hCAP18的免疫反應性(圖la、lc、ld)。對于hCAP18免疫反應性，所述腫瘤細胞群分布并不均勻，發(fā)現(xiàn)強陽性細胞與缺乏可測hCAP18的細胞相鄰(圖lc)。利用cathelin重組蛋白的免疫吸收消除了hCAPl免疫反應性(圖le、lf)。通過原位雜交，在同一區(qū)域檢測到AC4尸7SmRNA的陽性信號，該信號與免疫組化(圖lb)獲取的表達譜非常匹配。信號強度各不相同并且在高級別腫瘤中最突出。對照切片與缺乏AC1P/SmRNA特異信號的正義hCAP18cRNA探針雜交C未顯示)c通過ELISA對乳腺癌組織提取液中hCAP18蛋白質定量，定量結果顯示hCAP18蛋白質在Elstonl和II級腫瘤間沒有差別，但是在最高惡性級別的腫瘤中具有明顯較高的hCAP18水平(表2)。ElstonIII級和其它腫瘤間的差別具有統(tǒng)計顯著性(pO.Ol)。13個III級腫瘤中有IO個腫瘤的hCAP18濃度達到或超過5ng/mg總蛋白質。在18個其它腫瘤樣本中僅有2個樣本達到這個水平。我們還檢測了四個物種的健康乳房組織，顯示其與ElstonI或II級腫瘤具有相似的水平。為了證實通過ELISA獲取的表達譜，我們對四個正常樣本和四個腫瘤樣本進行了實時PCR。轉錄本定量的結果與蛋白質表達的數(shù)據(jù)一致(表2)。通過免疫印記，研究的所有腫瘤和正常乳房組織都顯示與完整的未處理18kDa全蛋白對應的免疫反應條帶(圖2)。在所研究的5個III級腫瘤中，其中4個腫瘤(表2，樣本6-10)檢測到了與LL-37(處理的hCAP18蛋白質)相對應的條帶(圖2)。使用針對hCAP18全蛋白產(chǎn)生的抗血清并以高濃度檢測LL-37，即使所述抗血清針對cathdin肽進行了親和純化。/zC^P7S/L丄-37遠裔7J:皮紛應游潛遭與轉染僅表達EGFP(E)的載體的對照細胞相比，轉染/zC4戶7S(hCAP18/E)表達載體的HEK293和HaCaT細胞顯示顯著增高的增殖速率(圖3A和圖3B)。通過HEK293和HaCaT轉染細胞蛋白質提取物的免疫印跡，我們證實這些含hCAP18載體的細胞產(chǎn)生全蛋白(圖3A和圖3B)并且在細胞培養(yǎng)基中檢測到與LL-37對應的4kD免疫反應條帶(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，在5%胎牛血清中培養(yǎng)并用1(^g/ml合成的、具有生物活性的LL-37肽處理的HaCaT細胞顯示細胞增殖的顯著提高(圖4)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>"-37菱謬F尸及Z/#冥蘑蘑^游表送已經(jīng)表明G蛋白偶聯(lián)受體FPRL1在白細胞中介導由LL-37誘導的作用4，5，為了評估FPRL1蛋白質在本發(fā)明中的潛在作用，我們研究了其在乳房組織中的表達并在乳腺癌細胞和正常腺上皮細胞中都發(fā)現(xiàn)對FPRL1的強免疫反應性(圖5a，5b)。免疫印跡證實在所述兩個組織中都表達FPRL1(圖5c)。此外，在HaCaT細胞中/zC4尸/S的轉基因表達顯著提高了FPRL1mRNA的表達(圖5d)，這可能進一步支持FPRL1參與了hCAP18/LL-37信號傳遞。然而，用百日咳毒素預處理HaCat細胞沒有完全終止而是約50%的抑制了這些細胞的增殖(未顯示)，說明在這些細胞中FPRL1可能并不唯一參與介導hCAP18/LL-37生長剌激作用。我們使用合成的、具有生物活性的LL-37處理HaCaT細胞以檢測ERK1/2參與激活上皮細胞增殖的可能性，但沒有ERK1/2的顯著激活，這說明EGFR不參與介導LL-37對HaCaT細胞增殖的刺激作用。討論在本研究中，我們證明在正常乳腺上皮細胞中組成性地產(chǎn)生hCAP18/LL-37。這與LL-37在人抗菌屏障保護中的作用一致，并與先前的報道一致，即在正常的靜止上皮細胞中發(fā)現(xiàn)LL-37的低組成性表達，而觀察到LL-37的顯著表達與損傷和炎癥相關7—1Q。先前已經(jīng)在多種外分泌腺中檢測到抗菌肽的組成性表達，例如，人汗腺中的cathdicidinLL-37、小鼠唾液腺中的cathelicidinCRAMP和人唾液腺中的P-防御素21'23。Bals等在1998年報道了人卩-防御素-2(hBD-2)mRNA在乳腺中的表達，最近其它研究組在未哺乳婦女的乳腺組織中和處于哺乳期的乳房組織和母乳中都發(fā)現(xiàn)組成性hBD-l表達24—26。有趣的是，與正常乳房上皮細胞或低級別腫瘤相比，在高級別的腫瘤中hCAP18的產(chǎn)生增加得最為顯著。然而hCAP18表達既不普遍也不均勻，即并不是所有的癌細胞都是hCAP18陽性的，但是發(fā)現(xiàn)明顯陽性的細胞與缺乏可檢測hCAP18mRNA和蛋白質的細胞相鄰(圖lc)，并且表達程度在所有腫瘤類型的細胞中相當不一樣。這可能反映了hCAP18復雜而嚴格受控的調控，正如曾提出的針對腎細胞癌中人a-防御素的調控27。在我們的研究中，在最高組織學分類的腫瘤中檢測到最高水平的hCAP18/LL-37。雖然從一方面來看，高級腫瘤與低級和正常乳房之間hCAP18表達的差異是統(tǒng)計顯著的，但是卻沒有明顯相關性。在所有組中都有以健康樣本的表達水平表達hCAP18的腫瘤，并且兩個I級腫瘤顯示了僅在III級腫瘤中觀察到的相對高的表達。然而，考慮到樣本數(shù)的局限性，我們的觀察提示在惡性級別和hCAP18/LL-37表達之間具有潛在的相關性。一些人認為hCAP18在乳腺癌中的過表達可能是由于影響/zC4i^S調控的細胞內通路失效造成的，并且hCAP18表達反映了這些改變而非對腫瘤提供了生長的有利條件。然而，與本文提供的體外研究相結合，我們相信所述數(shù)據(jù)揭示了LL-37在促進腫瘤生長方面的潛在作用。已經(jīng)在多種口腔癌中發(fā)現(xiàn)了高濃度的hBD-2蛋白質和針對人a-防御素和P-防御素的顯著免疫反應性，并且提示這些抗菌肽水平的提高可能是由細胞因子引起的感染和/或刺激的結果28—3、其它研究提出，從昆蟲中分離的抗菌肽，例如蜂毒素和天蠶抗菌肽(ceropin)相關肽顯示對哺乳動物腫瘤細胞的抗腫瘤作用31—34。此外，通過對人膀胱癌細胞系中蜂毒素和天蠶抗菌肽的編碼序列進行載體介導的遞送和表達抑制了裸鼠中腫瘤的形成11。同樣，豬cathelicidinPR-39的轉基因表達降低了人肝細胞癌的侵襲能力12。這些抗菌肽的多功能作用變得越來越明顯。除了通過直接的膜作用使病原體失活，LL-37還在體外發(fā)揮趨化作用，誘導人中性粒細胞、單核細胞、T細胞亞群和肥大細胞的遷移4'35，36。這種趨化活性依賴于LL-37與FPRL1的結合，F(xiàn)PRL1是對百日咳毒素敏感的膜結合G蛋白偶聯(lián)受體4。此外還提出hCAP18/LL-37的功能包括通過促進皮膚傷口的上皮再生和新血管形成修復上皮細胞和形成血管的作用5，1G。因此，本文顯示的hCAP18/LL-37在乳腺癌細胞中的顯著表達反映了對這些腫瘤細胞的生長有利。為了檢驗這種假設，我們用/2C4i^S表達載體轉染人上皮細胞系HEK293和HaCaT，并發(fā)現(xiàn)轉染細胞增殖的顯著提高。此外，合成的、具有生物活性的LL-37肽顯著提高了HaCaT細胞的增殖。這些發(fā)現(xiàn)與針對抗菌肽提出的可能的抗腫瘤作用形成鮮明的對比，但與最近Miiller等關于人a-防御素可能調節(jié)腎細胞癌(RCC)發(fā)展的發(fā)現(xiàn)一致。這些防御素發(fā)現(xiàn)于RCC腫瘤細胞和正常腎管狀上皮細胞中，并且以生理濃度刺激腫瘤細胞的增殖27。我們的體外研究表明LL-37部分地通過FPRL1剌激上皮細胞的增殖，原因是用百日咳毒素阻斷受體降低了外源LL-37約50°/。的增殖作用，說明可能還有其它受體的參與。在最近的研究中，提出LL-37利用促分裂原激活蛋白激酶/細胞外信號調控激酶(MAPK/ERK激酶=MEK)的活化通過反式激活表皮生長因子受體(EGFR)激活氣管上皮細胞。綜上所述，本文顯示的結果表明LL-37促進腫瘤生長。