專利名稱：一種人工脂質(zhì)體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥學(xué)領(lǐng)域，涉及一種蛋白質(zhì)藥物脂質(zhì)體的制備方法，具體涉及一種人工脂質(zhì)體的制備方法。
背景技術(shù)：
由于脂質(zhì)體獨(dú)特的物理、生理和藥理特征，如具有備整合親水性和疏水性藥物能力、生物適應(yīng)性好、毒性低、無免疫系統(tǒng)響應(yīng)及其在作用位點(diǎn)活性藥物的靶向緩釋能力等， 因此，作為治療型或診斷型活性試劑，脂質(zhì)體載體的研究一直以來得到廣泛的關(guān)注。自從發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體以來，其產(chǎn)品的大小能夠從微米到納米有效地控制；部分載體系統(tǒng)通過表面改性后與多肽、蛋白質(zhì)和抗體進(jìn)行了功能性整合。目前，F(xiàn)DA機(jī)構(gòu)已經(jīng)批準(zhǔn)如阿米卡星/HSPC/ CH/DSPG，胞壁酰二肽/DSPC/PS (1:1)等25種以上的脂質(zhì)體劑型藥物在臨床試驗，部分藥品已進(jìn)入臨床應(yīng)用階段。脂質(zhì)體的制備技術(shù)主要采取以下4種途徑水相攪拌、超聲技術(shù)(探頭超聲和水浴超聲分散技術(shù))、反向蒸發(fā)技術(shù)以及冷凍脫水干燥技術(shù)。脂質(zhì)體藥物為兼具親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)的產(chǎn)品，分別通過以下4種不同的途徑對靶向細(xì)胞發(fā)揮作用網(wǎng)狀內(nèi)皮組織中巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的內(nèi)吞作用、藥物與細(xì)胞表面弱的疏水性(或靜電)等非選擇性作用以及藥物和細(xì)胞表面組分的選擇性作用、磷脂雙分子層插入血清細(xì)胞膜并釋放到細(xì)胞質(zhì)中、月旨質(zhì)體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)膜或亞細(xì)胞器膜中。在以上情況中，較難判斷競爭性優(yōu)勢的作用途徑，同時對于1種以上的協(xié)同作用過程目前尚未清楚。對于治療型和診斷型脂質(zhì)體藥物，盡管開展了廣泛深入的研究工作。然而，在具體藥品的開發(fā)應(yīng)用中，脂質(zhì)體仍存在明顯的不足。例如，網(wǎng)狀內(nèi)皮組織細(xì)胞對脂質(zhì)體的生物降解速率很快，導(dǎo)致活性藥物組分很難達(dá)到穩(wěn)定、持久的緩釋和傳遞功效。為了克服以上的不足，在脂質(zhì)體藥物的構(gòu)建中成功采用了 2類聚合材料的改性方法通過親水性聚合材料如聚乙烯乙二醇(PEG)對現(xiàn)有的脂質(zhì)體表面進(jìn)行修飾；此外，可將預(yù)包裹的載藥脂質(zhì)體整合到聚合物基質(zhì)系統(tǒng)中，從而有效控制脂質(zhì)體藥物的緩釋和傳遞。然而，在預(yù)包裹載藥脂質(zhì)體與聚合基質(zhì)的復(fù)合構(gòu)建中，涉及的學(xué)科范圍廣泛同時技術(shù)要求嚴(yán)格，需要藥學(xué)、生物材料科學(xué)、化學(xué)、分子及細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)的研究人員通力合作才能實(shí)現(xiàn)。脂質(zhì)體藥物體系具有穩(wěn)定性差、藥物半衰期短和體內(nèi)藥物清除速率快等不足，使用親水性聚合材料改性后能夠明顯改善脂質(zhì)體的藥理特性。這種方法兼具了載藥脂質(zhì)體和包裹基質(zhì)材料的優(yōu)點(diǎn)，藥物的穩(wěn)定性提高，同時持久的藥物傳遞能力增強(qiáng)。然而，使用親水性聚合材料的最大缺點(diǎn)在于生物適應(yīng)性差。為實(shí)現(xiàn)載藥脂質(zhì)體與聚合材料的復(fù)合構(gòu)建，須將脂質(zhì)體暴露在有機(jī)溶劑并進(jìn)行熱超聲，導(dǎo)致藥物的生物活性明顯下降。當(dāng)前，脂質(zhì)體的構(gòu)建耦合聚合基質(zhì)的包裹技術(shù)是國內(nèi)外制藥行業(yè)的研究熱點(diǎn)。這種研究不僅有望提高藥物穩(wěn)定性和持久的緩釋控制，維持體內(nèi)藥物水平和延長用藥的時間間隔，減小藥物對腸胃道等組織的毒副作用；同時有望高效保留藥物活力，保證臨床的治療效果。為此，構(gòu)建并開發(fā)了不同的技術(shù)用來將載藥脂質(zhì)體包裹進(jìn)聚合性骨架結(jié)構(gòu)中。總體來看，這種研究仍處于基礎(chǔ)的探索階段，距離臨床的成功應(yīng)用仍有大量的技術(shù)難題等待解決。對現(xiàn)有脂質(zhì)體載體的改性進(jìn)行技術(shù)革新是制藥行業(yè)的另一個研究熱點(diǎn)。磷脂類 (PC)脂質(zhì)體在國內(nèi)外的報道已有很多，但PC如蛋黃卵磷脂(EPC)或大豆卵磷脂(SPC)具有構(gòu)型多變(錐形和圓柱形異構(gòu))導(dǎo)致形成的載藥脂質(zhì)體的穩(wěn)定性較低。在常見的口服或靜脈滴注等給藥途徑中，盡管脂質(zhì)體藥物的藥效高，但體液生理條件如酶催化使得載體的穩(wěn)定性差，直接導(dǎo)致了藥物水平的維持和清除時間很短(通常維持?jǐn)?shù)小時)，因此在臨床中需要持續(xù)給藥。專利申請人曾將EPC和SPC分別與無機(jī)離子進(jìn)行雜交，得到了穩(wěn)定性好、生物適應(yīng)性高、等電點(diǎn)適中、分離和純化過程簡單且不溶的膠束納米材料(參見專利 CN102107131A)。相對于其他的脂質(zhì)體系統(tǒng)，載體材料的制備具有條件十分溫和、工藝流程簡單等優(yōu)點(diǎn)，產(chǎn)品分散性高、粒度小(約5nm，與蛋白質(zhì)和藥物分子的幾何尺寸具有相同數(shù)量級)且分布均勻。