專(zhuān)利名稱(chēng)：5-氨基酮戊酸納米粒及其制備方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種5-氨基酮戊酸的納米粒制劑及其制備方法和裝置。
背景技術(shù)：
5-氨基酮戊酸，又名5-氨基左旋糖酸、5-氨基果糖酸、5-氨基乙酰丙酸，是一種水溶性的小分子氨基酸，是人體內(nèi)合成原卟啉IX的前體化合物。當(dāng)大量的外源性5-氨基酮戊酸進(jìn)入到人體后，優(yōu)先被非正常細(xì)胞吸收，合成過(guò)量的原卟啉IX。原卟啉IX作為一種光敏性物質(zhì)，局部光照后產(chǎn)生單態(tài)氧、氧自由基等氧活性物質(zhì)，對(duì)非正常細(xì)胞起到殺傷作用?；谟羞@樣的作用機(jī)理，DUSA公司成功地將5-氨基酮戊酸開(kāi)發(fā)成用于光動(dòng)力治療的光敏劑藥物le'ulanS隨后國(guó)內(nèi)復(fù)旦張江結(jié)合國(guó)情也推出自己的產(chǎn)品艾拉 ，5-氨基酮戍酸光動(dòng)力治療已經(jīng)成功地應(yīng)用于治療各種腫瘤、尖銳濕疣、痤瘡等疾病，由于對(duì)正常組織無(wú)損傷、創(chuàng) 傷性小、腫瘤靶向性好、可重復(fù)多次治療等優(yōu)點(diǎn)，成為目前國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。由于5-氨基酮戊酸分子量小，相對(duì)容易透過(guò)角質(zhì)層，是目前唯一可用于局部外敷給藥的光敏劑；此外，5-氨基酮戊酸憑借良好的光敏特性，較高的單態(tài)氧產(chǎn)出率，成為目前應(yīng)用最為廣泛的光敏齊IJ，并且，無(wú)可替代。但是5-氨基酮戊酸仍然存在著一些不足限制了 5-氨基酮戊酸光動(dòng)力治療的療效。①5-氨基酮戊酸穩(wěn)定性差，進(jìn)入體內(nèi)后容易被水解、酶解。②病變細(xì)胞對(duì)5-氨基酮戊酸吸收率有待提高。首先，5-氨基酮戊酸的親水性影響其透過(guò)細(xì)胞膜的效率。其次，5-氨基酮戊酸對(duì)病變細(xì)胞的靶向選擇性還有待進(jìn)一步提高；③“光漂白”現(xiàn)象影響5-氨基酮戊酸光動(dòng)力治療作用效果。5-氨基酮戊酸受到光照后，發(fā)生光敏反應(yīng)生成單態(tài)氧，氧自由基，這些活性氧在氧化殺傷病變細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)氧化5-氨基酮戊酸，使5-氨基酮戊酸結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，此外光敏劑光照后發(fā)生光敏反應(yīng)的同時(shí)還發(fā)生光分解、光電離、光氧化還原等反應(yīng)，使5-氨基酮戊酸失去光敏性。這種光照后活性光敏劑不斷被消耗的現(xiàn)象，被稱(chēng)為“光漂白”現(xiàn)象。臨床上由于“光漂白”現(xiàn)象的存在，使5-氨基酮戊酸光動(dòng)力治療作用減弱；④5-氨基酮戊酸的滲透深度有限。雖然5-氨基酮戊酸作為一種內(nèi)源性的小分子氨基酸，但由于親水性強(qiáng)，較難通過(guò)完整的皮膚屏障，特別是對(duì)于體積大、侵襲深的皮膚鱗癌效果差。針對(duì)5-氨基酮戊酸光動(dòng)力治療的上述不足，目前臨床上并沒(méi)有有效的解決方案，大多只是一味地提高5-氨基酮戊酸的敷藥濃度以求更好的治療效果，但是隨之而來(lái)的是高濃度5-氨基酮戊酸對(duì)正常組織的連帶損傷，引起疼痛、紅斑、水腫、糜爛、甚至潰瘍、疤痕。歐洲專(zhuān)利(EP-2-236-129-A2)描述了一種5_氨基酮戊酸的脂質(zhì)體制劑，對(duì)5_氨基酮戊酸的不足有一定的改善作用。但是脂質(zhì)體在人體內(nèi)并不穩(wěn)定，容易過(guò)早地被破壞，所以并不能有效地起到保護(hù)5-氨基酮戊酸的作用，納米級(jí)的5-氨基酮戊酸脂質(zhì)體也無(wú)法發(fā)揮出納米粒載體應(yīng)有的優(yōu)勢(shì)。
