專利名稱：hrEGF修飾的載順鉑高分子納米粒、制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)和納米醫(yī)藥領(lǐng)域的藥品及其制備方法，具體是一種主動靶向性hrEGF修飾的載順鉬高分子納米粒、制備及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
卵巢癌是婦科腫瘤中惡性程度最高的疾病，居婦科惡性腫瘤死亡率首位，嚴(yán)重威脅著女性的生殖健康。卵巢癌發(fā)病隱匿，極易發(fā)生侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，約70% 80%的卵巢癌患者診斷時即屬于III/IV期，其五年生存率僅為30%左右。卵巢癌的治療以徹底的腫瘤減滅術(shù)為主，但由于其轉(zhuǎn)移方式多表現(xiàn)為腹腔內(nèi)散在的廣泛種植，故依靠手術(shù)徹底切除腫瘤尚不可能，殘存的散在腫瘤結(jié)節(jié)，必須依靠手術(shù)后的化療。最常用的是以鉬類為主的一線聯(lián)合化療方案。但因化療藥物缺乏選擇性且具有毒 性反應(yīng)，它在殺死腫瘤細(xì)胞的同時往往也殺死了正常的細(xì)胞，導(dǎo)致患者出現(xiàn)骨髓抑制、腎功能不全、消化道反應(yīng)、心臟傳導(dǎo)障礙等情況，生活質(zhì)量嚴(yán)重下降，一些患者甚至因化療引起的感染及出血等并發(fā)癥而死亡。致使藥物利用度有限，使用劑量受限。此外，還有一些年老體弱或有心、肝、腎功能不全的患者無法耐受化療的毒性反應(yīng)而不能進(jìn)行化療，導(dǎo)致卵巢癌迅速進(jìn)展而死亡。因此，需要一種有效的靶向給藥系統(tǒng)使藥物到達(dá)腫瘤區(qū)。這種系統(tǒng)不僅可以提高藥物在腫瘤區(qū)的濃度，更有效地殺傷腫瘤細(xì)胞，而且可以減小對正常細(xì)胞、組織的損害。納米粒作為靶向性制劑載體已成為國內(nèi)外研究的熱點，通過載藥納米粒載體將治療藥物靶向地導(dǎo)向病灶部位，可以達(dá)到精密化給藥的目的，而又對非靶組織、器官、細(xì)胞的影響很少。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，將納米粒與具有特異腫瘤靶向的活性分子或特殊基團相連，可使之具備腫瘤特異靶向功能，從而在很大程度上提高了腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度。已知腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是由細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的多基因參與的極其復(fù)雜的過程，表皮生長因子受體(EGFR)信號通路在正常組織中多呈關(guān)閉狀態(tài)，而在腫瘤組織中被激活開放，而且其活躍程度與腫瘤病情進(jìn)展呈正相關(guān)。段友容等人報道了聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸(簡稱mPEG-PLGA-PLL)納米遞送系統(tǒng)、制備方法及其應(yīng)用(CN 200910247576. 7，Liu P. F，Biomaterials, 2012, 33 :4403-4412)為包載活性藥物提供了可能。本發(fā)明人和國內(nèi)外的許多研究均提示人卵巢癌組織和細(xì)胞株中高表達(dá)EGFR。本發(fā)明人利用EGFR的配體EGF修飾載藥的納米粒載體，無疑將使細(xì)胞膜表面高表達(dá)EGFR的卵巢癌細(xì)胞的藥物攝取量增加，從而使藥物特異性作用于卵巢癌細(xì)胞，發(fā)揮藥效，實現(xiàn)靶向治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有臨床中的問題，提供一種hrEGF修飾的載順鉬mPEG-PLGA-PLL納米粒，是具有特異性靶向和主動靶向性、EGFR高表達(dá)的卵巢癌腫瘤細(xì)胞的載順鉬高分子納米粒，使包裹的順鉬在血液中能長效循環(huán)、對卵巢癌組織具有雙重靶向性、釋藥速率可調(diào)，以期最大限度的提高療效、降低其毒副作用。