專利名稱：再生性組織支架的制作方法
再生性組織支架

本申請要求于2010.08. 10提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/372，339的優(yōu)先權。
本披露涉及用于治療組織或器官缺損或損傷的方法、混合物、以及套件，包括生產(chǎn)用于治療組織缺損的組織支架的方法、混合物、以及套件。
人的、動物的、以及合成的材料當前被用于增強組織或矯正組織缺損的醫(yī)療和外科手術中。為了某些目的，需要具有穩(wěn)定形狀的材料。在一些情況下，這種材料的遞送方式(例如，通過外科手術或通過注射)會是重要的。額外地，可能需要的是該材料不會遷移離開需要治療的位置的能力。
用于治療組織或器官缺損的不同現(xiàn)有裝置和方法已經(jīng)具有某些缺點。因此，對于治療組織或器官缺損的改進的裝置和方法存在需要。
某些實施方案包括一種方法(例如一種體外和/或體內(nèi)方法)，包括提供一種顆粒狀非細胞組織基質(zhì)(ATM)以及一種包括溶解于溶劑中的聚合物的溶液。該方法可以進一步包括將該溶液與該顆粒狀ATM混合以產(chǎn)生一種混合物，并且放置該混合物，與一種水性介質(zhì)相接觸。該溶劑可以從該混合物擴散，并且可以形成一種組織支架。
一些實施方案包括一種組織支架混合物，該組織支架混合物包括一種顆粒狀非細胞組織基質(zhì)(ATM)、一種聚合物、以及一種水可混溶的溶劑。當放置該混合物，與一種水性介質(zhì)接觸時，該水可混溶的溶劑可以能夠從該混合物擴散，以從該聚合物和ATM形成組織支架。
附圖簡要說明


圖1是顯示了用于制備一種組織支架的方法的流程圖。
圖2展示了根據(jù)某些實施方案，一種組織支架在一個缺損中的植入。
圖3A是如在實例I中所述，在400x放大倍數(shù)下，蘇木精和伊紅染色四周的、包括PCL的皮下外植體。
圖3B是根據(jù)實例I中所述方法，在400x放大倍數(shù)下，蘇木精和伊紅染色四周的、來自包括PCL、pADM、以及二噁烷的可注入組織支架的皮下外植體。
圖3C是根據(jù)實例I中所述方法，在400x放大倍數(shù)下，蘇木精和伊紅染色四周的、來自包括PCL、pADM、以及NMP的可注入組織支架的皮下外植體。
圖3D是如在實例I中所述，在400x放大倍數(shù)下，蘇木精和伊紅染色四周的、包括P4HB的皮下外植體。
圖3E是根據(jù)實例I中所述方法，在400x放大倍數(shù)下，蘇木精和伊紅染色四周的、來自包括P4HB、pADM、以及二噁烷的可注入組織支架的皮下外植體。
圖3F是根據(jù)實例I中所述方法，在400x放大倍數(shù)下，蘇木精和伊紅染色四周的、來自包括P4HB、pADM、以及NMP的可注入組織支架的皮下外植體。
圖4A是如在實例I中所述，在400x放大倍數(shù)下，蘇木精和伊紅染色十二周的包括PCL的皮下外植體。
圖4B是根據(jù)實例I中所述方法，在400x放大倍數(shù)下，蘇木精和伊紅染色十二周的、來自包括PCL、pADM、以及二噁烷的可注入組織支架的皮下外植體。
圖4C是根據(jù)實例I中所述方法，在400x放大倍數(shù)下，蘇木精和伊紅染色十二周的、來自包括PCL、pADM、以及NMP的可注入組織支架的皮下外植體。
圖4D是如在實例I中所述，在400x放大倍數(shù)下，蘇木精和伊紅染色十二周的、包括P4HB的皮下外植體。
圖4E是根據(jù)實例I中所述方法，在400x放大倍數(shù)下，蘇木精和伊紅染色十二周的、來自包括P4HB、pADM、以及二噁烷的可注入組織支架的皮下外植體。
圖4F是根據(jù)實例I中所述方法，在400x放大倍數(shù)下，蘇木精和伊紅染色十二周的、來自包括P4HB、pADM、以及NMP的可注入組織支架的皮下外植體。
圖5A是根據(jù)實例2中所述方法，在20x放大倍數(shù)下，蘇木精和伊紅染色四周的、來自包括BHA、pADM、以及NMP的可注入組織支架的股骨髁外植體。
圖5B是根據(jù)實例2中所述方法，在IOOx放大倍數(shù)下，蘇木精和伊紅染色四周的、來自包括BHA、pADM、以及NMP的可注入組織支架的股骨髁外植體。
圖5C是根據(jù)實例2中所述方法，在400x放大倍數(shù)下，蘇木精和伊紅染色四周的、來自包括BHA、pADM、以及NMP的可注入組織支架的股骨髁外植體。
圖6是在將包括BHA、pADM、以及NMP的注入組織支架植入一個組織缺損中，十二周后股骨髁的圖像。
示例性實施方案的說明
在本申請中，單數(shù)的使用包括復數(shù)，除非另外特別說明。在本申請中，除非另有說明，“或”的使用表示“和/或”。此外，術語“包括”(“including”)以及其他形式如“包括”(“includes”)和“包括”(“included”)的使用并不是限制性的。
在此使用的節(jié)標題僅是為了組織目的并且不應該被解釋為對所述主題的限制。在本申請中所引用的所有文件或文件的部分，包括但不局限于專利、專利申請、論文、書籍、和專著，特此出于任何目的通過引用將其全部內(nèi)容清楚地結合。
應當理解的是，在此說明的益處和優(yōu)點可以涉及一個實施方案或可以涉及若干實施方案。將進一步理解的是，對‘一個/ 一種’(‘a(chǎn)n’)物品的提及是指一個/ 一種或多個/多種那些物品。
