本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及SP肽或其衍生物在制備預(yù)防或治療哮喘的藥物中的應(yīng)用，尤其涉及該SP肽或其衍生物在制備預(yù)防或治療過(guò)敏性哮喘的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
哮喘是一種常見呼吸系統(tǒng)疾病，其發(fā)病機(jī)制包括：變態(tài)反應(yīng)、氣道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性、氣道神經(jīng)調(diào)節(jié)失常、遺傳機(jī)制、呼吸道病毒感染、神經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和氣道重構(gòu)及其相互作用等，主要表現(xiàn)為發(fā)作性的喘息、氣急、胸悶或咳嗽等癥狀，或原有癥狀急劇加重，常有呼吸困難，以呼氣流量降低為其特征，常因接觸變應(yīng)原、刺激物或呼吸道感染誘發(fā)。其程度輕重不一，病情加重，可在數(shù)小時(shí)或數(shù)天內(nèi)出現(xiàn)，偶爾可在數(shù)分鐘內(nèi)即危及生命。近年來(lái)，由各種過(guò)敏原(例如：花粉、粉塵、塵螨等)誘發(fā)的過(guò)敏性哮喘越來(lái)越引起人們的關(guān)注，所以針對(duì)哮喘的有效藥物的研究也成為本領(lǐng)域的主要研究課題之一。本發(fā)明人在中國(guó)專利CN1194986C和CN1216075C中披露了一種7P肽或其衍生物(簡(jiǎn)稱7P肽或其衍生物，本發(fā)明中名稱為SP肽或其衍生物)，是一種最初根據(jù)丙型肝炎病毒而設(shè)計(jì)的免疫原性肽，并證明所述7P肽或其衍生物具有誘導(dǎo)細(xì)胞因子r-IFN，IL-4，IL-10水平升高和抗體產(chǎn)生的功能，r-IFN是Th1分泌的細(xì)胞因子，是人體免疫系統(tǒng)抵抗病毒感染的主要細(xì)胞因子之一，針對(duì)HCV(丙型肝炎病毒)的清除具有相當(dāng)重要的意義，因此該7P肽或其衍生物具有預(yù)防和/或治療丙型肝炎的作用。進(jìn)一步的，本發(fā)明人在專利申請(qǐng)CN101822816A中公開了所述7P肽或其衍生物在預(yù)防和治療肺炎中的用途，并且具體記載該7P肽及其衍生物通過(guò)降低TNF-α水平對(duì)肺炎的治療。所以，已經(jīng)有的研究報(bào)道可以知道，7P肽具有降低肺炎患者的TNF-α水平，以及具有提高丙型肝炎患者細(xì)胞因子IL-4水平的作用。而所述肽或其衍生物是否具有預(yù)防哮喘發(fā)病以及改善哮喘疾病癥狀尚沒有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了上述SP肽或其衍生物在制備預(yù)防或治療哮喘的藥物中的應(yīng)用，為哮喘類疾病的治療和預(yù)防提供了新的臨床方法，也拓寬了該SP肽的潛在藥用領(lǐng)域。本發(fā)明還提供了利用所述SP肽或其衍生物治療或預(yù)防哮喘的方法，通過(guò)向患者施用含有治療有效量的所述肽或其衍生物的藥物，能有效預(yù)防哮喘發(fā)生，并能顯著改善哮喘的病變癥狀的目的。本發(fā)明還提供了上述SP肽或其衍生物在制備降低哮喘患者IL-13水平和IL-4水平的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了如式I所示的SP肽或其衍生物在制備預(yù)防或治療哮喘的藥物中的應(yīng)用：Xaa1-Gln-Xaa2-Xaa3-Thr-Ser-Gly-Xaa4(式I)其中，Xaa1為缺失、Ala、Gly、Val、Leu或Ile，Xaa2為Thr或Ser，Xaa3為Tyr、Phe或Trp，而且Xaa4為缺失、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Pro；所述衍生物包括所述肽在藥學(xué)上可接受的鹽或酯。發(fā)明人的研究證明，施用有效劑量的所述SP肽或其衍生物能夠有效預(yù)防或治療哮喘，尤其能預(yù)防或治療過(guò)敏性哮喘。上述式I所示的SP肽或其衍生物的基本結(jié)構(gòu)和組成即為發(fā)明人在之前的研究中所得到的7P肽或其衍生物，在本發(fā)明中稱為SP肽或其衍生物。根據(jù)在先專利的記載，所述SP肽或其衍生物可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的固相合成法或液相合成法合成，也可通過(guò)基因工程融合表達(dá)并提純獲得。