所述的所述的高分子載體是即聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸，簡稱mPEG-PLGA-PLL ;所述的hrEGF表示人重組表皮生長因子。本發(fā)明的目的還提供一種上述hrEGF修飾的載順鉬mPEG-PLGA_PLL納米粒的制備方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述hrEGF修飾的載順鉬mPEG-PLGA_PLL納米粒在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，尤其在制備抗卵巢癌藥物中的應(yīng)用。為了達(dá)到以上目的，本發(fā)明的hrEGF修飾的載順鉬mPEG-PLGA-PLL納米粒是hrEGF與mPEG-PLGA-PLL納米粒表面的氨基進(jìn)行連接，在納米粒中包裹順鉬藥物。所述的高分子載體是 mPEG-PLGA-PLL。本發(fā)明選擇的高分子材料mPEG-PLGA-PLL，具有良好的生物相容性及降解性，安
全無毒。本發(fā)明提供的hrEGF修飾的載順鉬mPEG-PLGA-PLL納米粒，粒徑在25_500nm ;優(yōu)選100 200nm之間；所述的納米粒粒徑為多數(shù)分散指數(shù)HH在0. 25 I之間；再加上EGFR靶向及mPEG化，可以有效減少網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)吞噬，延長循環(huán)時間，提高藥物制劑的靶向性。所述的mPEG化表示連接單甲醚聚乙二醇。本發(fā)明提供的hrEGF修飾的載順鉬mPEG-PLGA-PLL納米粒的制備方法，包括以下步驟(I)采用超聲乳化和溶劑揮發(fā)法制備載順鉬高分子納米粒將的mPEG-PLGA-PLL溶解在極性有機溶劑中構(gòu)成有機相，取順鉬溶液作為水相，將順鉬溶液加入到有機相中，200 400w超聲I 5min，乳化均勻形成初乳；將形成的初乳加到含有？ ？ ％重量的乳化劑的水溶液中，再次超聲乳化均勻，繼而在室溫條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)有機溶劑I 40min，使有機溶劑揮發(fā)完全，即得載順鉬mPEG-PLGA-PLL納米粒的膠體溶液；其中，mPEG-PLGA-PLL、順鉬和乳化劑的體積比為I :0 0. 5 :6 12 ;所述的乳化劑為泊洛沙姆188 (F68)溶液或聚乙烯醇(PVA)。所述的mPEG-PLGA-PLL的濃度為10 25mg/ml ;所述的順鉬的濃度為5 15mg/ml ;所述的極性有機相和水相的體積比為6 12 :1。所述的極性有機溶劑推薦為二氯甲烷和甲醇的混合溶劑，它們的體積比依次為I 3 :1 ;所述的順鉬溶液為順鉬的水和二甲亞砜的溶液，水和二甲亞砜的體積比I 3 :1。所述的初乳和乳化劑水溶液的體積比為I :6 12。所述的乳化劑水溶液為
0.5% 2%的泊洛沙姆188 (F68)溶液或0. 1% 3%的聚乙烯醇(PVA)。2) hrEGF修飾載順鉬mPEG-PLGA-PLL納米粒的制備在超純水中，hrEGF溶于500 的18M Q。取一定量的載順鉬mPEG-PLGA-PLL納米粒溶液，加入一定量的碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，磁力攪拌下充分活化反應(yīng)10 30min,,再加入一定量的lmg/ml的hrEGF水溶液,氮氣保護下繼續(xù)磁力攪拌2 4h。然后取以上反應(yīng)液，加入到超濾管中(MWC03000)，4000 IOOOOrpm下離心5 15min，除去EDC/NHS以及未包裹游離的順鉬；所述的超純水為10 20MQ的超純水。 所述的hrEGF、載順鉬mPEG-PLGA-PLL納米粒、碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為I :0. oro. 05 :0. 5 5。本發(fā)明提供的hrEGF修飾的載順鉬高分子納米粒不僅制備工藝簡單，穩(wěn)定性好，而且可應(yīng)用于制備抗腫瘤的藥物，尤其是制備抗卵巢癌腫瘤的藥物。預(yù)示著良好的應(yīng)用前景。