在此所述的方法的步驟可以按任何適合的順序進行，或在適當情況下同時進行。
在適當情況下，任何在此所述的實例的方面可以與任何所述的其他實例的方面相組合，從而形成具有可比較的特性或不同特性的并且著手解決同樣或不同問題的其他實例。
應當理解的是，在此優(yōu)選實施方案的說明僅僅是通過舉例而給出的，并且本領域的那些技術人員可以作出不同修改。在此的說明書、實例、以及數(shù)據(jù)提供了本發(fā)明的示例性實施方案的結構和用途的完整說明。雖然在此已經(jīng)以某種具體程度、或參考一個或多個單獨的實施方案說明了本發(fā)明的不同實施方案，但是本領域的那些技術人員可以對所披露的實施方案作出許多改變而不偏離本發(fā)明的范圍。
術語“非細胞組織基質(zhì)”(ATM)，如在此使用，通常是指基本上沒有細胞和/或細胞組分的任何組織基質(zhì)。皮膚、皮膚部分(例如，真皮)和其他組織如血管、心臟瓣膜、筋膜、軟骨、骨、神經(jīng)、以及結締組織可以用來產(chǎn)生本披露范圍內(nèi)的無細胞基質(zhì)(例如通過除去細胞和/或細胞組分)。可以按多個方式測試或評估無細胞組織基質(zhì)，以確定它們是否基本上不含細胞和/或細胞成分。例如，可以使用光學顯微鏡檢查處理的組織以確定是否殘留有細胞(活的或死的)和/或細胞組分。此外，可以使用某些測定法來鑒定細胞或細胞組分的存在。例如，DNA或其他核酸測定法可以用來定量組織基質(zhì)內(nèi)的剩余細胞核材料。通常，剩余DNA或其他核酸的缺失將指示完全去細胞化(S卩，去除細胞和/或細胞組分)。最后，可以使用鑒定細胞特異性組分(例如，表面抗原)的其他測定法來確定組織基質(zhì)是否為無細胞的。
本披露的組織支架可以包括一種具有用來支持組織再生的生物學能力的ATM。在一些實施方案中，這些組織支架可以支持細胞向內(nèi)生長和分化。例如，這些支架可以用于組織向內(nèi)生長、矯形外科、牙周應用、組織重塑、或組織恢復。在一個實施方案中，正如成纖維細胞樣細胞和血管的存在所證明的，這些組織支架產(chǎn)生了一種再生性組織反應。
在不同的實施方案中，這些組織支架可以用于在很多不同解剖部位上的治療，·并且可以用于一系列廣泛的應用中。某些示例性的應用包括，但不局限于吸收性敷件、真皮再生(例如用于治療所有類型的潰瘍和燒傷)、神經(jīng)再生、軟骨再生、結締組織再生或修復、骨再生、傷口 /泡沫襯料、整合的繃帶敷件、用于皮膚移植物的基質(zhì)或基底、血管再生、整容外科、金屬和/或聚合物植入物的涂層(例如，用于增加植入物的整合性和生物相容性)、以及缺失組織的替換(如在創(chuàng)傷、乳房縮小術、乳房切除術、乳房腫瘤切除術、腮腺切除術、或腫瘤切除后)。
與單獨用來生產(chǎn)該支架的一種或多種聚合物相比，當植入動物中時，這些組織支架引起降低的免疫或炎癥應答?？梢允褂枚鄠€方法來測試該組織支架在宿主中的作用。例如，在一些實施方案中，可以通過測量對該植入支架的免疫或炎癥應答，來測試該組織支架在宿主中的作用。可以通過多個方法(包括組織學方法)，測量對該組織支架的免疫或炎癥應答。例如，外植支架可以被染色并在顯微鏡下觀察，用于組織學評估，如以下進一步所述。在一些實施方案中，可以通過測量炎癥細胞(如白細胞)的數(shù)目，證明對該支架的免疫或炎癥應答。對該支架的弱化的免疫或炎癥應答可以與減少的炎癥細胞數(shù)目相關聯(lián)，如以下進一步所述。例如，可以通過設計為鑒定淋巴細胞、巨噬細胞以及中性粒細胞的免疫組化染色方法，來測量炎癥細胞。免疫組化方法也可以用來確定炎癥細胞因子(包括白細胞介素-1、腫瘤壞死因子-α (TNF-α )、以及轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β))的存在。
在不同實施方案中，本披露的組織支架可以被用來治療廣泛的任何失調(diào)。組織缺損可起因于許多原因，包括，例如先天畸形、跌打損傷、感染、以及腫瘤切除。這些組織支架可以用來治療肌骨骼缺損，例如，作為一種關節(jié)移植物以支持軟骨再生。這些組織支架還可以被用來治療任何軟組織中的缺損，例如，連接、支持、或圍繞其他結構的組織以及身體器官。軟組織可以是任何非骨組織。
這些組織支架可以被用來治療許多不同器官系統(tǒng)中的軟組織。這些器官系統(tǒng)可以包括，但不局限于，肌肉系統(tǒng)、生殖泌尿系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)(gastroenterological system)、皮膚系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、以及呼吸系統(tǒng)。這些組織支架對于胸部和腹壁的結締組織(包括筋膜、一種圍繞肌肉、骨、以及關節(jié)的特殊層)的治療，以及用于在泌尿?qū)W的、婦科學的、以及腸胃病學的解剖學方面的組織薄弱的修復和增強也可以是有用的。在一些實施方案中，需要治療的組織或器官可以選自下組，該組由以下各項組成皮膚、骨、軟骨、半月板、真皮、心肌、骨膜、動脈、靜脈、胃、小腸、大腸、膈、肌腱、韌帶、神經(jīng)組織、橫紋肌、平滑肌、膀胱、尿道、輸尿管、以及牙銀。
