Fgf-18冷凍干燥制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥物制劑領(lǐng)域。更具體地本發(fā)明涉及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子18（FGF-18）化合物的冷凍干燥制劑及該制劑的制造方法。本發(fā)明的冷凍干燥制劑在適當(dāng)?shù)馁A存時(shí)間內(nèi)是穩(wěn)定的。復(fù)溶后，它們可用于治療軟骨疾病如骨關(guān)節(jié)炎或軟骨損傷。
【專利說(shuō)明】FGF-18冷凍干燥制劑
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及藥物制劑領(lǐng)域。更具體地，針對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子18 (FGF-18)蛋白質(zhì)的冷凍干燥制劑，及該制劑的制造方法。本發(fā)明的冷凍干燥制劑室溫下貯存時(shí)在相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)是穩(wěn)定的。
[0002]發(fā)明背景
[0003]成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子18 (FGF-18)是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)蛋白家族的成員，與FGF-8和FGF-17密切相關(guān)。FGF家族成員的特點(diǎn)是肝素結(jié)合域。這樣一個(gè)推定的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域已被確定為FGF-18。據(jù)推測(cè)，與細(xì)胞表面的硫酸肝素蛋白多糖復(fù)合的FGF配體與受體結(jié)合后，即啟動(dòng)受體介導(dǎo)的信號(hào)傳遞。
[0004]已證明，F(xiàn)GF-18是軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖劑(Ellsworth ef al.，2002,骨關(guān)節(jié)炎和軟骨，10:308-320; Shimoaka 等，2002，J.Bi0.Chem.277 (9): 7493-7500)。有人提出用FGF-18 (單獨(dú)使用(W02008/023063)或與透明質(zhì)酸聯(lián)合使用(W02004/032849))治療軟骨疾病如骨關(guān)節(jié)炎和軟骨損傷。
[0005]含有FGF多肽的藥物組合物是本領(lǐng)域已知的。W000/21548公開(kāi)了一種藥物組合物，該組合物包含與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組合的重組FGF。注射用溶液的合適載體或稀釋劑的實(shí)例包括水或等滲鹽溶液。
[0006]W02008/121563涉及藥物制劑，這些藥物制劑含有以單位劑量注射形式制備的FGF-21化合物和藥學(xué)上可接受的載體。合適的載體中，可包括糖、緩沖液和/或表面活性劑。
`[0007]W092/01442公開(kāi)了一種凍干組合物，包含F(xiàn)GF、藥學(xué)上可接受的填充劑和i)纖維素的堿金屬鹽或ii)聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯與半胱氨酸的組合物。組分i)和ii)使FGF組合物保持穩(wěn)定。
[0008]WOO1/39788描述了一種藥物組合物，包含F(xiàn)GF-18化合物和細(xì)胞毒素，以與藥學(xué)上可接受載體(例如磷酸鹽緩沖鹽水)的混合物形式存在。
[0009]W02008/023063公開(kāi)了包含F(xiàn)GF-18化合物與至少一種藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或類似物的制劑。作為一個(gè)例子，它公開(kāi)了一種在諸如鹽水、葡萄糖溶液、血清白蛋白和Ringer溶液的賦形劑中包含F(xiàn)GF-18的注射用制劑。
[0010]當(dāng)制備含有生物活性蛋白的藥物組合物時(shí)，所述組合物的配制方式必須使蛋白活性保持一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間。蛋白質(zhì)活性/穩(wěn)定性的喪失，可能由蛋白質(zhì)化學(xué)或物理性質(zhì)不穩(wěn)定尤其因蛋白變性、聚合或氧化所引起。因此所產(chǎn)生的產(chǎn)物可能是藥學(xué)上不可接受的。雖然已知使用賦形劑(S)會(huì)增加給定蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,但這些賦形劑的穩(wěn)定化效果高度依賴于賦形劑的性質(zhì)和生物活性蛋白本身的性質(zhì)。
[0011]仍需要尋求包含F(xiàn)GF-18作為活性成分的進(jìn)一步的制劑，所述制劑在一段合適的時(shí)間內(nèi)是穩(wěn)定的和適用于注射，優(yōu)選為關(guān)節(jié)內(nèi)注射。所述制劑可給予患者以治療軟骨疾病，如骨關(guān)節(jié)炎或軟骨損傷。
