用于癌癥的個(gè)體化疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及提供對(duì)患者腫瘤特異并且可用于免疫治療原發(fā)腫瘤及腫瘤轉(zhuǎn)移的疫苗。在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及一種用于提供個(gè)體化癌癥疫苗的方法，其包括以下步驟：(a)鑒定癌癥患者腫瘤樣本中的癌癥特異性體細(xì)胞突變以提供所述患者的癌癥突變標(biāo)記(signature)；以及(b)提供以步驟(a)中獲得的所述癌癥突變標(biāo)記為特征(featuring)的疫苗。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及可通過所述方法獲得的疫苗。
【專利說明】用于癌癥的個(gè)體化疫苗
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及提供對(duì)患者腫瘤特異并且可用于免疫治療原發(fā)腫瘤及腫瘤轉(zhuǎn)移的疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是死亡的主要原因，占所有死亡的四分之一。傳統(tǒng)上，癌癥治療基于平均定律，即對(duì)最大數(shù)目患者而言作用最佳的癌癥治療。然而，由于癌癥的分子異質(zhì)性(heterogeneity),常常只有低于25%的受治療個(gè)體從經(jīng)批準(zhǔn)的療法中獲益?；诨颊叩亩ㄖ浦委煹膫€(gè)體化醫(yī)療被認(rèn)為是解決藥物開發(fā)革新中的低效和高成本的潛在方法。
[0003]抗原特異性免疫治療的目的在于加強(qiáng)或誘導(dǎo)患者中的特異性免疫應(yīng)答并且已經(jīng)成功用于控制癌癥疾病。T細(xì)胞在人和動(dòng)物的細(xì)胞介導(dǎo)免疫中發(fā)揮核心作用。在T細(xì)胞表面上表達(dá)的T細(xì)胞受體(TCR)介導(dǎo)特定抗原的識(shí)別和結(jié)合。T細(xì)胞的T細(xì)胞受體(TCR)能夠與結(jié)合于主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子并且在靶細(xì)胞表面上呈遞的免疫原性肽(表位)相互作用。TCR的特異性結(jié)合觸發(fā)T細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)級(jí)聯(lián)，導(dǎo)致增殖和分化成成熟的效應(yīng)T細(xì)胞。
[0004]越來越多的病原體相關(guān)抗原和腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的鑒定產(chǎn)生了大批用于免疫治療的合適靶標(biāo)。 可通過主動(dòng)或被動(dòng)免疫策略特異性靶向呈遞源于這些抗原的免疫原性肽(表位)的細(xì)胞。主動(dòng)免疫可傾向于誘導(dǎo)患者的抗原特異性T細(xì)胞并使其擴(kuò)增，所述T細(xì)胞能夠特異性識(shí)別和殺死病變細(xì)胞?？捎糜谀[瘤疫苗接種的不同抗原形式包括全癌癥細(xì)胞、蛋白質(zhì)、肽或免疫載體如RNA、DNA或病毒載體，其可在體內(nèi)直接施用或在體外通過脈沖(pulse)DC隨后轉(zhuǎn)移入患者。
[0005]癌癥可由基因組突變和表觀遺傳學(xué)變化的積累所引起，其中的一部分可能起致病性作用。除了腫瘤相關(guān)抗原之外，人癌癥平均攜帶100~120個(gè)非同義突變，其中的許多可由疫苗靶向。腫瘤中超過95%的突變是獨(dú)特的且患者特異的(Weide等2008:J.1mmunother.31，180-188)。改變蛋白質(zhì)的體細(xì)胞突變(可產(chǎn)生腫瘤特異性T細(xì)胞表位)的數(shù)目為30至400個(gè)。計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)每位患者有40至60個(gè)HLA I類限制性表位來源于腫瘤特異性體細(xì)胞突變(Azuma等1993:Nature366，76-79)。另外，從頭免(de novo)疫原性HLA II類限制性表位可能也是由腫瘤相關(guān)突變?cè)斐傻模撬鼈兊臄?shù)目仍未知。
[0006]特別地，一些非同義突變以致病性的方式參與惡性轉(zhuǎn)化，其對(duì)于維持致癌表型(驅(qū)動(dòng)突變(driver mutation))是至關(guān)重要的，并且可代表癌癥細(xì)胞的潛在“阿喀琉斯之踵(Achilles’ heel)”。因?yàn)檫@種非同義突變不經(jīng)受中樞免疫耐受，所以它們可以是個(gè)體癌癥疫苗開發(fā)的理想候選物。在原發(fā)腫瘤中發(fā)現(xiàn)的突變也可存在于轉(zhuǎn)移中。然而，若干研究表明患者的轉(zhuǎn)移瘤需要個(gè)體腫瘤進(jìn)展中的額外的基因突變，這些突變常常是臨床相關(guān)的(Suzuki 等 2007:Mol.0ncol.1 ⑵，172-180 !Campbell 等 2010:Nature467 (7319),1109-1113)。另外，許多轉(zhuǎn)移的分子特征也與原發(fā)腫瘤的顯著不同。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)問題是提供高效的個(gè)體化癌癥疫苗。[0008]本發(fā)明基于鑒定患者特異性癌癥突變以及靶向患者的個(gè)體癌癥突變“標(biāo)記(signature) ”。特別地，本發(fā)明涉及基于基因組測(cè)序、優(yōu)選外顯子組測(cè)序或轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的個(gè)體化免疫治療方法，其目的在于免疫治療性靶向癌癥中的多個(gè)個(gè)體突變。使用新一代測(cè)序(NGS)的測(cè)序使得能夠快速和節(jié)約成本地鑒定患者特異性癌癥突變。
[0009]鑒定導(dǎo)致將由患者主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子呈遞的氨基酸變化的非同義點(diǎn)突變提供了對(duì)患者癌癥特異但在患者正常細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)的新表位(novel epitope或neo-epitope)。收集一系列來自癌癥細(xì)胞如循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell,CTC)的突變使得能夠提供誘導(dǎo)可靶向原發(fā)腫瘤(即使包含遺傳上不同的亞類群)以及腫瘤轉(zhuǎn)移之免疫應(yīng)答的疫苗。對(duì)于疫苗接種，根據(jù)本申請(qǐng)鑒定的這種新表位以包含所述新表位的多肽的形式在患者中提供，在適當(dāng)加工和被MHC分子呈遞后，新表位被展示于患者的免疫系統(tǒng)用于刺激適當(dāng)?shù)腡細(xì)胞。 [0010]優(yōu)選地，這種多肽通過施用編碼該多肽的RNA而在患者中提供。在多種動(dòng)物模型中成功測(cè)試了通過不同免疫途徑將體外轉(zhuǎn)錄的RNA(IVT-RNA)直接注射至患者中的策略。RNA可在經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中被翻譯并且加工后的表達(dá)蛋白質(zhì)在細(xì)胞表面的MHC分子上呈遞，以引發(fā)免疫應(yīng)答。
[0011]使用RNA作為一種可逆基因治療的優(yōu)點(diǎn)包括瞬時(shí)表達(dá)和非轉(zhuǎn)化性特性。RNA不需要進(jìn)入核以被表達(dá)，另外不會(huì)整合至宿主基因組中，從而消除了致癌的風(fēng)險(xiǎn)。用RNA可得到的轉(zhuǎn)染率相當(dāng)高。另外，所獲得蛋白質(zhì)的量相當(dāng)于生理性表達(dá)中的量。
[0012]用于免疫治療性靶向多個(gè)個(gè)體突變的依據(jù)是(i)這些突變被專門地表達(dá)，(ii)可以預(yù)計(jì)對(duì)于T細(xì)胞免疫治療而言突變表位是理想的，這是因?yàn)樽R(shí)別它們的T細(xì)胞不經(jīng)歷胸腺選擇，(iii)可例如通過靶向?qū)δ[瘤表型高度相關(guān)的“驅(qū)動(dòng)突變”來減少腫瘤免疫逃逸，和(iv)多表位免疫應(yīng)答產(chǎn)生改進(jìn)的臨床益處的可能性更高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明涉及用于提供個(gè)體化重組癌癥疫苗的有效方法，所述疫苗誘導(dǎo)癌癥患者的有效和特異性免疫應(yīng)答并且可靶向原發(fā)腫瘤及腫瘤轉(zhuǎn)移。當(dāng)向患者施用時(shí)，根據(jù)本發(fā)明提供的癌癥疫苗提供了一批對(duì)患者腫瘤特異的適合用于刺激、啟動(dòng)(priming)和/或擴(kuò)增T細(xì)胞的MHC呈遞表位，所述T細(xì)胞針對(duì)表達(dá)所述MHC呈遞表位所來源之抗原的細(xì)胞。因此，本文中描述的疫苗優(yōu)選地能夠誘導(dǎo)或促進(jìn)細(xì)胞應(yīng)答(優(yōu)選細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性)，所述細(xì)胞應(yīng)答針對(duì)特征為用I類MHC呈遞一種或更多種癌癥表達(dá)抗原的癌癥疾病。由于根據(jù)本發(fā)明提供的疫苗將靶向癌癥特異性突變，所以其將對(duì)患者腫瘤特異。
[0014]在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及一種用于提供個(gè)體化癌癥疫苗的方法，其包括以下步驟:
[0015](a)鑒定癌癥患者腫瘤樣本中的癌癥特異性體細(xì)胞突變，以提供所述患者的癌癥突變標(biāo)記(signature);以及
[0016](b)提供以步驟(a)中獲得的所述癌癥突變標(biāo)記為特征的疫苗。
[0017]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括以下步驟:
[0018]i)提供來自癌癥患者的腫瘤樣本和優(yōu)選地來源于所述癌癥患者的非致瘤性(non-tumorigenous)樣本；[0019]ii)鑒定所述腫瘤樣本的基因組、外顯子組和/或轉(zhuǎn)錄組與所述非致瘤性樣本的基因組、外顯子組和/或轉(zhuǎn)錄組之間的序列差異；
[0020]iii)設(shè)計(jì)多肽，其包含整合步驟(ii)中確定的所述序列差異的表位；
[0021]iv)提供步驟(iii)中設(shè)計(jì)的所述多肽或編碼所述多肽的核酸(優(yōu)選RNA);以及
[0022]v)提供包含步驟(iv)中提供的所述多肽或核酸的疫苗。
[0023]根據(jù)本發(fā)明，腫瘤樣本涉及來源于包含或預(yù)期包含腫瘤或癌癥細(xì)胞之患者的任何樣品，例如身體樣品。所述身體樣品可以是任何組織樣品，例如血液、獲自原發(fā)腫瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移的組織樣品、或者包含腫瘤或癌癥細(xì)胞的任何其他樣品。優(yōu)選地，身體樣品為血液，并且在包含于血液中的一個(gè)或更多個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)中確定癌癥特異性體細(xì)胞突變或序列差異。在另一個(gè)實(shí)施方案中，腫瘤樣本涉及一個(gè)或更多個(gè)分離的腫瘤或癌癥細(xì)胞如循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)，或者包含一個(gè)或更多個(gè)分離的腫瘤或癌癥細(xì)胞如循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的樣品。
[0024]非致瘤性樣本涉及來源于患者或優(yōu)選地與所述患者為同一物種的另一個(gè)體(優(yōu)選不包含或預(yù)期不包含腫瘤或癌癥細(xì)胞的健康個(gè)體)的任何樣品，例如身體樣品。所述身體樣品可以是任何組織樣品例如血液或來自非致瘤性組織的樣品。
[0025]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“癌癥突變標(biāo)記(signature) ”可指存在于患者的一個(gè)或更多個(gè)癌癥細(xì)胞中的所有癌癥突變，或者其可指存在于患者的一個(gè)或更多個(gè)癌癥細(xì)胞中的癌癥突變的僅一部分。因此，本發(fā)明可涉及鑒定存在于患者的一個(gè)或更多個(gè)癌癥細(xì)胞中的所有癌癥特異性突變，或者其可涉及鑒定存在于患者的一個(gè)或更多個(gè)癌癥細(xì)胞中的癌癥特異性突變的僅一部分。通常，本發(fā)明的方法提供了多個(gè)突變的鑒定，其提供足夠數(shù)目的待包含至疫苗中的新表位?！鞍┌Y突 變”涉及包含于癌癥細(xì)胞中的核酸與包含于正常細(xì)胞中的核酸之間的序列差異。
[0026]優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的方法中所鑒定的突變是非同義突變，優(yōu)選為在腫瘤或癌癥細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)的非同義突變。
[0027]在一個(gè)實(shí)施方案中，在腫瘤樣本的基因組(優(yōu)選整個(gè)基因組)中確定癌癥特異性體細(xì)胞突變或序列差異。因此，本發(fā)明的方法可包括鑒定一個(gè)或更多個(gè)癌癥細(xì)胞基因組(優(yōu)選整個(gè)基因組)的癌癥突變標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方案中，鑒定癌癥患者腫瘤樣本中癌癥特異性體細(xì)胞突變的步驟包括鑒定全基因組癌癥突變譜。
[0028]在一個(gè)實(shí)施方案中，在腫瘤樣本的外顯子組(優(yōu)選整個(gè)外顯子組)中確定癌癥特異性體細(xì)胞突變或序列差異。外顯子組是由外顯子形成的生物體基因組的一部分，它們是表達(dá)基因的編碼部分。所述外顯子組提供了在蛋白質(zhì)和其他功能性基因產(chǎn)物的合成中所使用的基因藍(lán)圖(genetic blueprint)。它在功能上是基因組的最相關(guān)部分,從而最可能對(duì)生物體的表型有作用。估計(jì)人基因組的外顯子組包含總基因組的1.5% (Ng, PC等，PLoSGen.,4(8) =1-15,2008) 0因此，本發(fā)明的方法可包括鑒定一個(gè)或更多個(gè)癌癥細(xì)胞的外顯子組(優(yōu)選整個(gè)外顯子組)的癌癥突變標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方案中，鑒定癌癥患者腫瘤樣本中癌癥特異性體細(xì)胞突變的步驟包括鑒定全外顯子組癌癥突變譜。
[0029]在一個(gè)實(shí)施方案中，在腫瘤樣本的轉(zhuǎn)錄組(優(yōu)選整個(gè)轉(zhuǎn)錄組)中確定癌癥特異性體細(xì)胞突變或序列差異。轉(zhuǎn)錄組是所有RNA分子的集合,包括在一個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞類群中產(chǎn)生的mRNA、rRNA、tRNA和其他非編碼RNA。在本發(fā)明的上下文中，轉(zhuǎn)錄組意指在某個(gè)時(shí)間點(diǎn)在給定個(gè)體的一個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞類群(優(yōu)選癌癥細(xì)胞類群)或全部細(xì)胞中所產(chǎn)生的所有RNA分子的集合。因此，本發(fā)明的方法可包括鑒定一個(gè)或更多個(gè)癌癥細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組(優(yōu)選整個(gè)轉(zhuǎn)錄組)的癌癥突變標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方案中，鑒定癌癥患者腫瘤樣本中癌癥特異性體細(xì)胞突變的步驟包括鑒定全轉(zhuǎn)錄組癌癥突變譜。
[0030]在一個(gè)實(shí)施方案中，鑒定癌癥特異性體細(xì)胞突變或鑒定序列差異的步驟包括一個(gè)或更多個(gè)、優(yōu)選 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 個(gè)或甚至更多個(gè)
癌癥細(xì)胞的單細(xì)胞測(cè)序。因此，本發(fā)明的方法可包括鑒定所述一個(gè)或更多個(gè)癌癥細(xì)胞的癌癥突變標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥細(xì)胞是循環(huán)腫瘤細(xì)胞?？稍趩渭?xì)胞測(cè)序之前分離癌癥細(xì)胞例如循環(huán)腫瘤細(xì)胞。
[0031]在一個(gè)實(shí)施方案中，鑒定癌癥特異性體細(xì)胞突變或鑒定序列差異的所述步驟涉及使用新一代測(cè)序(NGS)。
[0032]在一個(gè)實(shí)施方案中，鑒定癌癥特異性體細(xì)胞突變或鑒定序列差異的所述步驟包括對(duì)腫瘤樣本的基因組DNA和/或RNA進(jìn)行測(cè)序。
[0033]為了揭示癌癥特異性體細(xì)胞突變或序列差異，優(yōu)選地將從腫瘤樣本中獲得的序列信息與參照(例如通過對(duì)可獲自所述患者或不同個(gè)體之正常非癌性細(xì)胞(例如，生殖系細(xì)胞(germline cell))的核酸(例如DNA或RNA)進(jìn)行測(cè)序所獲得的序列信息)進(jìn)行比較。在一個(gè)實(shí)施方案中，從外周血單核細(xì)胞(PBMC)獲得正?；蚪M生殖系DNA。