蛋黃卵磷脂鋯Ur (EPC) 2)和大豆卵磷脂鋯Ur (SPC) 2)作為脂質(zhì)體載體，具有以下的優(yōu)點(diǎn)1.脂質(zhì)體制備條件非常溫和，避免采用有機(jī)溶劑和熱超聲，有效地預(yù)防了蛋白質(zhì)分子的構(gòu)型變化和活力下降；2.脂質(zhì)體藥物與基質(zhì)、底物的分離過程簡單，離心和洗滌操作可方便地實(shí)現(xiàn)了脂質(zhì)體納米顆粒的純化；3.穩(wěn)定性高和機(jī)械強(qiáng)度適中的載體是保證脂質(zhì)體藥物對于溶劑和加熱等條件維持穩(wěn)定的前提；4.載體對蛋白質(zhì)藥物的吸附容量大， 且通過條件選擇可進(jìn)行人為控制；5.載體與蛋白質(zhì)的幾何尺寸相似，吸附動力學(xué)同時兼具主動和被動2個過程，產(chǎn)品的制備周期短。為實(shí)現(xiàn)藥物的有效傳遞和安全使用，使用脂質(zhì)體構(gòu)建耦合聚合物骨架包裹技術(shù)開發(fā)新型緩釋藥物具有非常重要的意義。盡管脂質(zhì)體技術(shù)適用于活性藥物的緩釋和傳遞等代謝動力學(xué)，然而廣泛應(yīng)用在藥劑學(xué)時仍然有明顯的不足，主要集中在脂質(zhì)體藥物的藥效和生物適應(yīng)性二個方面。具體表現(xiàn)為血漿半衰期短、穩(wěn)定性差、活力下降、毒副作用強(qiáng)和長期的緩釋和傳遞控制能力低等。聚合材料的表面改性或復(fù)合包裹技術(shù)能夠克服脂質(zhì)體藥物的部分缺點(diǎn)；但是，一方面加劇了包裹藥物的構(gòu)型轉(zhuǎn)變(如蛋白質(zhì)藥物的熔融和纖維化)以及活力下降，另一方面對機(jī)體組織的細(xì)胞造成了一定的代謝負(fù)荷。此外，聚合骨架復(fù)合包裹的技術(shù)要求極高，需要相關(guān)的多學(xué)科研究人員通力協(xié)作才有可能實(shí)現(xiàn)。在為數(shù)不多的研究報道中，改性或包裹的脂質(zhì)體產(chǎn)品的制備工藝繁雜、條件苛刻且工藝周期長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人工脂質(zhì)體的制備方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種人工脂質(zhì)體的制備方法，以納米球形顆粒的蛋黃卵磷脂鋯& (EPC)2或者大豆卵磷脂鋯&(SPC)2作為載體，以苦瓜蛋白MAP30、首烏蛋白GAP31、脂肪酶CRL、或者牛血清白蛋白BSA作為包裹蛋白，其中載體與包裹蛋白的質(zhì)量比為74. 3-77. 7:22. 3-25. 7，制備時， 在蛋黃卵磷脂鋯ττ (EPC) 2或者大豆卵磷脂鋯ττ (SPC) 2的載體材料中加入磷酸鹽緩沖溶液， 在溫度為4°C，轉(zhuǎn)速為3500rpm的條件下攪拌得到無色、透明的分散液，將包裹蛋白溶解在磷酸鹽緩沖溶液中，然后緩慢滴加至分散液液中，在低溫條件下快速攪拌至形成穩(wěn)定的脂質(zhì)體，離心分離出蛋白質(zhì)后反復(fù)洗滌并離心，經(jīng)低溫冷凍干燥得固體產(chǎn)品，固體產(chǎn)品低溫保存或無菌生理鹽水封存后置于低溫條件下儲藏，即得成品。
進(jìn)一步地，所述的載體與包裹蛋白的質(zhì)量比為75-77:23-25。蛋黃卵磷脂鋯(ττ (EPC) 2)和大豆卵磷脂鋯(& (SPC) 2)作為脂質(zhì)體載體，具有以下的優(yōu)點(diǎn)1.脂質(zhì)體制備條件非常溫和，避免采用有機(jī)溶劑和熱超聲，有效地預(yù)防了蛋白質(zhì)分子的構(gòu)型變化和活力下降；2.脂質(zhì)體藥物與基質(zhì)、底物的分離過程簡單，離心和洗滌操作可方便地實(shí)現(xiàn)了脂質(zhì)體納米顆粒的純化；3.穩(wěn)定性高和機(jī)械強(qiáng)度適中的載體是保證脂質(zhì)體藥物對于溶劑和加熱等條件維持穩(wěn)定的前提；4.載體對蛋白質(zhì)藥物的吸附容量大，且通過條件選擇可進(jìn)行人為控制；5.載體與蛋白質(zhì)的幾何尺寸相似，吸附動力學(xué)同時兼具主動和被動2個過程，產(chǎn)品的制備周期短。脂質(zhì)體包裹的蛋白質(zhì)分別選擇治療型天然植物藥物、脂肪水解酶和免疫診斷試齊U，天然植物蛋白質(zhì)粗提物分別來自苦瓜種籽和何首烏，為核糖體失活I(lǐng)-型的抗癌藥物； 脂肪酶用于水解血液中膽固醇、甘油酯和非游離脂肪酸。本發(fā)明免使用水溶性聚合骨架的包裹基質(zhì)，在脂質(zhì)體制備中未使用任何有機(jī)溶劑、未進(jìn)行超聲處理等工藝條件，構(gòu)建這種藥物脂質(zhì)體具有重要的臨床、醫(yī)學(xué)意義，具有廣泛的開發(fā)應(yīng)用價值。脂質(zhì)體的制備方法采取水相懸浮吸附技術(shù)，在低溫和攪拌條件下制得人工產(chǎn)品， 載體粒度約為5nm，和蛋白質(zhì)大小具有相同的數(shù)量級。載體粒度小，導(dǎo)致脂質(zhì)體中蛋白含量大；同時，制備過程中存在主動和被動2種吸附作用。制備過程在一定的吸附動力學(xué)條件下實(shí)施，設(shè)計考察工藝，正交篩選并優(yōu)化動力學(xué)的影響因子。一方面有利于獲得組成穩(wěn)定、蛋白質(zhì)含量高的脂質(zhì)體產(chǎn)品；另一方面，有利于考察影響蛋白質(zhì)藥物緩釋的具體因素。脂質(zhì)體藥物在進(jìn)入體液環(huán)境后，鹽度、PH和脂質(zhì)體(蛋白質(zhì))濃度的梯度變化，藥物進(jìn)行有效釋放和傳遞。其中，蛋白質(zhì)分子的釋放過程呈現(xiàn)主動擴(kuò)散的特性；同時，穩(wěn)定的生理酶催化條件有效地促進(jìn)載體材料的降解，藥物釋放同時具有侵蝕的擴(kuò)散特性。