抗-表皮生長因子受體變體iii嵌合抗原受體及其用于治療癌癥的用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了嵌合抗原受體(CAR)，其包含人抗體139的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、細胞外鉸鏈結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域T細胞受體信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。公開了與CAR有關(guān)的核酸、重組表達載體、宿主細胞、細胞群、抗體或其抗原結(jié)合部分和藥物組合物。也公開檢測癌癥在宿主中的存在的方法和治療或預(yù)防宿主的癌癥的方法。
【專利說明】抗-表皮生長因子受體變體111嵌合抗原受體及其用于治療癌癥的用途
[0001]對相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本專利申請要求2011年4月8日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/473，409的權(quán)益，其通過引用整體結(jié)合于此。
[0003]電子遞交的材料的通過引用的結(jié)合
[0004]通過引用完整結(jié)合于此的是與本文同時遞交并且如下識別的計算機可讀的核苷酸/氨基酸序列表:一個24，425字節(jié)的ASCII (文本)文件，文件名:“709980_ST25.TXT”，日期:2012年3月5日。
【背景技術(shù)】
[0005]美國癌癥學(xué)會估計，在美國每年出現(xiàn)大約20，500例新的原發(fā)性腦和神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤病例，并且大約12，740位患者由于這些癌癥而死亡(Jemal等，CancerJ.Clin.，57:43-66 (2007))。腦腫瘤占所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的大約85-90%。成膠質(zhì)細胞瘤是最有侵襲性的和最常見的神經(jīng)膠質(zhì)瘤，占所有神經(jīng)膠質(zhì)瘤的5l%(CBTRUS2008Statistical Report: Primary Brain Tumors in the UnitedStates-CBTRUS, 2000-2004(2008))。盡管在常規(guī)治療(諸如外科手術(shù)切除術(shù)、放射療法和化學(xué)療法)方面有所進展，神經(jīng)膠質(zhì)瘤以及其它類型的腦和神經(jīng)系統(tǒng)癌癥的預(yù)后可能較差。例如，大多數(shù)具有多形性成膠質(zhì)細胞瘤(GBM)的患者從診斷以后存活小于15個月。因此，對癌癥、尤其是神經(jīng)膠質(zhì)瘤的其它治療存在未得到滿足的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個實施方案提供了嵌合抗原受體(CAR)，其包含人抗體139的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、細胞外鉸鏈結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)T細胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
[0007]本發(fā)明的其它實施方案提供了有關(guān)的核酸、重組表達載體、宿主細胞、細胞群、抗體或其抗原結(jié)合部分、和與本發(fā)明的CAR有關(guān)的藥物組合物。
[0008]本發(fā)明的其它實施方案提供了檢測癌癥在宿主中的存在的方法以及治療或預(yù)防宿主中的癌癥的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1A的圖顯示了在不同效應(yīng)物:靶標(biāo)比(E:T比)，未轉(zhuǎn)導(dǎo)(UnTd) ( .)或轉(zhuǎn)導(dǎo)有編碼綠色熒光蛋白(GFP) (.)、SEQ ID N0:10(hl39Ab-hCD828BBZ CAR) (x)或 SEQ IDNO: 11 (hl39Ab-hCD28Z) ( ▲)的載體的人外周血淋巴細胞(PBL)(效應(yīng)細胞)對51Cr標(biāo)記的親本U87成膠質(zhì)細胞瘤腫瘤細胞系(“U87”)(靶細胞)的特異性裂解(裂解百分比)。
[0010]圖1B的圖顯示了在不同效應(yīng)物:靶標(biāo)比(E:T比)，未轉(zhuǎn)導(dǎo)(UnTd) ( .)或轉(zhuǎn)導(dǎo)有編碼 GFP(.)、SEQ ID N0:10(hl39Ab-hCD828BBZ CAR) (x)或 SEQ IDNO: 11 (hl39Ab-hCD28Z) ( ▲)的載體的人PBL(效應(yīng)細胞)對51Cr標(biāo)記的U87-GFP(表達GFP)成膠質(zhì)細胞瘤腫瘤細胞系(靶細胞)的特異性裂解(裂解百分比)。