此外，5-氨基酮戊酸是一種水溶性藥物。目前，制備水溶性藥物的聚合物納米粒一般多米用復(fù)乳法。其過(guò)程描述為取藥物溶于內(nèi)水相，聚合物材料溶于有機(jī)相，將內(nèi)水相加入到有機(jī)相，采用物理機(jī)械方式(超聲、攪拌、高壓均質(zhì)等)將其制備為油包水乳液，再將乳液傾入到含表面活性劑的外水相中，同樣采用物理機(jī)械方式(超聲、超聲、攪拌、高壓均質(zhì)等)制備為水包油包水的復(fù)乳，然后分散于大量外水相中固化形成納米粒。此法制得的水溶性藥物鋳聚合物納米粒，部分藥物位于納米粒表層，未能被包裹于聚合物納米粒內(nèi)部形成完整的核殼結(jié)構(gòu)，能耗較高，制備過(guò)程中的機(jī)械力作用、熱力作用容易破壞藥物，制得的水溶性藥物聚合物納米粒包封率低，納米粒粒徑過(guò)大，大小不夠均一；有機(jī)溶劑揮發(fā)、納米粒固化所需的外水相體積大，使得制得的納米粒膠體液中納米粒濃度低，在冷凍干燥前對(duì)納米粒膠體液進(jìn)行濃縮時(shí)，操作困難容易損失納米粒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種5-氨基酮戊酸納米粒及其制備方法和裝置，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
所述的5-氨基酮戊酸納米粒，包括治療有效量的5-氨基酮戊酸、離子絡(luò)合劑和可生物降解聚合物；優(yōu)選的，5-氨基酮戊酸的重量含量，O. 1_2%，離子絡(luò)合劑的重量含量為O. 1-20%，可生物降解聚合物的重量含量為78-99. 8%，百分比之和為100% ；所說(shuō)的可生物降解聚合物選自聚丙交酯、聚乙交酯、乙交酯-丙交酯共聚物、聚己內(nèi)酯或聚乙二醇-乙交酯-丙交酯共聚物中的一種以上；優(yōu)選的，乙交酯-丙交酯共聚物，單體的摩爾比例的范圍為50 50-25 75，可生物降解聚合物的重均分子量為5，000-180, 000道爾頓，20，000-15, 000道爾頓較為合適；所述的離子絡(luò)合劑選自磺基丁二酸鈉二辛酯或硫酸葡聚糖鈉，優(yōu)選磺基丁二酸鈉
二辛酯；制得納米粒的平均直徑10nm-200nm,優(yōu)選的，50nm_100nm。一種用于制備所述的5-氨基酮戊酸納米粒的裝置，包括密閉絕緣保護(hù)殼、高壓電發(fā)生器、雙通道噴管、接收杯和真空泵；所述密閉絕緣保護(hù)殼罩在雙通道噴管外，優(yōu)選的，所采用的材料透明可視；所述雙通道噴管包括水相管道和油相管道，所述油相管道套在水相管道外，所述水相管道的上端穿過(guò)所述密閉絕緣保護(hù)殼與水相傳輸泵相連通，油相管道的上端穿過(guò)所述密閉絕緣保護(hù)殼與油相傳輸泵相連通，所述雙通道噴管的下端向下延伸至所述密閉絕緣保護(hù)殼的下部；所述真空泵與所述密閉絕緣保護(hù)殼的真空口相連通；所述高壓電發(fā)生器的一個(gè)電極連接與所述的雙通道噴管通過(guò)導(dǎo)線相連接，另一個(gè)電極與所述的接收杯相連接；所述高壓電發(fā)生器為變壓器；所述的雙通道噴管和接收杯的材料為導(dǎo)電的金屬材料；所述的接收杯設(shè)置在所述雙通道噴管的下部的密閉絕緣保護(hù)殼的底部；采用上述的裝置，制備本發(fā)明的5-氨基酮戊酸納米粒的方法，包括如下步驟
(I)打開(kāi)真空泵，使密閉絕緣保護(hù)殼內(nèi)形成真空，壓強(qiáng)小于一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，以壓強(qiáng)范圍在“1333Pa-0. 133Pa”較為合適；打開(kāi)高壓電發(fā)生器，使雙通道噴管的上方與接收杯之間形成6 8，優(yōu)選7千伏的高壓電場(chǎng)，電流為O. l-20mA ；(2)將內(nèi)水相溶液通過(guò)水相傳輸泵送入水相管道，將油相溶液通過(guò)油相傳輸泵油相管道，在雙層噴嘴出口處匯合 形成油包水乳液，在高壓電場(chǎng)的作用下，油包水乳液崩碎成極小的液滴，由于真空狀態(tài)的存在，裂解更為充分，形成的液滴更小，由雙層噴嘴處噴出，進(jìn)入接收杯；所述的內(nèi)水相溶液為含有5-氨基酮戊酸和離子絡(luò)合劑的磷酸鹽緩沖液，pH為3 5 ；5-氨基酮戍酸的重量含量為1-5%,以2-3%較為合適；離子絡(luò)合劑為5-氨基酮戊酸重量的1-10倍，以1-3倍較為合適；所述的油相溶液為含有可生物降解聚合物的有機(jī)溶劑，可生物降解聚合物的重量含量5-20%，以7-12%較為合適；所述有機(jī)溶劑選自二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲醇、乙腈、丙酮、乙醇、N，N-二甲基吡咯烷酮、苯甲醇、碳酸丙烯、N，N-二甲基酰胺或二甲基亞砜等；內(nèi)水相溶液與油相溶液的重量比為內(nèi)水相溶液油相溶液=I :0. 54 I :18. 75 ；雙層噴嘴匯合處，內(nèi)水相溶液的容積速度為O. 1—10. 