在本文中，所述“藥學(xué)上可接受的酯”指適于與人或動(dòng)物的組織接觸而且無(wú)過(guò)多的毒性、刺激或變態(tài)反應(yīng)等的酯。通常，酯化修飾后能降低機(jī)體中的蛋白酶對(duì)肽的水解。對(duì)本發(fā)明的肽的末端氨基、羧基或側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行修飾可以形成藥學(xué)上可接受的酯。對(duì)氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的修飾包括但不限于蘇氨酸、絲氨酸側(cè)鏈羥基與羧酸發(fā)生的酯化反應(yīng)。優(yōu)選氨基酸末端基團(tuán)用蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的保護(hù)性基團(tuán)保護(hù)起來(lái)，如乙?；⑷阴；?、Fmoc(9-芴基-甲氧羰基)、Boc(叔丁氧羰基)、Alloc(烯丙氧羰基)、C1-3烷基、C6-12芳烷基等。有關(guān)該SP肽(即在先專利中的7P肽)的藥用酯在PCT/CN2006/001176中有詳細(xì)說(shuō)明，因此將該在先公開申請(qǐng)文件中的相關(guān)內(nèi)容并入本案作為參考。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的肽不經(jīng)修飾也足以在生理?xiàng)l件下用于治療或預(yù)防哮喘，因此優(yōu)選不對(duì)式I多肽N末端的氨基和C末端的羧基以及氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行修飾，即N末端的化學(xué)基團(tuán)仍舊為第一個(gè)氨基酸上的α-氨基(-NHB2B)，C末端的化學(xué)基團(tuán)是C末端氨基酸的羧基(-COOH)。在本文中，所述“藥學(xué)上可接受的鹽”指適于與人或動(dòng)物的組織接觸而且無(wú)過(guò)多的毒性、刺激或變態(tài)反應(yīng)等的鹽。藥學(xué)上可接受的鹽是本領(lǐng)域熟知的。這種鹽可以在本發(fā)明多肽的最終分離和純化的過(guò)程中制備，也可以將所述的肽與適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)或無(wú)機(jī)酸或堿反應(yīng)單獨(dú)制備。代表性酸加成鹽包括但不限于乙酸鹽、二己酸鹽、藻酸鹽、檸檬酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、富馬酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來(lái)酸鹽、甲磺酸鹽、煙酸鹽、2-萘磺酸鹽、草酸鹽、3-苯基丙酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、磷酸鹽、谷氨酸鹽、碳酸氫鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽和十一烷酸鹽。能用于形成藥學(xué)上可接受鹽的優(yōu)選的酸是鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、草酸、馬來(lái)酸、琥珀酸和檸檬酸。藥學(xué)上可接受的堿加成鹽中的陽(yáng)離子包括但不限于堿金屬或堿土金屬離子如鋰、鈉、鉀、鈣和鎂等，季銨陽(yáng)離子(如四甲基銨、四乙基銨等)、以及銨、甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙基胺、二乙基胺、乙基胺、二乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等的陽(yáng)離子。優(yōu)選的堿加成鹽包括磷酸鹽、三羥甲基氨基甲烷(tris)和乙酸鹽。這些鹽一般能夠增加多肽的溶解性，而且所形成的鹽基本上不改變多肽的活性。總之，根據(jù)本發(fā)明的方案，所述預(yù)防和/或治療哮喘的藥物可以是直接采用所述肽(SP肽)，也可以是采用所述SP肽的藥用鹽或藥用酯形式的藥物制劑。進(jìn)一步的，所述SP肽或其衍生物為式Ⅱ所示的肽或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯：Gly-Gln-Thr-Tyr-Thr-Ser-Gly(式Ⅱ)根據(jù)本領(lǐng)域公知的氨基酸表示方式，式Ⅱ所示的SP肽還可以縮寫為GQTYTSG。