[0011]圖1C的圖顯示了在不同效應(yīng)物:靶標(biāo)比(E:T比)，未轉(zhuǎn)導(dǎo)(UnTd) (實心)或轉(zhuǎn)導(dǎo)有編碼 GFP(.)、SEQ ID N0:10(hl39Ab-hCD828BBZ CAR) (x)或 SEQ IDNO: 11 (hl39Ab-hCD28Z) ( ▲)的載體的人PBL (效應(yīng)細胞)對51Cr標(biāo)記的U87-EGFR成膠質(zhì)細胞瘤腫瘤細胞系(表達野生型表皮生長因子受體)(靶細胞)的特異性裂解(裂解百分比)。
[0012]圖1D的圖顯示了在不同效應(yīng)物:靶標(biāo)比(E:T比)，未轉(zhuǎn)導(dǎo)(UnTd) ( 實心)或轉(zhuǎn)導(dǎo)有編碼 GFP(.)、SEQ ID N0:10(hl39Ab-hCD828BBZ CAR) (x)或 SEQ IDNO: 11 (hl39Ab-hCD28Z) ( ▲)的載體的人PBL(效應(yīng)細胞)對51Cr標(biāo)記的U87_vIII成膠質(zhì)細胞瘤腫瘤細胞系(表達EGFRvIII)(靶細胞)的特異性裂解(裂解百分比)。
[0013]圖2A的圖顯示了在不同效應(yīng)物:靶標(biāo)比(E:T比)，未轉(zhuǎn)導(dǎo)(UnTd) 實心)或轉(zhuǎn)導(dǎo)有編碼綠色熒光蛋白(GFP) (.)、抗-ERBB2CAR( ? )、SEQ ID NO: 10 (hl39Ab_hCD828BBZCAR) (X)或 SEQ ID NO: 11 (hl39Ab_hCD28Z) ( ▲)的載體的人 PBL(效應(yīng)細胞)對 51Cr 標(biāo)記的親本U251成膠質(zhì)細胞瘤腫瘤細胞系(靶細胞)的特異性裂解(裂解百分比)。
[0014]圖2B的圖顯示了在不同效應(yīng)物:靶標(biāo)比(E:T比)，未轉(zhuǎn)導(dǎo)(UnTd) (實心)或轉(zhuǎn)導(dǎo)有編碼綠色熒光蛋白(GFP) (.)、抗-ERBB2CAR( ? )、SEQ ID NO: 10 (hl39Ab_hCD828BBZCAR) (X)或 SEQ ID NO: 11 (hl39Ab_hCD28Z) ( ▲)的載體的人 PBL(效應(yīng)細胞)對 51Cr 標(biāo)記的U251-GFP成膠質(zhì)細胞瘤腫瘤細胞系(表達GFP)(靶細胞)的特異性裂解(裂解百分比)。
[0015]圖2C的圖顯示了在不同效應(yīng)物:靶標(biāo)比(E:T比)，未轉(zhuǎn)導(dǎo)(UnTd) (實心)或轉(zhuǎn)導(dǎo)有編碼綠色熒光蛋白(GFP) (.)、抗-ERBB2CAR( ? )、SEQ ID NO: 10 (hl39Ab_hCD828BBZCAR) (X)或 SEQ ID NO: 11 (hl39Ab_hCD28Z) ( ▲)的載體的人 PBL(效應(yīng)細胞)對 51Cr 標(biāo)記的U251-EGFR成膠質(zhì)細胞瘤腫瘤細胞系(表達野生型EGFR)(靶細胞)的特異性裂解(裂解百分比)。
[0016]圖2D的圖顯示了在不同效應(yīng)物:靶標(biāo)比(E:T比)，未轉(zhuǎn)導(dǎo)(UnTd) ( 實心)或轉(zhuǎn)導(dǎo)有編碼綠色熒光蛋白(GFP) (.)、抗-ERBB2CAR( ? )、SEQ ID NO: 10 (hl39Ab_hCD828BBZCAR) (X)或 SEQ ID NO: 11 (hl39Ab_hCD28Z) ( ▲)的載體的人 PBL(效應(yīng)細胞)對 51Cr 標(biāo)記的U251-VIII成膠質(zhì)細胞瘤腫瘤細胞系(表達野生型EGFRvIII)(靶細胞)的特異性裂解(裂解百分比)。
[0017]圖3A-3C的圖顯示了在與靶細胞系未轉(zhuǎn)導(dǎo)的NIH-3T3(3T3) (3T3UT，灰色條)、未轉(zhuǎn)導(dǎo)的BHK(BHK UT,帶點的條)、未轉(zhuǎn)導(dǎo)的293GP(293GPUT，帶方格的條)、EGFR-野生型轉(zhuǎn)導(dǎo)的3T3 (3T3EGFRwt，白色條)、EGFR-野生型轉(zhuǎn)導(dǎo)的BHK (BHK EGFRwt，帶條紋的條)、EGFRvII1-轉(zhuǎn)導(dǎo)的 3T3(3T3EGFRvIII,黑色條)、EGFRvII1-轉(zhuǎn)導(dǎo)的 BHK(BHK EGFRvIII,帶交叉影線的條)或EGFRvII1-轉(zhuǎn)導(dǎo)的293GP(293GP EGFRvIII，帶垂直和水平條紋的條)共培養(yǎng)以后，通過ELISA測得的未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞(UT)或被3C10CAR(圖3A)、L8A4CAR(圖3B)、hl39Ab-hCD28Z CAR(圖3C)轉(zhuǎn)導(dǎo)的人T細胞的干擾素(IFN)-Y分泌(pg/ml，一式三份測定的平均值)。
[0018]圖4A和4B的圖顯示了通過ELISA測得的下述T-細胞的IFN- Y分泌(pg/ml，一式三份測定的平均值):被綠色熒光蛋白(GFP)或139-28Z載體(未分選)(139bulk)轉(zhuǎn)導(dǎo)的、得自供體2 (圖4A)或供體3 (圖4B)的T-細胞，或被hl39Ab-hCD28Z載體轉(zhuǎn)導(dǎo)、然后小珠(bead)分選成CD8和CD4富集的(>96%+) T細胞群(139CD8+和139CD4+)的T細胞。在轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞與BHK靶細胞(黑色條)、EGFR野生型工程改造的BHK細胞(EGFRwt，灰色條)或EGFRvIII工程改造的BHK細胞(EGFRvIII，帶交叉影線的條)或培養(yǎng)基(帶方格的條)一起共培養(yǎng)過夜以后，測量IFN-Y。