本發(fā)明方法具有工藝簡單、條件溫和、重復(fù)性高等特點(diǎn)，采用的載體類型為蛋黃卵磷脂鋯^"(EPC)2或者大豆卵磷脂鋯^(SPC)2的納米球形顆粒，制備的重復(fù)性好且粒度分布均勻，載體對蛋白質(zhì)藥物、酶分子有很高的吸附容量，脂質(zhì)體中蛋白質(zhì)含量高達(dá) 22. 3-25. 7%，比常見人工脂質(zhì)體的蛋白包裹效率高1-2個數(shù)量級，采用如附圖1的構(gòu)型吸附，蛋白質(zhì)分子均勻分布在聚合載體的疏水性特殊區(qū)域，避免形成蛋白質(zhì)團(tuán)聚結(jié)構(gòu)，這種定位、有序構(gòu)型分布有利于提高蛋白質(zhì)的生物可利用度；脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、結(jié)合牢固，其穩(wěn)定儲藏時間長達(dá)6-10個月，對熱的耐受性溫度高達(dá)60-80°C。


圖1為人工脂質(zhì)體復(fù)合物的構(gòu)型示意圖2為苦瓜蛋白質(zhì)藥物MAP30在蛋黃卵磷脂鋯(Zr (EPC)2)納米載體的吸附動力學(xué)實(shí)驗
結(jié)果；
圖3為苦瓜蛋白質(zhì)藥物MAP30在大豆卵磷脂鋯(Zr(SPC)2)納米載體的吸附動力學(xué)實(shí)驗
結(jié)果；
圖4為首烏蛋白質(zhì)藥物GAP31在蛋黃卵磷脂鋯(Zr (EPC)2)納米載體的吸附動力學(xué)實(shí)驗
結(jié)果；
圖5為首烏蛋白質(zhì)藥物GAP31在大豆卵磷脂鋯(Zr(SPC)2)納米載體的吸附動力學(xué)實(shí)驗結(jié)果；
圖6為脂肪酶Candida Rugosa Lipase (CRL)在蛋黃卵磷脂鋯(Zr (EPC) 2)納米載體的吸附動力學(xué)實(shí)驗結(jié)果；
圖7為脂肪酶Candida Rugosa Lipase (CRL)在大豆卵磷脂鋯(Zr (SPC) 2)納米載體的吸附動力學(xué)實(shí)驗結(jié)果；
圖8為牛血清白蛋白(BSA)在蛋黃卵磷脂鋯(Zr (EPC)2)納米載體的吸附動力學(xué)實(shí)驗結(jié)
果；
圖9為牛血清白蛋白(BSA)在大豆卵磷脂鋯(Zr (SPC)2)納米載體的吸附動力學(xué)實(shí)驗結(jié)^ ο實(shí)施例1
制備苦瓜蛋白MAP30與蛋黃卵磷脂鋯& (EPC)2的復(fù)合脂質(zhì)體苦瓜蛋白(來自種子)粗提物，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳確認(rèn)分子量為30 kDa，準(zhǔn)確稱量6. 8 mg MAP30溶解在1. 0 ml 磷酸鹽緩沖液(pH 7.2，10 mM + 100 mM NaCl)中保存?zhèn)溆?；蛋黃卵磷脂鋯納米載體(5nm， 球形顆粒)依專利(CN102107131A)中方法制備。準(zhǔn)確稱量201. 6 μg & (EPC) 2顆粒載體，力口入1.49 ml磷酸鹽緩沖液(pH 7. 2)，在4 °C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.01 ml MAP30 蛋白儲備液，分別攪拌0. 5,1. 0,4. 0,7. 0,10. 0,12. 0,15. 0,18. 0、 20. 0和24. 0小時，高速離心(12000 rpm)20min后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復(fù)3次，合并上清液測定殘余蛋白質(zhì)量，確定最佳吸附時間。準(zhǔn)確稱量201. 6 μg Zr (EPC) 2顆粒載體，分別加入1. 49 ml不同pH磷酸鹽緩沖液 CpH 5. 00,5. 49,5. 89,6. 39,6. 92,7. 56,8. 06,8. 52,9. 02 和 9. 90)，在 4 0C 條件下高速攪拌 (3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.01 ml MAP30蛋白儲備液，攪拌15. 0小時，高速離心(12000 rpm)20min后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml相應(yīng)pH磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復(fù)3次，合并上清液測定殘余蛋白質(zhì)量，確定最佳吸附酸度。分別稱量12. 6,37. 8,63. 0,75. 6,100. 8,126. 0,138. 6,165. 0,189. 0,201. 6,226. 8 和252.0 μg Zr (EPC)2顆粒載體，加入1.49 ml磷酸鹽緩沖溶液(pH 8. 52)，在4 °C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.01 ml MAP30蛋白儲備液，攪拌15. 0 小時，高速離心(12000 rpm) 20min后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml磷酸鹽緩沖溶液 CpH 8. 52)洗滌后離心，重復(fù)3次，合并上清液測定殘余蛋白質(zhì)量，計算蛋白質(zhì)吸附容量。實(shí)例1人工脂質(zhì)體產(chǎn)品