[0034]根據(jù)本發(fā)明的方法提供的疫苗涉及這樣的疫苗，當(dāng)向患者施用時(shí)其優(yōu)選地提供一批整合了基于經(jīng)鑒定突變或序列差異之序列變化的MHC呈遞表位，例如2個(gè)或更多個(gè)、5個(gè)或更多個(gè)、10個(gè)或更多個(gè)、15個(gè)或更多個(gè)、20個(gè)或更多個(gè)、25個(gè)或更多個(gè)、30個(gè)或更多個(gè)以及優(yōu)選多至60個(gè)、多至55個(gè)、多至50個(gè)、多至45個(gè)、多至40個(gè)、多至35個(gè)或多至30個(gè)MHC呈遞表位。這種整合基于經(jīng)鑒定突變或序列差異之序列變化的MHC呈遞表位在本文中也稱為“新表位”。這些表位通過患者細(xì)胞(特別是抗原呈遞細(xì)胞)的呈遞優(yōu)選地在與MHC相結(jié)合時(shí)導(dǎo)致T細(xì)胞靶向所述表位，從而靶向表達(dá)MHC呈遞表位所來源之抗原并且在腫瘤細(xì)胞表面上呈遞相同表位的患者腫瘤(優(yōu)選原發(fā)腫瘤及腫瘤轉(zhuǎn)移)。
[0035]為了提供疫苗，本發(fā)明的方法可包括使足夠數(shù)目的新表位(優(yōu)選地以編碼核酸形式)任意包含在疫苗中，或者其可包括確定表位中經(jīng)鑒定突變用于癌癥疫苗接種之可用性的其他步驟。因此，其他步驟可涉及下述中的一個(gè)或更多個(gè):(i)評(píng)估所述序列變化是否位于已知或預(yù)測(cè)的MHC呈遞表位中，(ii)體外和/或計(jì)算機(jī)(in silico)測(cè)試所述序列變化是否位于MHC呈遞表位中，例如測(cè)試所述序列變化是否為加工至MHC呈遞表位和/或作為MHC呈遞表位呈遞的肽序列的一部份，以及(iii)體外測(cè)試所研究的突變表位(尤其是當(dāng)在其天然序列環(huán)境中呈遞時(shí)(例如，當(dāng)側(cè)翼的氨基酸序列也在天然蛋白質(zhì)的所述表位的側(cè)翼時(shí))和當(dāng)在抗原呈遞細(xì)胞中表達(dá)時(shí))是否能夠刺激具有期望特異性的患者的T細(xì)胞。這種側(cè)翼序列各自可包含3個(gè)或更多個(gè)、5個(gè)或更多個(gè)、10個(gè)或更多個(gè)、15個(gè)或更多個(gè)、20個(gè)或更多個(gè)且優(yōu)選多至50個(gè)、多至45個(gè)、多至40個(gè)、多至35個(gè)或多至30個(gè)氨基酸，并且可在表位序列的N末端和/或C末端側(cè)翼。
[0036]根據(jù)本發(fā)明確定的突變或序列差異可依據(jù)其作為表位用于癌癥疫苗接種的可用性進(jìn)行分級(jí)(rank)。因此，在一個(gè)方面中，本發(fā)明的方法包括手動(dòng)或基于計(jì)算機(jī)的分析過程，其中針對(duì)在待提供的各疫苗中的可用性分析并選擇經(jīng)鑒定的突變。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述分析過程是基于計(jì)算算法的過程。優(yōu)選地，所述分析過程包括下述步驟中的一個(gè)或更多個(gè)、優(yōu)選全部:
[0037]-通過例如分析轉(zhuǎn)錄本來鑒定表達(dá)的修飾蛋白質(zhì)的突變；
[0038]-鑒定具有潛在免疫原性的突變，即通過將所獲得的數(shù)據(jù)與經(jīng)確證免疫原性表位的可用數(shù)據(jù)集相比較，所述數(shù)據(jù)集例如在公共免疫表位數(shù)據(jù)庫(kù)(例如，即http: / / WWW.1mmunoepitope.0rg 的 IMMUNE EPITOPE DATABASE AND ANALYSIS RESOURCE)中包含的那些。
[0039]鑒定具有潛在免疫原性之突變的步驟可包括根據(jù)對(duì)其MHC結(jié)合能力(優(yōu)選MHC I類結(jié)合能力)的預(yù)測(cè)對(duì)表位進(jìn)行確定和/或分級(jí)。
[0040]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可通過使用其他參數(shù)例如蛋白質(zhì)影響(proteinimpact)、相關(guān)基因表達(dá)、序列獨(dú)特性、預(yù)測(cè)的呈遞可能性和癌基因相關(guān)性來對(duì)所述表位進(jìn)行選擇和/或分級(jí)。
[0041]多個(gè)CTC分析也使得能夠?qū)ν蛔冞M(jìn)行選擇和優(yōu)先化(prioritization)。例如，與在較少部分CTC中發(fā)現(xiàn)的突變相比，可更高地優(yōu)先化在較大部分CTC中發(fā)現(xiàn)的突變。
[0042]根據(jù)本發(fā)明鑒定并且由本發(fā)明疫苗提供的基于突變的新表位集合優(yōu)選地以包含所述新表位之多肽(多表位多肽)或編碼所述多肽的核酸(特別是RNA)的形式存在。另外，所述新表位可存在于疫苗序列形式的多肽中，即存在于其天然序列環(huán)境中，例如側(cè)翼的氨基酸序列也在天然蛋白質(zhì)的所述表位的側(cè)翼。這種側(cè)翼序列各自可包含5個(gè)或更多個(gè)、10個(gè)或更多個(gè)、15個(gè)或更多個(gè)、20個(gè)或更多個(gè)以及優(yōu)選多至50個(gè)、多至45個(gè)、多至40個(gè)、多至35個(gè)或多至30個(gè)氨基酸，并且可在所述表位序列的N末端和/或C末端側(cè)翼。因此，疫苗序列可包含20個(gè)或更多個(gè)、`25個(gè)或更多個(gè)、30個(gè)或更多個(gè)、35個(gè)或更多個(gè)、40個(gè)或更多個(gè)并且優(yōu)選多至50個(gè)、多至45個(gè)、多至40個(gè)、多至35個(gè)或多至30個(gè)氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述新表位和/或疫苗序列在所述多肽中從頭至尾排列。
[0043]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述新表位和/或疫苗序列通過接頭(特別是中性接頭(neutral linker))分開。根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“接頭”涉及在兩個(gè)肽結(jié)構(gòu)域例如表位或疫苗序列之間以連接所述肽結(jié)構(gòu)域的添加的肽。關(guān)于所述接頭序列沒有特定的限制。然而，優(yōu)選的是所述接頭序列降低兩個(gè)肽結(jié)構(gòu)域之間的空間位阻，被良好地翻譯，以及支持或允許表位的加工。另外，所述接頭應(yīng)不具有或僅具有極少的免疫原性序列元件。優(yōu)選地，接頭不應(yīng)產(chǎn)生可產(chǎn)生不期望免疫反應(yīng)的非內(nèi)源性新表位，像由相鄰新表位之間的匯合點(diǎn)接縫(junction suture)所產(chǎn)生的那些。因此，多表位疫苗應(yīng)優(yōu)選地包含這樣的接頭序列，其能夠降低不期望的MHC結(jié)合匯合點(diǎn)表位(binding junction epitope)的數(shù)目。Hoyt等(EMB0J.25(8)，1720-9,2006)和 Zhang 等(J.Biol.Chem.，279 (10)，8635-41，2004)已經(jīng)證明富含甘氨酸的序列損害蛋白酶體的加工，因此使用富含甘氨酸的接頭序列以盡可能減少可被蛋白酶體加工的包含接頭的肽的數(shù)目。另外，觀察到甘氨酸抑制MHC結(jié)合溝位置處的強(qiáng)結(jié)合(Abastado 等，J.1mmunol.151 (7)，3569-75,1993)。Schlessinger 等(Proteins, 61 (I)，115-26,2005)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包含在氨基酸序列中的氨基酸甘氨酸和絲氨酸產(chǎn)生了更具柔性的蛋白質(zhì)，其被更有效地翻譯和被蛋白酶體加工，使得能夠更好地接近編碼的新表位。所述接頭各自可包含3個(gè)或更多個(gè)、6個(gè)或更多個(gè)、9個(gè)或更多個(gè)、10個(gè)或更多個(gè)、15個(gè)或更多個(gè)、20個(gè)或更多個(gè)以及優(yōu)選多至50個(gè)、多至45個(gè)、多至40個(gè)、多至35個(gè)或多至30個(gè)氨基酸。優(yōu)選地，所述接頭富含甘氨酸和/或絲氨酸氨基酸。優(yōu)選地，所述接頭中至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的氨基酸是甘氨酸和/或絲氨酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，接頭基本上由甘氨酸和絲氨酸氨基酸構(gòu)成。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述接頭包含氨基酸序列(GGS) a(GSS)b(GGG)。(SSG)d(GSG)e，其中a、b、c、d和e獨(dú)立地為選自O(shè)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 的數(shù)字，并且其中 a+b+c+d+e不為0且優(yōu)選為2或更多、3或更多、4或更多或者5或更多。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述接頭包含本文中描述的序列，所述序列包含實(shí)施例中所述的接頭序列，例如序列GGSGGGGSG。
[0044]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明鑒定的和由本發(fā)明疫苗提供的基于突變的新表位的集合優(yōu)選地以在不同多肽上包含所述新表位的多肽集合(其中所述多肽各包含一個(gè)或更多個(gè)新表位(也可重疊))或編碼所述多肽的核酸(特別是RNA)集合的形式存在。 [0045]在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多表位多肽以核酸(優(yōu)選RNA,例如體外轉(zhuǎn)錄的RNA或合成RNA，其可在患者細(xì)胞例如抗原呈遞細(xì)胞中表達(dá)以產(chǎn)生多肽)的形式向患者施用。本發(fā)明還考慮了施用一種或更多種多表位多肽(其對(duì)于本發(fā)明的目的而言包含在術(shù)語“多表位多肽”中)，優(yōu)選地為核酸(優(yōu)選RNA，例如體外轉(zhuǎn)錄的RNA或合成RNA，其可在患者細(xì)胞例如抗原呈遞細(xì)胞中表達(dá)以產(chǎn)生一種或更多種多肽，其可在患者細(xì)胞例如抗原呈遞細(xì)胞中表達(dá)以產(chǎn)生一種或更多種多肽)的形式。在施用多于一種多表位多肽的情況中，由不同多表位多肽所提供的新表位可以不同或部分重疊。一旦在患者細(xì)胞例如抗原呈遞細(xì)胞中呈遞，根據(jù)本發(fā)明的多肽被加工以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明鑒定的新表位。施用根據(jù)本發(fā)明提供的疫苗可提供MHC II類呈遞表位，其能夠針對(duì)表達(dá)MHC呈遞表位所來源之抗原的細(xì)胞引發(fā)CD4+輔助T細(xì)胞應(yīng)答。可替換地或另外地，施用根據(jù)本發(fā)明提供的疫苗可提供MHCI類呈遞表位，其能夠針對(duì)表達(dá)MHC呈遞表位所來源之抗原的細(xì)胞引發(fā)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。另外，施用根據(jù)本發(fā)明提供的疫苗可提供一個(gè)或更多個(gè)新表位(包括已知的新表位和根據(jù)本發(fā)明鑒定的新表位)以及不包含癌癥特異性體細(xì)胞突變但由癌癥細(xì)胞表達(dá)并且優(yōu)選地誘導(dǎo)針對(duì)癌癥細(xì)胞的免疫應(yīng)答(優(yōu)選癌癥特異性免疫應(yīng)答)的一個(gè)或更多個(gè)表位。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用根據(jù)本發(fā)明提供的疫苗提供為MHC II類呈遞表位和/或能夠針對(duì)表達(dá)MHC呈遞表位所來源之抗原的細(xì)胞引發(fā)CD4+輔助T細(xì)胞應(yīng)答的新表位，以及為MHC I類呈遞表位和/或能夠針對(duì)表達(dá)MHC呈遞表位所來源之抗原的細(xì)胞引發(fā)⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答的不包含癌癥特異性體細(xì)胞突變的表位。在一個(gè)實(shí)施方案中，不包含癌癥特異性體細(xì)胞突變之表位來源于腫瘤抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，新表位和不包含癌癥特異性體細(xì)胞突變之表位在治療癌癥中具有協(xié)同效應(yīng)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明提供的疫苗可用于細(xì)胞毒性和/或輔助T細(xì)胞應(yīng)答的多表位刺激。
[0046]在又一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了可通過根據(jù)本發(fā)明之方法獲得的疫苗。因此，本發(fā)明涉及包含重組多肽或編碼所述多肽的核酸的疫苗，所述重組多肽包含基于突變的新表位，所述新表位是由癌癥患者腫瘤樣本中的癌癥特異性體細(xì)胞突變所造成的。這種重組多肽還可包含這樣的表位，其不包含如上所述的癌癥特異性體細(xì)胞突變。在本發(fā)明方法的上下文中，這種疫苗的一些優(yōu)選實(shí)施方案如上所述。
[0047]根據(jù)本發(fā)明提供的疫苗可包含可藥用載體以及可任選地包含一種或更多種佐劑、穩(wěn)定劑等。所述疫苗可以是治療或預(yù)防疫苗的形式。[0048]另一個(gè)方面涉及用于在患者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，其包括向所述患者施用根據(jù)本發(fā)明提供的疫苗。
[0049]另一個(gè)方面涉及治療癌癥患者的方法，其包括下述步驟:
[0050](a)提供通過根據(jù)本發(fā)明的方法的個(gè)體化癌癥疫苗；和
[0051](b)向所述患者施用所述疫苗。
[0052]另一個(gè)方面涉及治療癌癥患者的方法，其包括向所述患者施用根據(jù)本發(fā)明的疫苗。
[0053]在又一些方面中，本發(fā)明提供了用于本文所述治療方法、特別是用于治療或預(yù)防癌癥的本文所述疫苗。
[0054]本文所述的癌癥治療可與手術(shù)切除和/或照射和/或傳統(tǒng)化療聯(lián)合。
[0055]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及基于新一代測(cè)序數(shù)據(jù)確定錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(falsediscovery rate)的方法,所述方法包括:
[0056]取得來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第一樣品；
[0057]取得來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第二樣品；
[0058]取得來自腫瘤 細(xì)胞的遺傳物質(zhì)第一樣品；
[0059]取得來自所述腫瘤細(xì)胞的遺傳物質(zhì)第二樣品；
[0060]通過對(duì)既包含在腫瘤中又包含在所述來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第一樣品和所述來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第二樣品的至少之一中的參照基因組的全部堿基進(jìn)行計(jì)數(shù)來確定共同覆11 月中瘤比較(common coverage tumor comparison)；
[0061]通過對(duì)同時(shí)被所述來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第一樣品與所述來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第二樣品覆蓋的參照基因組的全部堿基進(jìn)行計(jì)數(shù)來確定共同覆蓋相同-相同比較(common coverage same vs.same comparison)；
[0062]將所述共同覆蓋腫瘤比較除以所述共同覆蓋相同-相同比較以形成歸一化；
[0063]通過以下來確定錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率:將I)在所述來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第一樣品和所述來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第二樣品的比較中品質(zhì)評(píng)分大于Q的單核苷酸變異的數(shù)目除以2)在來自所述腫瘤細(xì)胞的所述遺傳物質(zhì)第一樣品和來自所述腫瘤細(xì)胞的所述遺傳物質(zhì)第二樣品的比較中品質(zhì)評(píng)分大于Q的單核苷酸變異的數(shù)目，以及3)將結(jié)果乘以所述歸一化。
[0064]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述遺傳物質(zhì)為DNA。
[0065]在一個(gè)實(shí)施方案中，通過以下來確定Q:
[0066]建立一組品質(zhì)特性S=G1、…、sn),其中當(dāng)對(duì)于所有i = 1、…、n SiSti時(shí)，S優(yōu)于 T=Up...、tn),表示為 S>T,；
[0067]通過以下來確定中間錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率:將I)在所述來自動(dòng)物或人的第一DNA樣品和所述來自動(dòng)物或人的第二 DNA樣品的比較中品質(zhì)評(píng)分S>T的單核苷酸變異的數(shù)目除以2)在來自所述腫瘤細(xì)胞的所述第一 DNA樣品和來自所述腫瘤細(xì)胞的所述第二 DNA樣品的比較中品質(zhì)評(píng)分S>T的單核苷酸變異的數(shù)目，以及3)將結(jié)果乘以所述歸一化；