在本發(fā)明的方案中，所述肽或其衍生物可根據(jù)預(yù)防和/或治療目的，以及施用途徑采用適當(dāng)?shù)闹苿┬问?，例如：注射劑?注射用)凍干粉、噴霧劑、口服溶液、口服混懸液、片劑、膠囊、腸溶片、丸劑、粉劑、顆粒劑、緩釋劑(可控制藥劑有效成分緩慢釋放的劑型)或控釋劑(可控制藥劑有效成分釋放的劑型)等制劑，所述制劑中可包含常規(guī)的藥學(xué)上可接受的載體，所述“藥學(xué)上可接受的載體”指無(wú)毒固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)填充劑、稀釋劑、佐劑、包裹材料或其他制劑輔料，例如：生理鹽水、等滲葡萄糖溶液、緩沖鹽水、甘油、乙醇及上述溶液的組合。本發(fā)明的方案中優(yōu)選以注射方式施用由所述肽或其衍生物制成的藥物，即，使用注射針劑或凍干粉針劑是優(yōu)選的，以生理鹽水作為載體溶解即可。進(jìn)一步的，所述注射制劑中含有治療有效量為200-3000μg所述肽或其衍生物。更進(jìn)一步的，所述注射制劑中含有治療有效量為250-2500μg所述肽或其衍生物。本發(fā)明提供的一種治療或預(yù)防哮喘的方法，包括，向患者施用含有治療有效量的上述式I所示的肽或其衍生物的藥物，所述衍生物包括所述肽在藥學(xué)上可接受的鹽或酯。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述治療用藥中作為有效成分的肽或其衍生物可以為上述式Ⅱ所示的SP肽或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯。上述含有治療有效量的SP肽或其衍生物的藥物(所述肽或其衍生物作為有效成分)能夠有效預(yù)防或治療哮喘，尤其能預(yù)防或治療過(guò)敏性哮喘。進(jìn)一步的，在哮喘發(fā)病后向患者施用所述藥物進(jìn)行哮喘的治療；或在接觸哮喘致敏源1-48小時(shí)內(nèi)，優(yōu)選的1-24小時(shí)向患者施用所述藥物進(jìn)行哮喘的預(yù)防。所述患者為有哮喘過(guò)敏史或有哮喘疾病的人。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，向患者施用含有治療有效量為200-3000μg的所述SP肽或其衍生物的藥物。進(jìn)一步優(yōu)選的，向患者施用含有治療有效量為250-2500μg的所述SP肽或其衍生物的藥物。所述治療有效量是針對(duì)一般成人體重、單次施用的有效量。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選以注射方式施用含有治療有效量的所述肽或其衍生物的藥物。進(jìn)一步的，優(yōu)選對(duì)患者以單位制劑的劑量給藥，所述單位制劑為滿足一次給藥所需有效成分的制劑，常見的單位制劑如一單位(片)片劑、一單位(針)針劑或粉針劑等，其中有效成分的含量為一次給藥所需的量。患者一次施用所需的藥物的量可以方便地通過(guò)計(jì)算患者的體重和該患者一次用藥所需單位體重劑量的乘積得到。例如，在制備藥物的過(guò)程中，一般認(rèn)為成人體重為50-90kg，可以用該體重值來(lái)計(jì)算。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人的單位體重劑量可以通過(guò)等效劑量換算關(guān)系來(lái)計(jì)算。例如，根據(jù)的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人的等效劑量換算關(guān)系(可參見FDA、SFDA等藥品管理機(jī)構(gòu)的指導(dǎo)意見，也可參見(黃繼漢等，藥理試驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算，中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2004Sep；9(9):1069-1072)可從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的劑量推導(dǎo)出人的有效劑量。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，可以使用按照人和小鼠的體表面積折算系數(shù)0.1來(lái)?yè)Q算人和小鼠的劑量。