冷凍干燥3天得產(chǎn)品白色粉末，不溶于水和極性有機(jī)溶劑；最大蛋白質(zhì)含量對應(yīng)的吸附時間為15小時，最佳pH 8. 52，蛋白質(zhì)的最大百分含量M.0 士 1. 0% ；在注射生理鹽水和磷酸鹽緩沖液中分散后得無色透明懸浮液；固相條件下，蛋白質(zhì)熱脫附溫度為80 0C (5小時以內(nèi))；在模擬體外的生理條件下，脂質(zhì)體穩(wěn)定(蛋白質(zhì)脫附率< 5%)的時間達(dá)9個月； 用于核糖體失活型高效抗癌藥物穩(wěn)定劑型的構(gòu)建和開發(fā)，能夠用于如I-型HIV的治療。圖2為苦瓜蛋白質(zhì)藥物MAP30在蛋黃卵磷脂鋯(Zr (EPC)2)納米載體的吸附動力學(xué)實(shí)驗結(jié)果；其中實(shí)驗條件T= 4 °C，攪拌速率3500 rpm，攪拌時間15 h，和磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.52，10mM)。Ce和X分別表示上清液蛋白質(zhì)殘余濃度和蛋白吸附量占總蛋白量的比例。實(shí)施例2制備苦瓜蛋白MAP30與大豆卵磷脂鋯& (SPC)2的復(fù)合脂質(zhì)體準(zhǔn)確稱量苦瓜蛋白6. 8 mg溶解在1. 0 ml磷酸鹽緩沖液(pH 7. 2，10 mM + 100 mM NaCl)中保存?zhèn)溆?；大豆卵磷脂鋯納米載體(5nm，球形顆粒)依專利(CN102107131A)中方法制備。準(zhǔn)確稱量201. 6 μg &(SPC)2顆粒載體，加入1.49 ml磷酸鹽緩沖液(pH 7. 2)，在4 °C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0. 01 ml MAP30蛋白儲備液，分別攪拌0. 5,1. 0,4. 0,7. 0、 10. 0,12. 0,15. 0,18. 0,20. 0 和 24. 0 小時，高速離心(12000 rpm) 20min 后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復(fù)3次，合并上清液測定殘余蛋白質(zhì)量， 確定最佳吸附時間。準(zhǔn)確稱量201. 6 Pg &(SPC)2 顆粒載體，分別加入 pH 為 5. 00、5. 49、5. 89、6. 39、 6. 92,7. 56,8. 06,8. 52,9. 02和9. 90磷酸鹽緩沖液(1. 49 ml),在4 °C條件下高速攪拌 (3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.01 ml MAP30蛋白儲備液，攪拌15. 0小時，高速離心(12000 rpm)20min后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml相應(yīng)pH磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復(fù)3次，合并上清液測定殘余蛋白質(zhì)量，確定最佳吸附酸度。分別稱量12. 6,37. 8,63. 0,75. 6,100. 8,126. 0,138. 6,165. 0,189. 0,201. 6,226. 8 和252.0 μg Zr (SPC)2顆粒載體，加入1.49 ml磷酸鹽緩沖溶液(pH 9. 02)，在4 °C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.01 ml MAP30蛋白儲備液，攪拌15. 0 小時，高速離心(12000 rpm) 20min后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml磷酸鹽緩沖溶液 CpH 9. 02)洗滌后離心，重復(fù)3次，合并上清液測定殘余蛋白質(zhì)量，計算蛋白質(zhì)吸附容量。實(shí)例2人工脂質(zhì)體產(chǎn)品
冷凍干燥3天得產(chǎn)品白色粉末，不溶于水和極性有機(jī)溶劑；產(chǎn)品中蛋白質(zhì)吸附最大的時間為15小時，最佳pH 9. 02，蛋白質(zhì)的最大百分含量對.4 士 1. 2% ；在注射生理鹽水和磷酸鹽緩沖液中分散后得無色透明懸浮液；固相條件下，蛋白質(zhì)熱脫附溫度為72 0C (5小時以內(nèi))；在模擬體外的生理條件下，脂質(zhì)體穩(wěn)定(蛋白質(zhì)脫附率彡5%)的時間達(dá)6個月；用于核糖體失活型高效抗癌藥物穩(wěn)定劑型的構(gòu)建和開發(fā)，用于I-型HIV的治療。附圖3為苦瓜蛋白質(zhì)藥物MAP30在大豆卵磷脂鋯(Zr (SPC)2)納米載體的吸附動力學(xué)實(shí)驗結(jié)果。實(shí)驗條件T= 4 °C，攪拌速率3500 rpm，攪拌時間15 h，和磷酸鹽緩沖溶液 (pH 9.02，10mM)。Ce和X分別表示上清液蛋白質(zhì)殘余濃度和蛋白吸附量占總蛋白量的比例。實(shí)施例3
制備首烏蛋白GAP31與蛋黃卵磷脂鋯&(EPC)2的復(fù)合脂質(zhì)體首烏蛋白粗提物來自何首烏，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳確認(rèn)分子量為31 kDa。準(zhǔn)確稱量5. 8 mg GAP31溶解在1. 0 ml 磷酸鹽緩沖液(pH 7.2，10 mM + 100 mM NaCl)中保存?zhèn)溆茫坏包S卵磷脂鋯納米載體(5nm， 球形顆粒)依專利(CN102107131A)中方法制備。準(zhǔn)確稱量201. 6 μg & (EPC)2顆粒載體，力口入1.49 ml磷酸鹽緩沖液(pH 7. 2)，在4 °C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入 0.01 ml GAP31 蛋白儲備液，分別攪拌 0. 5、1. 0、4. 0、7. 0、10. 0、12. 0、15. 0、18. 0、 20. 0和24. 0小時，高速離心(12000 rpm)20min后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復(fù)3次，合并上清液測定殘余蛋白質(zhì)量，確定最佳吸附時間。準(zhǔn)確稱量201. 6 μg Zr (EPC) 2顆粒載體，分別加入1. 49 ml不同pH磷酸鹽緩沖液 CpH 4. 50,5. 00,5. 49,5. 89,6. 39,6. 98,7. 56,8. 06,8. 52,9. 02 和 9. 90)，在 4。(條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0. 