0ml/h,油相溶液的容積速度為 O.5-20ml/h ；(3)所述接收杯中裝有外水相溶液，進(jìn)入接收杯的油包水的納米粒初乳，形成水包油包水的納米粒復(fù)乳，攪拌器攪拌I 3小時(shí)，揮去有機(jī)溶劑，獲得固化的納米粒。然后水洗、離心去除多余物質(zhì)，并濃縮納米粒膠體液。最后，收集濃縮固化后的納米粒膠體液，-20°C _30°C冷凍減壓干燥，即得5-氨基酮戊酸納米粒，為一種5-氨基酮戊酸納米粒凍干粉；所述的外水相溶液為溶解有聚乙烯醇的磷酸鹽緩沖液，pH為3 5，聚乙烯醇重量含量為O. 05-5%。動(dòng)物試驗(yàn)證明，本發(fā)明獲得的5-氨基酮戊酸納米粒，可以用于治療日光性角化、基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、食管癌、惡性膠質(zhì)瘤、膀胱癌等各種腫瘤及癌前期病變，痤瘡、尖銳濕疣、頭癬等各種細(xì)菌真菌病毒感染以及抗光老化等各種衰老性疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明是利用生物可降解的聚合物材料乙交酯-丙交酯共聚物、其單體聚合物、或改性材料，來(lái)包裹5-氨基酮戊酸，形成納米?；蚣{米膠束，克服原有藥物5-氨基酮戊酸的不足。高壓電噴霧法制備聚合物納米粒是利用液流在高壓電場(chǎng)中易形成泰勒錐后崩碎形成極細(xì)的小液滴，制備成復(fù)乳納米粒。該法制備的納米?？蓪⑺幬锇诰酆衔飪?nèi)部，形成完整的核殼結(jié)構(gòu)，且能耗相對(duì)較低，制備條件溫和，不易破壞藥物，可克服傳統(tǒng)機(jī)械法制備復(fù)乳，導(dǎo)致藥物包封率低、納米粒表層含藥物較多的缺點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上，再將真空減壓技術(shù)和高壓電噴霧法相結(jié)合，用于制備納米粒，相比單用高壓電噴霧法，制得的納米粒顆粒更小，大小更均一，有機(jī)溶劑揮發(fā)、納米粒固化所需的時(shí)間和外水相體積更少。制備時(shí)間減少，有利于降低對(duì)原料藥的破壞，提聞包封率。外水相體積減少，有利于提聞納米粒I父體液中納米粒濃度，利于后期冷凍干燥前納米粒膠體液的濃縮，降低制備過(guò)程中納米粒的損失。本發(fā)明解決了諸多納米粒制備的難題，適用于原料藥、輔料易溶于上述有機(jī)溶劑或水中的各種納米粒的制備。本發(fā)明的5-氨基酮戊酸納米粒性質(zhì)穩(wěn)定，包封率高，靶向選擇性高，細(xì)胞吸收率高，“光漂白”現(xiàn)象減弱，光動(dòng)力反應(yīng)得到加強(qiáng)，對(duì)人體沒(méi)有毒副作用，可結(jié)合注射或微針給藥提高組織滲透深度，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。


圖I為高壓電噴霧納米粒制備儀結(jié)構(gòu)示意圖。圖2，3，4，5為5_氨基酮戊酸納米粒的體外釋放曲線。
圖6，7，8，9為5-氨基酮戊酸納米粒與5_氨基酮戊酸對(duì)人鱗癌A431細(xì)胞的體外光動(dòng)力治療結(jié)果。
具體實(shí)施例方式參見(jiàn)圖1，用于制備所述的5-氨基酮戊酸納米粒的裝置，包括密閉絕緣保護(hù)殼3、高壓電發(fā)生器4、雙通道噴管5、接收杯7和真空泵9 ；所述密閉絕緣保護(hù)殼3罩在雙通道噴管5外；所述雙通道噴管5包括水相管道I和油相管道2，所述油相管道2套在水相管道I夕卜，所述水相管道I的上端穿過(guò)所述密閉絕緣保護(hù)殼3與水相傳輸泵11相連通，油相管道2的上端穿過(guò)所述密閉絕緣保護(hù)殼3與油相傳輸泵21相連通，所述雙通道噴管5的下端向下延伸至所述密閉絕緣保護(hù)殼3的下部；所述真空泵9與所述密閉絕緣保護(hù)殼3的真空口 31相連通；所述高壓電發(fā)生器4的一個(gè)電極連接與所述的雙通道噴管5通過(guò)導(dǎo)線相連接，另一個(gè)電極與所述的接收杯7相連接；所述高壓電發(fā)生器4為變壓器；所述的接收杯7設(shè)置在所述雙通道噴管5的下部的密閉絕緣保護(hù)殼3的底部；所述的雙通道噴管5和接收杯7的材料為導(dǎo)電的金屬材料；優(yōu)選的，所述的雙通道噴管5的下部設(shè)有雙層噴嘴6 ；優(yōu)選的，所述的接收杯7中設(shè)有攪拌器8。實(shí)施例I處方I :5-氨基酮戍酸4mg ；磺基丁二酸鈉二辛酯4mg ；乙交酯-丙交酯共聚物3992mg ；乙交酯-丙交酯共聚物，單體的摩爾比例為50 50，重均分子量為5，000道爾頓；采用圖I的裝置制備所述的5-氨基酮戊酸納米粒。工藝參數(shù)如下密閉絕緣保護(hù)殼3內(nèi)，壓強(qiáng)為1333Pa ；雙通道噴管5的上方與接收杯7之間形成7千伏的高壓電場(chǎng)，電流為20mA ；