[0019]圖5A 和 5B 的圖顯示了被抗-EGFRvIII CAR 載體(139-28BBZ) (EGFRvIII)、GFP表達載體(GFP)或CAR載體靶向ERBB2轉(zhuǎn)導(dǎo)的或未轉(zhuǎn)導(dǎo)的(UT)、得自人供體4 (圖5A)和人供體5 (圖5B)的T細胞的IFN- Y分泌。將轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞與培養(yǎng)基(黑色條)、野生型EGFR工程改造的U251細胞(U251_EGFRwt，白色條)、EGFR變體III工程改造的U251細胞(U251-EGFRvIII，灰色條)或神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞系1228 (帶水平線的條)、308 (帶點的條)或822 (帶交叉影線的條)共培養(yǎng)。【具體實施方式】
[0020]本發(fā)明的一個實施方案提供了嵌合抗原受體(CAR)，其包含人抗體139(hl39Ab)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、細胞外鉸鏈結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)T細胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
[0021]嵌合抗原受體(CAR)是人工構(gòu)建的雜合蛋白或多肽，其含有與T-細胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域連接的、抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，scFv)。CAR的特征包括:它們利用單克隆抗體的抗原結(jié)合性質(zhì)以非-MHC限制的方式改變T-細胞對選定靶標(biāo)的特異性和反應(yīng)性的能力。所述非-MHC限制的抗原識別會給表達CAR的T細胞提供不依賴抗原加工而識別抗原的能力，由此繞過腫瘤逃逸的主要機制。此外，當(dāng)在T-細胞中表達時，CAR有利地不會與內(nèi)源T細胞受體(TCR) α和β鏈二聚化。
[0022]本文中使用的短語“具有抗原特異性”和“引起抗原-特異性反應(yīng)”是指，CAR可以特異性地結(jié)合并免疫識別抗原，使得CAR與所述抗原的結(jié)合會引起免疫反應(yīng)。
[0023]本發(fā)明的CAR對表皮生長因子受體變體III (EGFRvIII)具有抗原特異性。EGFRvIII是表皮生長因子受體(EGFR)的變體，其是作為蛋白激酶超家族成員之一的跨膜糖蛋白。EGFRvIII是在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)的幾種EGFR突變中的最普遍的，且在約30%至約50%的多形性成膠質(zhì)細胞瘤(GBM)(也被稱作“成膠質(zhì)細胞瘤”)中表達。EGFRvIII的表達源自消除EGFR外顯子2-7并造成編碼序列的外顯子I和8的連接的基因內(nèi)缺失重排。EGFRvIII由不同癌癥的腫瘤細胞表達，所述癌癥如，例如:成膠質(zhì)細胞瘤(包括成膠質(zhì)細胞瘤干細胞)；乳腺癌、卵巢癌和非小細胞肺癌；頭頸鱗狀細胞癌；髓母細胞瘤、結(jié)直腸癌、前列腺癌和膀胱癌。不受特定理論或機制的約束，據(jù)信，通過引起針對EGFRvIII的抗原-特異性反應(yīng)，本發(fā)明的CAR會提供下述的一項或多項:靶向和破壞表達EGFRvIII的腫瘤細胞，減少或消除腫瘤，促進免疫細胞向腫瘤部位的滲入，和增強/延長抗腫瘤反應(yīng)。因為EGFRvIII不在正常的(即，非癌性的)組織中表達，預(yù)見到，本發(fā)明的CAR有利地基本上避免靶向/破壞正常的組織和細胞。
[0024]本發(fā)明提供了一種包含人抗體139的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的CAR?？贵w139是一種人抗-EGFRvIII抗體?？贵w139特異性地結(jié)合EGFRvIII。合適的人抗體139序列公開在例如美國專利7，628，986中，所述文獻通過引用結(jié)合于此。在這點上，本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案提供了包含抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的CAR，其包含人抗體139的單鏈可變片段(scFv)、由其組成或基本上由其組成。[0025]人抗體139包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)。所述輕鏈可變區(qū)可以包含SEQ IDNO: 1、由其組成或基本上由其組成。所述重鏈可變區(qū)可以包含SEQ ID N0:2、由其組成或基本上由其組成。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含:包含SEQ IDNO:1的輕鏈可變區(qū)和/或包含SEQ ID NO: 2的重鏈可變區(qū)。