參考文獻1.GudmundssonGH，AgerberthB，OdebergJ,BergmanT,OlssonB,SalcedoR.ThehumangeneFALL39andprocessingofthecathelinprecursortotheantibacterialpeptideLL-37ingranulocytes.EurJBiochem1996;238:325-32.2.ZanettiM，GermaroR,RomeoD.Cathelicidins:anovelproteinfamilywithacommonproregionandavariableC-terminalantimicrobialdomain.FEBSLett1995;374:1-5.3.AgerberthB,GunneH，OdebergJ,KognerP,BomanHQGudmundssonGH.FALL-39,aputativehumanpeptideantibiotic,iscysteine-freeandexpressedinbonemarrowandtestis.ProcNatlAcadSciUSA1995;92:195-99.4.YangD,ChenQ,SchmidtAP,AndersonGM，JM，WootersJ，OppenheimJJ，ChertovO.LL-37,theneutrophilgranule-andepithelialcell-derivedcathelicidin,utilizesformylpeptidereceptor-like1(FPRL1)asareceptortochemoattracthumanperipheralbloodneutrophils,monocytes,andTcells.JExpMed2000;192:1069-74.5.KoczullaR,vonDegenfeldQKupattC，KrotzF，ZahlerS,GloeT,IssbruckerK,UnterbergerP,ZaiouM,LebherzC，KarlA,RaakeP,等AnangiogenicroleforthehumanpeptideantibioticLL-37/hCAP-18.JClinInvest2003;111:1665-72.6.CowlandJB,JohnsenAH,BorregaardN.hCAP-18,acathelin/pro-bactenecin-likeproteinofhumanneutrophilspecificgranules.FEBSLett1995;368:173-76.7.FrohmM,AgerberthB,AhangariGStMile-BackdahlM，Lid6nS，WigzellH，GudmundssonGH.TheexpressionofthegenecodingfortheantibacterialpeptideLL-37isinducedinhumankeratkiocytesduringinflammatorydisorders.JBiolChem1997;272:15258-63.8.FrohmNilssonM,SandstedtB,S0rensenO,WeberQBorregaardN,St&hle扁B汪ckdahlM.Thehumancationicantimicrobialprotein(hCAP18)，apeptideantibiotic,iswidelyexpressedinhumansquamousep他eliaandcolocalizeswithinterleukin-6.InfectImmun1999;67:2561-66.9.D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18在ER陽性腫瘤中的表達顯著高于(約5倍)沒有淋巴結時hCAP18在ER陽性腫瘤中的表達。實施例C:抑制hCAP18/LL-37活性的物質的鑒定可使用多個明確定義的體外和體內試驗來證明hCAP18/LL-37對腫瘤發(fā)展的不同方面的作用，即熟知的信號轉導通路的誘導、細胞增殖的刺激和凋亡的抑制、群落生長和非錨定生長的刺激、通過基底膜的侵襲刺激和在小鼠中加強腫瘤的生長和轉移瘤的形成。上文中歸結的hCAP18/LL-37對原發(fā)角化細胞和上皮細胞系的特征也可以在乳腺癌細胞系中得到證明。合適的靶細胞系是不表達hCAP18的低級別惡性的雌激素受體陽性細胞系MCF7。為了對以上方面進行研究，建立了由重組質粒表達hCAP18的MCF7衍生細胞。由于hCAP18蛋白質的自分泌活性和旁分泌LL-37可能不同，如果試驗的本身允許，還通過LL-37的外源加入而非通過細胞的內源產(chǎn)物進行體外試驗。雖然以上試驗在于評價hCAP18/LL-37產(chǎn)生腫瘤的全部潛能，但是可以利用具有抗hCAP18/LL-37活性的試劑進行進一步的試驗以證明其對這些作用的抑制。例如，合成的且有活性的蛋白質LL-37可以被認為是抗體抑制的耙標。此外，可以通過阻斷啟動子抑制hCAP18基因的轉錄和由RNA干擾引起的轉錄本的轉錄后下調，阻礙這種蛋白質的產(chǎn)生。因此，試驗可以在體外進行以證明作用的機制和靶標，也可以在小鼠體內的腫瘤上進行以證明在體內的作用。這種體外試驗可以在以上闡述的MCF7衍生細胞中進行。針對hCAP18基因的調控試驗，使用以低水平表達hCAP18但表達水平仍可清晰檢測到的乳腺癌細胞系ZR75-1。針對以下闡述的試驗，除非另有說明否則都使用以下條件:細胞在含10%胎牛血清的Dulbecco，smodifiedEagles培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用于轉基因細胞系的培養(yǎng)基含150ng/ml潮霉素和400pg/ml遺傳霉素以保持所述轉基因。對于持續(xù)不到3天的試驗，在使用細胞前24h除去抗生素，并將胎牛血清濃度調整至每個特定試驗所必需的濃度。LL-37以2pM的濃度加入。潘應潛遭微微r"參j服仏腦廁"在70%匯合時收集轉基因細胞系和細胞系并以每孔2000個細胞接種在96孔板中，96孔板中具有含10%FCS的DMEM。24小時后，將培養(yǎng)基更換成添加或未添加LL-37的含5n/。FCS的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后，用20Ci/mmol的[3司-胸苷以1nCi/孔處理細胞12小時，并收集(Harvester96;Tomtec，Orage,CT)到玻璃纖維濾膜(WallacOyTurku,Finland)上。利用液體閃爍計數(shù)器(MicrobetaPlus,Wallac)確定fH]-胸苷的摻入。為了確定試驗的統(tǒng)計顯著性，針對每個條件/細胞系都使用24個孔。51本實驗作為[3司-胸苷摻入試驗的補充進行，以確定hCAP18/LL-37對細胞增殖的刺激。以50個細胞/皿112密度接種MCF7衍生細胞(在6孔板中大約50,000細胞/孔)，每個時間點一式做三份。每隔2天用血細胞計數(shù)器計算總的細胞數(shù)量。通過臺盼藍評估細胞存活率。^/zC4i^S/ZX-37歹/志游銜亡#劍為了誘導凋亡，將細胞以2—55000細胞/孔接種到含具有5%FCS的培養(yǎng)基的6孔板中，并用6um拓撲異構酶I抑制劑喜樹堿(CAM)(SigmaChemicalCo.,St.Luis，MO)處理24h。評價兩個凋亡參數(shù)(DNA含量和Caspase-3的活性)以確定由hCAP18/LL-37引起的凋亡抑制。所有試驗進行6次以確定統(tǒng)計顯著性。遞淑拭紛應術分,"濕體f頻恥咖rto"還"在此分析中使用碘化丙啶(PI)/RNase染色緩沖液(BectonDickinson,SanJose,CA)。將胰酶消化的細胞固定在70%(V/V)冷乙醇中，并保存到4°C直至使用。通過將PI摻入到DNA中測量DNA含量。利用FACScan流式細胞儀(BectonandDickinson,MountainView,CA,USA)進行熒光分析。同時測量顆粒的FSC(前向光散射)和SSC(側向光散射)以確定細胞的尺寸和粒度。在FL-4窗口中(600nm帶通濾波器和35nm帶寬)檢測對核染色的PI紅色熒光。熒光強度與細胞DNA含量成正比。將每個柱狀圖分成兩部分(1)代表不同步的非凋亡活細胞的M1區(qū)(DNA含量等于2N至4N的G1、S和G2期細胞)；以及(2)代表與活細胞相比具有較少DNA量的凋亡細胞的M2區(qū)。Ca5pose-3活絲試驗利用熒光底物VDVAD-AMC(100pM)和DEVD-AMC(50pM)計算Caspase-3酶活性。將細胞裂解物合并在反應緩沖液(100mMHEPES、10%蔗糖、5mM二硫蘇糖醇(DTT)、10-6%NP-40和0.1%CHAPS，pH7.25)中并加至微孔板中。