圖1展示了用于制備一種組織支架的步驟。這些支架可以包括一種顆粒狀ATM(步驟100)。在一些實施方案中，該ATM可衍生自，例如，真皮、軟骨、骨、脫礦骨、血管、心臟瓣膜、筋膜、或神經(jīng)結締組織。顆粒狀ATM的制備在下文更詳細描述。在一些實施方案中，該顆粒狀ATM包括大小均勻的顆粒。該顆粒狀ATM可以包括一種真皮ATM。在一些實施方案中，該真皮ATM是一種人組織基質(zhì)。在一些實施方案中，該真皮ATM是一種豬組織基質(zhì)。在一些實施方案中，該顆粒狀ATM是一種可以衍生自人軟骨的軟骨組織基質(zhì)。在一些實施方案中，該軟骨組織基質(zhì)衍生自豬軟骨。在一些實施方案中，該顆粒狀ATM包含一種骨組織基質(zhì)。在一些實施方案中，該骨組織基質(zhì)衍生自人骨。在一些實施方案中，該骨組織基質(zhì)衍生自豬骨。
可以選擇該ATM以提供多種不同的生物學或力學特性。例如，可以選擇該ATM以允許細胞向內(nèi)生長和重塑，以便允許正常發(fā)現(xiàn)于基質(zhì)植入部位處的組織的再生。例如，該ATM，當植在軟骨上或軟骨內(nèi)時，可以被選擇為允許沒有過度纖維化或沒有疤痕形成的軟骨再生。此外，可以選擇該ATM以限制過度的炎癥反應、并且以產(chǎn)生與原始宿主組織相似的組織。在一些實施方案中，該ATM包括膠原、彈性蛋白、以及血管溝。ATM的實例在下文進一步討論。
此外，這些組織支架可以包括一種或多種聚合物材料，該一種或多種聚合物材料可以選自多個聚合物類型。如在此所使用，這些聚合物材料可以包括合成聚合物和/或天然存在的聚合物。此外，這些聚合物材料可以包括單獨的聚合物和/或聚合物混合物(共聚物)。在一些實施方案中，這些聚合物材料可以包括聚乙二醇、聚丙交酯、聚二噁烷(或其他聚醚酯)、聚丙交酯乙交酯共聚物、和/或聚羥基脂肪酸酯。例如，在某些實施方案中，這些聚合物材料可以包括聚羥基脂肪酸酯，例如，聚羥基丁酸酯(例如，聚-3-羥基丁酸酯、聚-4-羥基丁酸酯(P4HB))、聚羥基戊酸酯、聚羥基己酸酯、聚羥基辛酸酯、或三亞甲基碳酸酯?？商娲鼗蝾~外地，該聚合物材料可以包括聚己酸內(nèi)酯(PCL)和/或透明質(zhì)酸衍生物(例如酯、酸酐、等)，例如透明質(zhì)酸的芐酯衍生物(BHA)。在某些實施方案中，這些組織支架中的聚合物材料可以為ATM提供一種結構。該結構可以增加植入物的整合性、生物相容性、以及穩(wěn)定性，并且可以防止植入物遷移離開治療部位。此外，與一種僅包括聚合物的植入物相比較，將具有聚合物的ATM包含在組織支架中，可以經(jīng)由弱化或降低免疫或炎癥應答來增加該聚合物的可接受性。
在一些實施方案中，可以將該聚合物溶解于一種適合的溶劑中(步驟120)以形成一種聚合物溶液。如在此使用，該溶劑可以包括溶劑混合物。在某些實施方案中，為了使溶劑具有適當?shù)姆磻?，可以基于所使用的聚合物?或該溶劑將混合于其中或從其中釋放的環(huán)境，而選擇該溶劑從而避免不希望的反應。例如，在一些實施方案中，可以使用具體聚合物在其中是可溶的任何溶劑。在某些實施方案中，該溶劑可以選擇為生物相容的并且水可混溶的。這一選擇的溶劑還可以是微弱揮發(fā)的。在一些實施方案中，該溶劑可以包括，例如，二噁烷、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)JP /或二甲亞砜(DMSO)。將聚合物溶解在溶劑中可以提供一種適當粘度的溶液，以徹底接納與顆粒狀ATM的混合，并且協(xié)助該組合的植入(例如通過注射、填裝入一個部位中，等)?？梢詫υ摼酆衔餄饪s物進行操縱以產(chǎn)生一種更大或更小粘性的混合物。
作為一個實例，在一些實施方案中，PCL可以溶解在二噁烷和/或NMP中。在某些實施方案中，溶解在二噁烷和/或NMP中的PCL可以約為5%-30% (w/v)0在一個另外的實施方案中，溶解在二噁烷和/或NMP中的PCL可以是5%、8%、10%、12%、15%、18%、20%、25%、或30% (w/v) ;5%至30% (w/v);或10%至20% (w/v)以及它們之間的任何值。
在其他實施方案中，P4HB可以溶解在二噁烷和/或NMP中。在一些實施方案中，溶解在二噁烷和/或NMP中的P4HB可以約為5%-40% (w/v)。在一個另外的實施方案中，溶解在二噁烷和 / 或 NMP 中的 P4HB 可以是 5%、8%、10%、12%、15%、18%、20%、25%、30% (w/V)、或40% (w/v);5%至40% (w/v);或10%至30% (w/v)以及它們之間的任何值。
在其他實施方案中，BHA可以溶解在DMSO和/或NMP中。在一些實施方案中， 溶解在DMSO和/或NMP中的BHA可以約為5%-50% (w/v)。在一個另外的實施方案中，溶解在 DMSO 和 / 或 NMP 中的 BHA 可以是 5%、8%、10%、12%、15%、18%、20%、25%、30%、40%、或 50%(w/v) ；5% 至 50% (w/v) ；5% 至 40% (w/v) ； 10% 至 40% (w/v);或 10% 至 30% (w/v)以及它們之間的任何值。