01 ml GAP31蛋白儲備液，攪拌20. 0小時，高速離心(12000 rpm) 20min后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml相應(yīng)pH磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復(fù)3次，合并上清液測定殘余蛋白質(zhì)量，確定最佳吸附酸度。分別稱量12. 6,37. 8,63. 0,75. 6,100. 8,126. 0,138. 6,165. 0,189. 0,201. 6,226. 8 和252.0 μg Zr (EPC)2顆粒載體，加入1.49 ml磷酸鹽緩沖溶液(pH 5. 00)，在4 °C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.01 ml GAP31蛋白儲備液，攪拌20. 0 小時，高速離心(12000 rpm) 20min后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml磷酸鹽緩沖溶液 CpH 5. 00)洗滌后離心，重復(fù)3次，合并上清液測定殘余蛋白質(zhì)量，計算蛋白質(zhì)吸附容量。實(shí)例3人工脂質(zhì)體產(chǎn)品
冷凍干燥3天得產(chǎn)品白(淡黃)色粉末，不溶于水和極性有機(jī)溶劑；蛋白質(zhì)在載體吸附的穩(wěn)定時間為20小時，緩沖液的最佳pH=5. 00，產(chǎn)品中蛋白質(zhì)的最大百分含量23. 5 士 1. 2% ；在注射生理鹽水和磷酸鹽緩沖液中分散后得無(淺黃)色透明懸浮液；固相條件下，蛋白質(zhì)熱脫附溫度為78 0C (5小時以內(nèi))；在模擬體外的生理條件下，脂質(zhì)體穩(wěn)定(蛋白質(zhì)脫附率< 5%)的時間達(dá)10個月；用于核糖體失活型高效抗癌藥物穩(wěn)定劑型的構(gòu)建和開發(fā)， 殺滅如I-型HIV病毒。附圖4為首烏蛋白質(zhì)藥物GAP31在蛋黃卵磷脂鋯(Zr (EPC)2)納米載體的吸附動力學(xué)實(shí)驗結(jié)果。實(shí)驗條件T= 4 °C，攪拌速率3500 rpm，攪拌時間20 h，和磷酸鹽緩沖溶液 (pH 5.00，10mM)。Ce和X分別表示上清液蛋白質(zhì)殘余濃度和蛋白吸附量占總蛋白量的比例。實(shí)施例4
制備首烏蛋白GAP31與大豆卵磷脂鋯&(SPC)2的復(fù)合脂質(zhì)體首烏蛋白粗提物來自何首烏，SDS-PAGE凝膠電泳確認(rèn)其分子量為31 kDa。準(zhǔn)確稱量5. 8 mg GAP31溶解在1. 0 ml 磷酸鹽緩沖液(pH 7.2，10 mM + 100 mM NaCl)中保存?zhèn)溆?；大豆卵磷脂鋯納米載體(5nm， 球形顆粒)依專利(CN102107131A)中方法制備。準(zhǔn)確稱量201. 6 μg & (SPC)2顆粒載體，力口入1.49 ml磷酸鹽緩沖液(pH 7. 2)，在4 °C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入 0. 01 ml GAP31 蛋白儲備液，分別攪拌0. 5,1. 0,4. 0,7. 0,10. 0,12. 0,15. 0,18. 0、 20. 0和24. 0小時，高速離心(12000 rpm)20min后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復(fù)3次，合并上清液測定殘余蛋白質(zhì)量，確定最佳吸附時間。準(zhǔn)確稱量201. 6 μg Zr (SPC) 2顆粒載體，分別加入1. 49 ml不同pH磷酸鹽緩沖液 CpH 5. 00,5. 49,5. 89,6. 39,6. 98,7. 56,8. 06,8. 52,9. 02 和 9. 90)，在 4 0C 條件下高速攪拌 (3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.01 ml GAP31蛋白儲備液，攪拌15. 0小時，高速離心(12000 rpm)20min后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml相應(yīng)pH磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復(fù)3次，合并上清液測定殘余蛋白質(zhì)量，確定最佳吸附酸度。分別稱量12. 6,37. 8,63. 0,75. 6,100. 8,126. 0,138. 6,165. 0,189. 0,201. 6,226. 8 和252.0 μg Zr (SPC)2顆粒載體，加入1.49 ml磷酸鹽緩沖溶液(pH 5. 89)，在4 °C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.01 ml GAP31蛋白儲備液，攪拌15. 0 小時，高速離心(12000 rpm) 20min后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml磷酸鹽緩沖溶液 CpH 5. 89)洗滌后離心，重復(fù)3次，合并上清液測定殘余蛋白質(zhì)量，計算蛋白質(zhì)吸附容量。實(shí)例4人工脂質(zhì)體產(chǎn)品冷凍干燥3天得產(chǎn)品白(淺黃)色粉末，不溶于水和極性有機(jī)溶劑；蛋白質(zhì)在載體吸附的穩(wěn)定時間為15小時，緩沖液的最佳pH=5. 89，產(chǎn)品中蛋白質(zhì)的最大百分含量23. 8 士 1. 2% ；在注射生理鹽水和磷酸鹽緩沖液中分散后得無(淺黃)色透明懸浮液；固相條件下，蛋白質(zhì)熱脫附溫度為75 0C (5小時以內(nèi))；在模擬體外的生理條件下，脂質(zhì)體穩(wěn)定(蛋白質(zhì)脫附率< 5%)的時間達(dá)8個月；用于核糖體失活型高效抗癌藥物穩(wěn)定劑型的構(gòu)建和開發(fā)，滴注殺滅如I-型HIV等病毒。附圖5為首烏蛋白質(zhì)藥物GAP31在大豆卵磷脂鋯(Zr (SPC)2)納米載體的吸附動力學(xué)實(shí)驗結(jié)果。實(shí)驗條件T= 4 °C，攪拌速率3500 rpm，攪拌時間15 h，和磷酸鹽緩沖溶液 (pH 5.89，10mM)。Ce和X分別表示上清液蛋白質(zhì)殘余濃度和蛋白吸附量占總蛋白量的比例。實(shí)施例5