通過AMC釋放在FluoroscanII讀板儀(Labsystems,Stockholm,Sweden)中監(jiān)測熒光團底物的裂解。利用游離AMC產(chǎn)生的標準曲線將熒光單位轉化為pmolAMC。通過線性回歸分析數(shù)據(jù)。券霧承威試驗f參Jgi:w^-Me戸廁2，,g扁"本實驗用于確定在沒有支持性鄰細胞的情況下細胞持續(xù)增殖的能力。這種性質被認為反映了細胞形成腫瘤的能力。將轉基因細胞維持在半?yún)R合狀態(tài)并在最大70%的匯合度時進行胰酶消化，隨后稀釋至5、10和25個細胞/ml生長培養(yǎng)基的濃度。細胞培養(yǎng)3至7天(基本足夠增殖3至4倍)，并測定每個群落的細胞數(shù)。如果重組質粒表達綠色熒光蛋白，就能夠在熒光顯微鏡下計數(shù)細胞和群落。群落形成的結果表示為每個群落中熒光細胞的分布，利用Wilcoxon，s秩和檢驗比較培養(yǎng)基中存在和不存在LL-37時不同轉基因細胞系的分布。由于已知MCF7細胞僅在有J3-雌激素存在的情況下形成腫瘤，可以檢測l-5nM雌激素對轉基因細胞生長的影響。求錄^^主長試驗f參Ji^wccf^W2J這個試驗反映細胞形成轉移瘤的能力。通過用300u/ml胰酶、20u/ml彈性蛋白酶和lmMEDTA混合物的處理制備細胞。彈性蛋白酶的存在促使細胞的脫離而成單細胞懸液。將細胞懸浮在生長培養(yǎng)基中并以1:1的比例與含0.7%Seaplaque低熔點瓊脂糖的生長培養(yǎng)基混合，終濃度為500細胞/ml和0.35%瓊脂糖。將lml這種混合物加入到6孔板中，鋪在2ml固化的培養(yǎng)基/0.6%瓊脂糖層上。通過每隔3-4天加入100W生長培養(yǎng)基供養(yǎng)所述細胞。兩星期后培養(yǎng)物的上層用0.2%碘硝基四唑紫(Sigma)染色，并計算直徑大于100pM的群落。試驗一式作三份，并重復進行兩次。錢歸導f參jm固，"將從EHS肉瘤產(chǎn)生的Matrigel作為基底膜。Matrigel不僅包含基底膜成分(膠原蛋白、層粘連蛋白和蛋白聚糖)還包含基質降解酶/其抑制劑和生長因子。腫瘤細胞向Matrigel的侵襲用于表征細胞外基質受體和在腫瘤發(fā)展中起作用的基質降解酶的參與作用。將Matrigel在無血清的冷卻生長培養(yǎng)基中稀釋成2mg/ml，向24孔transwell的上部小室中加入100pl并在37。C溫育過夜以進行膠凝。收集細胞并以10Vml密度懸浮在含1%FCS的培養(yǎng)基中。用無血清的溫培養(yǎng)基洗滌matrigel后，向上部加入100pl細胞懸液。下部小室注滿600pl含條件培養(yǎng)基作為趨化物的生長培養(yǎng)基。將所述小室在細胞培養(yǎng)箱中溫育6h至24h。對transwell進行染色(Diff-Quick染色溶液，F(xiàn)isherScientific),并且在用棉簽刮掉非侵襲細胞后，在光學顯微鏡下對侵襲細胞進行計數(shù)。收集半?yún)R合的培養(yǎng)細胞并以2.5Xl(^細胞/ml懸浮在冷PBS中。向4-6周齡雌性SCID小鼠的脂肪墊或尾靜脈中皮下注射200pl的部分所述懸液。由于MCF7細胞的腫瘤形成通常依賴于雌激素，皮下植入可在60內每天釋放1.7mgJ3-雌二醇的小球。所述小鼠每周觸診兩次，并記錄首次發(fā)現(xiàn)可觸診腫瘤的日期。人工監(jiān)測腫瘤生長，并且最遲在腫瘤直徑為lcm時處死小鼠。記錄腫瘤的數(shù)量、尺寸和分布。通過對所述小鼠進行切片檢測小的轉移瘤，并掃描以誘導來自重組質粒表達的GFP的熒光。此外，對脾和肝進行膠原化，并在FACS分選儀中評價單細胞懸液以測定熒光細胞的數(shù)量。/zC4戶7S存錄茲^^/游#劍#:秀f^i爿garwa//卯&Jmfe/a20(W，7be//扁7,德z幽廁5,歸w週5J目前已知的最強的hCAP18轉錄誘導劑是維生素D。維生素D受體通過結合hCAP18啟動子中的效應元件直接激活hCAP18轉錄。由于小分子可以控制hCAP18的表達，系統(tǒng)地篩選抑制性化合物很有意義。最初的研究表明雌激素和其一些代謝物沒有效果。維生素A在皮膚角化細胞中抑制轉錄但在乳腺癌細胞系ZR-75-l中剌激轉錄。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，維生素D的拮抗劑如ZK159222(ScheringAG)禾卩TEI-9647(TejinInstituteforMedicalResearch,Tokyo),以及維生素A的拮抗劑如AGN193109(AllergenPharmaceuticals)都是用于本發(fā)明方法的潛在試劑。ZzC4，存錄#繊鄉(xiāng)#遂侈J歸"廁"ZR75-1細胞以25%的匯合鋪板并用終濃度為100nM的潛在抑制劑處理，所述抑制劑以100pM的濃度溶解在異丙醇或DMSO中。24h后，用QiagenRNeasy試齊!j盒(OperonBiotechnologies,Cologne,Germany)提取RNA并用第一鏈合成試劑盒(AmershamBiosciences,Norwalk，CT)進行反轉錄。利用5ngcDNA根據(jù)標準方法在ABIPrism7700(AppliedBiosystems)上通過實時PCR對RNA進行定量。所述樣本一式作三份進行評價。序列為引物序列5,-GTCACCAGAGGATTGTGACTTCAA畫3，[SEQIDNO:2]和5，-TTGAGGGTCACTGTCCCCATA-3，[SEQIDNO:3]，熒光探針序列6-FAM-5,-CCGCTTCACCAGCCCGTCCTT-3，-BHQl[SEQIDNO:4]。樣本通過18S-RNA的定量進行標準化(在Demand,AppliedBiosystems上進行試驗)。為了研究所述抑制的調控機制，通過使用重組質粒確定啟動子的活性，在所述重組質粒中hCAP18啟動子控制熒光素酶報告基因。將ZR75-1細胞以25%的匯合鋪在6孔板中，每孔用3|ig報告質粒和6jetPEI(qBiogene)的混合進行轉染。轉染14h后，加入如上所述的抑制劑。24h后，裂解細胞并在檢測系統(tǒng)(Promega)中測定熒光素酶的活性。所述活性相對于由200ng共轉染質粒(pEFl/lacZ，Invitrogen)表達的B-半乳糖苷酶進行標準化。每個試驗至少進行兩次，每次作三份。存;^>^#^^^^秀『朋g2005,Z/zfl"g2005，及o/2;>目前最有效的轉錄后抑制是RNA干擾，其主要誘導靶mRNA的序列特異性和酶促性降解?？梢宰詈唵蔚卦谵D染小干擾RNA的細胞系中篩選到轉錄本中最有效的靶位點。由定量PCR和蛋白質印跡分析監(jiān)測RNA干擾的功效。隨后可以在設計用于在腫瘤位點表達耙分子的重組載體中表達成功的靶位點。根據(jù)hCAP18編碼序列設計并合成小干擾RNA。所述RNA由19-mer的雙鏈，并在任意一端具有2個堿基dTdT的懸端構成。最簡單地，可以將商業(yè)siRNA數(shù)據(jù)庫用于所述設計，在所述數(shù)據(jù)庫中靶位點已經(jīng)被預先選擇出來(如針對hCAP18，siRNA為來自Ambion的第14586、14402、146365號)。用最大終濃度為10nM的siRNA轉染ZR75-1細胞或轉基因MCF7細胞以避免非特異性響應如干擾素相關通路。對照siRNA與靶序列相比含2-3個錯配。轉染24-72h后收集細胞，并通過如上所述的實時PCR和定量蛋白質印跡測定hCAP18的表達。在含SDS的樣本緩沖液中提取蛋白質，在15%的Tris-甘氨酸凝膠上進行分離，并電印跡到如上所述的硝酸纖維素膜上以進行所述蛋白印跡分析。在與1:1000稀釋的親和純化的抗LL-37抗血清進行溫育前，使用3%麗春紅S對所述濾膜進行可逆染色。如上所述，捕獲并評價由共軛結合辣根過氧化物酶的二抗IgG經(jīng)增強化學發(fā)光產(chǎn)生的信號。針對hCAP18表達轉錄的最有效抑制劑設置體內試驗。向12只小鼠注射表達轉基因hCAP18的MCF7細胞。其中一半小鼠每天接受溶解在50pl橄欖油(Sigma)中的30mg抑制劑的皮下注射。一旦形成腫瘤，按如上所述檢測腫瘤的尺寸和分布。對體內方法有效的siRNA應下調hCAP18表達至少90%。為了干擾小鼠體內腫瘤的形成，hCAP18表達的下調需要保持數(shù)星期。己經(jīng)證明每天向尾靜脈注射高劑量siRNA是可行的，但針對治療方法卻似乎不現(xiàn)實。另一個選擇是在生物體/腫瘤細胞中穩(wěn)定表達siRNA。