[0012]發(fā)明概述[0013]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種包含F(xiàn)GF-18蛋白的新制劑。更具體地，所述制劑是含有FGF-18的穩(wěn)定的冷凍干燥(即凍干)制劑。本發(fā)明還提供制備本發(fā)明冷凍干燥制劑的方法。本說(shuō)明書(shū)所描述的冷凍干燥制劑在復(fù)溶后對(duì)于軟骨疾病的治療給藥是非常有用的。
[0014]在第一方面，本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定的冷凍干燥制劑，其包含或由FGF-18、緩沖液、泊洛沙姆表面活性劑和作為穩(wěn)定劑的糖組成。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，緩沖液是磷酸鹽緩沖液，表面活性劑泊洛沙姆是泊洛沙姆188，穩(wěn)定劑是蔗糖。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，緩沖液的PH值保持在或約6至8，更尤其是在或約7.2。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，泊洛沙姆表面活性劑的濃度是在或約0.1至0.4mg/小瓶。優(yōu)選地，F(xiàn)GF-18選自:1)一種多肽，其包含或由成熟形式的人FG F-18組成，對(duì)應(yīng)的序列包含或由SEQ ID N0:1的殘基28(Glu)-殘基207 (Ala)組成，2) —種多肽，其包含或由截短形式的人FGF-18組成，對(duì)應(yīng)的序列包含或由SEQ ID NO:1的殘基28 (Glu)-殘基196 (Lys)組成，和3) —種多肽，其包含或由SEQ ID N0:2組成。更優(yōu)選地，F(xiàn)GF-18是trFGF-18，其定義見(jiàn)下文。
[0015]在第二方面，本發(fā)明提供穩(wěn)定的FGF-18冷凍干燥制劑的制造方法，包括以下步驟:
[0016]I)形成FGF-18與緩沖液、表面活性劑和穩(wěn)定劑的混合物，并
[0017]2 )將混合物進(jìn)行凍干(冷凍干燥)，
[0018]其中所述緩沖液是磷酸鹽緩沖液，穩(wěn)定劑是一種糖，如蔗糖，表面活性劑是泊洛沙姆表面活性劑，例如泊洛沙姆188。
[0019]一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，緩沖液保持pH在或約6-8，更特別地是在或約7.2。
[0020]優(yōu)選地，F(xiàn)GF-18選自:1)一種多肽，其包含或由成熟形式的人FGF-18組成，對(duì)應(yīng)的序列包含或由SEQ ID N0:1的殘基28 (Glu)-殘基207 (Ala)組成，2)—種多肽，其包含或由截短形式的人FGF-18組成，對(duì)應(yīng)的序列包含或由SEQ ID N0:1的殘基28 (Glu)-殘基196 (Lys)組成，和3) —種多肽，其包含或由SEQ ID N0:2組成。更優(yōu)選地，F(xiàn)GF-18是trFGF-18，其定義見(jiàn)下文。
[0021]在第三方面，本發(fā)明提供一種醫(yī)藥或獸醫(yī)用制品，包括:
[0022]I)第一容器，包含一種穩(wěn)定的冷凍干燥制劑，所述冷凍干燥制劑含有FGF-18、緩沖液、表面活性劑和穩(wěn)定劑，和
[0023]2)第二容器，包括復(fù)溶用的溶劑，
[0024]其中，所述緩沖液是磷酸鹽緩沖液，穩(wěn)定劑是一種糖如蔗糖，表面活性劑是泊洛沙姆表面活性劑，如泊洛沙姆188，復(fù)溶用的溶劑是水或鹽水溶液(例如0.9 % w/v注射用氯化鈉)。優(yōu)選地，F(xiàn)GF-18選自下列物質(zhì)組成的組:1) 一種多肽，其包含或由成熟形式的人FGF-18組成，對(duì)應(yīng)的序列包含或由SEQ ID N0:1的殘基28 (Glu)-殘基207 (Ala)組成，
2)—種多肽，其包含或由截短形式的人FGF-18組成，對(duì)應(yīng)的序列包含或由SEQ ID N0:1的殘基28 (Glu)-殘基196 (Lys)組成，和3) —種多肽，其包含或由SEQ ID NO: 2組成。更優(yōu)選地，F(xiàn)GF-18是trFGF-18，其定義見(jiàn)下文。
[0025]定義
[0026]-本說(shuō)明書(shū)所用的術(shù)語(yǔ)“FGF-18蛋白”或“FGF-18”，意指保持人FGF-18蛋白的至少一種生物活性的蛋白質(zhì)。FGF-18可以是天然的、以其成熟形式存在，或其截短形式。人FGF-18蛋白的生物活性特別包括成骨細(xì)胞活性提高(見(jiàn)W098/16644)或軟骨形成增加(見(jiàn)W02008/023063)。
[0027]天然的即野生型人FGF-18是由關(guān)節(jié)軟骨的軟骨細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)。W098/16644將人FGF-18首次指定為zFGF-5并加以充分描述。SEQ ID NO:1對(duì)應(yīng)于天然人FGF-18的氨基酸序列，其信號(hào)肽由氨基酸殘基I (Met)-殘基27 (Ala)組成。成熟形式的人FGF-18對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:1的殘基28(Glu)_殘基207(Ala)的氨基酸序列(180個(gè)氨基酸)。FGF-18對(duì)FGFR4和FGFR3、FGFR2的“ IIIC剪接變體具有特異性(Ellsworth et al.，2002，骨關(guān)節(jié)炎和軟骨，10:308-320)。成熟形式的FGF-18平均質(zhì)量為21.04kDa。