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式，所述單位制劑中所述肽或其衍生物以50-300μg/kg小鼠劑量施用至小鼠時(shí)治療效果較好，當(dāng)以60-250μg/kg小鼠劑量，例如250μg/kg或125μg/kg小鼠劑量施用至小鼠時(shí)治療效果更佳。制藥商可以根據(jù)上述換算方法得到用于人的單位制劑中的有效成分含量，用以應(yīng)用于其制藥過(guò)程中。在本發(fā)明的技術(shù)方案中，根據(jù)等效劑量換算關(guān)系以及人的常規(guī)體重，并且綜合用藥安全、成本和藥效，優(yōu)選的，所述單位制劑中含有200-3000μg劑量的所述肽或其衍生物，更優(yōu)選含有250-2500μg劑量的所述肽或其衍生物。根據(jù)本發(fā)明的研究，雖然本發(fā)明人在專利申請(qǐng)CN101822816A中公開了所述7P肽或其衍生物(即本發(fā)明的SP肽或其衍生物)能降低肺炎患者TNF-α的水平，但在過(guò)敏性哮喘中通常是IL-4和IL-13等細(xì)胞因子誘發(fā)哮喘而TNF-α等炎癥因子加重哮喘，IL-13和IL-4在誘導(dǎo)哮喘發(fā)病中的作用已得到了充分研究證實(shí)，IL-13在肺組織的高表達(dá)可誘導(dǎo)炎癥、粘液高分泌、上下皮纖維化、嗜酸粒細(xì)胞活化/趨化因子的產(chǎn)生和氣道高反應(yīng)。IL-4的表達(dá)可增加上皮細(xì)胞上血管細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)毒素，最終使嗜酸粒細(xì)胞對(duì)氣道的損害加重，促進(jìn)氣道炎癥。經(jīng)本申請(qǐng)人研究發(fā)現(xiàn)，將所述SP肽或其衍生物用于預(yù)防或治療哮喘，可有效改善哮喘病變癥狀，特別是過(guò)敏性哮喘的病變癥狀，在本發(fā)明的實(shí)施例中，使用本領(lǐng)域常規(guī)手段誘導(dǎo)出過(guò)敏性哮喘小鼠模型，即用卵白蛋白聯(lián)合佐劑誘導(dǎo)出過(guò)敏性哮喘小鼠模型來(lái)說(shuō)明上述SP肽或其衍生物對(duì)于過(guò)敏性哮喘的作用，從以下實(shí)施例的數(shù)據(jù)可以看出，應(yīng)用所述SP肽或其衍生物的組(包括SP肽預(yù)防給藥高、中、低劑量組和SP肽治療給藥高、中、低劑量組)，相比于模型組，均表現(xiàn)出顯著減輕的IL-13水平和IL-4水平，以及顯著改善的肺組織病變程度。表明SP肽或其衍生物具有顯著的預(yù)防或治療哮喘的作用。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了，如式I所示的SP肽或其衍生物在制備降低哮喘患者IL-13水平和IL-4水平的藥物中的應(yīng)用：Xaa1-Gln-Xaa2-Xaa3-Thr-Ser-Gly-Xaa4(式I)其中，Xaa1為缺失、Ala、Gly、Val、Leu或Ile，Xaa2為Thr或Ser，Xaa3為Tyr、Phe或Trp，而且Xaa4為缺失、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Pro；所述衍生物包括所述肽在藥學(xué)上可接受的鹽或酯。進(jìn)一步的，所述肽或其衍生物為式Ⅱ所示的肽或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯：Gly-Gln-Thr-Tyr-Thr-Ser-Gly(式Ⅱ)。進(jìn)一步的，所述藥物為單位制劑或注射制劑。進(jìn)一步的，所述單位制劑或注射制劑中含有治療有效量為200-3000μg所述肽或其衍生物。更進(jìn)一步的，其中所述單位制劑或注射制劑中含有治療有效量為250-2500μg所述肽或其衍生物。為了便于理解，以下將通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，具體實(shí)例僅是為了說(shuō)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說(shuō)明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，本發(fā)明引用了公開文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)也是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本發(fā)明而作為本發(fā)明說(shuō)明書的一部分。