[0026]在一個實施方案中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含接頭肽。所述接頭肽可以位于輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)之間。在這點上，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包含這樣的接頭肽:其包含SEQ ID NO: 3、由其組成或基本上由其組成。
[0027]在一個實施方案中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含前導(dǎo)序列。所述前導(dǎo)序列可以位于輕鏈可變區(qū)的氨基端。在這點上，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包含這樣的前導(dǎo)序列:其包含SEQ ID NO:4、由其組成或基本上由其組成。
[0028]在一個實施方案中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包含前導(dǎo)序列、輕鏈可變區(qū)、接頭肽和重鏈可變區(qū)。在這點上，所述包含前導(dǎo)序列、輕鏈可變區(qū)、接頭肽和重鏈可變區(qū)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO: 5 (scFv人抗體139)、由其組成或基本上由其組成。
[0029]在本發(fā)明的一個實施方案中，所述CAR包含細胞外鉸鏈結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、和任選的含有⑶8的細胞內(nèi)鉸鏈結(jié)構(gòu)域、以及含有⑶28、4-1ΒΒ和⑶3 ζ的細胞內(nèi)T細胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。CD28是一種在T細胞共刺激中重要的T細胞標(biāo)志物。CD8也是一種T細胞標(biāo)志物。4-1ΒΒ會將有效的共刺激信號傳導(dǎo)至T細胞，從而促進分化和增強T淋巴細胞的長期存活。CD3 ζ與TCR結(jié)合以產(chǎn)生信號，且含有基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)。在這點上，本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案提供了這樣的細胞外鉸鏈結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域:其包含SEQID Ν0:6(人CD8細胞外鉸鏈結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域)、基本上由其組成或由其組成。所述細胞內(nèi)T細胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID Ν0:7(人⑶28、4-1ΒΒ和⑶3ζ細胞內(nèi)T細胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域)、基本上由其組成或由其組成。
[0030]在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述CAR包含細胞外鉸鏈結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、以及含有CD28和CD3 4的細胞內(nèi)T細胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在這點上，本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案提供了這樣的的細胞外鉸鏈結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)T細胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其包含SEQ ID Ν0:8(人⑶28細胞外鉸鏈、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)T細胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域)和SEQ ID Ν0:9(人⑶3ζ細胞內(nèi)T細胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域)，基本上由其組成或由其組成。
[0031]本發(fā)明的其它實施方案提供了這樣的CAR:其包含顯示在表1中的任意氨基酸序列、由其組成或基本上由其組成。
[0032]表1
[0033]
【權(quán)利要求】