[0068]對(duì)于各自具有n個(gè)品質(zhì)特性的m個(gè)突變的每一特性確定值范圍；
[0069]從所述值范圍中抽取多至p個(gè)值；
[0070]產(chǎn)生所抽取品質(zhì)值的每種可能組合，得到Pn個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)；[0071]使用所述數(shù)據(jù)點(diǎn)的隨機(jī)樣作為隨機(jī)森林訓(xùn)練的預(yù)測(cè)子；
[0072]使用相應(yīng)的中間錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率值作為所述隨機(jī)森林訓(xùn)練的響應(yīng)，
[0073]其中所述隨機(jī)森林訓(xùn)練得到的回歸評(píng)分為Q。
[0074]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自動(dòng)物或人的第二 DNA樣品對(duì)于所述來自動(dòng)物或人的第一 DNA樣品是同種異體的(allogenic)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自動(dòng)物或人的第二DNA樣品對(duì)于所述來自動(dòng)物或人的第一 DNA樣品是自體的。在一個(gè)實(shí)施方案中,所述來自動(dòng)物或人的第二 DNA樣品對(duì)于所述來自動(dòng)物或人的第一 DNA樣品是異種的(xenogenic)。
[0075]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述遺傳物質(zhì)為RNA。
[0076]在一個(gè)實(shí)施方案中，通過以下來確定Q:
[0077]建立一組品質(zhì)特性S=G1、…、sn),其中當(dāng)對(duì)于所有i = 1、…、n SiSti時(shí)，S優(yōu)于 T=Up...、tn),表示為 S>T,；
[0078]通過以下來確定中間錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率:將I)在所述來自動(dòng)物或人的第一RNA樣品和所述來自動(dòng)物或人的第二 RNA樣品的比較中品質(zhì)評(píng)分S>T的單核苷酸變異的數(shù)目除以2)在來自所述腫瘤細(xì)胞的所述第一 RNA樣品和來自所述腫瘤細(xì)胞的所述第二 RNA樣品的比較中品質(zhì)評(píng)分S>T的單核苷酸變異的數(shù)目，以及3)將結(jié)果乘以所述歸一化；
[0079]對(duì)于各自具有n個(gè)品質(zhì)特性的m個(gè)突變的每一特性確定值范圍；
[0080]從所述值范圍中抽取多至p個(gè)值；
[0081]產(chǎn)生所抽取品質(zhì)值的每種可能組合，得到PnA數(shù)據(jù)點(diǎn)；
[0082]使用所述數(shù)據(jù)點(diǎn)的隨機(jī)樣作為隨機(jī)森林訓(xùn)練的預(yù)測(cè)子；
[0083]使用相應(yīng)的中間錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率值作為所述隨機(jī)森林訓(xùn)練的響應(yīng)，
[0084]其中所述隨機(jī)森林訓(xùn)練得到的回歸評(píng)分為Q。
[0085]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自動(dòng)物或人的第二 RNA樣品對(duì)于所述來自動(dòng)物或人的第一 RNA樣品是同種異體的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自動(dòng)物或人的第二 RNA樣品對(duì)于所述來自動(dòng)物或人的第一 RNA樣品是自體的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自動(dòng)物或人的第二 RNA樣品對(duì)于所述來自動(dòng)物或人的第一 RNA樣品是異種的。
[0086]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率用于制造疫苗制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疫苗可經(jīng)靜脈內(nèi)遞送。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疫苗可經(jīng)皮遞送。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疫苗可經(jīng)肌肉遞送。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疫苗可經(jīng)皮下遞送。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疫苗為特定患者定制。
[0087]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第一樣品和所述來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第二樣品之一來自所述特定患者。
[0088]在一個(gè)實(shí)施方案中，通過對(duì)既包含在腫瘤中又包含在所述來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第一樣品及所述來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第二樣品至少之一中的參照基因組的全部堿基進(jìn)行計(jì)數(shù)來確定共同覆蓋腫瘤比較的所述步驟使用自動(dòng)化系統(tǒng)以對(duì)所有堿基進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0089]在一個(gè)實(shí)施方案中，通過對(duì)同時(shí)被所述來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第一樣品與所述來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第二樣品覆蓋的參照基因組的全部堿基進(jìn)行計(jì)數(shù)來確定共同覆蓋相同-相同比較的所述步驟使用所述自動(dòng)化系統(tǒng)。
[0090]在一個(gè)實(shí)施方案中， 將所述共同覆蓋腫瘤比較除以所述共同覆蓋相同-相同比較以形成歸一化的所述步驟使用所述自動(dòng)化系統(tǒng)。[0091]在一個(gè)實(shí)施方案中，通過以下確定錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率的所述步驟使用所述自動(dòng)化系統(tǒng):將I)在所述來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第一樣品和所述來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第二樣品的比較中品質(zhì)評(píng)分大于Q的單核苷酸變異的數(shù)目除以2)在來自所述腫瘤細(xì)胞的所述遺傳物質(zhì)第一樣品和來自所述腫瘤細(xì)胞的所述遺傳物質(zhì)第二樣品的比較中品質(zhì)評(píng)分大于Q的單核苷酸變異的數(shù)目，以及3)將結(jié)果乘以所述歸一化。[0092]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及確定估計(jì)的接受者操作曲線(receiver operatingcurve, ROC)的方法，所述方法包括:[0093]獲得突變的數(shù)據(jù)集，每個(gè)突變與錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)相關(guān)；以及[0094]對(duì)于每個(gè)突變:[0095]通過從I中減去所述FDR來確定真陽性率(TPR);和[0096]通過將假陽性率(FPR)設(shè)定為等于所述FDR來確定假陽性率(FPR);以及[0097]通過以下形成估計(jì)的ROC:對(duì)于每個(gè)突變，在至所述突變?yōu)橹沟睦鄯eTPR和FPR值除以所有TPR和FPR值總和處繪制點(diǎn)。[0098]本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)從以下詳細(xì)的描述和權(quán)利要求中將顯而易見。[0099]發(fā)明詳述[0100]雖然在下面詳細(xì)描述本發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明并不限于本文所描述的特定方法，方案和試劑，因?yàn)樗鼈兛捎凶兓?。還應(yīng)當(dāng)理解的是，本文使用的術(shù)語僅以描述特定實(shí)施方案為目的，并不是為了限制本發(fā)明的范圍，其僅由所附權(quán)利要求限制。除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的相同的含義。[0101]在下文中，將描述本發(fā)明的要素。這些要素是通過特定的實(shí)施方案列出的，然而應(yīng)當(dāng)理解的是它們可以以任何方式和任何數(shù)目組合以創(chuàng)建另外的實(shí)施方案。描述的多種實(shí)施例和優(yōu)選的實(shí)施方案不應(yīng)該被解釋為僅將本發(fā)明限制到明確描述的實(shí)施方案。此描述應(yīng)被理解為支持和涵蓋了具有任何數(shù)量的公開和/或優(yōu)選要素的明確描述的實(shí)施方式的實(shí)施方案。此外，除非文中另有說明，否則應(yīng)當(dāng)認(rèn)為任何在本申請(qǐng)中所有描述的要素的排列和組合是本申請(qǐng)說明書所披露的。例如，如果在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，RNA包含由120個(gè)核苷酸組成的聚(A)尾，在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，RNA分子包含5’帽類似物，那么在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，RNA包含由120個(gè)核苷酸組成的聚(A)尾和5’帽類似物。[0102]優(yōu)選地，本文使用的術(shù)語例如A multilingual glossary of biotechnologicalterms: (IUPAC Recommendations), H.G.ff.Leuenberger, B.Nagel 和 H.Kolbl 編，(1995)Helvetica Chimica Acta, CH_4010Basel, Switzerland.所描述的進(jìn)行定義。[0103]除非另有說明，否則本發(fā)明的實(shí)施將用本領(lǐng)域文獻(xiàn)(參見例如MolecularCloning:A Laboratory Manual,第二 版，J.Sambrook 等編，Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harborl989)中所解釋的生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)和重組DNA技術(shù)的常規(guī)方法。[0104]在整個(gè)說明書和隨后的權(quán)利要求書中，除非上下文另有要求，否則詞語“包含”應(yīng)當(dāng)理解為意指包括所述的成員、整數(shù)或步驟或者成員、整數(shù)或步驟的組，但不排除任何其他成員、整數(shù)或者成員、整數(shù)或步驟的組，雖然在一些實(shí)施方案中，這樣的其他成員、整數(shù)或步驟或者成員、整數(shù)或步驟的組可被排除，即該主題由所述的成員、整數(shù)或步驟或成員、整數(shù)或步驟的組組成。除非本文另有指明或者與上下文明顯相矛盾，否則描述本發(fā)明的上下文中(尤其是在權(quán)利要求書的上下文中)不使用數(shù)量詞修飾時(shí)解釋為包括單數(shù)和復(fù)數(shù)。本文列舉的數(shù)值的范圍僅意在充當(dāng)單獨(dú)指代落入該范圍內(nèi)的每個(gè)獨(dú)立數(shù)值的快捷方法。除非本文另有指明，每個(gè)單獨(dú)的值均如同在本文中被單獨(dú)涉及一樣而被并入本說明書中。
[0105]除非本文另有說明或通過上下文明顯矛盾，否則本文所描述的所有方法均可以以任何適當(dāng)?shù)捻樞驁?zhí)行。本文所提供的任何和所有實(shí)施例，或示例性語言(例如，“例如”)的使用，其目的僅是為了更好地說明本發(fā)明，并不構(gòu)成本發(fā)明范圍的限制(由權(quán)利要求限制)。在本說明書中沒有語言應(yīng)當(dāng)解釋為表示任何未要求權(quán)利的要素對(duì)本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)是必須的。
[0106]本說明書的整個(gè)文件中引用了幾篇文獻(xiàn)。本文引用的每篇文獻(xiàn)(包括所有專利、專利申請(qǐng)、科學(xué)出版物、制造商說明、說明書，等等)(無論上文或下文)均通過整體引用并入本文。本文中任何信息均不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明無權(quán)通過在先發(fā)明而早于這些公開。
[0107]根據(jù)本發(fā)明提供的疫苗為重組疫苗。
[0108]本發(fā)明上下文中的術(shù)語“重組”意指“通過基因改造制成”。優(yōu)選地，在本發(fā)明的上下文中“重組實(shí)體”例如重組多肽不是天然的，優(yōu)選地為自然中未組合的實(shí)體(例如氨基酸或核酸序列)組合的結(jié)果。例如，在本發(fā)明的上下文中重組多肽可包含通過例如肽鍵或適當(dāng)接頭融合在一起的來源于不同蛋白質(zhì)或同一蛋白質(zhì)之不同部分的若干氨基酸序列如新表位或疫苗序列。
[0109]本文中使用的術(shù)語“天然”指的是物質(zhì)可在自然界被發(fā)現(xiàn)的事實(shí)。例如，存在于生物體(包括病毒)中并且可從天然來源中分離且沒有在實(shí)驗(yàn)室中被人有意改造的肽或核酸是天然的。
[0110]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“疫苗”涉及藥物制備物(藥物組合物)或產(chǎn)品，其在施用后誘導(dǎo)識(shí)別并攻擊病原體或病變細(xì)胞如癌癥細(xì)胞的免疫應(yīng)答，特別是細(xì)胞免疫應(yīng)答。疫苗可用于預(yù)防或治療疾病。術(shù)語“個(gè)體化癌癥疫苗”涉及特定的癌癥患者并且意指癌癥疫苗適合于個(gè)體癌癥患者的需要或特殊情況。
[0111]術(shù)語“免疫應(yīng)答”指的是對(duì)抗原的綜合身體應(yīng)答，優(yōu)選指細(xì)胞免疫應(yīng)答或細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答可以是保護(hù)性/防止性/預(yù)防性和/或治療性的。
[0112]“誘導(dǎo)免疫應(yīng)答”可指在誘導(dǎo)前對(duì)特定抗原沒有免疫應(yīng)答，但它也可指在誘導(dǎo)前針對(duì)特定抗原有一定水平的免疫應(yīng)答，并且在誘導(dǎo)后所述免疫應(yīng)答得到增強(qiáng)。因此，“誘導(dǎo)免疫應(yīng)答”也包括“增強(qiáng)免疫應(yīng)答”。優(yōu)選地，在對(duì)象中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答之后，所述對(duì)象被保護(hù)免于發(fā)生疾病(例如癌癥疾病)或者通過誘導(dǎo)免疫應(yīng)答使疾病狀況得到改善。例如，對(duì)腫瘤所表達(dá)抗原的免疫應(yīng)答可在患有癌癥疾病的患者中或者在有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生癌癥疾病的對(duì)象中被誘導(dǎo)。在這種情況下，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答可意味著對(duì)象的疾病狀況得到改善，對(duì)象沒有發(fā)生轉(zhuǎn)移，或者有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生癌癥疾病的對(duì)象沒有發(fā)生癌癥疾病。
[0113]“細(xì)胞免疫應(yīng)答”、“細(xì)胞應(yīng)答”、“針對(duì)抗原的細(xì)胞應(yīng)答”或者類似的術(shù)語意于包括這樣的細(xì)胞應(yīng)答，其針對(duì)特征為用I類或II類MHC呈遞抗原的細(xì)胞。細(xì)胞應(yīng)答涉及稱為T細(xì)胞或T-淋巴細(xì)胞的細(xì)胞，其作為“輔助者”或“殺傷者”。輔助T細(xì)胞(也被稱為CD4+T細(xì)胞)通過調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答發(fā)揮核心作用，殺傷細(xì)胞(也被稱為細(xì)胞毒性T細(xì)胞、細(xì)胞裂解性T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞或CTL)殺傷病變細(xì)胞(例如癌癥細(xì)胞)，防止產(chǎn)生更多的病變細(xì)胞。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及刺激抗腫瘤CTL應(yīng)答，其針對(duì)表達(dá)一種或更多種腫瘤表達(dá)抗原并且優(yōu)選地用I類MHC呈遞這種腫瘤表達(dá)抗原的腫瘤細(xì)胞。