所述的內(nèi)水相溶液為含有5-氨基酮戊酸和離子絡(luò)合劑磺基丁二酸鈉二辛酯的磷酸鹽緩沖液，PH為5 ;5-氨基酮戊酸的重量含量為1% ；離子絡(luò)合劑為5-氨基酮戊酸重量的I倍；離子絡(luò)合劑為磺基丁二酸鈉二辛酯；油相溶液為含有可生物降解聚合物一乙交酯-丙交酯共聚物的有機(jī)溶劑，乙交酯-丙交酯共聚物的重量含量20% ;有機(jī)溶劑為二氯甲烷；內(nèi)水相溶液與油相溶液的重量比為水相溶液油相溶液=I 18. 75 ；雙層噴嘴6匯合處，內(nèi)水相溶液與油相溶液的容積速度分別為0. lml/h和O. 5ml/h ；攪拌器8攪拌3小時(shí)以獲得固化的納米粒。然后，離心、水洗以去除多余物質(zhì)，并濃縮納米粒膠體液。最后，收集濃縮固化后的納米粒膠體液，_30°C冷凍減壓干燥，即得5-氨基酮戊酸納米粒，為一種5-氨基酮戊酸納米粒凍干粉；外水相溶液為溶解有聚乙烯醇的磷酸鹽緩沖液，pH為5，聚乙烯醇重量含量為5%。實(shí)施例2處方2 5-氨基酮戊酸lg ;硫酸葡聚糖10g ;乙交酯-丙交酯共聚物39g，單體的摩爾比例為25 75，重均分子量為180，000道爾頓；采用圖I的裝置制備所述的5-氨基酮戊酸納米粒。工藝參數(shù)如下密閉絕緣保護(hù)殼3內(nèi)，壓強(qiáng)為O. 133Pa ；雙通道噴管5的上方與接收杯7之間形成7千伏的高壓電場(chǎng)，電流為O. ImA ；所述的內(nèi)水相溶液為含有5-氨基酮戊酸和離子絡(luò)合劑硫酸葡聚糖的磷酸鹽緩沖液，pH為3 ;5-氨基酮戍酸的重量含量為5% ；離子絡(luò)合劑為5-氨基酮戊酸重量的10倍；離子絡(luò)合劑為硫酸葡聚糖鈉；油相溶液為含有可生物降解聚合物一乙交酯-丙交酯共聚物的有機(jī)溶劑，乙交酯-丙交酯共聚物的重量含量5% ；有機(jī)溶劑為丙酮；內(nèi)水相溶液與油相溶液的重量比為水相溶液油相溶液=I O. 54；雙層噴嘴6匯合處，水相溶液與油相溶液的容積速度分別為10ml/h，20ml/h;攪拌器8攪拌3小時(shí)以獲得固化的納米粒。然后，離心、水洗以去除多余物質(zhì)，并濃縮納米粒膠體液。最后，收集濃縮固化后的納米粒膠體液，_20°C冷凍減壓干燥，即得5-氨基酮戊酸納米粒，為一種5-氨基酮戊酸納米粒凍干粉；外水相溶液為溶解有聚乙烯醇的磷酸鹽緩沖液，pH為3，聚乙烯醇重量含量為
O.05%。
、
實(shí)施例3處方3:
5-氨基酮戊酸lg ;磺基丁二酸鈉二辛酯2g ;聚乙二醇-乙交酯-丙交酯共聚物47g，乙交酯-丙交酯單體的摩爾比例為25 75，重均分子量為65，000道爾頓；采用圖I的裝置制備所述的5-氨基酮戊酸納米粒。工藝參數(shù)如下密閉絕緣保護(hù)殼3內(nèi)，壓強(qiáng)為13Pa ；雙通道噴管5的上方與接收杯7之間形成7千伏的高壓電場(chǎng)，電流為IOmA ；所述的內(nèi)水相溶液為含有5-氨基酮戊酸和離子絡(luò)合劑磺基丁二酸鈉二辛酯的磷酸鹽緩沖液，PH為4 ; 5-氨基酮戊酸的重量含量為2. 5% ；離子絡(luò)合劑為5-氨基酮戊酸重量的2倍；所述的油相溶液為含有可生物降解聚合物一聚乙二醇-乙交酯-丙交酯共聚物的有機(jī)溶劑，聚乙二醇-乙交酯-丙交酯共聚物的重量含量9. 1% ；有機(jī)溶劑為二氯甲烷和丙酮(I :0. 1，體積)的混合溶劑；內(nèi)水相溶液與油相溶液的重量比為水相溶液油相溶液=I 3. 5 ；雙層噴嘴6匯合處，水相溶液與油相溶液的容積速度分別為2ml/h，20ml/h;攪拌器8攪拌2小時(shí)以獲得固化的納米粒。然后，離心、水洗以去除多余物質(zhì)，并濃縮納米粒膠體液。最后，收集濃縮固化后的納米粒膠體液，_28°C冷凍減壓干燥，即得5-氨基酮戊酸納米粒，為一種5-氨基酮戊酸納米粒凍干粉；外水相溶液為溶解有聚乙烯醇的磷酸鹽緩沖液，pH為4，聚乙烯醇重量含量為