考慮到體內(nèi)周轉(zhuǎn)/持久性、生物力學特性、以及全面生物反應的操縱，這些支架材料中的每一種可以對終產(chǎn)物賦予不同的特性。
然后這些聚合物溶液可以與顆粒狀ATM混合(步驟130)。在一些實施方案中，可以對聚合物溶液的體積進行選擇，以在與顆粒狀ATM組合時提供聚合物總體的25%(w/w)的終濃度。可以基于用于形成組織支架的預期位置來選擇將該溶液與該顆粒狀ATM相混合的方法。例如，在一些實施方案中，該溶液可以在任何適合的容器中與顆粒狀ATM相混合。在其他實施方案中，可以在一個或多個注射器中，將該溶液以及顆粒狀ATM混合。例如，可以將該顆粒狀ATM放置在一個第一注射器中?？梢詫⑺Ｍw積的聚合物溶液吸入一個第二注射器中。然后可以將該第一和第二注射器偶合，并且在各自之中的材料可以通過在注射器之間傳遞材料來混合。然后將所得最終混合物轉(zhuǎn)移至單個注射器中。然后將一個針或套管附接至該注射器以協(xié)助混合物的注射
在一個實施方案中，可以將組織支架混合物的一些或全部組分進行預混合或預包裝在一起。例如，在一些實施方案中，可以提供一種已溶解在溶劑中的、所希望濃度的聚合物用于制備組織支架混合物。類似地，在一些實施方案中，可以將一種具有溶解在溶劑中的聚合物的溶液與一種顆粒狀ATM預混合、以所希望的量進行包裝、并進行儲存供以后使用。因此，可以在形成組織支架之前、和/或在儲存、裝運、或出售之前，制備最終的組織支架混合物。
然后可以放置顆粒狀ATM、聚合物、以及溶劑的最終混合物，與一種水性介質(zhì)相接觸(步驟140)，允許該溶劑從該混合物擴散，以從該聚合物和ATM形成一種組織支架。在一些體內(nèi)實施方案中，可以將該最終混合物放置在組織部位之中、之上、或鄰近處。如以上討論，組織支架可以用于一系列應用中，并且用于很多不同解剖部位的治療。例如，在一些實施方案中，可以將該最終混合物放置在軟組織內(nèi)的組織缺損之中。在原位放置該混合物時，該溶劑可以擴散入周圍組織或細胞間隙中。
在體外實施方案中，在植入前，可以放置該最終混合物，與一種水性介質(zhì)相接觸。例如，在一些實施方案中，可以將該最終混合物放置在具有所希望形狀的模具中。模具可以包括一個印pendorf管、一個金屬管、一個注射管、或組織或器官缺損(該組織支架將被植入其中)形式的一個模具。在此類實施方案中，可以將該最終混合物和/或該模具暴露于一種水性介質(zhì)，以協(xié)助溶劑從該混合物擴散。例如，可以對該最終混合物和/或該模具進行漂洗、洗滌、和/或浸泡在浴中，以除去在最終混合物中的任何或所有溶劑。
該溶劑的擴散可以留下ATM和聚合物的分布一致的組織支架。生成的組織支架可以由包裹在一種聚合物/合成支持支架中的再生性組織顆粒組成。在一些實施方案中，該組織支架可以在機械應力下具有一種穩(wěn)定的三維形狀。如以上討論，可以選擇支架材料以達到具有具體生物力學特性的組織支架。因此，取決于預期的用途，組織支架可以是剛性的、彈性的(elastic)、有回彈性的(resilient)、和/或粘彈性的。在一些實施方案中，可以選擇支架材料以形成具有與靶位置處的組織的剛度基本上類似的剛度的組織支架。此外，在一些實施方案中，該組織支架還可以抵抗從目標位置遷移。
圖2提供了將組織支架植入以治療長骨500(例如股骨或肱骨)中的缺損505的示例性圖示。在不同實施方案中，可以將支架180a植入缺損505的位置中。在一些實施方案中，可以通過經(jīng)針或套管510的注射來植入組織支架180a，該針或套管偶合到提供組織支架材料的注射器515上。
非細胞組織基質(zhì)
術語“非細胞組織基質(zhì)”(ATM)，如在此使用，通常是指基本上沒有細胞和/或細胞組分的任何組織基質(zhì)。皮膚、皮膚部分(例如，真皮)和其他組織例如血管、心臟瓣膜、筋膜、軟骨、骨和神經(jīng)結締組織可以用來產(chǎn)生處于本披露范圍內(nèi)的無細胞基質(zhì)。可以按多個方式測試或評估無細胞組織基質(zhì)以確定它們是否基本上不含細胞和/或細胞組分。例如，可以使用光學顯微鏡檢查處理的組織以確定是否殘留有細胞(活的或死的)和/或細胞組分。另外，可以使用某些測定法來鑒定細胞或細胞組分的存在。例如，DNA或其他核酸測定法可以用來定量組織基質(zhì)內(nèi)的剩余細胞核材料。通常，剩余DNA或其他核酸的缺失將指示完全去細胞化(即，細胞和/或細胞組分的去除)。最后，可以使用鑒定細胞特異性組分(例如，表面抗原)的其他測定法來確定組織基質(zhì)是否為無細胞的。皮膚、皮膚部分(例如，真皮)和其他組織例如血管、心臟瓣膜、筋膜、軟骨、骨、和神經(jīng)結締組織可以用來產(chǎn)生處于本披露范圍內(nèi)的無細胞基質(zhì)。
通常，在生產(chǎn)ATM中涉及的步驟包括從一個供體(如人的尸體或動物來源)收獲組織，以及在保存生物和結構功能的條件下去除細胞。例如，希望的生物和結構功能包括支持細胞向內(nèi)生長和組織再生、提供機械支持(如為一個手術部位或缺損)、和/或防止過度免疫應答、炎癥、纖維化、和/或瘢痕形成的能力。在某些實施方案中，該方法包括化學處理以穩(wěn)定化組織并避免與除去細胞一起或在除去細胞之前的生物化學和結構降解。在不同實施方案中，穩(wěn)定化溶液阻止并且防止?jié)B透性、低氧性、自溶性和蛋白水解降解、保護免遭微生物污染、以及減少會伴隨含有例如平滑肌組分(例如，血管)的組織而發(fā)生的機械損傷。穩(wěn)定化溶液可以含有一種適當?shù)木彌_劑、一種或多種抗氧化劑、一種或多種腫脹劑(oncoticagent)、一種或多種抗生素、一種或多種蛋白酶抑制劑、和/或一種或多種平滑肌松弛劑。