[0028]在本發(fā)明中，F(xiàn)GF-18可由重組方法產(chǎn)生，如專利申請(qǐng)W02006/063362所教導(dǎo)。根據(jù)不同的表達(dá)系統(tǒng)和條件，在本發(fā)明中FGF-18是在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)，該重組宿主細(xì)胞具有起始的甲硫氨酸(Met殘基)或具有分泌信號(hào)序列。當(dāng)在原核宿主(如大腸桿菌)中表達(dá)時(shí)，F(xiàn)GF-18序列的N-末端還包含一個(gè)Met殘基。例如，人FGF-18的氨基酸序列在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，其N-端以Met殘基開(kāi)始(I位)，接著是SEQ ID NO:1的殘基28 (Glu)-殘基207 (Ala)0
[0029]-本說(shuō)明書(shū)所用的術(shù)語(yǔ)“截短形式”的FGF-18，指的是包含或由SEQID NO:1的殘基28 (Glu)-196 (Lys)組成的一種蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，F(xiàn)GF-18蛋白的截短形式是多肽“trFGF-18”(170個(gè)氨基酸)，它以Met殘基開(kāi)始(N-末端)，接著是野生型人FGF-18的氨基酸殘基 28 (Glu)-196 (Lys)0 trFGF-18 的氨基酸序列見(jiàn)于 SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 2 ^氨基酸殘基2-170，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的氨基酸殘基28-196)。trFGF-18是一種在大腸桿菌中產(chǎn)生的截短形式的重組人FGF-18 (見(jiàn)W02006/063362)。已證明trFGF-18顯示成熟人FGF-18類似的活性，例如，它增加軟骨細(xì)胞的增殖和軟骨的沉積，導(dǎo)致多種軟骨組織的修復(fù)和重建(見(jiàn) W02008/023063)。trFGF-18 的平均質(zhì)量為 19.83kDa。
[0030]-如本說(shuō)明書(shū)所用的 術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定性”，是指在本發(fā)明制劑中FGF-18的物理、化學(xué)和構(gòu)象穩(wěn)定性(包括維持生物效價(jià))。蛋白質(zhì)制劑的不穩(wěn)定性可能是由如下原因引起:化學(xué)降解或蛋白分子聚集形成高階聚合物、去糖基化、糖基化修飾、氧化或降低本發(fā)明的FGF-18蛋白至少一種生物活性的任何其他結(jié)構(gòu)修飾。
[0031]-本說(shuō)明書(shū)所用的術(shù)語(yǔ)，“穩(wěn)定”的溶液或制劑，是一種溶液或制劑，其中蛋白質(zhì)降解、修飾、聚集、生物活性損失等的程度是可以接受地加以控制的，并不隨時(shí)間的推移而不可接受地增加。優(yōu)選的是，在室溫下至少12個(gè)月的期間內(nèi)，該制劑保持至少80%以上的FGF-18活性。本發(fā)明的包含F(xiàn)GF-18的穩(wěn)定化制劑，優(yōu)選的是室溫下儲(chǔ)存時(shí)的貨架壽命至少為約12個(gè)月，18個(gè)月，更優(yōu)選至少20個(gè)月，還更優(yōu)選約24個(gè)月。監(jiān)測(cè)本發(fā)明的FGF-18制劑穩(wěn)定性的方法是本領(lǐng)域中可利用的方法，包括本說(shuō)明書(shū)所公開(kāi)的實(shí)施例中描述的方法。
[0032]-術(shù)語(yǔ)“緩沖液”，如本說(shuō)明書(shū)所用，指一些化合物的溶液，它們已知在藥用或獸醫(yī)用制劑中是安全的，并具有維持或控制該制劑的PH值在制劑所需pH范圍內(nèi)的效果。
[0033]用于控制pH在適度酸性pH值至適度堿性pH值的可接受的緩沖液包括(但不限于)磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、精氨酸、TRIS和組氨酸緩沖液?！癟RIS”是指2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇，及其任何藥理學(xué)上可接受的鹽。按照本發(fā)明，優(yōu)選的緩沖液是磷酸鹽緩沖液。
[0034]-術(shù)語(yǔ)“表面活性劑”，如本說(shuō)明書(shū)所用，是指一種可溶性的化合物，它可用于特別是增加疏水性、油性物質(zhì)在水中的溶解度或者增加具有不同疏水性的兩種物質(zhì)的混溶性。出于這個(gè)原因，這些聚合物通常用在工業(yè)應(yīng)用、化妝品和藥品中。它們也可以用作藥物遞送應(yīng)用的模擬系統(tǒng)，特別是為了改變藥物的吸收或其向靶組織的遞送。公知的表面活性劑包括聚山梨醇酯(聚氧乙烯衍生物；吐溫)和泊洛沙姆(即基于環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的共聚物，也稱作Pluronic?)。按照本發(fā)明，優(yōu)選的表面活性劑是泊洛沙姆表面活性劑，并且更優(yōu)選的是泊洛沙姆 188 (Pluronic?F68)。[0035]-術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定劑”或“等滲劑”，如本說(shuō)明書(shū)所用，是生理上可耐受的并賦予制劑合適的穩(wěn)定性/張力的化合物。特別是，它可以阻止細(xì)胞膜在與制劑接觸時(shí)水的跨細(xì)胞膜凈流量。在冷凍干燥(凍干)的過(guò)程中，穩(wěn)定劑作為冷凍保護(hù)劑也是有效的?；衔锶绺视?，通常用于這樣的目的。其它合適的穩(wěn)定劑包括(但不限于)氨基酸或蛋白質(zhì)(如甘氨酸或白蛋白)，鹽(如氯化鈉)，和糖(例如葡萄糖、甘露糖醇、蔗糖和乳糖)。按照本發(fā)明，優(yōu)選的穩(wěn)定劑是一種糖，甚至更優(yōu)選蔗糖。