圖I為hrEGF修飾的載順鉬mPEG-PLGA-PLL納米粒的制備示意圖。圖2為載順鉬mPEG-PLGA-PLL納米粒的粒徑分布圖。圖3為載順鉬mPEG-PLGA-PLL納米粒的Zeta電位分布圖。圖4為載順鉬mPEG-PLGA-PLL納米粒透射電鏡圖。圖5為hrEGF修飾的載順鉬mPEG-PLGA-PLL納米粒透射電鏡圖。 圖6為載順鉬mPEG-PLGA-PLL納米粒的釋藥性能對比圖。圖7為非靶向(-EGF)和靶向(+EGF) mPEG-PLGA-PLL納米粒的細(xì)胞攝取對比圖。圖8為不同形式的順鉬及DMSO對卵巢癌細(xì)胞SK0V3的細(xì)胞毒性研究圖。符號說明附圖2中 Size Distribution by intensity 表不強度分布大小，Intensity 表不強度，Size表示大??；附圖3 中 Zeta Potential Distribution 表不 Zeta 電位分布，Total Counts 表示總計數(shù)數(shù)，Zeta Potential表Zeta示電位；附圖6中Cumulative release of CDDP (%)表不順鉬累積釋放率，Time (h)表不時間(小時)；附圖7中a、b為非靶向組，C、d為靶向組；附圖8中⑶DP表示順鉬，⑶DP-NPs表示載順鉬納米粒，⑶DP-NPs-EGF表示EGF修飾的載順鉬納米粒，Cell viability (%)表示細(xì)胞生存率，Concentration (iig/ml)表示濃度(微克/暈升)，DMSO表不二甲亞砜；
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明加以進(jìn)一步的說明，但并不因此將本發(fā)明限制在如下的實施例范圍之內(nèi)。實施例I :hrEGF修飾的載順鉬高分子納米粒的制備I)精確稱取mPEG-PLGA-PLL 4mg，加入到200 yl的二氯甲烷-甲醇(3:2)中溶解構(gòu)成有機相。取20ii I的濃度為10mg/ml的順鉬溶液作為水相,順鉬溶解液為水-二甲亞砜(3:2)。將順鉬溶液加入到有機相中，350w，Imin超聲乳化均勻形成初乳。稱取Ig F68加入到IOOml超純水中使其充分溶解得濃度為1%,構(gòu)成外水相。內(nèi)水相與外水相的體積比為I :8。.將制備的初乳立即加入到外水相中，350w，Imin再次超聲乳化均勻，然后真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)5 8min，使有機溶劑揮發(fā)完全，即得載順鉬mPEG-PLGA-PLL納米粒膠體溶液。其形態(tài)規(guī)整呈圓形，分散性好，平均粒徑為140. 2nm, zeta電位為+12. lmv，包封率為88. 45%，見圖2，圖3，圖4。2)取上述制備的載順鉬mPEG-PLGA-PLL納米粒溶液放入15ml的旋蒸瓶中，分別稱取Img的EDC和NHS加入其中，室溫下磁力攪拌20min。將500 y g的hrEGF溶于500 U I的18MQ超純水中得濃度為lmg/ml。吸取50 的hrEGF溶液磁力攪拌下加入到旋蒸瓶中，然后氮氣保護下繼續(xù)磁力攪拌3h。最后取以上反應(yīng)液，加入到Millipore超濾離心管中(MWC03000)，4000 IOOOOrpm下離心5 15min,除去EDC/NHS以及未包裹游離的順鉬。通過透射電鏡可以看到明顯的核殼結(jié)構(gòu)，mPEG-PLGA-PLL納米粒在中心，周邊包被一層hrEGF，見圖 5。實施例2 :載順鉬高分子納米粒的體外緩釋性實驗取一定量的載順鉬納米粒裝入預(yù)先處理好的透析袋(MWC0，3500)中，置于裝有18mlPBS(PH=7. 4)的錐形瓶中，37°C，120r/min恒溫振蕩透析，在預(yù)定的間隔時間點取出透析液2ml，同時補充2ml 37°C的PBS溶液，電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測定透析液中鉬的含量。計算不同時間的藥物累積釋放量，并繪制藥物體外釋放曲線。如圖6。.實施例3 :卵巢癌細(xì)胞系的培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞系SK0V3，該細(xì)胞系對順鉬等多種藥物天然耐藥。