然后將該組織放置在一種去細胞化溶液中，以從結構基質(zhì)中去除活細胞(例如上皮細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、以及成纖維細胞)，而不損壞ATM (例如膠原基質(zhì))的生物學和結構完整性?？梢酝ㄟ^多種方法測試ATM的完整性。例如，可以使用差示掃描量熱法來鑒定熱轉(zhuǎn)變溫度的變化，這些變化指示交聯(lián)(轉(zhuǎn)變溫度的升高)或膠原降解(轉(zhuǎn)變溫度的降低)。此外，電子顯微鏡可以證明正常膠原模式(collagen pattern)的變化,并且酶消化分析可以證明膠原損壞。此外，各種糖胺聚糖(如硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸)的損失可以指示組織基質(zhì)中的不良變化。
去細胞化溶液可以含有適當?shù)木彌_劑、鹽、抗生素、一種或多種去垢劑(例如，TRITON X-100 、脫氧膽酸鈉、聚氧乙烯(20)山梨醇單油酸酯)、一種或多種防止交聯(lián)的試劑、一種或多種蛋白酶抑制劑、和/或一種或多種酶。用于生產(chǎn)ATM的適合的方法描述于，例如，H. Xu (徐)等人，衍生自豬的支持軟組織再生的非細胞真皮支架末端半乳糖-α-(1，3)-半乳糖的去除以及基質(zhì)結構的保留，組織工程，部分A，卷15，1-13(2009)(“徐，，)(A Porcine-Derived Acellular Dermal Scaffold That Supports Soft TissueRegeneration: Removal of Terminal Galactose-a-(1，3)-Galactose and Retention ofMatrix Structure), Tissue Eng. Part A15 卷1-13 (2009) (" Xu")中。具體地，在 Xu(徐)的第2頁上的小標題“測試材料”(“Test materials”)下的段落描述了用于從豬皮膚生產(chǎn)ATM的適合的方法。
在去細胞化過程后，將組織樣品用鹽水徹底洗滌。在一些示例性實施方案中，例如，當使用異種材料時，然后將去細胞化組織用脫氧核糖核酸酶(DNA酶)溶液在室溫下處理過夜。在一些實施方案中，用制備在DNA酶緩沖劑(20mM HEPES (4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、20mM CaCl2和20禮MgCl2)中的DNA酶溶液處理組織樣品。任選地，可以將抗生素溶液(例如，慶大霉素)添加至該DNA酶溶液?？梢允褂萌魏芜m合的緩沖劑，只要這種緩沖劑提供適合的DNA酶活性即可。
雖然一種ATM可以由與該組織支架的受體相同種類的一個或多個的個體制成，但這不是必需如此。因此，例如，在該組織支架中的ATM可以由豬組織制成?？梢宰鳛锳TM受體以及用于生產(chǎn)ATM的組織或器官的供體的種類包括，但不局限于哺乳動物，例如人、非人靈長類(例如猴、狒狒、或黑猩猩)、豬、牛、馬、山羊、綿羊、狗、貓、兔、豚鼠、沙鼠、倉鼠、大鼠、或小鼠。
Galal-3Galβ1-(3) 4GlcNAc_R 表位(“ a -gal 表位”)從 ATM 中的消除可以降低針對ATM的免疫應答。a-gal表位在非靈長類哺乳動物中以及新世界猴(南美的猴)中，在大分子例如細胞外組分的糖蛋白上表達，U. Galili (加利里)等人，J. Biol. Chem.(生物化學雜志)263:17755(1988)。然而，在舊世界靈長類(亞洲和非洲的猴以及猿)以及人類中該表位缺失?？筭al抗體是由于對在胃腸道細菌上的a-gal表位碳水化合物結構的免疫應答，而在人類以及靈長類體內(nèi)產(chǎn)生的，U. Galili (加利里)等人，Infect.1mmun.(感染與免疫)56:1730 (1988) ；R. M. Hamadeh (哈馬德)等人，J. Clin.1nvest.(臨床研究雜志)89:1223(1992)。
由于非靈長類哺乳動物(例如豬)產(chǎn)生a-gal表位，所以將ATM從這些哺乳動物異種移植至靈長類中通常會導致免疫激活，這是因為靈長類抗Gal抗體結合ATM上的這些表位。U. Galili(加利里)等人，Immunology Today(今日免疫學)，14:480 (1993) ；M. Sandrin(山寧)等人,Proc. Natl. Acad. Sc1. USA (美國國家科學院院刊)，90:11391 (1993) ；H. Good(古德)等人，Transplant. Proc.(移植學進展)，24:559 (1992) ；B. H. Collins (柯林斯) 等人，J.1mmunol.(免疫學雜志)，154:5500 (1995)。此外，異種移植導致免疫系統(tǒng)的主要激活以產(chǎn)生增加量的高親和力抗-gal抗體。因此，在一些實施方案中，當使用產(chǎn)生a-gal表位的動物作為組織來源時，從細胞和從ATM的細胞外組分實質(zhì)性消除a -gal表位并且防止細胞a -gal表位的再表達,可以減弱與抗-gal抗體結合a -gal表位相關的針對ATM的免疫應答。