[0036]-本說(shuō)明書(shū)所用的術(shù)語(yǔ)“小瓶”或“容器”，泛指適于將FGF-18制劑保存于凍干狀態(tài)的容器。同樣地，它可保存用于復(fù)溶的溶劑?？捎糜诒景l(fā)明的小瓶包括例如注射器、安瓿、藥筒，或其他適合于給患者經(jīng)注射(優(yōu)選經(jīng)關(guān)節(jié)內(nèi)注射)遞送FGF-18制劑的容器?；蛘撸４鍲GF-18制劑的小瓶和保存復(fù)溶用溶劑的小瓶可作為雙室系統(tǒng)的兩個(gè)隔室(例如注射器或藥筒)。適合于包裝關(guān)節(jié)內(nèi)注射用產(chǎn)品的小瓶是本領(lǐng)域公知的和經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的。
[0037]-術(shù)語(yǔ)“溶劑”，如本說(shuō)明書(shū)所用，是指水性或非水性的液體溶劑。溶劑的選擇特別取決于藥物化合物在所述溶劑中的溶解度及給藥方式。水性溶劑可僅由水組成，或者可以由水加一種或幾種可混溶的溶劑組成，并且可包含溶解的溶質(zhì)，如糖、緩沖劑、鹽或其它賦形劑。更常用的非水溶劑是短鏈的有機(jī)醇，如甲醇、乙醇、丙醇；短鏈的酮，如丙酮；和多元醇，如甘油。按照本發(fā)明，優(yōu)選的溶劑是一種水性溶劑，例如水或鹽水溶劑。
[0038]-術(shù)語(yǔ)“軟骨疾病”，如本說(shuō)明書(shū)所用，包括由于外傷或軟骨病造成的損害引起的病癥。給以本說(shuō)明書(shū)所描述的FGF-18制劑可以治療軟骨疾病的例子包括(但不限于)關(guān)節(jié)炎，如骨關(guān)節(jié)炎或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，和軟骨損傷。
[0039]-所用的術(shù)語(yǔ)“骨關(guān)節(jié)炎”意指關(guān)節(jié)炎的最常見(jiàn)形式。它可能由軟骨斷裂而引起。軟骨的小片可能折斷并導(dǎo)致骨頭之間的關(guān)節(jié)疼痛和腫脹。隨著時(shí)間的推移，軟骨可以完全磨損，骨頭會(huì)相互摩擦。骨關(guān)節(jié)炎可累及任何關(guān)節(jié)，但通常涉及手及負(fù)重關(guān)節(jié)，如髖、膝、腳和脊柱。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，骨關(guān)節(jié)炎可以是膝骨關(guān)節(jié)炎或髖骨關(guān)節(jié)炎。本領(lǐng)域技術(shù)人員充分知曉本領(lǐng)域所使用的骨關(guān)節(jié)炎分類，特別是OARSI評(píng)估系統(tǒng)(例如見(jiàn)Custers等人，2007)。骨關(guān)節(jié)炎是一種可通過(guò)給予本發(fā)明的FGF-18制劑進(jìn)行治療的優(yōu)選的軟骨疾病。
[0040]-本說(shuō)明書(shū)所用的術(shù)語(yǔ)“軟骨損傷”是特別由創(chuàng)傷引起的軟骨疾病或軟骨損傷。軟骨損傷可以是創(chuàng)傷性機(jī)械破壞的結(jié)果，更特別是事故或手術(shù)的結(jié)果。此外，此定義中還考慮與運(yùn)動(dòng)有關(guān)的損傷或與運(yùn)動(dòng)有關(guān)的關(guān)節(jié)組織的磨損。
[0041]發(fā)明詳述
[0042]本發(fā)明的主要目的是提供一種穩(wěn)定的凍干制劑，其包含或由FGF-18蛋白、緩沖液、泊洛沙姆表面活性劑和作為穩(wěn)定劑的糖組成。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，緩沖液是磷酸鹽緩沖液，泊洛沙姆表面活性劑是泊洛沙姆188，穩(wěn)定劑是蔗糖。優(yōu)選地，F(xiàn)GF-18蛋白選自下列物質(zhì)組成的組:1) 一種多肽，包含或由成熟形式的人FGF-18組成，其相應(yīng)的序列包含或由SEQ ID NO:1的殘基28 (Glu)-殘基207 (Ala)組成，2) —種多肽，包含或由截短形式的人FGF-18組成，其包含或由SEQ ID N0:1的殘基28 (Glu)-殘基196 (Lys)組成，和
3)一種多肽，包含或由SEQ ID NO:2組成。更優(yōu)選地，F(xiàn)GF-18是trFGF-18。
[0043]本發(fā)明中FGF-18的濃度較好是或約20_300mcg/小瓶，優(yōu)選是或約20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或 300mcg/ 小瓶，甚至更優(yōu)選是或約 20、30、60、100、200 或300mcg/小瓶。FGF-18可以被添加過(guò)量5%，以防止在配制過(guò)程中可能會(huì)發(fā)生的蛋白質(zhì)損失。例如，F(xiàn)GF-18濃度為30mcg/小瓶時(shí)，該化合物可以被加入的量為31.5mcg/小瓶。