已設計出的質粒(如pSuper，OriGenelnc)將RNA表達為發(fā)夾結構，所述發(fā)夾結構隨后在細胞內被轉化成siRNA。對于我們的最初方法，將由以上試驗確定的靶siRNA序列克隆至pSuper中，并在植入到小鼠前用此構建體轉染腫瘤細胞。目前尚未研發(fā)出腫瘤形成后遞送表達載體的治療方法，但是為了達到此目的，利用脂質體遞送質粒以及構建逆轉錄病毒和腺病毒表達載體是得到普遍研究的課題。相對于RNAi的另一種方法是"經(jīng)典的"反義方法。將與耙轉錄本互補的長度為20-3bp的單鏈寡核苷酸直接加入到細胞培養(yǎng)基中或注射到小鼠中。通常對所述寡核苷酸的骨架都進行了修飾以抑制其降解并促進其在沒有任何載體底物情況下的吸收。然而，由于抑制機制并非酶促機制，所以所述方法需要高劑量，并且骨架修飾提高了細胞毒性和非特異的副作用。在小鼠試驗中，通常的施用范圍為100-50(Hig/動物/天。1拔劍仏57雜f參J廁"已經(jīng)產(chǎn)生雞抗體，并且進行了足以進行所計劃試驗的大規(guī)模親和純化。之前已經(jīng)顯示抗LL-37的抗體能夠抑制LL-37的活性。所以不需要體外試驗。針對體內試驗，如上所述將腫瘤引入到小鼠中?？捎|及到腫瘤時每星期注射抗體兩次，最初用l-100mg/kg的抗體。隨后評估抗體對腫瘤形成的影響。參考文獻AgarwalCetal.:AGN193109isahighlyeffectiveantagonistofretinoidactioninhumanectocervicalepithelialcells.JBiolChem271:12209-12212(1996).AndelaVB,RosierRN:TheproteosomeinhibitorMGI32attenuatesretinoicacidreceptortrans-activationandenhancestrans-repressionofnuclearfactorB.Potentialrelevancetochemo-preventiveinterventionswithretinoids.MolecularCancer3:8-19(2004).FiucciQRavidD,ReichR,LiscovitchM:Caveolin-1inhibitsanchorage-independentgrowth,anoikisandinvasivenessinMCF7humanbreastcancercells.Oncogene21:2365-2375(2002).HeilbomJetal,:AntimicrobialproteinhCAP18/LL-37ishighlyexpressedinbreastcancerandisaputativegrowthfactorforepithelialcells.IntJCancer114:713-9(2005).IshizukaSetal.:(23S)-25-Dehydro-1(alpha}-hydroxyvitaminD3-26,23-lactone,avitaminDreceptorantagonistthatinhibitsosteoclastformationandboneresorptioninbonemarrowculturesfrompatientswithPaget'sdisease.Endocrinology.146:2023-2030(2005).LuC,ShenQetal.:cFosiscriticalforMCF7breastcancercellgrowth.Oncogene24:6516-6524(2005).Ludes-MeyersJHetal.:AP-1blockadeinhibitsthegrowthofnormalandmalignantbreastcells.Oncogene20:2771-2780(2001).RohHetal.:HER2/neuantisensetargetingofhumanbreastcarcinoma.Oncogene.2000Decll;19(53):6138-43.ToellAetal.:DifferentmolecularmechanismsofvitaminD3receptorantagonists.MolPharmacol59:1478-1485(2001).WangY醒hetal.:Knockdo，ofc國MycexpressionbyRNAiinhibitsMCF757breasttumourcellsgrowthinvitroandinvivo.BreastCancerRes7:R220-R228(2005).WarburtonCetal,:TreatmentofHER-2/neuoverexpressingbreastcancerxenograftmodelswithtrastuzumab(Herceptin)andgefitinib(ZD1839):drugcombinationeffectsontumourgrowth,HER-2/neuandepidermalgrowthfactorreceptorexpression,andviablehypoxiccellfraction.ClinCancerRes,10:2512-24(2004).WeberGetal.:VitaminDinducestheantimicrobialproteinhCAP18inhumanskin.JInvestDermatol.124:1080-2(2005).ZhangMetal.:SilencingtheepidermalgrowthfactorreceptorgenewithRNAimaybedevelopedasapotentialtherapyfornonsmallcelllungcancer.GenetVaccinesTher.3:5-16(2005).實施例D人抗菌肽LL-37在培養(yǎng)的人角化細胞中抑制凋亡并上調凋亡蛋白抑制劑(IAP-2)的表達介紹Cathelicidin是發(fā)現(xiàn)于多種哺乳動物物種的抗菌肽家族。它們由高度保守的氨基末端域、cathelin和可變的羧基末端域組成，所述羧基末端域通過蛋白質水解被釋放以使其獲得抗菌活性(1、2)。這個家族的唯一人源成員是18kDa人陽離子抗菌蛋白(hCAP18)，主要由中性粒細胞、多種上皮細胞和黏膜細胞(皮膚、支氣管、口腔黏膜、食道、子宮頸、陰道、附睪和唾液腺)產(chǎn)生(3-8)。C-末端37個氨基酸域(即LL-37)通過破壞膜的穩(wěn)定性(11、12)產(chǎn)生針對廣譜微生物的抗菌活性(9、10)。除了抗菌功能，所述肽還涉及其它生物活性，如在血液和上皮細胞中的趨化性和細胞因子釋放(8、13)、誘導上皮細胞增殖(14)以及血管產(chǎn)生(15)。最近的研究表明LL-37在傷口愈合的過程中高表達，影響人角化細胞的體外增殖并參與傷口的上皮再生(16、17)。材料和方法-微薦養(yǎng)從CascadeBiologies(CascadeBiologies,Eugene,OR)獲取包皮表皮細胞并在37。C和5°/。C02的條件下，培養(yǎng)于EpilifebasalMedium(CascadeBiologies,.)中，所述培養(yǎng)基補充有0.06mM鈣、0.2%v/vBPE、5pg/ml牛胰島素、0.18]ig/ml氫化可的松、5pg/ml牛運鐵蛋白、0.2ng/ml人表皮生長因子、100U/ml青霉素G、100ng/ml鏈霉素硫酸鹽和0.25pg/ml兩性霉素B(均來自CascadeBiologies)。利用0.025%(w/v)的胰酶和0.01%(w/v)EDTA(CascadeBiologies)每周對細胞進行傳代。HaCaT角化細胞培養(yǎng)在補充有10%胎牛血清(hyClone，BouleNordicABHuddinge,Sweden)、2mM谷氨酸、青霉素(50U/LGibco-BRL)和f連霉素(50mg/ml,Gibco-BRL)的DMEM(Dulbecco，smodifiedEagle's培養(yǎng)基；Gibco-BRLTechnology,Paisley,UK)中。潘應艦以25,000細胞/孔鋪至6孔板培養(yǎng)皿中。鋪板48h后，使用0、0.23、0.46、0.69、0.9、1.15、2.3、4.6和11.5的LL-37處理細胞，LL-37的序列如下NH2-LeuLeuGlyAspPhePheArgLysSerLysGluLyslieGlyLysGluPheLysArglieValGinArglieLysAspPheLeuArgAsnLeuValProArgThrGluSer國COOH.