O.5%。實(shí)施例4處方4:5-氨基酮戊酸lg ;硫酸葡聚糖3g ;聚乙二醇-乙交酯-丙交酯共聚物96g，乙交酯-丙交酯單體的摩爾比例為25 75，重均分子量為85，000道爾頓；采用圖I的裝置制備所述的5-氨基酮戊酸納米粒。工藝參數(shù)如下密閉絕緣保護(hù)殼3內(nèi)，壓強(qiáng)為130Pa ；雙通道噴管5的上方與接收杯7之間形成7千伏的高壓電場(chǎng)，電流為8mA ；所述的內(nèi)水相溶液為含有5-氨基酮戊酸和離子絡(luò)合劑硫酸葡聚糖的磷酸鹽緩沖液，pH為4 ;5-氨基酮戊酸的重量含量為3% ；離子絡(luò)合劑為5-氨基酮戊酸重量的3倍；所述的油相溶液為含有可生物降解聚合物一聚乙二醇-乙交酯-丙交酯共聚物的有機(jī)溶劑，聚乙二醇-乙交酯-丙交酯共聚物的重量含量9. 1% ；有機(jī)溶劑為二氯甲烷和丙酮(I :0. 1，體積)的混合溶劑；內(nèi)水相溶液與油相溶液的重量比為水相溶液油相溶液=I 6. 7 ；雙層噴嘴6匯合處，水相溶液與油相溶液的容積速度分別為3. 6ml/h,20ml/h;攪拌器8攪拌2小時(shí)以獲得固化的納米粒。然后，離心、水洗以去除多余物質(zhì)，并濃縮納米粒膠體液。最后，收集濃縮固化后的納米粒膠體液，_26°C冷凍減壓干燥，即得5-氨基酮戊酸納米粒，為一種5-氨基酮戊酸納米粒凍干粉；外水相溶液為溶解有聚乙烯醇的磷酸鹽緩沖液，pH為4，聚乙烯醇重量含量為
O.5%。實(shí)施例5納米粒包封率的測(cè)定方法精密稱(chēng)取實(shí)施例I的5-氨基酮戊酸納米粒凍干粉溶解于磷酸緩沖液(pH5)中，離心后納米粒沉淀，再分別測(cè)定沉淀納米粒中的5-氨基酮戊酸即包裹藥物量，以及磷酸緩沖液(PH5)中5-氨基酮戊酸及游離藥物量，以確定納米粒的包封率。
5-氨基酮戊酸分析方法采用柱前衍生化高效液相-熒光法測(cè)定，以熒光胺為熒光衍生化試劑，采用C18柱(4. 6mmX 250mm, 5 μ m),乙腈-水(O. 1% 三氟乙酸)(30 70)為流動(dòng)相，流速 I. 5ml · mirT1,激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)為398/480nm。包封率=包裹藥物量/ (游離藥物量+包裹藥物量)X 100%。測(cè)得實(shí)施例I的5-氨基酮戊酸包封率為76%。采用相同的方法，測(cè)得實(shí)施例2的5-氨基酮戊酸包封率為68% ;測(cè)得實(shí)施例3的5-氨基酮戊酸包封率為75% ;測(cè)得實(shí)施例4的5-氨基酮戊酸包封率為72%。實(shí)施例6納米粒緩釋的測(cè)定方法取實(shí)施例I的5-氨基酮戊酸納米粒凍干粉適量置于具塞管中，加入生理等滲磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鈉I. 84g、磷酸氫二鈉19. lg、疊氮化鈉O. 2g、吐溫_801g、氯化鈉4. 32g,加水至1000ml,調(diào)節(jié)pH為5形成膠體液,使5-氨基酮戍酸為lmg/ml,取其中1.5ml置于透析袋中，排氣后，扎緊端口，放于IOml磷酸鹽緩沖液的具塞錐形瓶中。將錐形瓶置于37°C恒溫水浴震蕩箱中，定時(shí)取樣，每次取樣后更換全部釋放介質(zhì)，得到的樣品與熒光胺進(jìn)行衍生化反應(yīng)，采用柱前衍生化高效液相-熒光法測(cè)定5-氨基酮戊酸的含量，計(jì)算5-氨基酮戊酸納米粒的累積釋放量。結(jié)果見(jiàn)圖2，可見(jiàn)5-氨基酮戊酸納米粒的釋藥速度快，釋藥時(shí)間6h左右，符合臨床光動(dòng)力治療的要求。采用相同的方法，對(duì)實(shí)施例2，3，4的實(shí)施例進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果分別見(jiàn)圖3，4，5。實(shí)施例7紅外光譜儀檢測(cè)采用溴化鉀壓片法紅外光譜儀測(cè)定5-氨基酮戊酸、乙交酯-丙交酯共聚物和實(shí)施例I中的5-氨基酮戊酸乙交酯-丙交酯共聚物納米粒的紅外光譜。在25°C，相對(duì)濕度50%的條件下，分別取5-氨基酮戊酸、乙交酯-丙交酯共聚物和5-氨基酮戊酸乙交酯-丙交酯共聚物納米粒適量，在瑪瑙研缽中研磨變細(xì)，再加入適量溴化鉀，再次研細(xì)研勻。隨后將研細(xì)的粉末進(jìn)行壓片，得到均勻的透明薄片，干燥后采用Perkin Elmer Spectrum one FT-IRSpectrometer光譜儀進(jìn)行光譜測(cè)定。觀察5-氨基酮戍酸乙交酯-丙交酯共聚物納米粒中5-氨基酮戊酸與乙交酯-丙交酯共聚物的結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化。結(jié)果紅外光譜儀掃描波譜顯示實(shí)施例I中的5-氨基酮戊酸乙交酯-丙交酯共聚物納米粒中5-氨基酮戊酸的結(jié)構(gòu)無(wú)變化，證實(shí)5-氨基酮戊酸存在于乙交酯-丙交酯共聚物納米粒中，且未與輔料乙交酯-丙交酯共聚物發(fā)生反應(yīng)，保持了藥物活性。