為了去除α-gal表位，在徹底用鹽水洗滌組織以去除DNA酶溶液后，該組織樣品可以經(jīng)受一次或多次酶處理，以去除某些免疫原性抗原，如果在該樣品中存在的話。在一些實施方案中，如果存在于組織中，可以用α-半乳糖苷酶處理組織樣品以消除α-gal表位。在一些實施方案中，用制備在pH 6. O的IOOmM磷酸鹽緩沖液中的、300U/L濃度的α-半乳糖苷酶處理組織樣品。在其他實施方案中，為了從收獲的組織充分去除a-gal表位，將α -半乳糖苷酶的濃度增加至400U/L?？梢允褂萌魏芜m合的酶濃度和緩沖劑，只要達到充分的抗原消除。
可替代地，可以選擇已經(jīng)基因修飾為缺乏一種或多種抗原表位的動物作為組織 來源，而不是用酶處理組織。例如，可以選擇已經(jīng)被基因修飾而缺乏末端α-半乳糖部分的動物(例如，豬)作為組織來源。對于適當?shù)膭游锏恼f明參見共同未決的美國申請序列號10/896，594和美國專利號6，166，288，其披露內(nèi)容通過引用以其全文結合在此。此外，加工組織以生產(chǎn)具有或不具有減少量的、或缺乏α -1, 3-半乳糖部分的非細胞基質(zhì)的某些示例性方法描述于Xu (徐)中。
在形成ATM后，可以任選地將組織相容性活細胞種在該ATM中，以產(chǎn)生可以被宿主進一步重塑的一種移植物。在一些實施方案中，可以在移植前通過標準體外細胞共培養(yǎng)技術，或在移植后通過體內(nèi)再增殖而將組織相容性活細胞添加到基質(zhì)中。體內(nèi)再增殖可以是通過將受體自身的細胞遷移至ATM中，或通過將得自受體的細胞或來自另一供體的組織相容性細胞注入或注射至原位ATM中?？梢允褂貌煌毎愋停ㄅ咛ジ杉毎?、成體干細胞(例如，間充質(zhì)干細胞)、和/或神經(jīng)元細胞。在不同實施方案中，可以剛好在移植之前或之后，將這些細胞直接施用于ATM的內(nèi)部部分。在某些實施方案中，可以將這些細胞放置在待植入的ATM內(nèi)，并且在移植前培養(yǎng)。在一些實施方案中，可以在溶劑已經(jīng)從支架中擴散后，將活細胞添加至在至希望的解剖部位的組織支架。
在某些實施方案中，該ATM可以包括ALLODERM 或Strattice (生命細胞公司(LifeCell Corporation),布蘭斯堡(Branchburg),新澤西州)，分別為人和豬非細胞真皮基質(zhì)。此類材料的實例可以在美國專利號6，933，326和7，358，284中找到。
顆粒狀非細胞組織基質(zhì)
可以使用以下程序，使用ALLODERM 、STRATTICETM、或其他適合的非細胞組織基質(zhì)來生產(chǎn)顆粒狀非細胞組織基質(zhì)。在去除包裝后，可以用裝有非中斷“連續(xù)”切割輪的Zimmer網(wǎng)格器(Zimmer mesher)將ATM切成條。將生成的ATM長條可以切成長度上約I厘米至約2厘米的長度。
可以裝配一種均質(zhì)器以及滅菌的均質(zhì)器探頭(例如一種從OMNI國際、Warrenton Va.可得的一種LabTeck Macro均質(zhì)器),并且使用灌入均質(zhì)器塔中的無菌液氮將其冷卻至深冷溫度。一旦該均質(zhì)器達到深冷溫度，可以將先前制備成如以上所述的條的ATM添加至含有無菌液氮的均質(zhì)器塔。然后可以起動該均質(zhì)器從而將這些ATM條深低溫破碎。低溫分餾步驟的次數(shù)和持續(xù)時間將取決于所使用的均質(zhì)器、均質(zhì)器室的大小、均質(zhì)器操作的速度和次數(shù)，并且應當能夠由本領域的一位技術人員通過參數(shù)的簡單變化來確定，從而達到希望的結果。
通過用液氮將均質(zhì)器的產(chǎn)物洗滌，穿過一系列也已冷卻至液氮溫度的金屬篩屏，可以將該低溫破碎的顆粒狀ATM材料根據(jù)粒徑進行分類。可以在上述類型的均質(zhì)塔內(nèi)，利用篩屏的一種組合，其中將這些顆粒洗滌并且首先分類以排除尺寸過大的顆粒，然后排除尺寸過小的顆粒。
一旦分離，可以移除該顆粒狀ATM，并且一旦該無菌液氮已經(jīng)蒸發(fā)，將其放置在用于冷凍干燥的小瓶中。這可以確保去除在以上程序中已經(jīng)吸收的任何殘余水分。最終產(chǎn)物可以是一種具有粒徑約I微米至約900微米或粒徑約30微米至約750微米的粉末。這些顆粒約分布在約150-300微米的均值。通過懸浮在生理鹽水或其他類似的適合的再水合試劑中，易于將將該材料再水合。這一再水合的ATM可以再懸浮于生理 鹽水或其他適合的藥學上相容的載體中。在某些實施方案中，該顆粒狀ATM可以包括CYMETRA (生命細胞公司(LifeCellCorporation),布蘭斯堡(Branchburg),新澤西州)，這是一種可注射形式的ALLODERM 。此類材料的實例可以在美國專利號7，358，284和6，933，326中找到。提供了以下實例以更好地解釋不同實施方案，這些實例不應當以任何方式被理解為限制本披露的范圍。