[SEQIDNO.5]每一次處理作三份。將所述肽稀釋在培養(yǎng)基(HaCaT細胞為含5。/c)FCS的DMEM;HEKn細胞為含0.1%FCS的EpilifebasalMedium)中。總共處理細胞24h。LL-37刺激之后，向細胞中加入含拓撲異構酶I抑制劑喜樹堿(CAM)(SigmaChemicalCo.，St.Luis,MO)的二甲基亞砜溶液至終濃度為6pM。在分析前進一步溫育細胞24h。淑魔微財微源亡通過流式細胞術評價兩個凋亡參數(shù)膜完整性的丟失和DNA的下降。^^^^:^"絲伊份在用LL-37刺激并用CAM處理后，通過胰酶消化收集細胞。隨后在冷Dulbecco's磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中洗滌細胞并用血細胞計數(shù)器(HausserScientific,Horsham,PA)計數(shù)。用PBS將細胞密度調整至lxl()6細胞/ml。通過用碘化丙啶和YO-PRO-1染料(MolecularProbes,Eugene,59OR)染色檢測凋亡。在FACScan(Beckton-Dickinson，SanJose，CA)上分析被染色的細胞。確定設門細胞以根據(jù)前向光散射(FSC)和側向光散射(SSC)特征分析細胞。利用CellQuest軟件(BectonDickinson)對具有YO-PRO和碘化丙啶(PI)的細胞進行分析，所述軟件提供YO-PRO和PI陽性細胞的百分數(shù)。認為被YO-PRO染成綠色的細胞為凋亡細胞，同時還被碘化丙啶染成紅的細胞為壞死細胞?；畹拇婊罴毎麕缀醪晃栈蛲耆晃杖玖稀^i^^5t^^^e分界"A^#畫針對這個分析使用PI/RNase染色緩沖液(BectonDickinson)。將胰酶消化的細胞固定在70%(V/V)冷乙醇中，并在4°C下保存直至使用。通過將PI摻入到DNA中測定DNA含量。利用FACScan流式細胞儀(BectonandDickinson,MountainView,CA，USA)進行熒光分析。同時測定顆粒的FSC(前向光散射)和SSC(側向光散射)以確定細胞的尺寸和粒度。在FL-4窗口中(600nm帶通濾波器和35nm帶寬)檢測對核PI染色的紅色熒光。熒光強度與細胞DNA含量成正比。將每個柱狀圖分成兩部分(1)代表不同步的、非凋亡活細胞的M1區(qū)(DNA含量等于2N至4N的G1、S和G2期細胞)；以及(2)代表與活細胞相比其DNA量較少的凋亡細胞的M2區(qū)。如前所述利用熒光底物VDVAD-AMC(100pM)和DEVD-AMC(50pM)評估Caspase-3的酶活性。簡而言之，將細胞裂解物合并在反應緩沖液(100mMHEPES、10%蔗糖、5mM二硫蘇糖醇(DTT)、10-6%NP-40和0.1%CHAPS，pH7.25)中并加至微孔板中。在FluoroscanII讀板儀(Labsystems,Stockholm,Sweden)中通過AMC釋放監(jiān)測熒光底物的裂解。利用游離AMC產(chǎn)生的標準曲線將熒光單位轉化為pmolAMC。通過線性回歸分析數(shù)據(jù)并表示為每分鐘的pmolAM釋放。及n及在不同處理后根據(jù)生產(chǎn)商的說明利用QuiagenRNasy試劑盒(OperonBiotechnologies,Cologne,Germany)從細胞中提取RNA。用第一鏈合成試劑盒(AmershanBiosciences)進行反轉錄。結果仏37鄉(xiāng)C4M顆麟亡腳劍我們檢測了LL-37對CAM誘導的細胞死亡和凋亡的影響，其中CAM是一種被廣泛地用作凋亡誘導試劑的藥物。處理之后，利用兩種方法通過流式細胞術分析膜的完整性和DNA的片段化。第一種方法是雙染色系統(tǒng)，通過該系統(tǒng)我們可以辨別細胞膜滲透性的增加;分析未處理細胞的染色強度(圖7)并將其分成三種類型存活的未染色細胞，凋亡的YO-PRO染色細胞和被YO-PRO和PI同時染色的壞死細胞。在第二種方法中，通過PI分析用乙醇進行滲透處理的細胞的DNA含量。已知凋亡細胞由于片段化其DNA的量較少。為了選擇誘導HaCaT和HEKn細胞凋亡的劑量和時間，之前先進行濃度和時間點試驗(數(shù)據(jù)未顯示)。當持續(xù)24小時接觸6nMCAM時，HaCaT和角化細胞都顯示具有凋亡特征的形態(tài)改變，例如膜完整性和DNA譜的改變(圖7)。當單獨用LL-37或同時用LL-37和CAM處理細胞24h時，沒有觀察到凋亡細胞數(shù)量的改變(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，高濃度的LL-37(4.6pM和11.5^M)具有細胞毒性，導致壞死細胞比例增加而凋亡細胞比例未增加。與所述同時處理相比，CAM誘導凋亡前使細胞持續(xù)24小時接觸LL-37，兩者的結果是不同的。在0.23)iM至高達2.3的濃度時，LL-37同時抑制HEKn和HaCaT細胞中DNA片段化和膜滲透性的損失(圖7和圖8)。同時在這些條件下，較高濃度LL-37(4.6nM和11.5pM)引起細胞死亡。即使在毒性濃度時凋亡細胞比例依然較低，這表明由LL-37引起的細胞死亡是通過非凋亡機制發(fā)生的。'鼓fl。r浙巡ii:"潘應中,劍C4M對C邵驗3游遂孕由于Caspase-3是凋亡通路的重要蛋白質之一并且是凋亡的早期指示物，我們決定在經(jīng)LL-37處理或未經(jīng)LL-37處理的角化細胞中檢測Caspase-3的活性。角化細胞中，在CAM處理的最初12個小時內Caspase的活性顯著增加并在24小時達到頂峰。2.3pMLL-37的預處理降低了由喜樹堿誘導的caspase的激活(圖9a和圖9b)。這些數(shù)據(jù)提示LL-37在人角化細胞中通過降低caspase活性來抑制凋亡。iZ-37在乂^眾潘應^遂導"戶-2游表這凋亡蛋白抑制劑(IAP)的成員被認為是重要的凋亡調控子。這個家族具有抑制caspase-3活性的能力。已經(jīng)將豬cathelicidin成員PR39的抗凋亡功能與IAP-2表達的誘導聯(lián)系起來。因此我們通過RT-PCR分析經(jīng)不同濃度LL-37處理的角化細胞在不同時間點IAP-2的表達。2.3pMLL-37的剌激提高了剌激后6小時至12小時的IAP-2mRNA(圖10)。濃度低于2.3|iM的LL-37不影響c-IAP-2的水平(數(shù)據(jù)未顯示)。麟辦飾應Jr滯09X-2由于在上皮細胞中COX-2的抑制降低了IAP-2的表達，之前的研究已經(jīng)將COX-2鑒定為IAP-2表達調控子。因此我們分析了用2.3pMLL37處理的HEKn細胞中COX-2的表達。發(fā)現(xiàn)mRNA水平是時間依賴性提高的(圖11)，并且明顯地在12小時后達到最高水平。為了檢測在LL-37剌激后COX-2是否介導IAP表達的提高，用25nM特異性COX-2抑制劑SC-791預處理HEKn細胞12h，隨后用2pMLL-37剌激。在這些條件下，LL-37處理沒有像之前觀察到的那樣提高IAP-2mRNA水平(圖12)。這些數(shù)據(jù)提示LL-37通過提高COX-2酶的表達來提高IAP-2的水平。討論已經(jīng)報道在皮膚損傷后，抗菌肽LL-37的表達提高。所述肽不僅通過抑制感染，還通過積極參與不同的傷口愈合相關的過程(例如趨化性、遷移、血管形成和上皮再生)而使其表達與傷口愈合的促進相關聯(lián)。本發(fā)明的數(shù)據(jù)顯示LL-37還通過對凋亡的抑制作用參與促進角化細胞的細胞存活?？s寫hCAP18/LL-37，人cathelicidin抗菌肽18kDa/LL-37;IAP-2，凋亡蛋白-2抑制劑；COX-2，環(huán)氧合酶-2;VDVAD-AMC，caspase3底物；HEKn，人新生表皮角化細胞；DMEM，Dulbecco'sModifiedEagle's培養(yǎng)基；PBS，磷酸鹽緩沖溶液。DEVDase,天冬氨酸-谷氨酸-纈氨酸-天冬氨酸蛋白酶活性；CHAPS，3-[(3-膽酰氨基丙基)二甲氨蜀-l-丙磺酸；CAM:喜樹堿。參考文獻1.Zanetti,M.,Ge皿aro,R.,andRomeo,D.(1995)i^^S丄e"374(1),l匪52.Sorensen,O.E.，F(xiàn)ollin,P.,Johnsen,A.H.,Calafat,J.