[0044]優(yōu)選地，本發(fā)明的制劑在凍干時(shí)和/或在包裝中保持至少80%的FGF-18生物活性至少12個(gè)月(第一次使用之前)。如下面“實(shí)施例”部分中所描述的，可測(cè)量FGF-18的活性。
[0045]按照本發(fā)明，優(yōu)選的緩沖液是磷酸鹽緩沖液，并保持pH在包括6-8之間的范圍內(nèi)，優(yōu)選在包括7-7.5之間的范圍內(nèi)，甚至更優(yōu)選是或約7.2。
[0046]在整個(gè)技術(shù)方案中緩沖液的濃度最好是或約5 - 500mM。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，緩沖液的濃度是或約10 - lOOmM。優(yōu)選地，緩沖液的濃度是或約10mM。
[0047]本發(fā)明中的穩(wěn)定劑優(yōu)選糖。優(yōu)選的糖是蔗糖。優(yōu)選地，穩(wěn)定劑的濃度是或約0.5 -250mg/小瓶,更優(yōu)選是或約I至IOOmg/小瓶,更特別是或約15至60mg/小瓶,甚至最優(yōu)選的是或約30mg/小瓶。
[0048]本發(fā)明中的表面活性劑優(yōu)選泊洛沙姆表面活性劑，特別是泊洛沙姆188 (即Pluronic?.F68)。優(yōu)選地，表面活性劑的濃度是或約0.01 -1Omg/小瓶，更優(yōu)選是或約
0.05-5mg/小瓶,更特別是或約0.1至約Img/小瓶,甚至最優(yōu)選的是或約0.1、0.2或0.4mg/小瓶，特別是或約0.2mg/ 小瓶。
[0049]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的凍干制劑包含或由約20、30、60、100、200或300mcg/小瓶FGF-18、IOmM磷酸鹽緩沖液(pH7.2)、30mg/小瓶蔗糖和0.2mg/小瓶泊洛沙姆188組成。當(dāng)包含5%過(guò)量時(shí)，本發(fā)明的凍干制劑包含的FGF-18是或約21、31.5、63、105、210 或 315mg/ 小瓶。
[0050]在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明針對(duì)一種穩(wěn)定的凍干制劑，其包含:
[0051]DFGF-18:蔗糖，濃度比是或約1:95000至是或約1:6000，較佳是或約1:92000、1:61000,1:31000,1:18450,1:9200 或 1:6100，
[0052]2)FGF-18:泊洛沙姆188，濃度比是或約1:25至是或約6:10，較佳是或約1:25、5:83、5:42、1:5、2:5 或 6:10，
[0053]3)FGF-18:磷酸緩沖液(pH7.2)，摩爾比是或約1:10500至是或約1:700，優(yōu)選是或約 1:10500、1:7000、1:3500、1:2100,1:1050 或 1:700，
[0054]其中，所述FGF-18蛋白較佳選自下列物質(zhì)組成的組:1) 一種多肽，包含或由SEQID NO:1的氨基酸殘基28 (Glu)-207 (Ala)組成，2) —種多肽，包含或由SEQ ID NO:1的氨基酸殘基28 (Glu)-196 (Lys)組成，和3) —種多肽，包含或由SEQ ID N0:2組成。更優(yōu)選地，F(xiàn)GF-18蛋白包含或由SEQ ID NO:1的氨基酸殘基28 (Glu) -207 (Ala)組成。
[0055]在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明是針對(duì)一種穩(wěn)定的凍干制劑，其包含:1)FGF_18:鹿糖，摩爾比是或約1:90000至是或約1:5000,優(yōu)選是或約1:87000、1:58000、1:29000、1:17400、1:8700 或 1:5800，
[0056]2)FGF-18:泊洛沙姆188，摩爾比是或約5:120至是或約5:8，優(yōu)選是或約5:118、5:79、10:79、10:47、5:12 或 5:8，
[0057]3)FGF-18:磷酸鹽緩沖液(pH7.2)，摩爾比是或約1:10000至是或約1:700，優(yōu)選是或約 1:10000、1:6600、1:3300、1:2000、1:1000 或 1:700，
[0058]其中，F(xiàn)GF-18蛋白較佳選自下列物質(zhì)組成的組:1) 一種多肽，包含或由SEQ IDNO:1的氨基酸殘基28 (Glu)-207 (Ala)組成，2) —種多肽，包含或由SEQ ID NO:1的氨基酸殘基28 (Glu)-196 (Lys)組成，和3) —種多肽，包含或由SEQ ID N0:2組成。更優(yōu)選地，F(xiàn)GF-18蛋白包含或由SEQ ID NO:1的氨基酸殘基28 (Glu)-196 (Lys)組成。甚至更特別地，F(xiàn)GF-18蛋白包含或由SEQ ID N0:2組成。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，F(xiàn)GF-18蛋白質(zhì)是 trFGF-18。
[0059]本發(fā)明還提供一種用于制造上述任何一種穩(wěn)定的FGF-18冷凍干燥制劑的方法，該方法包括以下步驟:
[0060]I)形成FGF-18與緩沖液、泊洛沙姆表面活性劑和作為穩(wěn)定劑的糖的混合物，并
[0061]2)將混合物凍干。
[0062]步驟I和2用常規(guī)方法進(jìn)行。作為一個(gè)例子，為了制備合適的穩(wěn)定制劑，將給定量的FGF-18 (如trFGF-18)與磷酸鹽緩沖液(pH值保持在或約7.2)、泊洛沙姆188和蔗糖混合。這些化合物中的每一個(gè)(即FGF-18、緩沖液、表面活性劑和穩(wěn)定劑)可以采用上面描述的濃度、PH值和/或比例。將所得到的混合物冷凍干燥，然后分裝到小瓶中。本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到該 方法可作一些變化。
[0063]本發(fā)明還提供一種醫(yī)藥或獸醫(yī)用制品，所述制品包括:
[0064]I)第一容器，包含上面描述的任何一種穩(wěn)定的冷凍干燥制劑，所述制劑包含或由FGF-18、緩沖液、泊洛沙姆表面活性劑和作為穩(wěn)定劑的糖組成，和
[0065]2)第二容器，包含復(fù)溶用的溶劑。
[0066]作為一個(gè)例子，第一容器包含一種穩(wěn)定的冷凍干燥制劑，該制劑包含或由給定量的FGF-18(如trFGF-18)、磷酸鹽緩沖液(其保持pH值在或約7.2)、泊洛沙姆188和蔗糖組成；第二容器包含鹽水溶液(0.9% w/v注射用氯化鈉)。這些化合物中的每一種(即FGF-18、緩沖液、表面活性劑和穩(wěn)定劑)可以采用上面描述的濃度、PH值和/或比例。優(yōu)選地，保存FGF-18制劑的容器和保存復(fù)溶用溶劑的容器相當(dāng)于雙室系統(tǒng)的兩個(gè)隔室(例如注射器或藥筒)。
[0067]本說(shuō)明書(shū)還描述了一種包裝材料，其提供如何用溶劑(第二容器)復(fù)溶FGF-18冷凍干燥制劑(第一容器)的說(shuō)明。
[0068]本發(fā)明的冷凍干燥制劑可以保存至少約12個(gè)月至約24個(gè)月。首次使用前，制劑應(yīng)在優(yōu)選的儲(chǔ)存條件下避光(最好是在黑暗中)保存于室溫下(在或約25°C)。
[0069]本發(fā)明的穩(wěn)定的冷凍干燥制劑需要進(jìn)行復(fù)溶，在使用前即注射前，最好在無(wú)菌條件下用溶劑如水或鹽水溶液(如0.9% w/v的氯化鈉注射液)進(jìn)行復(fù)溶。復(fù)溶后，擬注射的體積優(yōu)選0.5ml至5ml，更優(yōu)選為0.5、I或2ml。FGF-18應(yīng)在復(fù)溶后一小時(shí)內(nèi)給藥為佳。
[0070]本發(fā)明提供了穩(wěn)定的FGF-18冷凍干燥制劑，特別是用于單次使用，適合于醫(yī)藥用或獸醫(yī)用的制劑。
[0071]本發(fā)明的穩(wěn)定的含F(xiàn)GF-18冷凍干燥制劑可在復(fù)溶后用于給藥，以改善軟骨修復(fù)或治療軟骨疾病，如骨關(guān)節(jié)炎或軟骨損傷。[0072]這些穩(wěn)定的冷凍干燥制劑，在復(fù)溶后，適于以注射劑和其它可選擇遞送系統(tǒng)的形式加以使用。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的制劑用于關(guān)節(jié)內(nèi)注射。它們?cè)趶?fù)溶后可以通過(guò)直接注射到關(guān)節(jié)滑液中或直接注入缺陷部位進(jìn)行給藥。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在選自髖、膝、肘、腕、踝、脊柱、腳、手指、腳趾、手、肩、肋骨、肩胛骨、大腿、小腿、腳踝關(guān)節(jié)和沿脊柱骨點(diǎn)的關(guān)節(jié)，進(jìn)行關(guān)節(jié)內(nèi)給藥。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，在髖關(guān)節(jié)或膝關(guān)節(jié)進(jìn)行關(guān)節(jié)內(nèi)給藥。
[0073]本發(fā)明的FGF-18制劑穩(wěn)定性改善，可以很容易地存儲(chǔ)在室溫下(在或約25°C)或2-8°C (見(jiàn)下面的實(shí)施例)，優(yōu)選在室溫下。事實(shí)上，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，包含F(xiàn)GF-18 (例如trFGF-18)、10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.2)、30mg/小瓶蔗糖和0.2mg/小瓶泊洛沙姆188的冷凍干燥制劑，隨著時(shí)間的推移是穩(wěn)定的，特別是當(dāng)在室溫下保存時(shí)。所述制劑活性成分FGF-18的丟失降到最低，還發(fā)現(xiàn)，所述制劑是更耐氧化和蛋白質(zhì)聚集體形成的。 [0074]下面提供實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的制劑和組合物的制備。本發(fā)明的范圍不應(yīng)被理解為僅僅由下面的實(shí)施例組成。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0075]圖1:顯示冷凍干燥前表面活性劑(泊洛沙姆188)對(duì)FGF-18回收的影響。使用以磷酸鹽緩沖液(ρΗ7.2)配制的含1011^/1111(+5(%過(guò)量疋6?-18的前制劑(pre-formulation),而表面活性劑的濃度不同(從O到0.2 % )。評(píng)估過(guò)濾前(BF)和過(guò)濾后(T=O )每個(gè)前制劑中的蛋白質(zhì)含量。