附圖說(shuō)明圖1SP肽對(duì)各組小鼠的血清中IL-13水平和IL-4水平的影響。圖2SP肽對(duì)各組小鼠的肺組織勻漿中IL-13水平和IL-4水平的影響。圖3各組小鼠的肺組織病變程度綜合評(píng)分。圖4顯示實(shí)施例1中空白對(duì)照組小鼠肺組織病理變化。圖5顯示實(shí)施例1中模型組小鼠肺組織病理變化。圖6顯示實(shí)施例1中陽(yáng)性藥物組小鼠肺組織病理變化。圖7顯示實(shí)施例1中SP肽預(yù)防給藥低劑量組小鼠肺組織病理變化。圖8顯示實(shí)施例1中SP肽預(yù)防給藥中劑量組小鼠肺組織病理變化。圖9顯示實(shí)施例1中SP肽預(yù)防給藥高劑量組小鼠肺組織病理變化。圖10顯示實(shí)施例1中SP肽治療給藥低劑量組小鼠肺組織病理變化。圖11顯示實(shí)施例1中SP肽治療給藥中劑量組小鼠肺組織病理變化。圖12顯示實(shí)施例1中SP肽治療給藥高劑量組小鼠肺組織病理變化。具體實(shí)施方式實(shí)施例1SP肽對(duì)小鼠哮喘的保護(hù)作用1.實(shí)驗(yàn)材料1.1動(dòng)物：清潔級(jí)ICR小鼠，體重18g～22g，雌雄各半，購(gòu)自南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1.2藥物、試劑及儀器：使用通過(guò)固相肽合成方法，由413A型自動(dòng)肽合成儀(購(gòu)自PerkinElmer公司)合成的以下序列的肽：GQTYTSG(以下稱為SP肽)，具體的合成步驟請(qǐng)參見PCT/CN2006/001176中實(shí)施例1的記載，使用時(shí)用生理鹽水溶解。陽(yáng)性對(duì)照藥：地塞米松注射液，購(gòu)自貴州華圣制藥有限公司，規(guī)格：5mg/ml/支，人日用量10mg/70kg.d。卵白蛋白(AlbuminEgg)，購(gòu)自Sigma公司。小鼠IL-13ELISAKit,購(gòu)自上海上海藍(lán)基生物科技有限公司。BIO-RAD680伯樂(lè)酶標(biāo)儀。1.3分組及藥物劑量ICR小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為9組，小鼠每組10只，分別為：1)空白對(duì)照組(施用與模型組等體積的生理鹽水)；2)模型組(施用使用生理鹽水配制的卵白蛋白和氫氧化鋁溶液)；3)陽(yáng)性藥物組(施用與模型組等體積的地塞米松注射液，劑量為0.9μg/kg·d)；4)SP肽預(yù)防給藥高劑量組、5)SP肽預(yù)防給藥中劑量組、6)SP肽預(yù)防給藥低劑量組(施用卵白蛋白和氫氧化鋁，以及劑量分別為250μg/kg·d，125μg/kg·d，62.5μg/kg·d的SP肽，用生理鹽水配置成需要濃度的SP肽溶液)。7)SP肽治療給藥高劑量組、8)SP肽治療給藥中劑量組、9)SP肽治療給藥低劑量組(施用卵白蛋白和氫氧化鋁，以及劑量分別為250μg/kg·d，125μg/kg·d，62.5μg/kg·d的SP肽，用生理鹽水配置成需要濃度的SP肽溶液)。SP肽各劑量組均皮下注射給藥，小鼠每10g體重給藥0.1ml的SP肽溶液，空白對(duì)照組使用等量的生理鹽水(小鼠每10g體重給予0.1ml生理鹽水)，陽(yáng)性藥物組腹腔注射給藥，小鼠每10g體重給藥0.1ml的陽(yáng)性藥物。2.試驗(yàn)方法2.1實(shí)驗(yàn)方案：致敏液的配制：以10ug卵白蛋白和2mg氫氧化鋁溶于0.5mL生理鹽水的比例配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。按照以下方式對(duì)各組小鼠進(jìn)行給藥，給藥期間，每天向各組小鼠正常喂食。在第1、7、14天，對(duì)除空白對(duì)照組外的其余各組小鼠(模型組、預(yù)防給藥組、治療給藥組、陽(yáng)性藥物組)，腹腔注射0.5ml新鮮配制的所述致敏液。空白對(duì)照組腹腔注射等體積的生理鹽水。從第21天起(即第4周起)，對(duì)除空白對(duì)照組外的其余各組小鼠，每隔3天置于16L密閉容器中，通過(guò)超聲霧化使小鼠吸入1wt％卵白蛋白生理鹽水，吸入時(shí)間為25min/d,霧化流量為3ml/min,每周2次，以激發(fā)哮喘，直到第19周結(jié)束。空白對(duì)照組小鼠用等體積的生理鹽水腹腔進(jìn)行霧化。