采用相同的方法，對(duì)實(shí)施例2，3，4的5-氨基酮戊酸納米粒凍干粉進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果也證實(shí)5-氨基酮戊酸納米粒中5-氨基酮戊酸的結(jié)構(gòu)也無(wú)變化。實(shí)施例8差示掃描量熱法檢測(cè)分別取少量5-氨基酮戊酸、乙交酯-丙交酯共聚物納米粒和實(shí)施例I的5-氨基酮戊酸乙交酯-丙交酯共聚物納米粒凍干粉，采用差示掃描量熱儀專(zhuān)用制樣器，制成上機(jī)樣品后，按差示掃描量熱儀操作規(guī)范進(jìn)行檢測(cè)，每分鐘升溫10°c，根據(jù)檢測(cè)到的吸熱峰，判斷5-氨基酮戊酸在乙交酯-丙交酯共聚物納米粒中是否生成新的物相。結(jié)果5-氨基酮戊酸在158°C附近出現(xiàn)熔融吸熱峰，5-氨基酮戊酸與乙交酯-丙交酯共聚物納米粒的物理混合物在157°C處也有此熔融吸熱峰，但稍有較弱。而5-氨基酮戊酸乙交酯-丙交酯共聚物則無(wú)此熔融吸熱峰。說(shuō)明5-氨基酮戊酸在乙交酯-丙交酯共聚物納米粒中形成了新的物相，以無(wú)定形存在。 采用相同的方法，對(duì)實(shí)施例2，3，4的處方進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果也證實(shí)5-氨基酮戊酸納米粒中也形成了新的物相，以無(wú)定形存在。實(shí)施例95-氨基酮戊酸納米粒及其細(xì)胞吸收的形態(tài)學(xué)觀察取實(shí)施例I的凍干粉lmg，復(fù)溶于IOml蒸餾水中得到納米膠體液。吸管吸取少許膠體液，滴于硅片上，自然晾干，噴金后在掃描電子顯微鏡下觀察粒子的表面形態(tài)。結(jié)果顯示實(shí)施例I的5-氨基酮戊酸納米粒在掃描電鏡下呈典型的球形，圓潤(rùn)飽滿(mǎn)，大小均勻，表面光滑，分散性好，無(wú)溶解、粘連，平均粒徑大小為65nm左右。將鱗癌A431細(xì)胞(3父105/0112，21111)接種到兩塊培養(yǎng)皿中，分別加入新鮮配制的含5-氨基酮戊酸終濃度為O. lmmol/1的5-氨基酮戊酸納米粒和5-氨基酮戊酸培養(yǎng)基2ml，37. 0°C>5% C02條件下錫箔紙包裹避光培養(yǎng)4h。4h后吸去含藥培養(yǎng)液，PBS漂洗二次，加入5ml 2%戊二醛PBS固定液固定2小時(shí)，4°C保存過(guò)夜，次日送電鏡室，刮下固定好的細(xì)胞，PBS漂洗二次進(jìn)行后固定，4°C下1%鋨酸PBS固定液固定2小時(shí)，送電鏡室制樣，采用PHILIP (荷蘭菲利浦公司)CM-120透射電鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果電鏡可見(jiàn)，5-氨基酮戊酸納米粒與鱗癌A431細(xì)胞共孵育后5_氨基酮戊酸納米粒大量的被鱗癌細(xì)胞吸收，以完整的球形形態(tài)，密集分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，每個(gè)細(xì)胞可見(jiàn)吸收200-20000個(gè)左右的5-氨基酮戊酸納米粒。采用相同的方法，對(duì)實(shí)施例2，3，4的處方進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示實(shí)施例2，3，4的5-氨基酮戊酸納米粒在掃描電鏡下也呈典型的球形，圓潤(rùn)飽滿(mǎn)，大小均勻，表面光滑，分散性好，無(wú)溶解、粘連，平均粒徑大小為60-70nm左右。實(shí)施例2，3,4的5-氨基酮戊酸納米粒與鱗癌A431細(xì)胞共孵育后5-氨基酮戊酸納米粒大量的被鱗癌細(xì)胞吸收，以完整的球形形態(tài)，密集分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，每個(gè)細(xì)胞可見(jiàn)吸收200-20000個(gè)左右的5-氨基酮戊酸納米粒。說(shuō)明5-氨基酮戊酸納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向選擇性高。實(shí)施例10穩(wěn)定性考察實(shí)施例I制得的5-氨基酮戊酸納米粒置于_20°C、4°C、室溫三種不同條件下保存，3個(gè)月，6個(gè)月，12個(gè)月后分別采用激光粒度測(cè)定儀檢測(cè)其粒徑變化，掃描電鏡檢測(cè)其表面形態(tài)，按“實(shí)施例2”方法檢測(cè)包封率、和載藥量。以明確5-氨基酮戊酸納米粒在三種溫度下的穩(wěn)定性。