制備脂肪酶CRL與蛋黃卵磷脂鋯^(EPC)2的復(fù)合脂質(zhì)體脂肪酶Rugosa Lipase, CRL)購自Sigma公司，其中蛋白質(zhì)含量為2. 84% (質(zhì)量百分比)，SDS-PAGE凝膠電泳確認(rèn)分子量約為60 kDa。準(zhǔn)確稱量120. 42 mg粗酶溶解在磷酸鹽緩沖液(pH 7.2，10 mM + 100 mM NaCl)，離心分離并洗滌不溶物，上清液收集并調(diào)節(jié)總體積為1.0 ml (CRL濃度為 3.42 mg/ml)，保存?zhèn)溆?；蛋黃卵磷脂鋯納米載體(5nm，球形顆粒)依專利(CN102107131A) 中方法制備。準(zhǔn)確稱量900 μg & (EPC) 2顆粒載體，加入1.4 ml磷酸鹽緩沖液(pH 7.40)， 在4 °C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0. 1 ml CRL蛋白儲備液， 分別攪拌 0. 6,1. 5,3. 5,7. 5、11. 0,14. 0、19. 0 和 24. 0 小時，高速離心(12000 rpm)20min 后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復(fù)3次，合并上清液測定殘余蛋白質(zhì)量，確定最佳吸附時間。準(zhǔn)確稱量MO μg Zr (EPC) 2顆粒載體，分別加入1. 4 ml不同pH磷酸鹽緩沖液(pH 7.40、8.59、9.73和10.43)，在4 °C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.1 ml CRL蛋白儲備液，攪拌14.0小時，高速離心(12000 rpnO20min后分離上清液。 固體顆粒使用0. Iml相應(yīng)pH磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復(fù)3次，合并上清液測定殘余蛋白質(zhì)量，確定最佳吸附酸度。分別稱量50、100、200、350、500 和 750 Pg Zr (EPC) 2 顆粒載體，加入 1. 4 ml 磷酸鹽緩沖溶液(pH 8. 59)，在4 ° C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入 0.1 ml CRL蛋白儲備液，攪拌14.0小時，高速離心(12000 rpm) 20min后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml磷酸鹽緩沖溶液(pH 8. 59)洗滌后離心，重復(fù)3次，合并上清液測定殘余蛋白質(zhì)量，計算蛋白質(zhì)吸附容量。實(shí)例5人工脂質(zhì)體產(chǎn)品
冷凍干燥3天得產(chǎn)品白色粉末，不溶于水和極性有機(jī)溶劑；產(chǎn)品中蛋白質(zhì)吸附的穩(wěn)定時間為14小時，最佳pH 8. 59，蛋白質(zhì)的最大百分含量23. 9 士 1. 2% ；固相條件下，脂質(zhì)體中的蛋白質(zhì)熱脫附溫度為64 0C (5小時以內(nèi))；在磷酸緩沖溶液中，脂質(zhì)體穩(wěn)定(蛋白質(zhì)脫附率< 5%)的時間達(dá)6個月；用于構(gòu)建和開發(fā)新型、高效的生物酶，催化脂肪水解和酯交換合成的反應(yīng)。附圖6為脂肪酶Candida Rugosa Lipase (CRL)在蛋黃卵磷脂鋯(& (EPC) 2)納米載體的吸附動力學(xué)實(shí)驗結(jié)果。實(shí)驗條件T= 4 °C，攪拌速率3500 rpm，攪拌時間14 h，和磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.59，10mM)。Ce和X分別表示上清液蛋白質(zhì)殘余濃度和蛋白吸附量占總蛋白量的比例。實(shí)施例6
制備脂肪酶CRL與大豆卵磷脂鋯^(SPC)2的復(fù)合脂質(zhì)體脂肪酶Rugosa Lipase, CRL)購自Sigma公司，蛋白質(zhì)的質(zhì)量百分比為2. 84%，SDS-PAGE凝膠電泳確認(rèn)分子量約為60 kDa。準(zhǔn)確稱量120. 42 mg粗酶溶解在磷酸鹽緩沖液(pH 7.2，10 mM + 100 mM NaCl)，離心分離并洗滌不溶物，上清液收集并調(diào)節(jié)總體積為1.0 ml (CRL濃度為3. 42 mg/ ml)，保存?zhèn)溆?；大豆卵磷脂鋯納米載體(5nm，球形顆粒)依專利(CN102107131A)中方法制備。準(zhǔn)確稱量900 μg & (SPC)2顆粒載體，加入1.4 ml磷酸鹽緩沖液(pH 7. 40)，在4冗條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.1 ml CRL蛋白儲備液，分別攪拌 0. 6,1. 5,3. 5,7. 5、11. 0,14. 0,19. 0 和 24. 0 小時，高速離心(12000 rpm)20min 后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復(fù)3次，合并上清液測定殘余蛋白質(zhì)量，確定最佳吸附時間。準(zhǔn)確稱量1. 26 mg & (SPC)2顆粒載體，分別加入1. 4 ml不同pH磷酸鹽緩沖液(pH 7.40、8.59、9.73和10.43)，在4 °C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.1 ml CRL蛋白儲備液，攪拌19. 0小時，高速離心(12000 rpnO20min后分離上清液。 固體顆粒使用0. Iml相應(yīng)pH磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復(fù)3次，合并上清液測定殘余蛋白質(zhì)量，確定最佳吸附酸度。分別稱量50、100、200、350、500 和 750 Pg Zr (SPC) 2 顆粒載體，加入 1. 4 ml 磷酸