實例
實例I根據(jù)下述程序，對具有豬真皮組織衍生的顆粒狀ATM (pADM)的再生性組織支架的植入效果與單獨的預成型聚合物的植入作比較。再生性組織支架產(chǎn)生自顆粒狀ATM。從豬真皮組織制備ATM并且將其冷凍干燥。將干燥的ATM切成 I cm2的塊并且放置在cryomill小瓶中。然后將該小瓶放置在已經(jīng)用液氮預冷的SPEX 6800冷凍研磨機中，并且使其經(jīng)受低溫破碎實驗方案。然后將該顆粒狀ATM從小瓶中移除，并且保持在干燥儲存條件下。根據(jù)以下程序，將與pADM結合的PCL以及與pADM結合的P4HB各自溶解在二噁烷以及NMP的每一個之中。將選擇的聚合物以10% (w/v)的濃度溶解在選擇的溶劑中。然后將0. 5 ml的該溶液吸入一個I ml注射器中。將150 mg的pADM添加至3 ml注射器中。將一個接頭放置在I ml注射器上，并且從筒中除去所有空氣。將在3 ml注射器上的活塞拉回至2 ml標記，并且輕敲注射器以使pADM粉末松散。然后將該3ml注射器連接至該Iml注射器。將來自該Iml注射器的溶液緩慢注射入該3ml注射器中，以允許該pADM變得潤濕。重復輕敲該3ml注射器直到該pADM顯得完全潤濕。將該材料在該Iml和3ml注射器之間轉(zhuǎn)移約10次，以均勻混合該聚合物溶液和pADM，并且當完成時，將該材料留在該3ml注射器中。將該Iml注射器斷開連接，并縮回在該3ml注射器上的活塞。輕敲該3ml注射器，以將內(nèi)容物壓縮至緊貼活塞。緩慢壓低活塞，排出3ml注射器中的所有空氣。然后將Iml注射器重新連接，并且將該聚合物-pADM混合物在這些注射器之間重復地來回轉(zhuǎn)移持續(xù)約2分鐘。將聚合物-pADM混合物轉(zhuǎn)移至該Iml注射器，并且附接一個針/套管用于遞送。
通過在正常免疫功能大鼠(褐家鼠；路易鼠)背側(cè)面上的一個小切口，將上述不同的聚合物-pADM混合物、僅包括PCL的構造物、以及僅包括P4HB的構造物各自都植入皮下位置。在植入后4周(圖3A-F)和12周(圖4A-F)，收集外植體并用PBS洗滌并固定在10%的福爾馬林中。將固定的組織包埋在石蠟中，使用標準程序，用蘇木精和伊紅(H和E)將組織基質(zhì)樣品的切片染色。D. C. Sheehan (希恩)和B. B. Hrapchak (哈普查克)，Theory andPractice of Histotechnology (組織技術理論與實踐),第二版,哥倫布(Columbus),俄亥俄州，Battelle 出版社(1987)。
然后在400x放大倍數(shù)(圖3A-F和圖4A-F)的顯微鏡下觀察樣品。圖3A-C分別描述在4周后單獨的PCL、連同pADM與二噁烷、連同pADM與NMP的結果。圖3D-F分別描述在4周后單獨的P4HB、連同pADM與二噁烷、連同pADM與NMP的結果。類似地，圖4A-C分別描述在12周后單獨的PCL、連同pADM與二噁烷、以及連同pADM與NMP的結果。并且圖4D-F分別描述在12周后單獨的P4HB、連同pADM與二噁烷、以及連同pADM與NMP的結果。外植體的組織學分析顯示，在PADM存在下，當溶解在二噁烷亦或NMP中時，與單獨的PCL和 P4HB的外植體相比，PCL和P4HB具有弱化的炎癥應答。
實例2
評估了在兔股骨髁中的再生性組織支架的植入。根據(jù)實例I中描述的程序，制備包括BHA、pADM、以及NMP的植入物。將BHA與pADM混合在NMP溶劑中，并且將其注入在兔股骨髁上產(chǎn)生的約3. 5x3mm的骨軟骨缺損中。在4周后移除樣品，并且使用常規(guī)的蘇木精和伊紅組織學染色對細胞應答進行評估。在20χ、ΙΟΟχ、以及400x放大倍數(shù)(對應地為圖5a-c)的顯微鏡下觀察樣品。還在12周時拍攝了顯示組織支架植入物180b的股骨髁的照片(圖6)。這些結果顯示了植入物的持久性，以及如通過在缺損部位中透明樣軟骨的沉積證明的一種再生性組織應答。
考慮了在此披露的本發(fā)明的說明書以及實踐后，本發(fā)明的其他實施方案對于本領域的那些技術人員而言將是顯而易見的。希望說明書和各實例只是被當作示例性的，而本發(fā)明的實際范圍和精神由隨附權利要求書來指示。
權利要求
1.一種方法，包括 提供一種顆粒狀非細胞組織基質(zhì)(ATM)以及一種包括溶解于溶劑中的聚合物的溶液； 將該溶液與該顆粒狀ATM混合以產(chǎn)生一種混合物；并且 放置該混合物，與一種水性介質(zhì)相接觸，以允許該溶劑從該混合物擴散，以從該聚合物和ATM形成一種組織支架。
2.如權利要求1所述的方法，其中放置該混合物、與一種水性介質(zhì)相接觸包括將該混合物放在一個組織部位之中、之上、或鄰近處。
3.如權利要求2所述的方法，進一步包括將該混合物注入到該組織部位中、該組織部位上、或它們的一個組合。
4.如權利要求2-3中任一項所述的方法，其中該組織部位包括骨、軟骨組織、或乳房組織。
5.如權利要求1所述的方法，其中放置該混合物、與一種水性介質(zhì)相接觸包括將該混合物放置在一個模具中。
6.如權利要求5所述的方法，其中該模具是處于一種組織或器官缺損的形式。
7.如權利要求5所述的方法,其中該模具是一個eppendorf管、一個金屬管、或一個注射管。