其中，預(yù)防給藥組(SP肽預(yù)防給藥高劑量組、SP肽預(yù)防給藥中劑量組、SP肽預(yù)防給藥低劑量組)在第一次腹腔注射致敏液1小時(shí)后(即第1天起)，在小鼠的右后肢皮下注射相應(yīng)劑量的SP肽，隔天給藥一次，共給藥15次。第15周第1天，隨機(jī)抽取模型組、預(yù)防給藥組、治療給藥組、陽(yáng)性藥物組中各5只小鼠，經(jīng)病理學(xué)檢查，除預(yù)防給藥組外，其余小組哮喘小鼠模型成功。同一天起，對(duì)治療給藥組(治療給藥SP高劑量組、治療給藥SP中劑量組、治療給藥SP低劑量組)的小鼠，右后肢皮下注射相應(yīng)劑量的SP肽,隔天給藥一次，共給藥15次。同一天起，對(duì)陽(yáng)性藥物組的小鼠，腹腔注射相應(yīng)0.1ml/10g小鼠體重的地塞米松注射液，隔天給藥一次，共給藥15次。關(guān)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的測(cè)定，所有小鼠在最后一次霧化吸入(第19周)后6h摘眼球取血處死，收集血清，-70℃保存?zhèn)溆谩２捎秒p抗體夾心ELISA法，使用小鼠IL-13ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清IL-13水平，將IL-13標(biāo)準(zhǔn)品用試劑盒中的稀釋液進(jìn)行倍比稀釋，然后按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出所測(cè)樣本的數(shù)值，再乘以稀釋倍數(shù)，即得出樣本血清中IL-13的水平值。類似于IL-13的方式，通過(guò)IL-4標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得樣本血清中IL-4的水平值。并收集完血清后,將小鼠肺先用冰生理鹽水浸泡沖洗后,取小鼠左肺上葉用10％中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，再經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，以中性樹膠封片，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查包括：肺組織是否表現(xiàn)為肺內(nèi)小支氣管、血管周圍間質(zhì)水腫，以及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔是否清晰、是否有滲出物，肺泡壁充血是否增厚，以及炎細(xì)胞的主要類型等。肺組織勻漿的制備：取完小鼠左肺上葉后，從剩余的新鮮肺組織取大約0.04g放入研磨器中，加入400ul冰PBS(10℅濃度)，按組別分別在冰上逐個(gè)研磨，然后吸取研磨物，離心取上清進(jìn)行檢測(cè)。在酶標(biāo)包被板上的待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40ul，然后再加待測(cè)小鼠肺組織勻漿樣品10ul(待測(cè)1：5倍稀釋)。然后同血清樣本按照ELISA試劑盒說(shuō)明檢測(cè)小鼠肺組織勻漿中IL-4、IL-13。根據(jù)肺組織病變(包括小支氣管、血管周圍間質(zhì)水腫，肺泡壁充血或氣腫)由輕到重的程度分別標(biāo)記為1分，2分，3分，4分，無(wú)明顯病變?yōu)?分，極輕度病變?yōu)?.5分，累加所有分?jǐn)?shù)，并計(jì)算出每組每只動(dòng)物的均分(±SD)，分值越高提示病變程度越重。對(duì)病變?cè)u(píng)分結(jié)果進(jìn)行兩個(gè)樣本比較的秩和檢驗(yàn)，與模型組進(jìn)行比較。2.2數(shù)據(jù)處理：對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對(duì)病理學(xué)評(píng)分采用秩和檢驗(yàn)，其他數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，并統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。3.結(jié)果3.1小鼠血清以及肺組織勻漿中IL-13水平和IL-4水平圖1和圖2分別表示了SP肽對(duì)各組小鼠的血清以及肺組織勻漿中IL-13水平和IL-4水平的影響，其中給藥量如上述1.3中所述，圖1和圖2中的結(jié)果為各組小鼠的平均值。