鹽緩沖溶液(pH 8. 59)，在4 ° C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入 0.1 ml CRL蛋白儲備液，攪拌19.0小時，高速離心(12000 rpm) 20min后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml磷酸鹽緩沖溶液(pH 8. 59)洗滌后離心，重復(fù)3次，合并上清液測定殘余蛋白質(zhì)量，計算蛋白質(zhì)吸附容量。實(shí)例6人工脂質(zhì)體產(chǎn)品
冷凍干燥3天得產(chǎn)品白色粉末，不溶于水和極性有機(jī)溶劑；產(chǎn)品中蛋白質(zhì)吸附的穩(wěn)定時間為19小時，最佳pH 8. 59，蛋白質(zhì)的最大百分含量1 士 1. ;固相條件下，脂質(zhì)體中的蛋白質(zhì)熱脫附溫度為60 0C (5小時以內(nèi))；在磷酸緩沖溶液中，脂質(zhì)體穩(wěn)定(蛋白質(zhì)脫附率< 5%)的時間達(dá)6個月；用于構(gòu)建和開發(fā)新型、高效的生物催化劑，促進(jìn)脂肪水解和酯交換合成的反應(yīng)。附圖7為脂肪酶Candida Rugosa Lipase (CRL)在大豆卵磷脂鋯(Ir (SPC) 2)納米載體的吸附動力學(xué)實(shí)驗結(jié)果。實(shí)驗條件T= 4 °C，攪拌速率3500 rpm，攪拌時間19 h，和磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.59，10mM)。Ce和X分別表示上清液蛋白質(zhì)殘余濃度和蛋白吸附量占總蛋白量的比例。實(shí)施例7
制備牛血清白蛋白BSA與蛋黃卵磷脂鋯&(EPC)2的復(fù)合脂質(zhì)體牛血清白蛋白購自 Sigma公司，分子量為66. 5 kDa，蛋白質(zhì)含量為90%。準(zhǔn)確稱量3. 80 mg BSA溶解在1.0 ml 磷酸鹽緩沖液(pH 7. 2，10 mM + 100 mM NaCl)中保存?zhèn)溆?BSA濃度為3. 42 mg/ml)；蛋黃卵磷脂鋯納米載體(5nm，球形顆粒)依專利(CN102107131A)中方法制備。準(zhǔn)確稱量1. 1 mg Zr (EPC) 2顆粒載體，加入1.4 ml磷酸鹽緩沖液(pH 7. 2)，在4 ° C條件下高速攪拌(3500rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0. 1 ml BSA蛋白儲備液，分別攪拌0. 6、1. 5、3. 5、7. 5、 11. 0,14. 0,19. 0和24. 0小時，高速離心(12000 rpm)20min后分離上清液。固體顆粒使用
0. Iml磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復(fù)3次，合并上清液測定殘余蛋白質(zhì)量，確定最佳吸附時間。準(zhǔn)確稱量MO μg Zr (EPC) 2顆粒載體，分別加入1. 4 ml不同pH磷酸鹽緩沖液(pH 7.40、8.59、9.73和10.43)，在4 °C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.1 ml BSA蛋白儲備液，攪拌19.0小時，高速離心(12000 rpnO20min后分離上清液。 固體顆粒使用0. Iml相應(yīng)pH磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復(fù)3次，合并上清液測定殘余蛋白質(zhì)量，確定最佳吸附酸度。分別稱量40、80. 5、16U82、402. 5 和 603. 8 ^g Zr (EPC) 2 顆粒載體，加入 1. 4 ml 磷酸鹽緩沖溶液(pH 8. 59)，在4 ° C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.1 ml BSA蛋白儲備液，攪拌19.0小時，高速離心(12000 rpnO20min后分離上清液。 固體顆粒使用0. Iml磷酸鹽緩沖溶液(pH 8. 59)洗滌后離心，重復(fù)3次，合并上清液測定殘余蛋白質(zhì)量，計算蛋白質(zhì)吸附容量。實(shí)例7人工脂質(zhì)體產(chǎn)品
冷凍干燥3天得產(chǎn)品白色粉末，不溶于水和極性有機(jī)溶劑；產(chǎn)品中最大蛋白質(zhì)含量的吸附時間為19小時，最佳pH 8. 59，蛋白質(zhì)的最大百分含量對.5 士 1.2%;固相條件下，蛋白質(zhì)熱脫附溫度為70 0C (5小時以內(nèi))；在模擬體外的生理條件下，脂質(zhì)體穩(wěn)定(蛋白質(zhì)脫附率(5%)的時間達(dá)9個月；用于構(gòu)建和開發(fā)新型、穩(wěn)定的免疫診斷試劑，用于生物和醫(yī)學(xué)檢測。附圖8為牛血清白蛋白(BSA)在蛋黃卵磷脂鋯(Zr(EPC)2)納米載體的吸附動力學(xué)實(shí)驗結(jié)果。實(shí)驗條件T= 4 °C，攪拌速率3500 rpm，攪拌時間19 h，和磷酸鹽緩沖溶液(pH 8. 59，10mM)。Ce和X分別表示上清液蛋白質(zhì)殘余濃度和蛋白吸附量占總蛋白量的比例。實(shí)施例8