結(jié)果-20°C條件下12個(gè)月后粒徑大小、表面形態(tài)、包封率、載藥量均無(wú)明顯變化；4°C條件下，6個(gè)月后粒徑大小、表面形態(tài)、包封率均無(wú)明顯變化，12個(gè)月后粒徑略有變小，部分納米粒形態(tài)由球形變橄欖狀，包封率載藥量稍有下降；室溫下3個(gè)月后粒徑變小，納米粒形態(tài)由球形變橄欖狀，包封率載藥量下降。說(shuō)明本5-氨基酮戊酸納米粒在_20°C狀態(tài)下保存，穩(wěn)定性好不易降解、破裂，藥物載藥量無(wú)變化。采用相同的方法，對(duì)實(shí)施例2，3，4的處方進(jìn)行考察，結(jié)果兩種處方制得的5-氨基酮戊酸納米粒在穩(wěn)定性上沒(méi)有明顯的差別。實(shí)施例11細(xì)胞學(xué)研究
采用人鱗癌細(xì)胞A431作為研究對(duì)象，對(duì)比實(shí)施例I制得的5_氨基酮戊酸納米粒和5-氨基酮戊酸對(duì)細(xì)胞的殺傷作用。取2X 105/ml細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板上，分為a、b、c三組，每組6孔，培養(yǎng)24h后，更換培養(yǎng)液，a組培養(yǎng)液中加入5-氨基酮戊酸含量為O. lmol/1的5-氨基酮戊酸納米粒，b組培養(yǎng)液中加入與a組相同含量5-氨基酮戊酸的5-氨基酮戊酸，c組培養(yǎng)液中不加入5-氨基酮戊酸。避光培養(yǎng)24小時(shí)后，先用磷酸緩沖液漂洗3次再加入新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)基，給予635nm半導(dǎo)體激光照射，光能量密度為lOJ/cm2，光功率密度為60mW/cm2再培養(yǎng)24小時(shí)后用MTT法計(jì)算細(xì)胞生存率。結(jié)果如圖6所示，5-氨基酮戊酸納米粒組對(duì)人鱗癌細(xì)胞的殺傷作用強(qiáng)于5-氨基酮戊酸組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p〈0.01 )。采用相同的方法，對(duì)實(shí)施例2，3，4制得的5-氨基酮戊酸納米粒進(jìn)行考察，結(jié)果如圖7，8，9所示，5-氨基酮戊酸納米粒組對(duì)人鱗癌細(xì)胞的殺傷作用也強(qiáng)于5-氨基酮戊酸組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0. 01)。說(shuō)明5-氨基酮戊酸納米粒加強(qiáng)了光動(dòng)力反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.5-氨基酮戊酸納米粒，其特征在于，所述的5-氨基酮戊酸納米粒，包括治療有效量的5-氨基酮戊酸、離子絡(luò)合劑和可生物降解聚合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的5-氨基酮戊酸納米粒，其特征在于，5-氨基酮戊酸的重量含量為0. 1_2%，離子絡(luò)合劑的重量含量為0. 1_20%，可生物降解聚合物的重量含量為78-99. 8%，總量為 100%o
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的5-氨基酮戊酸納米粒，其特征在于，所說(shuō)的可生物降解聚合物選自聚丙交酯、聚乙交酯、乙交酯-丙交酯共聚物、聚己內(nèi)酯或聚乙二醇-乙交酯-丙交酯共聚物中的一種以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的5-氨基酮戊酸納米粒，其特征在于，所說(shuō)的可生物降解聚合物選自聚丙交酯、聚乙交酯、乙交酯-丙交酯共聚物、聚己內(nèi)酯或聚乙二醇-乙交酯-丙交酯共聚物中的一種以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求I 4任一項(xiàng)所述的5-氨基酮戊酸納米粒，其特征在于，乙交酯-丙交酯共聚物，單體的摩爾比例的范圍為50 50-25 75，生物可降解聚合物的重均分子量為 5，000-180，000 道爾頓。
6.根據(jù)權(quán)利要求I 4任一項(xiàng)所述的5-氨基酮戊酸納米粒，其特征在于，所述的離子絡(luò)合劑選自磺基丁二酸鈉二辛酯或硫酸葡聚糖鈉。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的5-氨基酮戊酸納米粒，其特征在于，所述的離子絡(luò)合劑選自磺基丁二酸鈉二辛酯或硫酸葡聚糖鈉。