1.一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含人抗體139的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、細胞外鉸鏈結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)T細胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CAR，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含含有SEQID NO:1的輕鏈可變區(qū)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的CAR，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含含有SEQID NO:2的重鏈可變區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的CAR，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含含有SEQIDNO:3的接頭肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的CAR，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含含有SEQIDNO:4的前導(dǎo)序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的CAR，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含SEQIDN0:5。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的CAR，所述CAR進一步包含細胞內(nèi)鉸鏈結(jié)構(gòu)域。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的CAR，其中所述細胞外鉸鏈結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域包含 CD8 (SEQ ID NO: 6) ?
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的CAR，其中所述細胞內(nèi)T細胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含 CD28、4-1BB 和 / 或 0)3ζ (SEQ ID NO:7)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的CAR，其中所述細胞外鉸鏈結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)T細胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含CD28 (SEQ ID NO: 8)和/或CD3 ζ (SEQ ID NO: 9)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項所述的CAR，所述CAR包含選自由SEQID NOilO-1l組成的組的氨基酸序列。
12.一種核酸，其包含編碼根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項所述的CAR的核苷酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的核酸，所述核酸包含選自由SEQID NO: 12-14組成的組的核苷酸序列。
14.一種重組表達載體,其包含權(quán)利要求12或13所述的核酸。
15.—種分離的宿主細胞，其包含權(quán)利要求14所述的重組表達載體。
16.包含至少一個權(quán)利要求15所述的宿主細胞的細胞群。
17.特異性地結(jié)合根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項所述的CAR的抗體或其抗原結(jié)合部分。
18.—種藥物組合物，其包含:權(quán)利要求1-11所述的CAR、權(quán)利要求12-13所述的核酸、權(quán)利要求14所述的重組表達載體、權(quán)利要求15所述的宿主細胞、權(quán)利要求16所述的細胞群或者權(quán)利要求17所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，以及藥用載體。
19.一種檢測癌癥在宿主中的存在的方法，所述方法包括: (a)使包含來自所述宿主的一個或多個細胞的樣品與權(quán)利要求1-11所述的CAR、權(quán)利要求12-13所述的核酸、權(quán)利要求14所述的重組表達載體、權(quán)利要求15所述的宿主細胞、權(quán)利要求16所述的細胞群或者權(quán)利要求17所述的抗體或其抗原結(jié)合部分接觸，由此形成復(fù)合物，和 (b)檢測所述復(fù)合物，其中檢測到所述復(fù)合物指示癌癥在所述宿主中的存在。
20.權(quán)利要求1-11所述的CAR、權(quán)利要求12-13所述的核酸、權(quán)利要求14所述的重組表達載體、權(quán)利要求15所述的宿主細胞、權(quán)利要求16所述的細胞群、權(quán)利要求17所述的抗體或其抗 原結(jié)合部分、或者權(quán)利要求18所述的藥物組合物，其用于治療或預(yù)防宿主的癌癥。
【文檔編號】A61P35/00GK103596981SQ201280027682
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年3月21日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月8日
【發(fā)明者】理查德·A·摩根, 史蒂文·A·羅森堡 申請人:美國衛(wèi)生和人力服務(wù)部