[0114]根據(jù)本發(fā)明的“抗原”涵蓋將引發(fā)免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)。特別是，“抗原”涉及任何物質(zhì)，優(yōu)選為與抗體或T淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)特異性反應(yīng)的肽或蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“抗原”包括包含至少一個(gè)表位的任何分子。優(yōu)選地，在本發(fā)明的上下文中抗原是這樣的分子，其(任選地在加工后)誘導(dǎo)優(yōu)選地對(duì)抗原(包括表達(dá)該抗原的細(xì)胞)特異的免疫反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明，可使用對(duì)于免疫反應(yīng)而言為候選物的任何合適的抗原，其中所述免疫反應(yīng)優(yōu)選地為細(xì)胞免疫反應(yīng)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案的情況下，抗原優(yōu)選地被細(xì)胞、優(yōu)選被抗原呈遞細(xì)胞(包括病變細(xì)胞、特別是癌癥細(xì)胞，在MHC分子的環(huán)境下)呈遞，這導(dǎo)致針對(duì)該抗原的免疫反應(yīng)。優(yōu)選地，抗原是對(duì)應(yīng)于或來源于天然抗原的產(chǎn)物。這種天然抗原包括腫瘤抗原。
[0115]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗原是腫瘤抗原，即腫瘤細(xì)胞的一部分，例如可來源于胞質(zhì)、細(xì)胞表面或細(xì)胞核的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)或肽，尤其是主要在細(xì)胞內(nèi)存在或作為腫瘤細(xì)胞表面抗原的那些。例如，腫瘤抗原包括癌胚抗原、a 1-胎蛋白、異鐵蛋白和胎兒磺基糖蛋白(fetal sulphoglycoprotein)、a2_H_鐵蛋白以及Y -胎蛋白。根據(jù)本發(fā)明，腫瘤抗原優(yōu)選地包括在腫瘤或癌癥以及腫瘤或癌癥細(xì)胞中表達(dá)并且任選地表征其類型和/或表達(dá)水平的任何抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語“腫瘤抗原”或“腫瘤相關(guān)抗原”涉及這樣的蛋白質(zhì)，其在正常條件下在有限數(shù)目的組織和/或器官中或者在特定的發(fā)育階段中特異性表達(dá)(例如，腫瘤抗原可在正常條件下在胃組織中(優(yōu)選在胃粘膜中)、在生殖器官中(例如，在睪丸中)、在滋養(yǎng)層組織(例如，在胎盤)或在生殖系細(xì)胞中特異性表達(dá))，并且在一種或更多種腫瘤或癌組織中表達(dá)或異常表達(dá)。在此上下文中，“有限數(shù)目”優(yōu)選是指不超過3，更優(yōu)選不超過2。本發(fā)明的上下文中的腫瘤抗原包括，例如，分化抗原，優(yōu)選細(xì)胞類型特異性分化抗原，即在正常條件下在一定分化階段的某些細(xì)胞類型中特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)；癌癥/睪丸抗原，即在正常情況下在睪丸以及有時(shí)在胎盤中特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)；和生殖系特異性抗原。優(yōu)選地，腫瘤抗原或腫瘤抗原的異常表達(dá)鑒定癌癥細(xì)胞。在本發(fā)明的上下文中，對(duì)象(例如，患有癌癥疾病的患者)的癌癥細(xì)胞表達(dá)的腫瘤抗原優(yōu)選地是所述對(duì)象的自身蛋白質(zhì)。在一些優(yōu)`選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的上下文中的腫瘤抗原在正常條件下在非必需的組織或器官中(即當(dāng)被免疫系統(tǒng)損傷時(shí)不導(dǎo)致對(duì)象死亡或者免疫系統(tǒng)不可及或難以觸及的身體器官或結(jié)構(gòu)中的組織或器官)特異性表達(dá)。
[0116]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“腫瘤抗原”、“腫瘤表達(dá)抗原”、“癌癥抗原”和“癌癥表達(dá)抗原”是等同的并且在本文中可互換使用。
[0117]術(shù)語“免疫原性”涉及抗原誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的相對(duì)效力。
[0118]根據(jù)本發(fā)明的“抗原肽”優(yōu)選地涉及抗原的一部分或片段，其能夠刺激免疫應(yīng)答，優(yōu)選為針對(duì)抗原或特征為表達(dá)該抗原以及優(yōu)選地呈遞該抗原之細(xì)胞(例如病變細(xì)胞，尤其是癌癥細(xì)胞)的細(xì)胞應(yīng)答。優(yōu)選地，抗原肽能夠刺激針對(duì)特征為用I類MHC呈遞抗原的細(xì)胞的細(xì)胞應(yīng)答，并且優(yōu)選地能夠刺激抗原響應(yīng)性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的抗原肽是MHC I類和/或II類呈遞的肽或者可被加工以產(chǎn)生MHC I類和/或II類呈遞的肽。優(yōu)選地，抗原肽包含基本上對(duì)應(yīng)于抗原片段之氨基酸序列的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述抗原片段為MHC I類和/或II類呈遞的肽。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的抗原肽包含基本上對(duì)應(yīng)于這種片段之氨基酸序列并且被加工以產(chǎn)生這種片段(即來源于抗原的MHC I類和/或II類呈遞的肽)的氨基酸序列。
[0119] 如果肽被直接呈遞(即未經(jīng)加工，尤其是未經(jīng)切割)，它具有適合用于結(jié)合MHC分子(特別是I類MHC分子)的長(zhǎng)度，優(yōu)選長(zhǎng)度是7~20個(gè)氨基酸，更優(yōu)選長(zhǎng)度是7~12個(gè)氨基酸，更優(yōu)選長(zhǎng)度是8~11個(gè)氨基酸，尤其是長(zhǎng)度為9或10個(gè)氨基酸。
[0120]如果肽是包含額外序列之較大實(shí)體(例如疫苗序列或多肽)的一部份，并且將在加工后(尤其是切割后)呈遞，則通過加工產(chǎn)生的肽具有適合用于結(jié)合MHC分子(特別是I類MHC分子)的長(zhǎng)度，優(yōu)選長(zhǎng)度是7~20個(gè)氨基酸，更優(yōu)選長(zhǎng)度是7~12個(gè)氨基酸，更優(yōu)選長(zhǎng)度是8~11個(gè)氨基酸，尤其是長(zhǎng)度為9或10個(gè)氨基酸。優(yōu)選地，待經(jīng)過加工后呈遞肽的序列來源于抗原的氨基酸序列，即，其序列基本上對(duì)應(yīng)于抗原片段并優(yōu)選地與其完全一致。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中根據(jù)本發(fā)明的抗原肽或疫苗序列包含長(zhǎng)度是7~20個(gè)氨基酸、更優(yōu)選長(zhǎng)度是7~12個(gè)氨基酸、優(yōu)選長(zhǎng)度是8~11個(gè)氨基酸、尤其是長(zhǎng)度為9或10個(gè)氨基酸的序列，所述序列基本上對(duì)應(yīng)于抗原片段并優(yōu)選地與其完全一致，并且在加工后，所述抗原肽或疫苗序列構(gòu)成呈遞的肽。根據(jù)本發(fā)明，通過加工產(chǎn)生的這種肽包含經(jīng)鑒定的序列變化。
[0121]根據(jù)本發(fā)明，在疫苗中可存在作為較大實(shí)體(例如，包含多于一個(gè)抗原肽或表位的疫苗序列和/或多肽)之一部份的抗原肽或表位。在合適的加工之后產(chǎn)生呈遞的抗原肽或表位。
[0122]氨基酸序列基本上對(duì)應(yīng)于由I類MHC呈遞之肽的序列的肽可在一個(gè)或更多個(gè)殘基上不同，所述殘基對(duì)于由I類MHC呈遞之肽的TCR識(shí)別或者對(duì)于肽與MHC的結(jié)合不是必要的。這種基本上對(duì)應(yīng)的肽也能夠刺激抗原響應(yīng)性CTL并且可被認(rèn)為是免疫等價(jià)物。如下的肽可改善抗原肽的免疫原性并可在本文中被稱為“優(yōu)化的肽”，其氨基酸序列在不影響TCR識(shí)別但改善與MHC結(jié)合之穩(wěn)定性的殘基上與呈遞的肽不同。利用這些殘基哪些更可能影響與MHC或TCR結(jié)合的現(xiàn)有知識(shí)，可使用設(shè)計(jì)基本上對(duì)應(yīng)的肽的合理方法。所得的功能性肽被考慮作為抗原肽。
[0123]當(dāng)抗原肽被MHC呈遞時(shí)其應(yīng)該可以被T細(xì)胞受體識(shí)別。優(yōu)選地，如果抗原肽被T細(xì)胞受體識(shí)別，則在適當(dāng)?shù)墓泊碳ば盘?hào)存在的情況下，其能夠誘導(dǎo)攜帶特異性識(shí)別抗原肽之T細(xì)胞受體的T細(xì)胞的克隆增殖。優(yōu)選地，抗原肽(尤其是如果在MHC分子的環(huán)境中呈遞)能夠刺激免疫應(yīng)答，優(yōu)選為針對(duì)其所來源的抗原或特征為表達(dá)該抗原以及優(yōu)選地特征為呈遞該抗原的細(xì)胞的細(xì)胞應(yīng)答。優(yōu)選地，抗原肽能夠刺激針對(duì)特征為用I類MHC呈遞抗原的細(xì)胞的細(xì)胞應(yīng)答，并且優(yōu)選地能夠刺激抗原響應(yīng)性CTL。這種細(xì)胞優(yōu)選地是靶細(xì)胞。
[0124]“抗原加工”或“加工”是指多肽或抗原到加工產(chǎn)物(為所述多肽或抗原之片段)的降解(例如，多肽到肽的降解)以及這些片段中的一個(gè)或更多個(gè)與MHC分子的相關(guān)聯(lián)(例如，通過結(jié)合)來被細(xì)胞(優(yōu)選抗原呈遞細(xì)胞)呈遞到特異性T細(xì)胞。
[0125]“抗原呈遞細(xì)胞” (APC)是在其細(xì)胞表面展示與MHC分子相關(guān)聯(lián)之蛋白質(zhì)抗原的肽片段的細(xì)胞。一些APC可活化抗原特異性T細(xì)胞。
[0126]專門的抗原呈遞細(xì)胞在內(nèi)化抗原(通過吞噬作用或通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用)然后在它們的膜上顯示抗原片段(與II類MHC分子結(jié)合)方面是非常有效的。T細(xì)胞識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞膜上的抗原-1I類MHC分子復(fù)合物并與其相互作用。然后抗原呈遞細(xì)胞產(chǎn)生額外的共刺激信號(hào)，導(dǎo)致T細(xì)胞的活化。共刺激分子的表達(dá)是專門的抗原呈遞細(xì)胞的限定性特征。
[0127]專門的抗原呈遞細(xì)胞的主要類型是樹突細(xì)胞(其具有最廣范圍的抗原呈遞并且可能是最重要的抗原呈遞細(xì)胞)、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和某些活化的上皮細(xì)胞。
[0128]樹突細(xì)胞(DC)是這樣的白細(xì)胞類群，其通過MHC II類和I類抗原呈遞途徑呈遞在外周組織中捕獲的抗原給T細(xì)胞。公知樹突細(xì)胞是免疫應(yīng)答的強(qiáng)誘導(dǎo)物，并且這些細(xì)胞的活化是誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的關(guān)鍵步驟。
[0129]樹突細(xì)胞通常歸類為“未成熟”和“成熟”的細(xì)胞，這可用作區(qū)分兩個(gè)良好表征的表型的簡(jiǎn)單方式。但是，此術(shù)語不應(yīng)該被解釋為排除分化的所有可能的中間階段。
[0130]未成熟樹突細(xì)胞的特征為具有高的抗原攝取和加工能力的抗原呈遞細(xì)胞，其與Fcy受體和甘露糖受體的高表達(dá)相關(guān)。成熟表型通常特征為這些標(biāo)志物的較低表達(dá)而負(fù)責(zé)T細(xì)胞活化的細(xì)胞表面分子例如I類和II類MHC、粘附分子(例如，CD54和CD11)和共刺激分子(例如，CD40、CD80、CD86和4-1BB)的高表達(dá)。 [0131]樹突細(xì)胞成熟指的是該抗原呈遞樹突細(xì)胞導(dǎo)致T細(xì)胞啟動(dòng)(priming)的樹突細(xì)胞活化的狀態(tài)，而由未成熟樹突細(xì)胞進(jìn)行的呈遞導(dǎo)致耐受。樹突細(xì)胞成熟主要由以下引起:被先天受體檢測(cè)到的具有微生物特征的生物分子(細(xì)菌DNA、病毒RNA、內(nèi)毒素等)，促炎性細(xì)胞因子(TNF、IL-1、IFN)，樹突細(xì)胞表面上通過⑶40L的⑶40連接，以及從正在經(jīng)歷應(yīng)激細(xì)胞死亡的細(xì)胞中釋放的物質(zhì)。樹突細(xì)胞可通過用細(xì)胞因子(如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和腫瘤壞死因子a)體外培養(yǎng)骨髓細(xì)胞而衍生。
[0132]非專門的抗原呈遞細(xì)胞不組成型表達(dá)與幼稚T細(xì)胞相互作用所需的MHC II類蛋白質(zhì)；這些僅在某些細(xì)胞因子(例如，IFNy)刺激非專門抗原呈遞細(xì)胞時(shí)才表達(dá)。
[0133]可通過用編碼包含待呈遞肽的肽或多肽的核酸、優(yōu)選RNA(例如編碼抗原的核酸)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞來使“抗原呈遞細(xì)胞”裝載MHC I類呈遞的肽。
[0134]在一些實(shí)施方案中，可向患者施用包含靶向樹突細(xì)胞或其他抗原呈遞細(xì)胞之基因遞送載劑的本發(fā)明的藥物組合物，導(dǎo)致在體內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)染。樹突細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)染例如通?？墒褂帽绢I(lǐng)域中已知的任何方法進(jìn)行，例如W097 / 24447中描述的那些，或由Mahvi等，Immunology and cell Biology75:456-460,1997 描述的基因槍方法。
[0135]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“抗原呈遞細(xì)胞”還包括靶細(xì)胞。
[0136]“靶細(xì)胞”意指為免疫應(yīng)答例如細(xì)胞免疫應(yīng)答之靶標(biāo)的細(xì)胞。靶細(xì)胞包括呈遞抗原或抗原表位(即來源于抗原的肽片段)的細(xì)胞，并且包括任何不期望的細(xì)胞例如癌癥細(xì)胞。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶細(xì)胞是表達(dá)本文所述抗原并優(yōu)選用I類MHC呈遞所述抗原的細(xì)胞。
[0137]術(shù)語“表位”是指在分子(例如，抗原)中的抗原決定簇，即，是指免疫系統(tǒng)識(shí)別(例如，由T細(xì)胞識(shí)別，特別是在MHC分子的環(huán)境中呈遞時(shí))的分子的一部份或片段。蛋白質(zhì)(例如，腫瘤抗原)的表位優(yōu)選地包含所述蛋白質(zhì)的連續(xù)或不連續(xù)部分，且優(yōu)選長(zhǎng)度為5至100，優(yōu)選5至50，更優(yōu)選8至30，最優(yōu)選10至25個(gè)氨基酸，例如，表位的長(zhǎng)度可優(yōu)選地為 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 或 25 個(gè)氨基酸。特別優(yōu)選地，本發(fā)明上下文中的表位是T細(xì)胞表位。
[0138]根據(jù)本發(fā)明，表位可與MHC分子(例如，細(xì)胞表面上的MHC分子)相結(jié)合，并且因此可以是“MHC結(jié)合肽”或“抗原肽”。術(shù)語“MHC結(jié)合肽”涉及結(jié)合到MHC I類和/或MHCII類分子的肽。在I類MHC /肽復(fù)合物的情況下，雖然更長(zhǎng)或更短的肽可以是有效的，但結(jié)合肽通常長(zhǎng)度是8~10個(gè)氨基酸。在II類MHC /肽復(fù)合物的情況下，盡管更長(zhǎng)或更短的肽可以是有效的，但結(jié)合肽通常長(zhǎng)度是10~25個(gè)氨基酸，特別是13~18個(gè)氨基酸。
[0139]術(shù)語“表位”、“抗原肽”、“抗原表位”、“免疫原性肽”和“MHC結(jié)合肽”在本文中可互換使用，并優(yōu)選涉及抗原的不完整呈現(xiàn)，其優(yōu)選能夠引發(fā)針對(duì)抗原或者表達(dá)或包含且優(yōu)選地呈遞抗原之細(xì)胞的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，該術(shù)語涉及抗原的免疫原性部分。優(yōu)選地，它是被T細(xì)胞受體識(shí)別(即，特異性結(jié)合)的抗原的一部分(特別是如果在MHC分子的環(huán)境中呈遞)。優(yōu)選地這種免疫原性部分結(jié)合至MHC I類或II類分子。如本文所使用的，如果使用本領(lǐng)域中已知的任何測(cè)定可檢測(cè)到這種結(jié)合，則認(rèn)為免疫原性部分“結(jié)合至”MHC I或II類分子。
[0140]本文中使用的術(shù)語“新表位”是指沒有存在于參照(例如，正常的非癌性細(xì)胞或生殖系細(xì)胞)中但是發(fā)現(xiàn)于癌癥細(xì)胞中的表位。這尤其包括這樣的狀況，其中，在正常非癌性細(xì)胞或生殖系細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)相應(yīng)表位，然而，由于癌癥細(xì)胞中的一個(gè)或更多個(gè)突變改變了該表位的序列從而以產(chǎn)生新表位。