[0076]序列的描述:
[0077]SEQ ID N0.1:天然人FGF-18的氨基酸序列。
[0078]SEQ ID N0.2:截短的重組FGF-18 (trFGF-18)的氨基酸序列。
實(shí)施例
[0079]材料
[0080]本實(shí)施例的截短的重組FGF-18 (trFGF-18)是按照專利申請(qǐng)W02006/063362中所描述的技術(shù)通過(guò)在大腸桿菌中的表達(dá)而制備的。下面的實(shí)施例中，trFGF-18和FGF-18可以互換使用。
[0081]實(shí)施例中使用的其它物質(zhì)有以下幾種:
[0082]-蔗糖(1.07653，默克公司，分子量:342.30克/摩爾)
[0083]-磷酸二氫鈉一水合物(1.06345，默克公司)
[0084]-磷酸氫二鈉二水合物(1.06586，默克公司)
[0085]-泊洛沙姆188(Lutrol F68DAC，USP/NF,巴斯夫，分子量:8400克/摩爾)
[0086]-注射用水
[0087]-鹽水溶液(0.9% w/v的注射用氯化鈉)
[0088]-抗FGF-18單克隆抗體，克隆#F5A2，蛋白質(zhì)含量(由RBM提供)
[0089]-BAF3-FGFR3C細(xì)胞(華盛頓大學(xué))
[0090]-羅斯韋爾公園紀(jì)念研究所(RPMI)1640 (Roswell Park Memorial Institute,(RPMI) 1640)基選擇性培養(yǎng)基(Invitrogen)[0091]-ATPIitel 步發(fā)光測(cè)定系統(tǒng)(Perkin Elmer 制)
[0092]-肝素H3149 (Sigma)
[0093]設(shè)備
[0094]-AMICON ULTRA-410, 000 截?cái)?超濾管)(UFC8012024，Amicon)
[0095]-Biacore2000 (Biacore)
[0096]-CO2 培養(yǎng)箱(Heraeus)
[0097]-TSK2000SWxl 柱，7.8X300mm，5y (TosoHaas，代碼 08540)
[0098]-TSKG2000 保護(hù)柱(Hichrom，代碼 8543)
[0099]-高效液相色譜系統(tǒng)(Waters)
[0100]-光度計(jì)(PerkinElmer)
[0101]-膜過(guò)濾器0.22 μ m (Durapore 型 GWVP, Millipore)
[0102]-Stabileo 軟件(ver.1.1 ;微軟?軟件包 Excel Visual Basic?)
[0103]-GraphPad 軟件(Pri sm)
[0104]-不鎊鋼持釬器22ml和220ml容量(Sartorius)
[0105]-Zorbax300SB-C18 (150x4.6cm)柱
`[0106]-DIN2R (3ml)玻璃小瓶(Nuova OMPI)
[0107]-涂層橡膠塞(S2F452，D777-1，B2-40，WestPharmaceutical)
[0108]-橡膠塞(代碼1779,W1816 灰色，Pharma-Gummi )
[0109]方法
[0110]對(duì)制劑的不同檢測(cè)方法
[0111]標(biāo)準(zhǔn)方法用于:
[0112]-排阻高效液相色譜法(SE-HPLC)，
[0113]-反相高效液相色譜法(RP-HPLC)，
[0114]-殘余水分，
[0115]-pH 值，
[0116]-滲透度(僅在時(shí)間為O時(shí))，
[0117]-SDS-PAGE/SS，和
[0118]-作肽圖/超高效液相色譜法(氧化形式)。
[0119]蛋白質(zhì)含暈
[0120]用Biacore進(jìn)行不同制劑中蛋白質(zhì)即trFGF-18的定量。對(duì)含trFGF-18的樣品(25 μ L)進(jìn)行測(cè)試(在10mg/mL BSA中作適當(dāng)稀釋)，于25°C以5 μ L/分鐘流速流經(jīng)表面涂有抗-FGF-18單克隆抗體克隆F5A2的傳感器，然后用IOmM甘氨酸(ρΗ2.0) 5 μ L作為再生緩沖液。每次分析使用125 - 2000ng/ml參比標(biāo)準(zhǔn)(IRS FGF_18N0.051230)。收集結(jié)果，以共振單位(RU)表示，從用二次算法和對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線外推每個(gè)樣品的FGF-18水平。
[0121]牛物測(cè)丨定
[0122]采用體外生物測(cè)定法，用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了 FGF受體3c (FGFR3c)的BaF3細(xì)胞株測(cè)定FGF-18生物活性，為增殖活性。表達(dá)FGFR3c的BaF3細(xì)胞在FGF-18刺激下增殖。
[0123]在RPMI1640基選擇性培養(yǎng)基中，在r_hIL_3作為生長(zhǎng)因子存在下，培養(yǎng)BaF3/FGFR3c細(xì)胞。為了具體測(cè)試FGF-18的增殖效應(yīng)，細(xì)胞需要去除IL-3。因此，在檢測(cè)前將細(xì)胞在缺乏r-hIL-3的情況下于37°C、5% CO2中培養(yǎng)26小時(shí)。