，Tjabringa,GS.,Hiemstra，P.S.,andBorregaard,N.(2001)97(12),3951-39593.Sorensen,O.，Arnljots，K.,Cowland,J.B.,Bainton,D.F.,andBorregaard，N.(1997)說ood90(7)，2796-28034.Bals，R.，Wang,X.，Zasloff,M.，andWilson,J,M.(1998)脂"oj^C/S」95(16)，9541-95465.Frohm,M.,Agerberth,B.,Ahangari,G"Stahle畫Backdahl，M.,Liden,S.,Wigzell,H.，andGudmundsson,GH.(1997)J歷o/Ozern272(24)，15258-152636.Agerberth,B.,Gunne,H.,Odeberg,J.,Kogner,P,，Boman，H.G.，andGudmundsson,G.H.(1995)iVoc淑/A^5WC/S爿92(1),195-1997.FrohmNilsson,M.,Sandstedt，B.，Sorensen，O.，Weber,G"Borregaard,N.,andStahle-Backdahl,M.(1999)/"/ec〃附mw"67(5),2561-25668.De,Y"Chen,Q"Schmidt,A.P"Anderson,G.M.，Wang，J.M.,Wooters,J"Oppenheim，J.J.，andChertov,O.(2000)192(7)，1069-10749.Zasloff,M.(2002)7Va&w415(6870),389-39510.Dorschner,R.A.,Pestonjamasp，V.K.,Tamakuwala，S.,Ohtake,T"Rudisill,J"Nizet,V"Agerberth,B.，Gudmundsson,G.H.,andGallo,R.L.(2001)//m^WDwmato/117(1)，91-9711.Oren，Z.，Lerman，J.C"Gudmundsson,G.H.,Agerberth,B.，andShai,Y.(1999)歷0c/7emJ341(Pt3),501-51312.Ramanathan,B.,Davis,E.G"Ross，C.R.,andBlecha，F(xiàn).(2002)M/craZ^/"/e"4(3)，361-37213.Braff，M.H.,Hawkins,M.A.，DiNardo,A.，Lopez-Garcia,B.，Howell,M.D.,Wong,C.,Lin，K.，Streib，J.E.,Dorschner，R.,Leung,D.Y"andGallo,R.L.(2005)J/附mw"o/174(7),4271-427814.Shaykhiev,R.,Beisswenger,C.,Kandler,K.,Senske，J.，Puchner,A.，Damm，T.,Behr，J.，andBals,R.(2005)爿w/戶/yw'o/Ce//Afo/尸/yw'o/289(5)，L842-L84815.Koczulla，R.，vonDegenfeld,G.,Kupatt,C.，Krotz,R,Zahler，S.,Gloe，T"Issbrucker,K.，Unterberger,R，Zaiou，M.，Lebherz，C.,Karl，A.,Raake,P"Pfosser，A.,Boekstegers，P"Welsch，U.,Hiemstra,P.S.,Vogelmeier，C.，Gallo,R.L.,Clauss,M.，andBals,R.(2003)JC//"/"veW111(11),1665-167216.Heilborn,J.D.,Nilsson,M.R,Jimenez,C.L,Sandstedt，B.,Borregaard,N.，Tham，E.，Sorensen,O.E.，Weber,G"andStaWe,M.(2005)/"〃114(5),713-71917.Heilborn，J.D.,Nilsson,M.R,Kratz,G"Weber,G.，Sorensen,O.,Borregaard,N.，andStahle-Backdahl，M.(2003)//騰WD簡加/120(3),379-389實施例E:共溫育LL-37與Heregulin對EFG受體活性的影響材料與方法微儲歪頗微分叛ERBB2、STAT3、p42/p44MAPK(=ERKl/2)，方法概述在所述研究的全過程中使用低級別惡性乳腺癌系ZR75-1(從ATCC獲取)。ZR75-1以低水平表達hCAP18和ERBB2。處理所有試驗都一式作三份。在添加10%FCS的Optimem中培養(yǎng)細胞，并以50%的匯合鋪在12孔板中。在重新貼壁后，細胞在沒有FCS的DMEM中饑餓48小時。針對誘導試驗，向培養(yǎng)基中加入預熱的溶解在PBS中的底物，并且將細胞溫育20min。LL-37的終濃度為10ng/ml，Heregulin為2ng/ml或20ng/ml。室內合成LL-37。從Upstate,LakePlacid,NY獲取重組的Heregulin-J3(EGF域，ac178-241)。用含磷酸酶抑制劑(1mMNaF+1mMNa3V04)和作為蛋白酶抑制劑的2mMPMSF的冰冷PBS洗滌細胞，并用含以上抑制劑的200piSDS樣本緩沖液裂解細胞。樣本勻漿并在8(TC變性，隨后將50pl樣本上樣至7.5%SDS-PAGE凝膠上，分離并通過標準程序印跡在硝酸纖維素膜上。在TBS(0.1%吐溫20，4%NFDM)中封閉后，將所述膜與一抗在4。C溫育過夜。所使用的抗體-pERBB2:1248位磷酸化酪氮酸，兔源，Upstate(catno.06-229)，以1:2000的比例使用，可以再次使用。pMAPKl/2(202位磷酸化蘇氨酸/204位磷酸化酪氨酸)，CellSignallingInc.在洗滌并用HRP偶聯(lián)的二抗溫育2h后，所述膜用ECL(Amersham)顯色。用CCD相機通過定量程序(Fujifilm，Tokyo)的方式測定信號。相對于麗春紅染色對化學發(fā)光信號進行標準化。在一個試驗中，以從20nM至2.5nM逐漸增加的濃度加入酪氨酸激酶抑制齊ljPD153035(MerckBiosciences)。結果圖13中顯示LL-37和Heregulin聯(lián)合處理的效果。圖14顯示了定量數(shù)據(jù)。圖13顯示在用LL-37、Heregulin或其組合處理后，ZR75-l細胞中ERBB2和MAPK的激活。通過蛋白質印跡分析細胞提取物中的磷酸化ERBB2和MAPK。用CCD相機捕獲信號并在相對于麗春紅染色標準化后進行定量。圖14顯示三份實驗的結果，表明LL-37和Heregulin在所述激活方面相互協(xié)助。發(fā)現(xiàn)ERBB2的磷酸化被酪氨酸激酶抑制劑PD153035抑制，表明MAPK在信號傳導中有作用。實施例F:LL-37在體外對乳腺癌細胞轉移的影響材料和方法豐餘定生長試驗這個試驗反映細胞形成轉移瘤的能力。通過用300u/ml胰酶、20u/ml彈性蛋白酶和lmMEDTA的混合物的處理來制備細胞。彈性蛋白酶的存在促使細胞脫離成單細胞懸液。在70°C水浴中將1.4%SeaPlaque瓊脂糖融解于Optimem(無添加物)，冷卻至42°C并以1:1的比例與含濃度為兩倍終濃度的FCS和添加物的預熱培養(yǎng)基混合。向帶格子的4cm皮替氏皿中倒入4ml所述混合作為底層瓊脂并使其凝固。使胰酶消化的細胞穿過細胞濾網(wǎng)并以1000細胞/ml的終濃度懸浮在培養(yǎng)基(含雙倍濃度的添加物)中。將所述細胞懸液加熱至37。C并以1:l的比例與如上制備的0.7%瓊脂糖溶液混合。放入2ml所述混合物作為所述底層瓊脂的上層，并在室溫保持30min使所述上層凝固。將所述平板放入培養(yǎng)箱中并每隔3-4天通過加入lO(Hil生長培養(yǎng)基飼養(yǎng)細胞。兩星期后培養(yǎng)物的上層用0.2%對碘硝基四唑紫(Sigma)染色，并計數(shù)直徑大于100jiM的群落。試驗一式作三份，并重復進行兩次。添加物FCS:1-8%Fungizone(兩性霉素B):0.5(ig/ml潮霉素B(使用轉基因MCF7細胞系時)150嗎/ml青霉素G/鏈霉素(使用ZR75-1細胞系時)1%儲備溶液(Invitrogen)LL-37:10(ig/mlHeregulin(重組蛋白Upstate):2ng/mlFiucci等，2002,(9"coge"e21:2365-2375中也闡述了檢測非錨定生長的方法。