[0141]術(shù)語“部分(portion) ”是指段(fraction)。對(duì)于特定的結(jié)構(gòu)例如氨基酸序列或蛋白質(zhì)，術(shù)語其“部分”可指所述結(jié)構(gòu)的連續(xù)或不連續(xù)段。優(yōu)選地，氨基酸序列的部分包含至少I %、至少為5 %、至少10 %、至少20 %、至少30 %、優(yōu)選至少40 %、優(yōu)選至少50 %、更優(yōu)選至少60 %、更優(yōu)選至少70 %、甚至更優(yōu)選至少80 %并且最優(yōu)選至少90 %的所述氨基酸序列的氨基酸。優(yōu)選地，如果該部分是不連續(xù)段，所述不連續(xù)段由2、3、4、5、6、7、8個(gè)或更多個(gè)結(jié)構(gòu)部份構(gòu)成，每部份是所述結(jié)構(gòu)的連續(xù)元件。例如，氨基酸序列的不連續(xù)段可由2、3、4、5、6、7、8個(gè)或更多個(gè)(優(yōu)選不超過4個(gè))的所述氨基酸序列部份構(gòu)成，其中每個(gè)部份優(yōu)選包含所述氨基酸序列的至少5個(gè)連續(xù)氨基酸，至少10個(gè)連續(xù)氨基酸，優(yōu)選至少20個(gè)連續(xù)氨基酸，優(yōu)選至少30個(gè)連續(xù)氨基酸。
[0142]術(shù)語“部份(part )”和“片段”在本文中可互換使用，是指連續(xù)的元件。例如，結(jié)構(gòu)(如氨基酸序列或蛋白質(zhì))的部份是指所述結(jié)構(gòu)的連續(xù)元件。結(jié)構(gòu)的部分，部份或片段優(yōu)選包含一個(gè)或更多個(gè)所述結(jié)構(gòu)的功能特性。例如，表位、肽或蛋白質(zhì)的部分，部份或片段優(yōu)選與其所來源的表位、肽或蛋白質(zhì)是免疫學(xué)等價(jià)的。在本發(fā)明的上下文中，結(jié)構(gòu)(例如氨基酸序列)的“部份”優(yōu)選包含至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98 %、至少99 %的整個(gè)結(jié)構(gòu)或氨基酸序列，優(yōu)選地由其組成。
[0143]本發(fā)明的上下文中的術(shù)語“免疫反應(yīng)性細(xì)胞”涉及在免疫反應(yīng)過程中顯示效應(yīng)子功能的細(xì)胞?！懊庖叻磻?yīng)性細(xì)胞”優(yōu)選能夠結(jié)合抗原或特征為呈遞抗原或來自抗原的抗原肽的細(xì)胞，以及介導(dǎo)免疫應(yīng)答。例如，這樣的細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和/或趨化因子，分泌抗體，識(shí)別癌性細(xì)胞并且任選地消除這樣的細(xì)胞。例如，免疫反應(yīng)性細(xì)胞包括T細(xì)胞(細(xì)胞毒性T細(xì)胞，輔助T細(xì)胞，腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞)，B細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞。優(yōu)選地，在本發(fā)明的上下文中，“免疫反應(yīng)性細(xì)胞”是T細(xì)胞，優(yōu)選CD4+和/或CD8+T細(xì)胞。
[0144]優(yōu)選地，“免疫反應(yīng)性細(xì)胞”以某種程度的特異性識(shí)別抗原或來自抗原的抗原肽(特別是如果其在MHC分子的環(huán)境下呈遞，例如在抗原呈遞細(xì)胞或病變細(xì)胞(例如，癌癥細(xì)胞)的表面上)。優(yōu)選地，所述識(shí)別能夠使識(shí)別抗原或來自該抗原的抗原肽的細(xì)胞具有響應(yīng)性或反應(yīng)性。如果該細(xì)胞是帶有識(shí)別在II類MHC分子的環(huán)境下的抗原或來自抗原之抗原肽的受體的輔助T細(xì)胞(CD4+T細(xì)胞)，這樣的響應(yīng)性或反應(yīng)性可涉及細(xì)胞因子的釋放和/或CD8+淋巴細(xì)胞(CTL)和/或B細(xì)胞的激活。如果該細(xì)胞是CTL，這樣的響應(yīng)性或反應(yīng)性可涉及消除在I類MHC分子的環(huán)境下呈遞的細(xì)胞(即特征為用I類MHC呈遞抗原的細(xì)胞，例如通過凋亡或穿孔蛋白(perforin)介導(dǎo)的細(xì)胞裂解)。根據(jù)本發(fā)明，CTL響應(yīng)性可包括持續(xù)的鈣通量，細(xì)胞分裂，細(xì)胞因子(如IFN- y和TNF- a )的產(chǎn)生，活化標(biāo)志物(例如CD44和CD69)的上調(diào)，以及表達(dá)抗原的靶細(xì)胞的特異性細(xì)胞裂解性殺傷。CTL響應(yīng)性也可使用準(zhǔn)確指示CTL響應(yīng)性的人工報(bào)告子來確定。這種識(shí)別抗原或來自抗原的抗原肽并且具有響應(yīng)性或反應(yīng)性的CTL在本文中也被稱為“抗原響應(yīng)性CTL”。如果該細(xì)胞是B細(xì)胞，這種響應(yīng)性可涉及免疫球蛋白的釋放。
[0145]術(shù)語“T細(xì)胞”和“T淋巴細(xì)胞”在本文中互換使用并且包括T輔助細(xì)胞(⑶4+T細(xì)胞)和包括細(xì)胞裂解性T細(xì)胞的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL，⑶8+T細(xì)胞)。
[0146]T細(xì)胞屬于被稱為淋巴細(xì)胞的一類白血細(xì)胞，并在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫中發(fā)揮核心作用。通過它們細(xì)胞表面稱為T細(xì)胞受體(TCR)的特殊受體的存在，可將它們區(qū)別于其他的淋巴細(xì)胞類型(如B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞)。胸腺是負(fù)責(zé)T細(xì)胞成熟的主要器官。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幾種不同的T細(xì)胞亞群，每一個(gè)都具有不同的功能。
[0147]T輔助細(xì)胞在免疫過程中協(xié)助其他白血細(xì)胞，包括B細(xì)胞到漿細(xì)胞的成熟以及細(xì)胞毒性T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化等功能。這些細(xì)胞也被稱為CD4+T細(xì)胞，因?yàn)樗鼈冊(cè)谄浔砻姹磉_(dá)⑶4蛋白。當(dāng)它們被通過II類MHC分子(在抗原呈遞細(xì)胞(APC)的表面上表達(dá))呈遞肽抗原時(shí)，輔助T細(xì)胞被激活。一旦被激活，它們迅速分裂并分泌調(diào)節(jié)或協(xié)助活化的免疫應(yīng)答的稱為細(xì)胞因子的小蛋 白。
[0148]細(xì)胞毒性T細(xì)胞破壞病毒感染的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，并且也參與移植排斥。由于它們?cè)谄浔砻嫔媳磉_(dá)CD8糖蛋白，這些細(xì)胞也被稱為CD8+T細(xì)胞。這些細(xì)胞通過結(jié)合與I類MHC(存在于身體幾乎每個(gè)細(xì)胞表面上)相關(guān)聯(lián)的抗原來識(shí)別其靶標(biāo)。
[0149]大多數(shù)T細(xì)胞具有作為幾種蛋白質(zhì)的復(fù)合物存在的T細(xì)胞受體(TCR)。實(shí)際的T細(xì)胞受體由兩個(gè)單獨(dú)的肽鏈構(gòu)成，它們由獨(dú)立的T細(xì)胞受體a和0 (TCRa和TCRP )基因產(chǎn)生并被稱為a-和0-TCR鏈。Y S T細(xì)胞(gamma delta T細(xì)胞)代表在其表面具有獨(dú)特的T細(xì)胞受體(TCR)的T細(xì)胞的小亞型。然而，在Y S T細(xì)胞中，TCR由一個(gè)Y -鏈和一個(gè)S鏈構(gòu)成。這組T細(xì)胞較a P T細(xì)胞不常見得多(總T細(xì)胞的2% )。
[0150]通過T細(xì)胞受體與另一細(xì)胞上的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)呈遞的短肽的結(jié)合提供T細(xì)胞激活中的第一個(gè)信號(hào)。這確保了只激活具有對(duì)該肽特異的TCR的T細(xì)胞。伴侶細(xì)胞通常是專門的抗原呈遞細(xì)胞(APC)，在幼稚應(yīng)答(naiVe response)的情況中通常是樹突細(xì)胞，但是B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可以是重要的APC。由MHC I類分子呈遞到⑶8+T細(xì)胞的肽長(zhǎng)度通常為8~10個(gè)氨基酸；由于MHC II類分子的結(jié)合槽(binding cleft)的末端打開，所以由MHC II類分子呈遞到⑶4+T細(xì)胞的肽通常更長(zhǎng)。
[0151]根據(jù)本發(fā)明，如果T細(xì)胞受體對(duì)于預(yù)先確定的靶標(biāo)有顯著的親和力并在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定中結(jié)合至所述預(yù)先確定的靶標(biāo)，則其能夠結(jié)合至該預(yù)先確定的靶標(biāo)。“親和力”或“結(jié)合親和力”往往通過平衡解離常數(shù)(Kd)測(cè)量。如果T細(xì)胞受體對(duì)靶標(biāo)沒有顯著的親和力并且在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定中不顯著結(jié)合至該靶標(biāo)，則其(基本上)不能結(jié)合至所述靶標(biāo)。
[0152]T細(xì)胞受體優(yōu)選地能夠特異性結(jié)合至預(yù)先確定的靶標(biāo)。如果T細(xì)胞受體能夠結(jié)合至預(yù)先確定的靶標(biāo)而其(基本上)不能結(jié)合至其他靶標(biāo)(即對(duì)其他靶標(biāo)沒有顯著的親和力并且在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定中不顯著地結(jié)合至其他靶標(biāo))，則其對(duì)于所述預(yù)先確定的靶標(biāo)是特異的。
[0153]可通過在體內(nèi)將抗原或抗原肽整合入抗原呈遞細(xì)胞來在體內(nèi)產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞?？乖蚩乖目杀槐憩F(xiàn)為蛋白質(zhì)、DNA(例如，在載體內(nèi))或RNA?？乖杀患庸ひ援a(chǎn)生用于MHC分子的肽伴侶，而其片段可以不需要進(jìn)一步加工而被呈遞。如果后者可與MHC分子相結(jié)合，則其特別是這種情況。通常，可通過皮內(nèi)注射向患者施用。但是，也可通過結(jié)內(nèi)注射進(jìn)入淋巴結(jié)來進(jìn)行(Maloy 等(2001)，Proc Natl Acad Sci USA98:3299-303) ? 所得細(xì)胞呈遞目的復(fù)合體并被自體細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞識(shí)別，之后細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞增殖。
[0154]CD4+或CD8+T細(xì)胞的特異性活化可以以多種不同的方式檢測(cè)。用于檢測(cè)特異性T細(xì)胞活化的方法包括檢測(cè)T細(xì)胞增殖,細(xì)胞因子(例如,淋巴因子)的產(chǎn)生,或細(xì)胞裂解活性的產(chǎn)生。對(duì)于CD4+T細(xì)胞，一個(gè)優(yōu)選的檢測(cè)特異性T細(xì)胞活化的方法是T細(xì)胞增殖的檢測(cè)。對(duì)于CD8+T細(xì)胞，一個(gè)優(yōu)選的檢測(cè)特異性T細(xì)胞活化的方法是檢測(cè)細(xì)胞裂解活性的產(chǎn)生。
[0155]術(shù)語“主要組織相容性復(fù)合體”和縮寫“MHC”包括MHC I類和MHC II類分子，并涉及存在于所有脊椎動(dòng)物的基因的復(fù)合體。MHC蛋白或分子在免疫反應(yīng)中對(duì)于淋巴細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞或病變細(xì)胞之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)很重要，其中MHC蛋白或分子結(jié)合肽并且呈遞它們以被T細(xì)胞受體識(shí)別。由MHC編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞的表面上表達(dá)，并向T細(xì)胞顯示自身抗原(來自細(xì)胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如，入侵微生物的片段)。
[0156]MHC區(qū)分為3個(gè)亞類，I類、II類和III類。MHC I類蛋白包含a -鏈和0 2_微球蛋白(不是由15號(hào)染色體 編碼的MHC的一部分)。它們呈遞抗原片段給細(xì)胞毒性T細(xì)胞。在大多數(shù)免疫系統(tǒng)細(xì)胞中，特別是在抗原呈遞細(xì)胞中，MHC II類蛋白包含a-和鏈，并且它們呈遞抗原片段給T輔助細(xì)胞。MHC III類區(qū)編碼其他的免疫成分，例如補(bǔ)體成分并且一些編碼細(xì)胞因子。
[0157]在人中，編碼細(xì)胞表面上之抗原呈遞蛋白的MHC區(qū)基因被稱為人白細(xì)胞抗原(HLA)基因。然而，縮寫MHC經(jīng)常用于指HLA基因產(chǎn)物。HLA基因包括9個(gè)所謂的經(jīng)典MHC基因:HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPAl、HLA-DPBU HLA-DQAl、HLA-DQBU HLA-DRA 和 HLA-DRB1。
[0158]在本發(fā)明所有方面的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，MHC分子是HLA分子。
[0159]“特征為呈遞抗原的細(xì)胞”或“呈遞抗原的細(xì)胞”或者類似表述意指在MHC分子的環(huán)境中(尤其是MHC I類分子)呈遞其表達(dá)之抗原或來源于所述抗原之片段(例如通過加工抗原)的細(xì)胞例如病變細(xì)胞(如癌癥細(xì)胞)或抗原呈遞細(xì)胞。類似地，術(shù)語“特征為呈遞抗原的疾病”表示這樣的疾病，其涉及特征為呈遞抗原(特別是通過I類MHC)的細(xì)胞。通過細(xì)胞的抗原呈遞可通過使用核酸(如編碼抗原的RNA)轉(zhuǎn)染細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)。
[0160]所謂“呈遞的抗原的片段”或類似表述意指該片段可由MHC I類或II類(優(yōu)選MHCI類)呈遞，例如當(dāng)直接加入到抗原呈遞細(xì)胞中時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該片段是表達(dá)抗原的細(xì)胞自然呈遞的片段。
[0161]術(shù)語“免疫學(xué)上等同”是指免疫學(xué)上等同的分子，例如，顯示出相同或基本相同的免疫學(xué)性質(zhì)和/或發(fā)揮相同的或基本上相同的免疫效果的免疫學(xué)上等同的氨基酸序列，例如，關(guān)于免疫效果的類型，例如誘導(dǎo)體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和/或持續(xù)時(shí)間，或誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的特異性。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“免疫學(xué)上等同的”優(yōu)選用于免疫所用肽的免疫效果或性質(zhì)。例如，如果當(dāng)暴露于對(duì)象的免疫系統(tǒng)時(shí)，氨基酸序列誘導(dǎo)具有與參照氨基酸序列反應(yīng)的特異性的免疫反應(yīng)，則所述氨基酸序列與參照氨基酸序列免疫學(xué)上等同。
[0162]在本發(fā)明的上下文中的術(shù)語“免疫效應(yīng)子功能”包括通過免疫系統(tǒng)的組分介導(dǎo)的導(dǎo)致以下的任何功能:例如，腫瘤細(xì)胞的殺傷，或腫瘤生長(zhǎng)的抑制和/或腫瘤發(fā)生的抑制，包括腫瘤傳播和轉(zhuǎn)移的抑制。優(yōu)選地，本發(fā)明上下文中的免疫效應(yīng)子功能是T細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)子功能。這樣的功能就輔助T細(xì)胞(⑶4+T細(xì)胞)來說，包括由T細(xì)胞受體識(shí)別MHC II類分子環(huán)境下的抗原或來自抗原的抗原肽，細(xì)胞因子的釋放和/或CD8+淋巴細(xì)胞(CTL)和/或B-細(xì)胞的活化，并且就CTL來說，包括由T細(xì)胞受體識(shí)別MHC I類分子環(huán)境下的抗原或來自抗原的抗原肽，消除在MHC I類分子的環(huán)境下呈遞的細(xì)胞(即，特征為用I類MHC呈遞抗原的細(xì)胞)(例如，通過凋亡或穿孔蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞裂解)，生成細(xì)胞因子(如IFN-Y和TNF- a )，以及表達(dá)抗原的靶細(xì)胞的特異性細(xì)胞裂解性殺傷。
[0163]術(shù)語“基因組”涉及生物體或細(xì)胞的染色體中遺傳信息的總量。術(shù)語“外顯子組”是指基因組的編碼區(qū)。術(shù)語“轉(zhuǎn)錄組”涉及所有RNA分子的集合。