[0124]將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品用檢測(cè)介質(zhì)作5倍系列稀釋，濃度范圍在0.002U/ml至177.5U/ml。在lyg/mL肝素和10%新生牛血清白蛋白存在下，將去除IL-3的BAF3/FGFR3c細(xì)胞(20，000細(xì)胞/孔)與FGF-18 —起于37°C、5% CO2培養(yǎng)，48小時(shí)后用一種基于螢火蟲(chóng)熒光素酶的ATP監(jiān)控系統(tǒng)一 "ATPIitel步”發(fā)光分析對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行評(píng)估。
[0125]采用擴(kuò)展的劑量-反應(yīng)曲線模型測(cè)量樣品的效價(jià)。用這個(gè)模型，以S形劑量-反應(yīng)曲線擬合標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的完整劑量-反應(yīng)曲線，采用可變斜率(4PL)算法，報(bào)告cps (即每秒計(jì)數(shù))與FGF-18濃度對(duì)數(shù)的關(guān)系。由GraphPad軟件自動(dòng)計(jì)算每個(gè)曲線的EC5(I。根據(jù)參比制劑的EC5tl和未知樣品的EC5tl之間的比率(效力比)計(jì)算樣品的效價(jià)。FGF-18的效價(jià)表示為U/mL。
[0126]實(shí)施例1: trFGF-18冷凍干燥制劑
[0127]下面的表1中提供FGF-18冷凍干燥制劑的組成。
[0128]表1:FGF_18冷凍干燥制劑(*)的組成
[0129]
【權(quán)利要求】
1.一種穩(wěn)定的冷凍干燥制劑，包含F(xiàn)GF-18、緩沖液、泊洛沙姆表面活性劑和作為穩(wěn)定劑的糖。
2.如權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定的冷凍干燥制劑，其中所述緩沖液是磷酸鹽緩沖液，并保持PH值在包含6和8之間的范圍內(nèi)。
3.如權(quán)利要求2所述的穩(wěn)定的冷凍干燥制劑，其中所述磷酸鹽緩沖液保持pH值是或約7.2。
4.如前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的穩(wěn)定的冷凍干燥制劑，其中所述緩沖液的濃度是或約5至lOOmM。
5.如前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的穩(wěn)定的冷凍干燥制劑，其中所述泊洛沙姆表面活性劑是泊洛沙姆188。
6.如前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的穩(wěn)定的冷凍干燥制劑，其中所述泊洛沙姆表面活性劑的濃度是或約0.1-0.4mg/小瓶。
7.如前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的穩(wěn)定的冷凍干燥制劑，其中所述穩(wěn)定劑是蔗糖。
8.如前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的穩(wěn)定的冷凍干燥制劑，其中所述穩(wěn)定劑的濃度是或約10-60mg/小瓶。
9.如前述權(quán)利要 求中任何一項(xiàng)所述的穩(wěn)定的冷凍干燥制劑，其中所述FGF-18的濃度是或約20-300mg/小瓶。
10.如前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的穩(wěn)定的冷凍干燥制劑，其中所述制劑包含20、30,60,100,200或300mcg/小瓶FGF-18，IOmM且pH是或約7.2的磷酸鹽緩沖液，30mg/小瓶蔗糖和0.2mg/小瓶泊洛沙姆188。
11.如前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的穩(wěn)定的制劑，其中所述制劑還包含5%過(guò)量的FGF-18 ο
12.如前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的穩(wěn)定的冷凍干燥制劑，其中FGF-18選自下列物質(zhì)組成的組: a.一種多肽，其包含或由SEQ ID NO:1的氨基酸殘基28-207組成， b.一種多肽，其包含或由SEQ ID NO:1的氨基酸殘基28-196組成，和 c.一種多肽，其包含或由SEQ ID N0:2組成。
13.前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述穩(wěn)定的冷凍干燥制劑的制造方法，包括以下步驟: a.形成FGF-18與緩沖液、表面活性劑和穩(wěn)定劑的混合物，和 b.將混合物進(jìn)行冷凍干燥。
14.一種制品，包括第一容器，其包含權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述穩(wěn)定的冷凍干燥制劑；和第二容器，其包含用于復(fù)溶的溶劑。
15.如權(quán)利要求14所述的制品，其中包含穩(wěn)定的冷凍干燥制劑的容器和包含用于復(fù)溶的溶劑的容器是雙室系統(tǒng)的兩個(gè)隔室。
【文檔編號(hào)】A61K38/18GK103619347SQ201280029683
【公開(kāi)日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月17日
【發(fā)明者】A·切萊蒂, A·德?tīng)柪飱W 申請(qǐng)人:阿雷斯貿(mào)易股份有限公司