用10%FCS DMEM培 養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)SK0V3細(xì)胞，內(nèi)含1% (v/v)青霉素-鏈霉素(100U/ml青霉素G和100ug/ml鏈霉素)，于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)(95%02，5%C02)孵育，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。實施例4 卵巢癌細(xì)胞SK0V3對高分子納米粒的體外攝取實驗將SK0V3細(xì)胞接種在24孔板中，每孔細(xì)胞的密度為3 X 104/ml，37°C，5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。避光操作下，分別在不同孔中加入含等量羅丹明B的靶向性納米粒(十EGF)和非靶向性mPEG-PLGA-PLL (—EGF)納米粒，37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)lh。.吸出培養(yǎng)液，37°C PBS洗滌3次。于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞對納米粒的攝入情況。載羅丹明B的納米粒制備方法同上。從圖7中可以觀察到細(xì)胞hrEGF修飾的祀向納米粒的攝取明顯強于沒有hrEGF修飾的非靶向納米粒。實施例5 hrEGF修飾的載順鉬高分子納米粒對卵巢癌細(xì)胞SK0V3的體外殺傷毒性實驗取對數(shù)生長期的SK0V3細(xì)胞，制成5X IO4個/ml懸液，以0. Iml/孔鋪96孔板，37 0C，5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。吸出培養(yǎng)液，將所制備的靶向或非靶向載順鉬納米粒用培養(yǎng)液調(diào)整到不同濃度，分別加入到96孔板中(另設(shè)空白對照和陰性對照)，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔。為評估二甲亞砜(DMSO)對實驗的影響，另設(shè)3個DMSO組(濃度為0. 45%、
0.2%、1%分別與2. 25、1、0. 5mg/ml的材料濃度中DMSO含量一致)。培養(yǎng)24h、48h后，加CCK810 U I/孔繼續(xù)培養(yǎng)2h，在酶標(biāo)儀上于490nm波長處測定OD值。計算細(xì)胞存活率細(xì)胞的存活率(％)=實驗組OD值/陰性組OD值X 100%。靶向(+EGF)或非靶向(-EGF)載順鉬納米粒對于SK0V3細(xì)胞均具有明顯的殺傷作用，且隨著濃度的提高及時間延長抑制作用逐漸增強，見圖8D，E。其中靶向性載CDDP納米粒對SK0V3的增殖抑制作用最強，見圖8A，B。而在制備時加入的用于溶解順鉬的DMSO對SK0V3細(xì)胞的增殖基本沒有影響，見圖8F。
權(quán)利要求
1.一種hrEGF修飾的載順鉬高分子納米粒,其特征在于所述的高分子載體是聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸，簡稱mPEG-PLGA-PLL ;所述的重組人表皮生長因子hrEGF對載順鉬高分子納米粒的修飾，是通過與高分子載藥納米粒表面的氨基進(jìn)行偶聯(lián)，納米粒中載有順鉬；所述的納米粒中高分子載體、hrEGF和順鉬的摩爾比為I :0. θΓθ. 05 :0. 5 5。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的hrEGF修飾的載順鉬高分子載藥納米粒,其特征在于所述的納米粒粒徑為25-500nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的hrEGF修飾的載順鉬高分子載藥納米粒,其特征在于所述的納米粒粒徑多分散指數(shù)PDI在O. 25 I之間。
4.一種如權(quán)利要求所述的hrEGF修飾的載順鉬高分子納米粒的制備方法,其特征在于，包括以下步驟 (I)采用超聲乳化和溶劑揮發(fā)法制備載順鉬高分子納米粒 將的mPEG-PLGA-PLL溶解在極性有機溶劑中構(gòu)成有機相，取順鉬溶液作為水相，將順 鉬溶液加入到有機相中，200 400w超聲I 5min，乳化均勻形成初乳； 將形成的初乳加到含有O. Γ2%重量的乳化劑的水溶液中，再次超聲乳化均勻，繼而在室溫條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)有機溶劑I 40min，使有機溶劑揮發(fā)完全，即得載順鉬mPEG-PLGA-PLL納米粒的膠體溶液； 其中，mPEG-PLGA-PLL、順鉬和乳化劑的體積比為I :(Γθ. 5 6^12 ;所述的乳化劑為泊洛沙姆188 (F68)溶液或聚乙烯醇(PVA)。