[0164]根據(jù)本發(fā)明的“核酸”優(yōu)選地是脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，更優(yōu)選RNA，最優(yōu)選體外轉(zhuǎn)錄的RNA(IVT RNA)或合成的RNA。根據(jù)本發(fā)明，核酸包括基因組DNA、cDNA、mRNA、重組產(chǎn)生的和化學(xué)合成的分子。根據(jù)本發(fā)明，核酸可以以單鏈或雙鏈的以及線性或共價(jià)環(huán)狀閉合的分子存在。根據(jù)本發(fā)明的核酸可以是分離的。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“分離的核酸”意指所述核酸為(i)體外擴(kuò)增的，例如通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，(ii)通過克隆重組產(chǎn)生的，(iii)純化的，例如通過切割和經(jīng)凝膠電泳分離，或(iv)合成的，例如通過化學(xué)合成。可用核酸引入(即轉(zhuǎn)染)細(xì)胞，尤其是，可通過體外轉(zhuǎn)錄從DNA模板制備的RNA形式。RNA還可在應(yīng)用之前通過穩(wěn)定序列、加帽和聚腺苷酸化進(jìn)行修飾。
[0165]術(shù)語“遺傳物質(zhì)”是指分離的核酸(DNA或RNA)、雙螺旋的一段、染色體的一段或者生物體或細(xì)胞的整個(gè)基因組，特別是其外顯子組或轉(zhuǎn)錄組。
[0166]術(shù)語“突變”是指與參照相比核酸序列的變化或差異(核苷酸替換、添加或刪除)。“體細(xì)胞突變”可在除生殖細(xì)胞(精子和卵子)以外的任何身體細(xì)胞中發(fā)生，從而不會(huì)傳遞給子代。這些改變可(但不總是)引起癌癥或其他疾病。優(yōu)選地，突變是非同義突變。術(shù)語“非同義突變”是指確實(shí)導(dǎo)致翻譯產(chǎn)物中氨基酸變化(例如，氨基酸替換)的突變，優(yōu)選核苷酸替換。
[0167]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“突變”包括點(diǎn)突變、插入-缺失(Indel)、融合、染色體碎裂(chromothripsis)和 RNA 編輯(RNA edit)。
[0168]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“插入-缺失”描述了特定的突變類型，其定義為導(dǎo)致共定位的(colocalized)插入和缺失以及核苷酸凈增加或損失的突變。在基因組的編碼區(qū)，除非插入-缺失的長(zhǎng)度是3的倍數(shù)，否則它們產(chǎn)生移框突變。插入-缺失可與點(diǎn)突變形成對(duì)比；其中插入-缺失從序列中插入和缺失核苷酸，而點(diǎn)突變是替代一個(gè)核苷酸的一種替換形式。
[0169]融合可產(chǎn)生從 兩個(gè)先前單獨(dú)的基因形成的雜合基因。這可以是易位、中間缺失或染色體倒位(chromosomal inversion)的結(jié)果。融合基因常常是癌基因。致癌融合基因可產(chǎn)生具有新功能或與兩個(gè)融合伴侶不同功能的基因產(chǎn)物?；蛘撸┗蚺c強(qiáng)啟動(dòng)子相融合，從而致癌功能被設(shè)定成通過由上游融合伴侶之強(qiáng)啟動(dòng)子所造成的上調(diào)來發(fā)揮功能。致癌融合轉(zhuǎn)錄本也可通過反式剪接(trans-splicing)或通讀事件(read-through event)造成。
[0170]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“染色體碎裂”是指一種遺傳現(xiàn)象，其中通過單個(gè)破壞性事件染色體的特定區(qū)域被打碎，之后連接在一起。
[0171]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“RNA編輯”(RNA edit或RNA editing)是指分子加工，其中RNA分子中的信息內(nèi)容通過堿基組成中的化學(xué)變化而改變。RNA編輯包括核苷修飾例如胞苷(C)修飾成尿苷(U)和腺苷(A)修飾成肌苷(I)脫氨基作用以及非模板化的核苷酸添加和插入。mRNA中的RNA編輯有效地改變編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列，使得其不同于通過基因組DNA序列所預(yù)測(cè)的序列。
[0172]術(shù)語“癌癥突變標(biāo)記(cancer mutation signature) ”是指與非癌性參照細(xì)胞相比時(shí)存在于癌癥細(xì)胞中的一組突變。
[0173]根據(jù)本發(fā)明，“參照”可用于關(guān)聯(lián)并比較在本發(fā)明之方法中獲得的來自腫瘤樣本的結(jié)果。通常，可在一個(gè)或更多個(gè)正常樣本(特別是沒有被癌癥疾病影響的樣本)的基礎(chǔ)上獲得“參照”，所述樣本獲自患者或者一個(gè)或更多個(gè)不同個(gè)體(優(yōu)選健康個(gè)體，特別是同一物種的個(gè)體)?？赏ㄟ^測(cè)試足夠大數(shù)目的正常樣本來在經(jīng)驗(yàn)上確定“參照”。
[0174]根據(jù)本發(fā)明可使用任何合適的測(cè)序方法，優(yōu)選新一代測(cè)序(NGS)技術(shù)。第三代測(cè)序方法可能在將來取代NGS技術(shù)用于使本方法的測(cè)序步驟加速。為了清楚目的:在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“新一代測(cè)序”或“NGS”意指所有新的高通量測(cè)序技術(shù)，其與已知為Sanger化學(xué)的“常規(guī)”測(cè)序方法不同，通過使整個(gè)基因組破碎成小片段來沿著整個(gè)基因組隨機(jī)地并行閱讀核酸模板。這種NGS技術(shù)(也稱為大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)(massively parallelsequencing technology)`)能夠在非常短的時(shí)間內(nèi)(例如，I~2周內(nèi)、優(yōu)選I~7天內(nèi)或最優(yōu)選小于24小時(shí)內(nèi))遞送全基因組、外顯子組、轉(zhuǎn)錄組(基因組的所有經(jīng)轉(zhuǎn)錄序列)或甲基化組(methylomeM基因組的所有經(jīng)甲基化序列)的核酸序列信息并且原則上允許單細(xì)胞測(cè)序法。在本發(fā)明的上下文中，可使用市售或文獻(xiàn)中所提及的多種NGS平臺(tái)，例如在 Zhang 等 2011:The impact of next-generation sequencing on genomics.J.GenetGenomics38 (3), 95-109 中；或在 Voelkerding等 2009:Next generation sequencing:Frombasic research to diagnostics.Clinical chemistry55,641-658 中詳細(xì)描述的那些。這種NGS技術(shù)/平臺(tái)的非限制性實(shí)例是:
[0175]I)在例如 Roche -associated company454Life Sciences(Branford，Connecticut)的GS-FLX454基因組測(cè)序儀?中實(shí)施的稱作焦磷酸測(cè)序的邊合成邊測(cè)序技術(shù)(sequencing-by-synthesis technology)，首次描述于 Ronaghi 等 1998:Asequencingmethod based on real-time pyrophosphate".Science281 (5375)，363-365 中。該技術(shù)使用乳劑PCR，其中將單鏈DNA結(jié)合珠通過劇烈渦旋封裝至包含油環(huán)繞之PCR反應(yīng)物的水性膠束中用于乳劑PCR擴(kuò)增。在焦磷酸測(cè)序過程中，隨著聚合酶合成DNA鏈，記錄核苷酸整合期間從磷酸分子發(fā)射的光。
[0176]2)由 Solexa(現(xiàn)在是 Illumina Inc.，San Diego, California 的一部分)開發(fā)的邊合成邊測(cè)序法，其是基于可逆染料終止劑并且在例如Illumina / Solexa基因組分析儀ts^P Illumina HiSeq2000基因組分析儀?中實(shí)施。在該技術(shù)中，所有四種核苷酸與DNA聚合酶一起在流動(dòng)細(xì)胞通道中同時(shí)添加至寡引物化的簇片段中。橋式擴(kuò)增(bridgeamp I i fi cat i on)用所有四種經(jīng)突光標(biāo)記的核苷酸延伸簇鏈用于測(cè)序。
[0177]3)邊連接邊測(cè)序法(Sequencing-by-ligation approach),在例如 AppliedBiosystems (現(xiàn)在是 Life Technologies Corporation, Carlsbad, California)的 SOL id?平臺(tái)中實(shí)施。在該技術(shù)中，根據(jù)測(cè)序位置標(biāo)記固定長(zhǎng)度的所有可能寡核苷酸的合并物。將寡核苷酸退火并連接；對(duì)于匹配序列通過DNA連接酶的優(yōu)先連接產(chǎn)生該位置核苷酸的信號(hào)信息。在測(cè)序前，通過乳液PCR擴(kuò)增DNA。所得珠子(各自僅包含同一 DNA分子的拷貝)置于載玻片上。作為第二實(shí)例，Dover Systems (Salem, New Hampshire)的 Polonator? G.007平臺(tái)也采用通過使用隨機(jī)排列的、基于珠子的乳液PCR以擴(kuò)增DNA片段用于并行測(cè)序的邊連接邊測(cè)序法。
[0178]4)單分子測(cè)序技術(shù)，例如在 Pacific Biosciences (Menlo Park, California)的PacBio RS 系統(tǒng)中或在 Helicos Biosciences (Cambridge, Massachusetts)的 HeIiScope?平臺(tái)中實(shí)施的。該技術(shù)的獨(dú)特特征是其能夠?qū)蝹€(gè)DNA或RNA分子進(jìn)行測(cè)序而不進(jìn)行擴(kuò)增，將其定義為單分子實(shí)時(shí)(SMRT)DNA測(cè)序。例如，HeliScope使用高靈敏度熒光檢測(cè)系統(tǒng)以在其合成時(shí)直接檢測(cè)各核苷酸?；跓晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移(FRET)的類似方法由Visigen Biotechnology (Houston, Texas)開發(fā)。其他基于突光的單分子技術(shù)來自美國(guó)Genomics(GeneEngine?)和 Genovoxx(AnyGene?)。
[0179]5)單分子測(cè)序的納米技術(shù)，其中使用例如布置在芯片上的多個(gè)納米結(jié)構(gòu)以在復(fù)制期間監(jiān)測(cè)聚合酶分子在單鏈上的運(yùn)動(dòng)?；诩{米技術(shù)之方法的非限制性實(shí)例為OxfordNanopore Technologies(Oxford, UK)的 GridON? 平臺(tái)、由 Nabsys(Providence, RhodeIsland)開發(fā)的雜交輔助納米孔測(cè)序(HANS?)平臺(tái)和用DNA納米球(DNB)技術(shù)的基于專有連接酶的DNA測(cè)序平臺(tái) (稱作組合型探針-錨連接(cPAL?))。
[0180]6)單分子測(cè)序的基于電子顯微鏡的技術(shù)，例如由LightSpeedGenomics(Sunnyvale,California)和 Halcyon Molecular(Redwood City, California)開發(fā)的那些。
[0181]7)離子半導(dǎo)體測(cè)序，其是基于檢測(cè)在DNA聚合期間釋放的氫離子。例如，1nTorrent Systems (San Francisco, California)使用微加工孔的高密度陣列以用大規(guī)模并行方式進(jìn)行該生化過程。每個(gè)孔裝有不同的DNA模板?？椎南路绞请x子敏感層，再下方是專有離子傳感器。
[0182]優(yōu)選地，DNA和RNA制備物充當(dāng)NGS的起始材料。這種核酸可容易地獲自諸如生物材料的樣品，例如來自新鮮的、快速冷凍的或福爾馬林固定的石蠟包埋腫瘤組織(FFPE)或者來自新鮮分離細(xì)胞或來自CTC(存在于患者外周血中)?？蓮恼５捏w細(xì)胞組織中提取正常的非突變基因組DNA或RNA，然而在本發(fā)明的上下文中優(yōu)選生殖系細(xì)胞。從患有非血液惡性腫瘤患者的外周血單核細(xì)胞(PBMC)中提取生殖系DNA或RNA。盡管從FFPE組織或新鮮分離的單細(xì)胞中提取的核酸被高度片段化，但是它們適合用于NGS應(yīng)用。
[0183]外顯子組測(cè)序的數(shù)種靶向NGS方法描述于文獻(xiàn)中(綜述參見例如Teer andMullikin2010:Human Mol Genetl9 (2)，R145-51)，其中所有可用于與本發(fā)明結(jié)合。在這些方法中許多(例如作為基因組捕獲、基因組分割、基因組富集等描述)使用雜交技術(shù)并且包括基于陣列的(例如，Hodges等2007:Nat.Genet.39，1522-1527)和基于流體的(例如，Choi 等 2009:Proc.Natl.Acad.Sci USA106，19096-19101)雜交方法。用于 DNA 樣品制備和隨后外顯子捕獲的商業(yè)試劑盒也是可獲得的:例如，Illumina Inc.(San Diego,California)提供 TruSeq? DNA 樣品制備試劑盒和 Exome Enrichment Kit TruSeqTj^hM子組富集試劑盒。 [0184]當(dāng)將例如腫瘤樣品序列與參照樣品序列(例如，生殖系樣品序列)進(jìn)行比較時(shí)，為了減少在檢測(cè)癌癥特異性體細(xì)胞突變或序列差異中假陽性發(fā)現(xiàn)的數(shù)目，優(yōu)選地在這些樣品類型的一種或兩種的重復(fù)中確定序列。因此，優(yōu)選的是對(duì)參照樣品序列(例如，生殖系樣品序列)確定兩次、三次或更多次。可替換地或另外，對(duì)腫瘤樣品序列確定兩次、三次或更多次。還可通過對(duì)所述參照樣品和/或所述腫瘤樣品至少一次確定基因組DNA中的序列和至少一次確定RNA中的序列來多于一次地確定參照樣品序列(例如，生殖系樣品序列)和/或腫瘤樣品序列。例如，通過確定參照樣品(例如，生殖系樣品)的重復(fù)之間的變異，可估計(jì)體細(xì)胞突變作為統(tǒng)計(jì)數(shù)量的預(yù)期假陽性率(FDR)。樣品的技術(shù)重復(fù)應(yīng)產(chǎn)生一致的結(jié)果并且該“相同-相同比較”中的任何檢測(cè)突變是假陽性的。特別是，為了確定相對(duì)于參照樣品在腫瘤樣品中體細(xì)胞突變檢測(cè)的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率，參照樣品的技術(shù)重復(fù)可用作參照以評(píng)估假陽性的數(shù)目。也可使用機(jī)器學(xué)習(xí)法將多種品質(zhì)相關(guān)度量(例如，覆蓋或SNP品質(zhì))組合成單一品質(zhì)評(píng)分。對(duì)于給定的體細(xì)胞變異，可計(jì)數(shù)具有更高品質(zhì)評(píng)分的所有其他變異，這使得能夠在數(shù)據(jù)集中對(duì)所有變異進(jìn)行分級(jí)(ranking)。
[0185]根據(jù)本發(fā)明，可使用高通量全基因組單細(xì)胞基因分型方法。
[0186]在高通量全基因組單細(xì)胞基因分型的一個(gè)實(shí)施方案中，可使用Fluidigm平臺(tái)。這種方法可包括以下步驟:
[0187]1.從給定的患者中采集腫瘤組織/細(xì)胞和健康組織。
[0188]2.從癌性細(xì)胞和健康細(xì)胞中提取遺傳物質(zhì)，之后使用標(biāo)準(zhǔn)新一代測(cè)序(NGS)方案對(duì)其外顯子組(DNA)進(jìn)行測(cè)序。NGS的覆蓋是這樣的，使得可檢測(cè)具有至少5%頻率的雜合子等位基因。還從癌癥細(xì)胞中提取轉(zhuǎn)錄組(RNA)，轉(zhuǎn)化成cDNA并測(cè)序以確定哪些基因由癌癥細(xì)胞表達(dá)。
[0189]3.如本文中描述地鑒定非同義表達(dá)的單核苷酸變異(SNV)。濾出健康組織中SNP的位點(diǎn)。
[0190]4.跨越不同頻率選擇來自(3)的N=96個(gè)突變。對(duì)于這些突變，設(shè)計(jì)基于熒光檢測(cè)的SNP基因分型測(cè)定并合成(這種測(cè)定的實(shí)例包括:Life Technologies的基于TaqMan的SNP測(cè)定或Fluidigm的SNPtype測(cè)定)。測(cè)定將包括特異性靶標(biāo)擴(kuò)增(STA)引物以擴(kuò)增包含給定SNV的擴(kuò)增子(這在TaqMan和SNPtype測(cè)定中是標(biāo)準(zhǔn)的)。
[0191]5.通過激光顯微切割(LMD)或通過解聚從腫瘤和從健康組織中使個(gè)體細(xì)胞分離成單細(xì)胞懸液，然后如前所述進(jìn)行分選(Dalerba P.等(2011) Nature Biotechnology29:1120-1127)?？稍诓贿M(jìn)行預(yù)選擇的情況下選擇細(xì)胞(即，無偏向性)，或可替換地，可富集癌性細(xì)胞。富集方法包括:特異性染色、通過細(xì)胞大小分選、LMD期間的組織學(xué)檢查，等。
[0192]6.在包含具有STA引物之預(yù)混物(master mix)的PCR管中分離個(gè)體細(xì)胞并且擴(kuò)增包含SNV的擴(kuò)增子?；蛘?，通過如前所述的全基因組擴(kuò)增(WGA)來擴(kuò)增單細(xì)胞的基因組(Frumkin D.等(2008) Cancer Research68:5924)。通過95°C加熱步驟或通過專用裂解緩沖液來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞裂解。
[0193]7.稀釋STA擴(kuò)增樣品并加樣至Fluidigm基因分型陣列上。