從圖1和圖2可以看出，卵白蛋白聯(lián)合佐劑氫氧化鋁致敏引起的過(guò)敏性哮喘小鼠模型組的血清及肺組織勻漿中IL-13水平和IL-4水平顯著升高(P<0.01)，根據(jù)下面病理組織學(xué)檢查可知，IL-13水平和IL-4水平升高誘發(fā)了小鼠支氣管哮喘，表明卵白蛋白聯(lián)合佐劑氫氧化鋁致敏引起的小鼠支氣管哮喘可通過(guò)釋放IL-13和IL-14引發(fā)。而SP肽治療給藥高、中、低劑量組及SP肽預(yù)防給藥高、中劑量組小鼠的血清及肺組織勻漿中IL-13和IL-14水平相比模型組均有顯著降低(*P＜0.05,**P＜0.01)。3.2肺組織切片結(jié)果分析由圖4可以看出，空白對(duì)照組小鼠肺內(nèi)小血管周圍組織間隙增寬，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)(如圖4箭頭所示)。由圖5可以看出，模型組小鼠肺內(nèi)小血管周圍間質(zhì)重度水腫并有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(如圖5箭頭所示)，炎細(xì)胞以嗜酸性粒細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞為主，肺泡腔清晰、無(wú)滲出物。由圖6可以看出，陽(yáng)性藥物組小鼠肺間質(zhì)輕度水腫并且少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(如圖6箭頭所示)，炎細(xì)胞以嗜酸性粒細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞為主。由圖7可以看出，SP肽預(yù)防給藥低劑量組小鼠肺間質(zhì)中度或重度水腫并有較多的炎細(xì)胞浸潤(rùn)(如圖7箭頭所示)，炎細(xì)胞以嗜酸性粒細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞為主。由圖8可以看出，SP肽預(yù)防給藥中劑量組小鼠肺間質(zhì)中度或輕度水腫并有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(如圖8箭頭所示)，炎細(xì)胞以嗜酸性粒細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞為主。由圖9可以看出，SP肽預(yù)防給藥高劑量組小鼠肺間質(zhì)輕度水腫并且支氣管周圍有較少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(如圖9箭頭所示)。由圖10可以看出，SP肽治療給藥低劑量組小鼠肺內(nèi)小血管和支氣管周圍肺間質(zhì)中度水腫并有較多量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(如圖10箭頭所示)，炎細(xì)胞以嗜酸性粒細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞為主。由圖11可以看出，SP肽治療給藥中劑量組小鼠肺內(nèi)小血管和支氣管周圍肺間質(zhì)輕度水腫并有較多量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(如圖11箭頭所示)，炎細(xì)胞以嗜酸性粒細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞為主，周圍肺泡壁充血，肺泡呈氣腫狀。由圖12可以看出，SP肽治療給藥高劑量組小鼠肺間質(zhì)輕度水腫并有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(如圖12箭頭所示)，炎細(xì)胞以嗜酸性粒細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞為主。(×200)3.2將各組小鼠的肺組織病變輕重程度按照上述評(píng)分規(guī)則，使用秩和檢驗(yàn)方法獲得各病理學(xué)檢查指標(biāo)的綜合評(píng)分結(jié)果，如圖3所示，由圖3可以看出，病理組織學(xué)檢查表明SP肽預(yù)防給藥或治療給藥后均能顯著性減輕小鼠支氣管、血管周圍間質(zhì)水腫、水腫處炎細(xì)胞的浸潤(rùn)以及肺泡壁充血或氣腫，并且SP肽治療給藥低劑量組及SP肽預(yù)防給藥中、低劑量組小鼠，相比于模型組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(*P＜0.05)，其中SP肽治療給藥高、中劑量組，SP肽預(yù)防給藥高劑量組與模型組相比有高度顯著性差異(**P＜0.01)。