8.用于制備權(quán)利要求I 7任一項(xiàng)所述的5-氨基酮戊酸納米粒的裝置，其特征在于，包括密閉絕緣保護(hù)殼(3)、高壓電發(fā)生器(4)、雙通道噴管(5)、接收杯(7)和真空泵(9)； 所述密閉絕緣保護(hù)殼(3)罩在雙通道噴管(5)外； 所述雙通道噴管(5)包括水相管道(I)和油相管道(2)，所述油相管道(2)套在水相管道(I)外，所述水相管道(I)的上端穿過(guò)所述密閉絕緣保護(hù)殼(3)與水相傳輸泵(11)相連通，油相管道(2)的上端穿過(guò)所述密閉絕緣保護(hù)殼(3)與油相傳輸泵(21)相連通，所述雙通道噴管(5)的下端向下延伸至所述密閉絕緣保護(hù)殼(3)的下部； 所述真空泵(9)與所述密閉絕緣保護(hù)殼(3)的真空口(31)相連通； 所述高壓電發(fā)生器(4)的一個(gè)電極連接與所述的雙通道噴管(5)通過(guò)導(dǎo)線相連接，另一個(gè)電極與所述的接收杯(X)相連接； 所述的接收杯(7)設(shè)置在所述雙通道噴管(5)的下部的密閉絕緣保護(hù)殼(3)的底部； 所述的雙通道噴管(5)和接收杯(7)的材料為導(dǎo)電的金屬材料。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的裝置，其特征在于，所述的雙通道噴管(5)的下部設(shè)有雙層噴嘴(6)，所述的接收杯(7)中設(shè)有攪拌器(8)。
10.采用權(quán)利要求8或9所述的裝置，制備本發(fā)明的5-氨基酮戊酸納米粒的方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)打開(kāi)真空泵，使透明密閉絕緣保護(hù)殼內(nèi)形成真空，壓強(qiáng)為1333Pa-0.133Pa ； 打開(kāi)高壓電發(fā)生器，使雙通道噴管的上方與接收杯之間形成6 8千伏的電場(chǎng)，電流為0.I-20mA ； (2)將內(nèi)水相溶液通過(guò)水相傳輸泵送入水相管道，將油相溶液通過(guò)油相傳輸泵油相管道，在雙層噴嘴出口處匯合形成油包水乳液，由雙層噴嘴處噴出，進(jìn)入接收杯；所述的內(nèi)水相溶液為含有5-氨基酮戊酸和離子絡(luò)合劑的磷酸鹽緩沖液，pH為3 5 ; 5-氨基酮戍酸的重量含量為1-5% ； 離子絡(luò)合劑為5-氨基酮戊酸重量的1-10倍； 所述的油相溶液為含有生物可降解聚合物的有機(jī)溶劑，生物可降解聚合物的重量含量為 5-20% ； 所述有機(jī)溶劑選自二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲醇、乙腈、丙酮、乙醇、N，N-二甲基吡咯烷酮、苯甲醇、碳酸丙烯、N，N-二甲基酰胺或二甲基亞砜等； 內(nèi)水相溶液與油相溶液的重量比為內(nèi)水相溶液油相溶液=I :0. 54 I :18. 75 ; 雙層噴嘴匯合處，內(nèi)水相溶液的容積速度為0. 1—10. 0ml/h,油相溶液的容積速度為0. 5-20ml/h ； (3)所述接收杯裝有外水相溶液，進(jìn)入接收杯的產(chǎn)物形成水包油包水的納米粒復(fù)乳，攪拌器攪拌I 3小時(shí)，揮去有機(jī)溶劑，獲得固化的納米粒，然后水洗、離心，收集固化的納米粒，-20° C _30°C冷凍減壓干燥，即得5-氨基酮戊酸納米粒，為一種5-氨基酮戊酸納米粒凍干粉； 所述的外水相溶液為溶解有聚乙烯醇的磷酸鹽緩沖液，pH為3 5，聚乙烯醇重量含量為 0.05-5%。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種涉及5-氨基酮戊酸納米粒及其制備方法和和裝置。所述5-氨基酮戊酸納米粒，包括治療有效量的5-氨基酮戊酸、離子絡(luò)合劑和可生物降解聚合物。本發(fā)明的5-氨基酮戊酸納米粒性質(zhì)穩(wěn)定，靶向選擇性高，細(xì)胞吸收率高，“光漂白”現(xiàn)象減弱，光動(dòng)力反應(yīng)得到加強(qiáng)，可結(jié)合注射或微針給藥提高組織滲透深度，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61J3/00GK102697731SQ201210145318
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月10日
發(fā)明者楊莉, 欒瀚森, 王宏偉, 王浩, 王秀麗, 石磊, 趙鋒 申請(qǐng)人:上海現(xiàn)代藥物制劑工程研究中心有限公司, 華東醫(yī)院