[0194]8.來自健康組織的樣品將用作陽性對(duì)照以確定純合子等位基因簇(無突變)。因?yàn)镹GS數(shù)據(jù)表明純合子突變是極其稀有的，所以通常僅兩個(gè)簇是預(yù)期的:XX和XY，其中X=健康。
[0195]9.不限制可進(jìn)行的陣列的數(shù)目，實(shí)際上允許多至~1000個(gè)待測(cè)定的單細(xì)胞(~10個(gè)陣列)。如果在384板中進(jìn)行，那么樣品制備可減少至數(shù)天。
[0196]10.之后確定每個(gè)細(xì)胞的SNV。
[0197]在高通量全基因組單細(xì)胞基因分型的另一個(gè)實(shí)施方案中，可使用NGS平臺(tái)。這種方法可包括以下步驟:
[0198]1.上述步驟I至6是一樣的，除了 N(所測(cè)定SNV的數(shù)目)可比96大得多。在WGA的情況中，之后將進(jìn)行若干循環(huán)的STA。STA引物在各個(gè)引物上包含兩個(gè)通用標(biāo)簽序列。
[0199]2.STA之后，標(biāo)記(barcode)引物將被PCR擴(kuò)增至擴(kuò)增子中。標(biāo)記引物包含獨(dú)特的標(biāo)記序列和上述通用標(biāo)簽序列。每個(gè)細(xì)胞從而包含獨(dú)特的標(biāo)記。
[0200]3.混合來自所有細(xì)胞的擴(kuò)增子并通過NGS進(jìn)行測(cè)序。對(duì)可被多重化之細(xì)胞的數(shù)目的實(shí)際限制是可制備之板的數(shù)目。因?yàn)榭稍?84板中制備樣品，所以實(shí)際極限應(yīng)是~5000個(gè)細(xì)胞。
[0201]4.基于序列數(shù)據(jù)，檢測(cè)個(gè)體細(xì)胞的SNV (或其他結(jié)構(gòu)異常)。
[0202]對(duì)于優(yōu)先抗原，可根據(jù)本發(fā)明使用基于單細(xì)胞基因分型的腫瘤系統(tǒng)發(fā)育重建(“系統(tǒng)發(fā)育抗原優(yōu)先化”)。除了基于標(biāo)準(zhǔn)(例如表達(dá)、突變類型(非同義突變相對(duì)于其他)、MHC結(jié)合特征等)的抗原優(yōu)先化之外，可使用旨在處理腫瘤內(nèi)和腫瘤間異質(zhì)性以及活檢偏向性的用于優(yōu)先化的又一參數(shù)，例如以下所述。
[0203]1.鑒定最豐富的抗原
[0204]可基于上述單細(xì)胞測(cè)定結(jié)合高通量全基因組單細(xì)胞基因分型方法準(zhǔn)確地評(píng)估各個(gè)SNV的頻率并且可選擇存在的最豐富SNV用于提供癌癥個(gè)體化疫苗(IVAC)。
[0205]2.基于有根樹分析鑒定原發(fā)基本抗原(primary basal antigen)
[0206]來自腫瘤的NGS數(shù)據(jù)表明純合子突變(在兩個(gè)等位基因中均有)是稀有事件。因此不需要單體型分型并且可從單細(xì)胞SNV數(shù)據(jù)集中創(chuàng)建腫瘤體細(xì)胞突變的系統(tǒng)發(fā)育樹。生殖系序列將用于使樹有根。使用再現(xiàn)祖先序列的算法，再現(xiàn)接近樹根之節(jié)點(diǎn)的序列。這些序列包含預(yù)期存在于原發(fā)腫瘤中的最早突變(本文中定義為原發(fā)基礎(chǔ)突變/抗原)。由于兩個(gè)突變?cè)诨蚪M同一位置中的相同等位基因上發(fā)生的低概率，所以預(yù)測(cè)祖先序列中的突變?cè)谀[瘤中是固定的。
[0207]優(yōu)先化原發(fā)基礎(chǔ)抗原不等于優(yōu)先化活檢中最頻繁突變(盡管預(yù)計(jì)原發(fā)基礎(chǔ)突變?cè)诨顧z中最頻繁當(dāng)中)。原因如下:假如兩個(gè)SNV顯示出存在于來源于活檢的所有細(xì)胞中(并且因而具有相同頻率-100%)，但是一個(gè)突變是基礎(chǔ)的而另一個(gè)不是，那么應(yīng)選擇該基礎(chǔ)突變用于IVAC。這是因?yàn)?，基礎(chǔ)突變可能存在于腫瘤的所有區(qū)域中，而后一種突變可能是偶爾在進(jìn)行活檢之區(qū)域中固定的較新突變。另外，基礎(chǔ)抗原可能存在于來源于原發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)移瘤中。因此，通過優(yōu)先化基礎(chǔ)抗原用于IVAC，可極大地提高IVAC能夠根除整個(gè)腫瘤而不僅僅是腫瘤之一部分的機(jī)會(huì)。[0208]如果繼發(fā)性腫瘤存在并且這些也被采樣，那么可評(píng)估所有腫瘤的進(jìn)化樹。這可改進(jìn)樹的穩(wěn)定性并且使得能夠檢測(cè)對(duì)所有腫瘤為基礎(chǔ)的突變。
[0209]3.鑒定最大程度跨越腫瘤的抗原
[0210]獲得最大覆蓋所有腫瘤位點(diǎn)之抗原的另一種方法是從腫瘤取得若干活檢。一個(gè)策略應(yīng)選擇通過NGS分析鑒定為存在于所有活檢中的抗原。為了改進(jìn)經(jīng)鑒定基礎(chǔ)突變的機(jī)會(huì)，可進(jìn)行基于來自所有活檢之單細(xì)胞突變的系統(tǒng)發(fā)育分析。
[0211]在轉(zhuǎn)移的情況中，可獲得來自所有腫瘤的活檢并且可選擇通過NGS鑒定的對(duì)于所有腫瘤是共同的突變。
[0212]4.使用CTC優(yōu)先化抑制轉(zhuǎn)移的抗原
[0213]認(rèn)為轉(zhuǎn)移瘤來源于單細(xì)胞。因此，通過對(duì)提取自給定患者之不同腫瘤的個(gè)體細(xì)胞進(jìn)行基因分型結(jié)合對(duì)患者的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)進(jìn)行基因分型，可重建癌癥的進(jìn)化史。預(yù)期觀察從原始腫瘤通過來源于原發(fā)腫瘤之CTC進(jìn)化枝進(jìn)化的轉(zhuǎn)移腫瘤。
[0214]以下(鑒定、計(jì)數(shù)和在遺傳上用探針探查CTC的無偏向性方法)，我們描述了上述高通量全基因組單細(xì)胞基因型分型方法對(duì)無偏向性分離和基因組分析CTC的延伸。使用上述分析，可重建原發(fā)腫瘤、CTC和由轉(zhuǎn)移(如果它們存在)所導(dǎo)致繼發(fā)性腫瘤的系統(tǒng)發(fā)育樹。基于該樹，可鑒定在CTC首次從原發(fā)腫瘤分離時(shí)或緊接其后發(fā)生的突變(過客或驅(qū)動(dòng))。預(yù)期的是，由原發(fā)腫瘤所產(chǎn)生的CTC的基因組與繼發(fā)性腫瘤基因組相比進(jìn)化地更類似于原發(fā)腫瘤基因組。另外，預(yù)期由原發(fā)腫瘤所產(chǎn)生的CTC的基因組將包含在繼發(fā)性腫瘤中固定或?qū)⒖赡芄潭?如果將來形成繼發(fā)性腫瘤)的獨(dú)特突變?？蓛?yōu)先化這些獨(dú)特突變用于IVAC以靶向(或預(yù)防)轉(zhuǎn)移。
[0215]相對(duì)于原發(fā)基礎(chǔ)突變優(yōu)先化CTC突變的優(yōu)點(diǎn)是，來源于CTC的抗原可使T細(xì)胞移動(dòng)以特異性靶向轉(zhuǎn)移，從而將與靶向原發(fā)腫瘤之T細(xì)胞相獨(dú)立的一支(使用不同抗原)。另外，如果有很少(或沒有)繼發(fā)性腫瘤，那么預(yù)計(jì)來自CTC來源抗原之免疫逃逸的機(jī)會(huì)較低，因?yàn)槟[瘤逃逸的可能性應(yīng)該用攜帶給定抗原之癌癥細(xì)胞的數(shù)目來衡量。
[0216]5.鑒定同一細(xì)胞上共發(fā)生的抗原(“雞尾酒”IVAC)
[0217]認(rèn)為腫瘤因免疫系統(tǒng)和治療的選擇壓力而進(jìn)化以抑制突變。靶向多抗原(其在同一細(xì)胞上共發(fā)生并且在腫瘤中也是頻繁的)的癌癥疫苗具有較大的機(jī)會(huì)壓倒腫瘤逃逸機(jī)制，因此降低了復(fù)發(fā)的機(jī)會(huì)。這種“雞尾酒疫苗”類似于HIV+患者的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒聯(lián)合治療?？赏ㄟ^系統(tǒng)發(fā)育分析或通過檢查所有細(xì)胞的SNV比對(duì)來鑒定共發(fā)生突變。
[0218]另外，根據(jù)本發(fā)明，可使用用于鑒定、計(jì)數(shù)和在遺傳上用探針探查CTC的無偏向性方法。這種方法可包括以下步驟:
[0219]1.獲得腫瘤的活檢并且確定體細(xì)胞突變的圖譜。
[0220]2.選項(xiàng)1:選擇N > 96個(gè)突變用于基于之前所建立優(yōu)先化方案的進(jìn)一步研究。
[0221]選項(xiàng)2:進(jìn)行單細(xì)胞試驗(yàn)(參見上述高通量全基因組單細(xì)胞基因分型方法)然后進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析以選擇N > 96個(gè)原發(fā)基礎(chǔ)突變和可能較新近的突變以最大化多樣性。前一種突變可用于鑒定CTC(參見下文)，后者用于產(chǎn)生系統(tǒng)發(fā)育分析(參見“鑒定同一細(xì)胞上共發(fā)生的抗原(“雞尾酒” IVAC) ”部分)。
[0222]3.從癌癥患者獲得全血。
[0223]4.裂解紅細(xì)胞。[0224]5.通過消耗⑶45+細(xì)胞移除白血細(xì)胞(例如，通過分選、綴合抗⑶45抗體的磁珠，等)以富集CTC。
[0225]6.通過DNA酶消化移除自由DNA。自由DNA的來源可以是存在于血液中的DNA或來自死亡細(xì)胞的DNA。
[0226]7.將剩余細(xì)胞分選至PCR管中，進(jìn)行STA (基于經(jīng)選擇的突變)并且用Fluidigm(上述高通量全基因組單細(xì)胞基因分型方法)篩選。CTC通常應(yīng)是多個(gè)SNV陽性。
[0227]8.之后可基于一系列所篩選的SNV在系統(tǒng)發(fā)育上進(jìn)一步分析鑒定為癌性的細(xì)胞(=CTC)(參見“鑒定同一細(xì)胞上共發(fā)生的抗原(“雞尾酒” IVAC) ”部分)。
[0228]對(duì)于分離的CTC而言還可將該方法與之前建立的方法組合。例如，可分選EpCAM+細(xì)胞或?qū)?xì)胞角蛋白呈陽性的細(xì)胞(Rao CG.等(2005) International journal ofoncology27:49 ；Allard WJ.等(2004)Clinical Cancer ResearchlO:6897-6904)。之后可用Fluidigm / NGS對(duì)這些假定的CTC進(jìn)行確證/譜分析以導(dǎo)出其突變。
[0229]該方法可用于計(jì)數(shù)CTC。因?yàn)樵摲椒ú灰蕾囈粋€(gè)可以或可以不通過癌癥細(xì)胞表達(dá)的特定標(biāo)記物，而是依賴在對(duì)患者而言獨(dú)特癌癥體細(xì)胞突變的突變譜，這是檢測(cè)和列舉CTC的無偏向性方法。
[0230]根據(jù)本發(fā)明，可使用涉及基于單細(xì)胞基因分型之腫瘤系統(tǒng)發(fā)育重建以富集驅(qū)動(dòng)突變的方法(“系統(tǒng)發(fā)育過濾”)。
[0231]在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)行用于恢復(fù)驅(qū)動(dòng)突變的泛腫瘤系統(tǒng)發(fā)育分析。
[0232]例如，可檢測(cè)來自n=l種腫瘤的驅(qū)動(dòng)突變。
[0233]在上述“基于有根樹分析鑒定原發(fā)基礎(chǔ)抗原”部分中，我們描述了恢復(fù)祖先序列和/或鑒定具有接近樹根之序列的細(xì)胞的方法。預(yù)計(jì)突變?cè)谶@些序列中的數(shù)目顯著小于突變?cè)诎┌Y大塊樣品中的數(shù)目，因?yàn)榘凑斩x，這些是接近樹根的序列。因此，通過選擇接近樹根的序列，預(yù)計(jì)許多過客突變被“系統(tǒng)發(fā)育過濾”出來。該過程可極大地富集驅(qū)動(dòng)突變。之后，驅(qū)動(dòng)突變可用于鑒定/選擇用于患者的治療或者可用作新療法的引導(dǎo)。
[0234]在另一個(gè)實(shí)例中，可檢測(cè)來自給定類型之n>l種腫瘤的驅(qū)動(dòng)突變。
[0235]通過重建來自特定類型之許多腫瘤的原發(fā)基礎(chǔ)突變，可極大地提高檢測(cè)驅(qū)動(dòng)突變的機(jī)會(huì)。因?yàn)榻咏鼧涓幕A(chǔ)序列濾出了許多過客突變，所以預(yù)計(jì)檢測(cè)驅(qū)動(dòng)突變中的信噪比極大地提高。因此該方法可檢測(cè)(I)較低頻繁的驅(qū)動(dòng)突變(2)來自較少樣品的頻繁驅(qū)動(dòng)突變。
[0236]在涉及基于單細(xì)胞基因分型之腫瘤系統(tǒng)發(fā)育重建以富集驅(qū)動(dòng)突變的方法(“系統(tǒng)發(fā)育過濾”)的另一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析以恢復(fù)引起轉(zhuǎn)移的驅(qū)動(dòng)突變。
[0237]在上述“使用CTC以優(yōu)先化抑制轉(zhuǎn)移的抗原”部分中，我們描述了檢測(cè)CTC相關(guān)突變的方法。該方法還可用于富集導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的驅(qū)動(dòng)突變。例如，通過對(duì)原發(fā)腫瘤、繼發(fā)性腫瘤和CTC的組合系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行作圖，來源于原發(fā)腫瘤的CTC應(yīng)在原發(fā)繼發(fā)性腫瘤的進(jìn)化枝之間連接。該系統(tǒng)發(fā)育分析可幫助精確找到在原發(fā)和繼發(fā)性腫瘤之間的該過渡處獨(dú)特的突變。這些突變的一部分可以是驅(qū)動(dòng)突變。另外，通過比較來自同一癌癥(即，n>l種腫瘤)之不同實(shí)例的獨(dú)特CTC突變，可進(jìn)一步富集引起轉(zhuǎn)移的獨(dú)特驅(qū)動(dòng)突變。
[0238]根據(jù)本發(fā)明，可使用鑒定相對(duì)于繼發(fā)性腫瘤之原發(fā)腫瘤的系統(tǒng)發(fā)育分析。
[0239]在轉(zhuǎn)移的情況中，如果采集所有腫瘤，有根樹可用于預(yù)測(cè)腫瘤出現(xiàn)的時(shí)間順序:哪個(gè)腫瘤是原發(fā)腫瘤(最接近樹根的節(jié)點(diǎn))并且哪個(gè)腫瘤是最新近的腫瘤。在難以確定哪一種腫瘤是原發(fā)的情況中這可以是有幫助的。
[0240]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“RNA”涉及包含至少一個(gè)核糖核苷酸殘基并且優(yōu)選完全或基本上由核糖核苷酸殘基構(gòu)成的分子?！昂颂呛塑账帷鄙婕霸?-D-核糖呋喃基的2’ -位置具有羥基的核苷酸。術(shù)語“RNA”包括雙鏈RNA、單鏈RNA、分離的RNA(例如部分純化或完全純化的RNA)、基本上純的RNA、合成RNA和重組產(chǎn)生的RNA (例如修飾的RNA，其通過一個(gè)或更多個(gè)核苷酸的添加、刪除、替換和/或改變而區(qū)別于天然的RNA)。這樣的改變可包括例如向RNA的末端或內(nèi)部(例如，在RNA的一個(gè)或更多個(gè)核苷酸)添加非核苷酸物質(zhì)。RNA分子中的核苷酸還可以包括非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸，例如非天然的核苷酸或化學(xué)合成的核苷酸或脫氧核苷酸。這些改變的RNA可被稱為類似物或天然RNA的類似物。
[0241 ] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“RNA”包括并且優(yōu)選涉及“mRNA”。術(shù)語“mRNA”意指“信使RNA”并且涉及通過使用DNA模板產(chǎn)生并編碼肽或多肽的“轉(zhuǎn)錄本”。通常，mRNA包含5’ -UTR、蛋白質(zhì)編碼區(qū)和3’-UTR。mRNA在細(xì)胞內(nèi)和體外僅具有有限的半衰期。在本發(fā)明的上下文中，可通過體外轉(zhuǎn)錄從DNA模板產(chǎn)生mRNA。體外轉(zhuǎn)錄方法對(duì)技術(shù)人員而言是已知的。例如,有多種市售的體外轉(zhuǎn)錄試劑盒。
[0242]根據(jù)本發(fā)明，RNA的穩(wěn)定性和翻譯效率可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)節(jié)。例如，可以通過具有穩(wěn)定效果和/或增加RNA翻譯效率的一個(gè)或更多個(gè)修飾來穩(wěn)定RNA和增加其翻譯。這樣的修飾在例如通過引用并入本文的PCT / EP2006 / 009448中描述。為了增加根據(jù)本發(fā)明使用的RNA的表達(dá)，其可在編碼區(qū)域內(nèi)對(duì)其進(jìn)行修飾(即編碼所表達(dá)的肽或蛋白質(zhì)的序列，優(yōu)選不改變所表達(dá)肽或蛋白質(zhì)的序列)以便增加GC含量以提高mRNA穩(wěn)定性并進(jìn)行密碼子優(yōu)化從而加強(qiáng)在細(xì)胞中的翻譯。
[0243]在本發(fā)明中使用RNA的上下文中，術(shù)語“修飾”包括不天然存在于RNA中的所述RNA的任何修飾。
[0244]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施 方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的RNA不具有非加帽5'-三磷酸酯?？赏ㄟ^用磷酸酶處理RNA來實(shí)現(xiàn)去除這種非加帽5'-三磷酸酯。
[0245]根據(jù)本發(fā)明的RNA可具有經(jīng)修飾的核糖核苷酸以提高其穩(wěn)定性和/或減少細(xì)胞毒性。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明使用的RNA中，5-甲基胞苷部分地或完全地、優(yōu)選完全地替換胞苷?？商鎿Q地或另外，在一個(gè)實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明使用的RNA中，假尿苷部分地或完全地、優(yōu)選完全地替換尿苷。