結果結果在圖16中顯示。通過檢測LL-37對軟瓊脂中乳腺癌細胞系ZR75-1群落形成的影響研究LL-37對體外腫瘤形成的作用。所述作用受到存在的其它因素(例如FCS和Heregulin)的密切調節(jié)。圖16a顯示2%FCS時對群落數(shù)的影響。不存在Heregulin時，所使用的LL-37顯著降低群落數(shù)。在Heregulin存在的情況下，LL-37的負作用被完全消除，這表明需要它們的功能協(xié)助。LL-37和Heregulin顯著影響軟瓊脂群落的外觀。圖16b顯示軟瓊脂群落的代表性實例，所述群落在培養(yǎng)14天并進行活細胞染色后獲取。單獨接觸LL-37導致較弱的群落染色和較不緊密的外觀，表明群落密度驟減。不同的是，在母克隆(metemalclone)周圍出現(xiàn)單個細胞的暈環(huán)。單獨的Heregulin產(chǎn)生極小影響。當Heregulin和LL-37合并時，母群落(metemalcolony)以和未處理群落相似的方式被染色。然而，LL-37誘導的單細胞暈環(huán)仍得到保持。單個細胞從健康母克隆的脫離類似于/模仿了來自腫瘤的轉移細胞的產(chǎn)生?？傊?，LL-37似乎對原發(fā)腫瘤的生長不起作用但是決定性地刺激原發(fā)腫瘤產(chǎn)生轉移瘤的潛能。因此LL-37的抑制劑應降低乳腺癌中轉移瘤的產(chǎn)生。乳腺癌死亡的原因通常是轉移瘤而非原發(fā)腫瘤。實施例G:LL-37對體內乳腺癌轉移的影響材料和方法/2C4尸/S,MCF7敏鄉(xiāng)柳縫厲教細胞系MJ1117[由MEgeblad惠贈，參見/"f/Ca"cw86,617-625(2000)]是MCF7的衍生細胞，其由附加型表達載體表達ERBB2。MJ1005是相應的具有空對照載體的對照細胞系。所述細胞系在含5-10Q/oFCS和150fig/ml潮霉素B的Optimem中培養(yǎng)。將來自Imageclone305793119的Bfal片段亞克隆至雙順反子載體pIRES2畫EGFP(BDBiosciences,Bedford,MA)的Smal位點中以構建hCAP18的表達載體(參見圖17)，其中所述Bfal片段包含具有16bp的5'非翻譯區(qū)的完整編碼序列。在標準條件下利用Fugene(RocheDiagnostics,Indianapolis,IN)轉染所述細胞系，并用400ng/mlG418(Invitrogen,Paisley,UK)選擇培養(yǎng)兩周。根據(jù)EGFP的表達，用MoFlo㊣高速細胞分選流式細胞儀(DakoCytomation，F(xiàn)ortCollins,CO)使用SummitTM數(shù)據(jù)分析軟件分選細胞，通過免疫印跡定量所述細胞的CAP18表達。同樣通過轉染僅表達EGFP的載體建立對照細胞系。在數(shù)月沒有任何選擇的連續(xù)培養(yǎng)過程中，所述細胞系保持了穩(wěn)定的CAP18表達。EGFP和hCAP18的同時表達不僅促進細胞選擇和保持，還允許在小鼠試驗過程中檢測血液和組織中的單個轉移細胞。67sc/d//v賞砟游,瘦,成,秀在含10%FCS、150ng/ml潮霉素和400|ig/mlG418的Optimem中培養(yǎng)所述細胞。在以50%的匯合收集細胞2411之前除去抗生素。細胞用胰酶消化并以50,000,000細胞/ml懸浮在含lmMMgCl2的PBS中。向小鼠皮下注射io，ooo,ooo個細胞(200m1)。由于mcf7細胞需要j3-雌激素以形成腫瘤，在感染前向小鼠植入存儲型藥丸(1.7mg/天)。每天觀察小鼠，并每星期觸診2次以了解腫瘤形成。在注射1星期后已經(jīng)可以在注射位點觀察到可觸的浸潤，但是持續(xù)生長的腫瘤在約40天后才明顯。當腫瘤尺寸達到約lcn^時處死小鼠。切除或速凍所有腫瘤，包括注射位點的腫瘤或小鼠體內擴散的腫瘤。此外，將脾和肝進行勻漿，并在0.17。/。NH4C1裂解紅細胞并離心除去碎片后，通過FACS分析EGFP表達細胞的存在。結果結果在圖18中顯示。圖18a顯示SCID小鼠中由對照細胞系MJ1005IRES形成的腫瘤的實例，其中MJ1005IRES是MCF7的衍生細胞。目前尚未在對照小鼠的肝或脾中檢測到次生腫瘤或轉移細胞。圖18b顯示hCAP18在同一細胞系的轉基因表達的效果。與對照細胞系相比，原發(fā)腫瘤的生長并不更強勁。然而，次生腫瘤在多個位置都有發(fā)生，例如與原發(fā)腫瘤相鄰的淋巴結和相對的側面中，以及腹部大部分(abdominalmasse)。腹水液體(圖18c)含大量表達綠色熒光蛋白的細胞，其中所述綠色熒光蛋白與hCAP18轉基因同時產(chǎn)生。在產(chǎn)生hCAP18的細胞系感染的SCID小鼠中，四分之三的所述小鼠具有轉移腫瘤或轉移細胞向脾或肝的擴散。根據(jù)這些觀察，我們得出結論LL-37導致原發(fā)腫瘤產(chǎn)生轉移細胞。因此，LL-37的抑制劑將抑制癌細胞向其它位置的擴散。實施例H:通過siRNA在腫瘤和乳腺癌細胞中抑制hCAP18/LL-371.通過siRNA在腫瘤中抑制hCAP18/LL-37蛋白質的表達在處理MCF7-hCAP18轉基因細胞48小時后，觀察到由hCAP18mRNA特異性小干擾RNA(siRNA)引起的強劑量依賴性抑制，而非hCAP18/LL-37蛋白質的過量表達(參見實施例G中材料與方法"hCAP18在MCF7衍生細胞中的轉基因表達"一節(jié))。經(jīng)HPLC純化、雙鏈和即用型陰性對照siRNA和四個hCAP18/LL-37特異性siRNA購自(Ambion,Austin,USA)，包括用于優(yōu)化轉染效率和重復能力的siPORTNeoFX轉染試劑。siRNA名稱編號正義序列(5->3')反義序列(5->3')siRNA-CAMPl14402GGUCCUCAqCUACAAGGAAttUUCCUUGUAGCUGAGGACCtgsiRNA-CAMP2146365GGACAGAGUCCUAGUGUGUttACACACUAGGACUCUGUCCtgsiRNA-CAMP3146364CCAGAGGAUUGUGACUUCAttUGAAGUCACAAUCCUCUGGtgsiRNA-CAMP414586GGAUAACAAGAGAUUUGCCttGGCAAAUCUCUUGUUAUCCtt將所有四個siRNA-CAMP匯集作為混合物以將非特異性作用減至最小，并對所述陰性siRNA對照進行類似的操作。在與siPORT轉染試劑配套的詳細方案中提供了用于優(yōu)化轉染的說明書。所有試驗過程均根據(jù)生產(chǎn)商的闡述進行。SiRNA的終濃度為10nM、25nM或100nM。針對hCAP18/LL-37蛋白質，如實施例C的材料和方法中的闡述，在蛋白質印跡中利用1/2000稀釋的抗hCAP18抗體分析經(jīng)處理的乳腺癌細胞的細胞提取物。通過CCD相機(Fujifilm，Tokyo,Japan)捕獲增強的化學發(fā)光(ECL)信號(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)，并在相對于麗春紅染色標準化后進行定量。結果在圖19中顯示。2.人抗菌肽hCAP18/LL-37在乳腺癌中誘導的轉移表型可被hCAP18特異性siRNA逆轉結果在圖20中顯示。(A)/2，就丄-37絲蘑微應柳過量教微微應存微更庸游超進行Matrigel侵襲試驗以評價與不表達hCAP18/LL-37的MCF7-IRES轉基因對照細胞相比，過表達hCAP18/LL-37蛋白質的MCF7-hCAP18轉基因69細胞的轉移潛能(參見實施例G中材料與方法"hCAP18在MCF7衍生細胞中的轉基因表達"一節(jié))。完全根據(jù)生產(chǎn)商的說明書使用BioCoatMatrigelInvasionChamber試劑盒(BectonDickinsonBioscience,Bedford,MA，USA)。在將細胞轉移至Matrigel濾膜前，細胞在沒有FCS的DMEM(Gibco-BRL)中饑餓24h。在使用當天，使用0.25%Tryp-EDTA(Invitrogen，cat#25200-056)胰酶消化細胞并通過加入50|il胰酶抑制劑和lOOplDMEM終止胰酶消化。將200^1220,000個細胞/ml的細胞懸液接種至具有Matrigel包被濾膜的transwell插入小室中，并放置在裝有750[il包含5。/。FCS的DMEM的下室中。