2) hrEGF修飾載順鉬mPEG-PLGA-PLL納米粒的制備 在超純水中，hrEGF溶于500 μ I的18M Ω。取步驟I)的載順鉬mPEG-PLGA-PLL納米粒溶液，加入碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，磁力攪拌下充分活化反應(yīng)10 30min，，再加入lmg/ml的hrEGF水溶液,氮氣保護下繼續(xù)磁力攪拌2 4h。然后取以上反應(yīng)液,力口入到超濾管中，4000 IOOOOrpm下離心5 15min,除去碳二亞胺鹽酸鹽和N-輕基琥拍酰亞胺以及未包裹游離的順鉬； 所述的hrEGF、載順鉬mPEG-PLGA-PLL納米粒、碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為 0-0. 008 0. 01-0. I 0. 5 3 0. 5 3。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的hrEGF修飾的載順鉬高分子納米粒的制備方法,其特征是，步驟(I)中所述的mPEG-PLGA-PLL的濃度為10 25mg/ml ;所述的順鉬的濃度為5 15mg/ml ;所述的極性有機相和水相的體積比為6 12 :14。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的hrEGF修飾的載順鉬高分子納米粒的制備方法,其特征是，步驟(I)中所述的極性有機溶劑為二氯甲烷和甲醇的混合溶劑，它們的體積比依次為I 3 :I;所述的順鉬溶液為順鉬的水和二甲亞砜的溶液，水和二甲亞砜的體積比I 3 :1。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的hrEGF修飾的載順鉬高分子納米粒的制備方法,其特征是，步驟(I)中所述的初乳和乳化劑水溶液的體積比為I :6 12。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的hrEGF修飾的載順鉬高分子納米粒的制備方法,其特征是，步驟(I)中所述的乳化劑水溶液為O. 5% 2%的泊洛沙姆188溶液或O. 1% 3%聚乙烯醇溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的hrEGF修飾的載順鉬高分子納米粒的制備方法,其特征是,步驟(2)中所述的超純水為1(Γ20Μ的超純水。
10.一種如權(quán)利要求I所述的hrEGF修飾的載順鉬高分子納米粒的用途,其特征在于制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種hrEGF修飾的載順鉑高分子納米粒、制備及其應(yīng)用。系以聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸(mPEG-PLGA-PLL)為載體，通過超聲乳化/溶劑揮發(fā)法制得載順鉑納米粒，然后利用端氨基與重組人表皮生長因子hrEGF連接，得到hrEGF修飾的包載順鉑的mPEG-PLGA-PLL納米粒。該納米?？膳c腫瘤細(xì)胞表面的表皮生長因子受體(EGFR)特異性結(jié)合并發(fā)生細(xì)胞內(nèi)吞，從而降低順鉑的毒副作用，達(dá)到減毒增效的目的?？捎糜诳鼓[瘤藥物的制備，尤其在卵巢癌的治療研究中證明，該納米粒靶向性好，殺傷作用強，在卵巢癌的化療中具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號A61K9/14GK102793671SQ201210181369
公開日2012年11月28日 申請日期2012年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月4日
發(fā)明者狄文, 段友容, 王云飛, 劉培峰 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院, 上海市腫瘤研究所