[0246]在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語“修飾”涉及提供具有5’ -帽或5’ -帽類似物的RNA。術(shù)語“5’ -帽”是指在mRNA分子的5’ -末端發(fā)現(xiàn)的帽結(jié)構(gòu)并且通常由通過不常見5'至5'三磷酸酯鍵與mRNA相連接的鳥苷核苷酸組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，該鳥苷在7-位被甲基化。術(shù)語“常規(guī)5’ -帽”是指天然的RNA5’ -帽，優(yōu)選于7-甲基鳥苷帽O(jiān)n7G)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“5’ -帽”包括5’ -帽類似物，其類似RNA帽結(jié)構(gòu)并且被修飾以優(yōu)選地在體內(nèi)和/或細(xì)胞中具有穩(wěn)定RNA和/或加強(qiáng)RNA翻譯(如果與其連接)的能力。
[0247]優(yōu)選地，RNA的5’末端包括具有下述通式的帽結(jié)構(gòu):
[0248]
【權(quán)利要求】
1.用于提供個(gè)體化癌癥疫苗的方法，其包括以下步驟: (a)鑒定癌癥患者腫瘤樣本中的癌癥特異性體細(xì)胞突變，以提供所述患者的癌癥突變標(biāo)記；以及 (b)提供以步驟(a)獲得的所述癌癥突變標(biāo)記為特征的疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述鑒定癌癥特異性體細(xì)胞突變的步驟包括鑒定一個(gè)或更多個(gè)癌癥細(xì)胞的外顯子組的癌癥突變標(biāo)記。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述鑒定癌癥特異性體細(xì)胞突變的步驟包括一個(gè)或更多個(gè)癌癥細(xì)胞的單細(xì)胞測(cè)序。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述癌癥細(xì)胞為循環(huán)腫瘤細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述鑒定癌癥特異性體細(xì)胞突變的步驟涉及使用新一代測(cè)序(NGS)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述鑒定癌癥特異性體細(xì)胞突變的步驟包括對(duì)所述腫瘤樣本的基因組DNA和/或RNA進(jìn)行測(cè)序。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述鑒定癌癥特異性體細(xì)胞突變的步驟至少以一式兩份的方式重復(fù)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其包括確定鑒定出的突變?cè)谟糜诎┌Y疫苗接種之表位中的可用性的另外步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中以所述患者的突變標(biāo)記為特征的所述疫苗包含多肽或編碼所 述多肽的核酸，所述多肽包含基于突變的新表位。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述多肽包含多至30個(gè)基于突變的新表位。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法，其中所述多肽還包含由癌癥細(xì)胞表達(dá)的不含癌癥特異性體細(xì)胞突變的表位。
12.根據(jù)權(quán)利要求9至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述表位在其天然序列環(huán)境中以形成疫苗序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述疫苗序列的長(zhǎng)度為約30個(gè)氨基酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求9至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述新表位、表位和/或疫苗序列頭尾連接地排列。
15.根據(jù)權(quán)利要求9至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述新表位、表位和/或疫苗序列通過接頭分隔開。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述疫苗為RNA疫苗。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述疫苗為預(yù)防性和/或治療性疫苗。
18.可通過根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述之方法獲得的疫苗。
19.包含重組多肽或編碼所述多肽的核酸的疫苗，所述重組多肽包含基于突變的新表位,所述新表位因癌癥患者腫瘤樣本中的癌癥特異性體細(xì)胞突變而產(chǎn)生。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的疫苗，其中所述多肽還包含由癌癥細(xì)胞表達(dá)的不含癌癥特異性體細(xì)胞突變的表位。
21.治療癌癥患者的方法，其包括以下步驟: (a)通過根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的方法提供個(gè)體化癌癥疫苗；和(b)向所述患者施用所述疫苗。
22.治療癌癥患者的方法，其包括向所述患者施用根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)所述的疫苗。
23.用于基于新一代測(cè)序數(shù)據(jù)確定錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率的方法，所述方法包括: 取得來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第一樣品； 取得來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第二樣品； 取得來自腫瘤細(xì)胞的遺傳物質(zhì)第一樣品； 取得來自所述腫瘤細(xì)胞的遺傳物質(zhì)第二樣品； 通過對(duì)既包含在所述腫瘤中又包含在所述來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第一樣品和所述來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第二樣品的至少之一中的參照基因組的全部堿基進(jìn)行計(jì)數(shù)來確定共同覆蓋腫瘤比較； 通過對(duì)同時(shí)被所述來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第一樣品和所述來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第二樣品覆蓋的參照基因組的全部堿基進(jìn)行計(jì)數(shù)來確定共同覆蓋相同-相同比較； 用所述共同覆蓋腫瘤比較除以所述共同覆蓋相同-相同比較以形成歸一化； 通過以下來確定錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率:用I)在所述來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第一樣品和所述來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第二樣品的比較中品質(zhì)評(píng)分大于Q的單核苷酸變異的數(shù)目除以2)在來自所述腫瘤細(xì)胞的所述遺傳物質(zhì)第一樣品和來自所述腫瘤細(xì)胞的所述遺傳物質(zhì)第二樣品的比較中品質(zhì)評(píng)分大于Q的單核苷酸變異的數(shù)目，以及3)將結(jié)果乘以所述歸一化。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述遺傳物質(zhì)為DNA。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中通過以下來確定Q: 建立一組品質(zhì)特性S=(S1、...、sn)，其中當(dāng)對(duì)于所有i = 1、...、n, SiSti時(shí)，S優(yōu)于T=(V ? ? ?、tn),表示為 S>T,； 通過以下來確定中間錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率:用I)在所述來自動(dòng)物或人的第一DNA樣品和所述來自動(dòng)物或人的第二 DNA樣品的比較中品質(zhì)評(píng)分S>T的單核苷酸變異的數(shù)目除以2)在來自所述腫瘤細(xì)胞的所述第一 DNA樣品和來自所述腫瘤細(xì)胞的所述第二 DNA樣品的比較中品質(zhì)評(píng)分S>T的單核苷酸變異的數(shù)目，以及3)將結(jié)果乘以所述歸一化； 對(duì)于各自具有n個(gè)品質(zhì)特性的m個(gè)突變的每一特性確定值范圍； 從所述值范圍中抽取多至P個(gè)值； 產(chǎn)生所抽取品質(zhì)值的每種可能組合，得到PnA數(shù)據(jù)點(diǎn)； 使用所述數(shù)據(jù)點(diǎn)的隨機(jī)樣作為隨機(jī)森林訓(xùn)練的預(yù)測(cè)子； 使用相應(yīng)的中間錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率值作為所述隨機(jī)森林訓(xùn)練的響應(yīng)， 其中所述隨機(jī)森林訓(xùn)練得到的回歸評(píng)分為Q。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述來自動(dòng)物或人的第二DNA樣品對(duì)于所述來自動(dòng)物或人的第一 DNA樣品是同種異體的。
27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述來自動(dòng)物或人的第二DNA樣品對(duì)于所述來自動(dòng)物或人的第一 DNA樣品是自體的。
28.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述來自動(dòng)物或人的第二DNA樣品對(duì)于所述來自動(dòng)物或人的第一 DNA樣品是異種的。
29.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述遺傳物質(zhì)為RNA。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，通過以下來確定Q: 建立一組品質(zhì)特性S=(S1、...、sn)，其中當(dāng)對(duì)于所有i = 1、...、n, SiSti時(shí)，S優(yōu)于T=(V ? ? ?、tn),表示為 S>T,； 通過以下來確定中間錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率:用I)在所述來自動(dòng)物或人的第一RNA樣品和所述來自動(dòng)物或人的第二 RNA樣品的比較中品質(zhì)評(píng)分S>T的單核苷酸變異的數(shù)目除以2)在來自所述腫瘤細(xì)胞的所述第一 RNA樣品和來自所述腫瘤細(xì)胞的所述第二 RNA樣品的比較中品質(zhì)評(píng)分S>T的單核苷酸變異的數(shù)目，以及3)將結(jié)果乘以所述歸一化； 對(duì)于各自具有n個(gè)品質(zhì)特性的m個(gè)突變的每一特性確定值范圍； 從所述值范圍中抽取多至P個(gè)值； 產(chǎn)生所抽取品質(zhì)值的每種可能組合，得到PnA數(shù)據(jù)點(diǎn)； 使用所述數(shù)據(jù)點(diǎn)的隨機(jī)樣品作為隨機(jī)森林訓(xùn)練的預(yù)測(cè)子； 使用相應(yīng)的中間錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率值作為所述隨機(jī)森林訓(xùn)練的響應(yīng)， 其中所述隨機(jī)森林訓(xùn)練得到的回歸評(píng)分為Q。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述來自動(dòng)物或人的第二RNA樣品對(duì)于所述來自動(dòng)物或人的第一 RNA樣品是同種異體的。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述來自動(dòng)物或人的第二RNA樣品對(duì)于所述來自動(dòng)物或人的第一 RNA樣品是自體的。
33.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述來自動(dòng)物或人的第二RNA樣品對(duì)于所述來自動(dòng)物或人的第一 RNA樣品是異種的。
34.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率用于制造疫苗制劑。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述疫苗可靜脈內(nèi)遞送。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述疫苗可經(jīng)皮遞送。
37.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述疫苗可經(jīng)肌肉遞送。
38.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述疫苗可經(jīng)皮下遞送。
39.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述疫苗是針對(duì)特定患者定制的。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第一樣品和所述來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第二樣品之一來自所述特定患者。
41.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中通過對(duì)既包含在所述腫瘤中又包含在所述來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第一樣品及所述來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第二樣品的至少之一中的參照基因組的全部堿基進(jìn)行計(jì)數(shù)來確定共同覆蓋腫瘤比較的所述步驟使用自動(dòng)化系統(tǒng)以對(duì)全部堿基進(jìn)行計(jì)數(shù)。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中通過對(duì)同時(shí)被所述來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第一樣品與所述來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第二樣品覆蓋的參照基因組的全部堿基進(jìn)行計(jì)數(shù)來確定共同覆蓋相同-相同比較的所述步驟使用所述自動(dòng)化系統(tǒng)。
43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中用所述共同覆蓋腫瘤比較除以所述共同覆蓋相同-相同比較以形成歸一化的所述步驟使用所述自動(dòng)化系統(tǒng)。
44.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中通過以下來確定錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率的所述步驟使用所述自動(dòng)化系統(tǒng):用I)在所述來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第一樣品和所述來自動(dòng)物或人的遺傳物質(zhì)第二樣品的比較中品質(zhì)評(píng)分大于Q的單核苷酸變異的數(shù)目除以2)在來自所述腫瘤細(xì)胞的所述遺傳物質(zhì)第一樣品和來自所述腫瘤細(xì)胞的所述遺傳物質(zhì)第二樣品的比較中品質(zhì)評(píng)分大于Q的單核苷酸變異的數(shù)目，以及3)將結(jié)果乘以所述歸一化。
45.用于確定估計(jì)的接受者操作曲線(ROC)的方法，所述方法包括: 接收突變的數(shù)據(jù)集，每個(gè)突變與錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)相關(guān)聯(lián)；和 對(duì)于每個(gè)突變: 通過從I中減去所述FDR來確定真陽性率(TPR);和通過將假陽性率(FPR)設(shè)定為等于所述FDR來確定假陽性率(FPR);以及通過以下形成估計(jì)的ROC:對(duì)于每個(gè)突變，在至所述突變?yōu)橹沟睦鄯eTPR和FPR值除以所有TPR和FPR值總和處繪制點(diǎn)。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103608033SQ201280029551
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2012年5月23日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月24日
【發(fā)明者】烏爾·沙欣, 塞巴斯蒂安·克賴特爾, 穆斯塔法·迪肯, 揚(yáng)·狄克曼, 米夏埃爾·科斯洛夫斯基, 采德里克·布里滕, 約翰·卡斯特勒, 馬丁·勒韋爾, 貝恩哈德·雷納, 塔納·歐莫科科, 約翰內(nèi)斯·亨德里克斯·德格拉夫 申請(qǐng)人:生物技術(shù)公司, 約翰·古騰堡大學(xué)美因茲醫(yī)學(xué)大學(xué)轉(zhuǎn)化腫瘤學(xué)公司