制備牛血清白蛋白BSA與大豆卵磷脂鋯&(SPC)2的復(fù)合脂質(zhì)體牛血清白蛋白購自 Sigma公司，分子量為66. 5 kDa，蛋白質(zhì)含量為90%。準(zhǔn)確稱量3. 80 mg BSA溶解在1.0 ml 磷酸鹽緩沖液(pH 7. 2，10 mM + 100 mM NaCl)中保存?zhèn)溆?BSA濃度為3. 42 mg/ml)；大豆卵磷脂鋯納米載體(5nm，球形顆粒)依專利(CN102107131A)中方法制備。準(zhǔn)確稱量1. 1 mg Zr (SPC) 2顆粒載體，加入1.4 ml磷酸鹽緩沖液(pH 7. 2)，在4 ° C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0. 1 ml BSA蛋白儲備液，分別攪拌0. 6、1. 5、3. 5、7. 5、 11. O、14. O、19. O和24. O小時，高速離心(12000 rpm)20min后分離上清液。固體顆粒使用 0. Iml磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復(fù)3次，合并上清液測定殘余蛋白質(zhì)量，確定最佳吸附時間。準(zhǔn)確稱量1. 26 mg & (SPC)2顆粒載體，分別加入1. 4 ml不同pH磷酸鹽緩沖液(pH 7.40、8.59、9.73和10.43)，在4 °C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.1 ml BSA蛋白儲備液，攪拌Μ. O小時，高速離心(12000 rpnO20min后分離上清液。 固體顆粒使用0. Iml相應(yīng)pH磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復(fù)3次，合并上清液測定殘余蛋白質(zhì)量，確定最佳吸附酸度。分別稱量40、80. 5、16U82、402. 5 和 603. 8 μδ Zr (SPC) 2 顆粒載體，加入 1. 4 ml磷酸鹽緩沖溶液(pH 8. 59)，在4 ° C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.1 ml BSA蛋白儲備液，攪拌Μ. 0小時，高速離心(12000 rpnO20min后分離上清液。 固體顆粒使用0. Iml磷酸鹽緩沖溶液(pH 8. 59)洗滌后離心，重復(fù)3次，合并上清液測定殘余蛋白質(zhì)量，計算蛋白質(zhì)吸附容量。實(shí)例8人工脂質(zhì)體產(chǎn)品
冷凍干燥3天得產(chǎn)品白色粉末，不溶于水和極性有機(jī)溶劑；產(chǎn)品中蛋白質(zhì)吸附穩(wěn)定時間為M.0小時，最佳pH 8. 59，蛋白質(zhì)的最大百分含量對.2 士 1.2%;固相條件下，蛋白質(zhì)熱脫附溫度為68 0C (5小時以內(nèi))；在模擬體外的生理條件下，脂質(zhì)體穩(wěn)定(蛋白質(zhì)脫附率 ^ 5%)的時間達(dá)9個月；用于構(gòu)建新型、穩(wěn)定的生物和醫(yī)學(xué)免疫診斷試劑盒。附圖9為牛血清白蛋白(BSA)在大豆卵磷脂鋯(Zr(SPC)2)納米載體的吸附動力學(xué)實(shí)驗結(jié)果。實(shí)驗條件T= 4 °C，攪拌速率3500 rpm，攪拌時間M h，和磷酸鹽緩沖溶液(pH 8. 59，10mM)。Ce和X分別表示上清液蛋白質(zhì)殘余濃度和蛋白吸附量占總蛋白量的比例。
權(quán)利要求
1.一種人工脂質(zhì)體的制備方法，其特征是以納米球形顆粒的蛋黃卵磷脂鋯ττ (EPC) 2或者大豆卵磷脂鋯^(SPC)2作為載體，以苦瓜蛋白ΜΑΡ30、首烏蛋白GAP31、脂肪酶CRL、或者牛血清白蛋白BSA作為包裹蛋白，其中載體與包裹蛋白的質(zhì)量比為74. 3-77. 7:22. 3-25. 7， 制備時，在蛋黃卵磷脂鋯ττ (EPC) 2或者大豆卵磷脂鋯ττ (SPC) 2的載體材料中加入磷酸鹽緩沖溶液，在溫度為4°C，轉(zhuǎn)速為3500rpm的條件下攪拌得到無色、透明的分散液，將包裹蛋白溶解在磷酸鹽緩沖溶液中，然后緩慢滴加至分散液液中，在低溫條件下快速攪拌至形成穩(wěn)定的脂質(zhì)體，離心分離出蛋白質(zhì)后反復(fù)洗滌并離心，經(jīng)低溫冷凍干燥得固體產(chǎn)品，固體產(chǎn)品低溫保存或無菌生理鹽水封存后置于低溫條件下儲藏，即得成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人工脂質(zhì)體的制備方法，其特征是所述的載體與包裹蛋白的質(zhì)量比為75-77:23-25。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人工脂質(zhì)體的制備方法，屬于藥學(xué)領(lǐng)域，涉及一種蛋白質(zhì)藥物脂質(zhì)體的制備方法。以納米球形顆粒的蛋黃卵磷脂鋯或者大豆卵磷脂鋯作為載體，以苦瓜蛋白MAP30、首烏蛋白GAP31、脂肪酶CRL、或者牛血清白蛋白BSA作為包裹蛋白，其中載體與包裹蛋白的質(zhì)量比為74.3-77.7:22.3-25.7，制備時，在載體材料中加入磷酸鹽緩沖溶液，在溫度為4℃，轉(zhuǎn)速為3500rpm的條件下攪拌得到無色、透明的分散液，將包裹蛋白溶解在磷酸鹽緩沖溶液中，然后緩慢滴加至分散液液中，在低溫條件下快速攪拌至形成穩(wěn)定的脂質(zhì)體，離心分離出蛋白質(zhì)后反復(fù)洗滌并離心，經(jīng)低溫冷凍干燥即得成品。本發(fā)明方法具有工藝簡單、條件溫和、重復(fù)性高，蛋白質(zhì)吸附容量大，脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的特點(diǎn)。
文檔編號A61K38/38GK102552145SQ20121002325
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月2日
發(fā)明者喬元彪 申請人:呂梁學(xué)院