8.如權利要求5-7中任一項所述的方法，其中放置該混合物、與一種水性介質(zhì)相接觸包括在一種水性介質(zhì)中對該混合物進行漂洗、洗滌、或浸泡中的至少一種。
9.如權利要求1-8中任一項所述的方法，其中該溶劑是水可混溶的。
10.一種組織支架混合物，包括 一種顆粒狀非細胞組織基質(zhì)(ATM)； 一種聚合物；以及 一種水可混溶的溶劑， -其中當放置該混合物、與一種水性介質(zhì)相接觸時，該水可混溶的溶劑能夠從該混合物擴散，以允許該混合物從該聚合物和ATM形成一種組織支架。
11.一種組織支架混合物，包括 一種顆粒狀非細胞組織基質(zhì)(ATM)； 一種聚合物；以及 一種水可混溶的溶劑， 其中當將該混合物植入一種動物中時，該水可混溶的溶劑能夠從該混合物擴散，以允許該混合物從該聚合物和ATM形成一種組織支架。
12.如權利要求1-11中任一項所述的方法或組織支架混合物，其中該組織支架具有一種穩(wěn)定的三維形狀。
13.如權利要求1-12中任一項所述的方法或組織支架混合物，其中當植入動物時，與單獨的該聚合物相比，該組織支架具有降低的免疫或炎癥應答。
14.如權利要求13所述的方法或組織支架混合物，其中該免疫或炎癥應答是通過存在的炎癥細胞的數(shù)目來測量。
15.一種套件，包括 一種顆粒狀非細胞組織基質(zhì)(ATM)；一種聚合物；以及 一種溶劑。
16.如權利要求1-15中任一項所述的方法、套件、或組織支架混合物，其中該溶劑是生物相容的。
17.如權利要求1-16中任一項所述的方法、套件、或組織支架混合物，其中該溶劑包括二噁烷、N-甲基-2-吡咯烷酮、或二甲亞砜、或它們的組合中的至少一種。
18.如權利要求1-17中任一項所述的方法、套件、或組織支架混合物，其中該聚合物包括聚己內(nèi)酯。
19.如權利要求18所述的方法、套件、或組織支架混合物，其中當該聚己內(nèi)酯溶解于溶劑中時，它是以范圍從約5%-30% (w/v)的量存在于該溶劑中。
20.如權利要求18所述的方法、套件、或組織支架混合物，其中當該聚己內(nèi)酯溶解于溶劑中時，它是以范圍從約10%-20% (w/v)的量存在于該溶劑中。
21.如權利要求1-17中任一項所述的方法、套件、或組織支架混合物，其中該聚合物包括聚-4-羧基丁酸酯。
22.如權利要求21所述的方法、套件、或組織支架混合物，其中當該聚-4-羧基丁酸酯溶解于溶劑中時，它是以范圍從約5%-40% (w/v)的量存在于該溶劑中。
23.如權利要求21所述的方法、套件、或組織支架混合物，其中當該聚-4-羧基丁酸酯溶解于溶劑中時，它是以范圍從約10%-30% (w/v)的量存在于該溶劑中。
24.如權利要求1-17中任一項所述的方法、套件、或組織支架混合物，其中該聚合物包括一種透明質(zhì)酸的芐酯衍生物。
25.如權利要求24所述的方法、套件、或組織支架混合物，其中當該透明質(zhì)酸的芐酯衍生物溶解于溶劑中時，它是以范圍從約5%-50% (w/v)的量存在于該溶劑中。
26.如權利要求24所述的方法、套件、或組織支架混合物，其中當該透明質(zhì)酸的芐酯衍生物溶解于溶劑中，時它是以范圍從約5%-40% (w/v)的量存在于該溶劑中。
27.如權利要求1-26中任一項所述的方法、套件、或組織支架混合物，其中該顆粒狀ATM包含均勻大小的顆粒。
28.如權利要求1-27中任一項所述的方法、套件、或組織支架混合物，其中該顆粒狀ATM包括一種真皮ATM、一種軟骨組織基質(zhì)、一種骨組織基質(zhì)、或它們的組合。
29.如權利要求28所述的方法、套件、或組織支架混合物，其中該真皮ATM是一種人組織基質(zhì)或一種豬組織基質(zhì)。
30.如權利要求28所述的方法、套件、或組織支架混合物，其中該軟骨組織基質(zhì)包括一種人軟骨基質(zhì)或一種豬軟骨基質(zhì)。
31.如權利要求28所述的方法、套件、或組織支架混合物，其中該骨組織基質(zhì)包括一種人骨或一種豬骨。
32.如權利要求1-31中任一項所述的方法、套件、或組織支架混合物，其中該顆粒狀ATM包括來自兩種或更多種不同類型的組織的ATM。
33.如權利要求32所述的方法、套件、或組織支架混合物，其中該兩種或更多種不同類型的組織包括真皮和軟骨、軟骨和骨、人組織基質(zhì)、豬組織基質(zhì)、或人組織基質(zhì)和豬組織基質(zhì)。
34.如權利要求10-33中任一項所述的組織支架混合物或套件用于治療一個組織部位的用途。
35.如權利要求34所述的組織支架混合物或套件的用途，其中該組織是骨、軟骨、或乳房。
全文摘要
在此提供了涉及治療組織的方法、混合物、以及套件。這些方法、混合物、以及套件可以包括一種非細胞組織基質(zhì)、一種聚合物、以及一種溶劑，并且可以能夠生產(chǎn)組織支架。這些組織支架可以能夠在原位形成一種穩(wěn)定的、三維形狀，并且引起有限的免疫或炎癥應答。
文檔編號A61L27/48GK103002927SQ201180036258
公開日2013年3月27日 申請日期2011年8月9日 優(yōu)先權日2010年8月10日
發(fā)明者里克·T·歐文斯, 勞拉·埃爾莫, 劉米克, 勇·馬奧 申請人:生命細胞公司