小室在37°C、5°/。(:02氣氛下溫育48h。隨后，移去插入小室并除去保留在濾膜上方的非侵襲癌細胞。將已經(jīng)侵襲至濾膜下方的細胞染色，在相差顯微鏡下觀察并計數(shù)。癌細胞的侵襲能力用已經(jīng)侵襲至濾膜下方的平均細胞數(shù)量表示。所述試驗一式作三份。"Jifi^厲/zC4戶7S/LU7錄#絲wTA^,^蘑蘑潘應^漸^/磁/zC4尸皿丄-37遂微虔激存參超為了證明其通過減少腫瘤內表達的hCAP18/LL-37而抑制癌細胞轉移潛能的能力，使用了RNA干擾。將全部四個siRNA-CAMP—起作為10nM的混合物使用以將非特異性作用減至最小，并對所述陰性siRNA對照進行同樣操作以進行RNA干擾。在進行如(A)所述的Matrigel侵襲試驗前40h進行siRNA處理(參見圖19)。由siRNA引起的RNA干擾通過減少侵襲性腫瘤細胞的數(shù)量顯示明顯抑制癌細胞轉移潛能的能力。(詳情也可見實施例C，"轉錄后抑制研究和侵襲誘導"一節(jié))實施例I:本發(fā)明試劑生產(chǎn)和體內應用貧/C4尸/5/ZZ-37拔銀必表這在NSO骨髓瘤細胞中表達抗hCAP18/LL-37抗體。簡要而言，通過電轉染編碼融合蛋白的組成性輕鏈和重鏈的表達載體共轉染NSO骨髓瘤細胞。隨后通過ELISA試驗選擇并篩選產(chǎn)生抗體的轉染骨髓瘤細胞。鵬微秀將抗體配成無菌的注射水溶液。隨后通過90分鐘的靜脈(IV)輸注將制劑施予患乳腺癌的患者。根據(jù)每個患者的個體需求選擇劑量，所述劑量由從醫(yī)人員確定。然而，通常使用4mg/kg的初始劑量隨后每周保持2mg/kg的劑量。麗疾微屋隨后通過常規(guī)的掃描/NMR監(jiān)測抗體治療對乳腺癌發(fā)展尤其是癌細胞轉移的影響。權利要求1.一種抑制癌細胞轉移的試劑，其中所述試劑抑制hCAP18/LL-37的生物活性。2.如權利要求l所述的試劑，其中所述試劑通過改變hCAP18/LL-37的轉錄、翻譯、剪切和/或結合特性抑制hCAP18/LL-37的生物活性。3.如權利要求1或2所述的試劑，其中所述試劑是hCAP18/LL-37轉錄的抑制劑。4.如權利要求1或2所述的試劑，其中所述試劑是hCAP18/LL-37翻譯的抑制劑。5.如權利要求1或2所述的試劑，其中所述試劑是hCAP18/LL-37結合特性的抑制劑。6.如權利要求l所述的試劑，其中所述試劑是hCAP18/LL-37受體拮抗劑。7.如權利要求6所述的試劑，其中所述hCAP18/LL-37受體是FPR家族中的成員。8.如前述任一項權利要求所述的試劑，其中所述試劑能夠選擇性地抑制癌細胞內的hCAP18/LL-37的生物活性。9.如前述任一項權利要求所述的試劑，其中與不接觸所述試劑的癌細胞內的hCAP18/LL-37的生物活性相比，所述試劑能夠抑制hCAP18/LL-37的生物活性50%或更多。10.如前述任一項權利要求所述的試劑，其中所述試劑選自以下組成的組小干擾RNA(siRNA)分子、反義寡核苷酸和對hCAP18/LL-37具有結合親和力的化合物和小的抑制劑化合物。11.如前述任一項權利要求所述的試劑，其中所述試劑是小干擾RNA(siRNA)分子。12.如權利要求11所述的試劑，其中所述siRNA分子包含SEQIDNO:1所示核苷酸的片段或其變體。13.如權利要求11或12所述的試劑，其中所述siRNA分子的長度為19至23個核苷酸。14.如權利要求1至10的任一項所述的試劑，其中所述試劑為反義寡核苷酸。15.如權利要求14所述的試劑，其中所述反義寡核苷酸包含SEQIDNO:1所示核苷酸的片段或其變體。16.如權利要求14或15所述的試劑，其中所述反義寡核苷酸的長度為15至35個核苷酸。17.如權利要求1至10中任一項所述的試劑，其中所述試劑為對hCAP18/LL-37具有結合親和力的化合物。18.如權利要求1至10中任一項所述的試劑，其中所述試劑為小的抑制劑化合物。19.如權利要求17所述的試劑，其中所述化合物為多肽。20.如權利要求19所述的試劑，其中所述多肽為抗體或其抗原結合片段。21.如權利要求20所述的試劑，其中所述抗體或其抗原結合片段選自以下組成的組Fv片段、Fab樣片段、單個可變域和域抗體。22.如權利要求20或21所述的試劑，其中所述抗體或其抗原結合片段為人源化的。23.如權利要求17所述的試劑，其中所述化合物對hCAP18/LL-37具有配體結合能力。24.如前述任一項權利要求所述的試劑，其中所述試劑能夠選擇性地遞送至癌細胞或被癌細胞選擇性地激活。25.如權利要求24所述的試劑，其中所述試劑包含耙細胞特異性部分。26.如權利要求25所述的試劑，其中所述靶細胞特異性部分為抗體或其抗原結合部分。27.如權利要求26所述的試劑，其中所述抗體或其抗原結合片段為人源化的。28.如權利要求26或27所述的試劑，其中所述抗體或其抗原結合片段對在癌細胞表面表達的抗原具有特異性。29.如權利要求28所述的試劑，其中所述在癌細胞表面表達的抗原選自以下組成的組C46、85A12、H17E2、NR-LU-IO、HMFG1、SM-3(IgGl)、W14、L6(IgG2a)、1F5(IgG2a)、甲胎蛋白、Ca-125、前列腺特異性抗原和表皮生長因子受體家族的成員。30.如權利要求24所述的試劑，其中所述試劑是被癌細胞選擇性激活的前藥。31.如前述任一項權利要求所述的試劑，其中所述癌細胞為上皮細胞。32.如前述任一項權利要求所述的試劑，其中所述癌細胞為鱗狀細胞。33.如前述任一項權利要求所述的試劑，其中所述癌細胞選自以下癌細胞組成的組乳腺癌細胞、膽管癌細胞、腦癌細胞、結腸癌細胞、胃癌細胞、生殖器官癌細胞、肺和氣管癌細胞、皮膚癌細胞、膽囊癌細胞、肝癌細胞、鼻咽癌細胞、神經(jīng)細胞癌細胞、腎癌細胞、前列腺癌細胞、淋巴腺癌細胞和胃腸道癌細胞。34.如權利要求33所述的試劑，其中所述癌細胞為乳腺癌細胞。35.如權利要求34所述的試劑，其中所述乳腺癌細胞為ElstonIII級細胞。36.如前述任一項權利要求所述的試劑，其中所述乳腺癌細胞為轉移性的。37.—種藥物組合物，其包含如權利要求1至36中任一項所述的試劑和藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。38.如權利要求37所述的藥物組合物，其適合腸胃外施藥。39.如權利要求37或38所述的藥物組合物，其中所述制劑能夠向癌細胞靶向遞送所述試劑。40.—種抑制患者體內癌細胞轉移的方法，所述方法包括向所述患者施予如權利要求1至36中任一項所述的試劑或如權利要求37至39的任一項所述的藥物制劑。41.如權利要求40所述的方法，其中所述患者為人。42.如權利要求40或41所述的方法，其中所述試劑選擇性地遞送至癌細胞或被癌細胞選擇性地激活。43.如權利要求1至36中任一項所述的試劑，其用于醫(yī)藥中。44.如權利要求43所述的試劑，其用于癌癥的治療中。45.權利要求1至36中任一項所述的試劑在制備用于抑制癌細胞轉移的藥物中的應用。46.如權利要求40至42中任一項所述的方法或如權利要求45所述的應用，其中所述癌細胞為上皮細胞。47.如權利要求40至42中任一項所述的方法或如權利要求45所述的應用，其中所述癌細胞為鱗狀細胞。48.如權利要求40至42中任一項所述的方法或如權利要求45所述的應用，其中所述癌細胞選自以下癌細胞組成的組乳腺癌細胞、膽管癌細胞、腦癌細胞、結腸癌細胞、胃癌細胞、生殖器官癌細胞、肺和氣管癌細胞、皮膚癌細胞、膽囊癌細胞、肝癌細胞、鼻咽癌細胞、神經(jīng)細胞癌細胞、腎癌細胞、前列腺癌細胞、淋巴腺癌細胞和胃腸道癌細胞。49.如權利要求48所述的方法或應用，其中所述癌細胞為乳腺癌細胞。50.如權利要求49所述的方法或應用，其中所述乳腺癌細胞為ElstonIII級細胞。51.如權利要求49或50所述的方法或應用，其中所述乳腺癌細胞為轉移性的。全文摘要本發(fā)明提供了用于抑制癌細胞轉移的試劑，其中所述試劑抑制hCAP18/LL-37的生物活性。在優(yōu)選實施方案中，所述試劑改變hCAP18/LL-37的轉錄、翻譯和/或結合特性。優(yōu)選地，所述試劑選自于小干擾RNA(siRNA)分子、反義寡核苷酸和對hCAP18/LL-37或其受體具有結合親和力的化合物。本發(fā)明還提供了抑制患者體內癌細胞轉移的方法，以及診斷癌癥的方法和試劑盒。文檔編號C12N15/113GK101479385SQ200780023565公開日2009年7月8日申請日期2007年5月4日優(yōu)先權日2006年5月4日發(fā)明者京特·韋博,莫娜·斯塔勒申請人:利波佩普蒂德有限公司