專利名稱：bumetanide在抑制肝癌細胞轉移中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種bumetanide的新用途,具體涉及bumetanide在抑制肝癌細胞轉移中的應用。
背景技術：
原發(fā)性肝癌中90% 以上為肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC),HCC 是一種很常見的、致死率非常高的惡性腫瘤，每年約650，000人死于HCC，且其發(fā)病率有逐年增高的趨勢。HCC多發(fā)于東南亞和非洲等發(fā)展中國家，其中約有50%以上發(fā)生于中國，位居我國癌癥死亡率的第二位，另外，在發(fā)達國家HCC的發(fā)病率也在逐年上升。HCC的早期診斷一直是臨床治療中的瓶頸。臨床上的手術切除肝臟腫瘤以及肝移植被認為是HCC獲得根治的 最佳手段，但是僅僅有10-20%的HCC病人適合外科手術治療；即使是根治性切除，5年內仍有60-70%的病人會出現(xiàn)HCC的轉移復發(fā)，而局部治療的轉移復發(fā)率則更高。HCC的轉移是影響治療效果和預后的最大障礙，是導致其高死亡率的主要原因。布美他尼(bumetanide)是一種利尿劑,主要抑制腎小管髓袢升支厚壁段對NaCl的主動重吸收，對近端小管重吸收Na+也有抑制作用，但對遠端腎小管無作用。能抑制前列腺素分解酶的活性，使前列腺素E2含量升高，從而具有擴張血管作用。擴張腎血管，降低腎血管阻力，使腎血流量尤其是腎皮質深部血流量增加，在布美他尼的利尿作用中具有重要意義，也是其用于預防急性腎功能衰竭的理論基礎。另外，布美他尼能擴張肺部容量靜脈，降低肺毛細血管通透性，加上其利尿作用，使回心血量減少，左心室舒張末期壓力降低，有助于急性左心衰竭的治療。由于布美他尼可降低肺毛細血管通透性，為其治療成人呼吸窘迫綜合征提供了理論依據。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種布美他尼(bumetanide)在抑制肝癌轉移中的應用。本發(fā)明提供了布美他尼(bumetanide)在制備抑制肝癌細胞增殖和/或侵襲和/或轉移的藥物中的應用。所述肝癌細胞可為肝癌細胞株MHCC97H或Huh7細胞。本發(fā)明還保護布美他尼(bumetanide)在制備治療肝癌的藥物中的應用。所述肝癌可為肝癌細胞株MHCC97H或Huh7細胞引起的。本發(fā)明還保護布美他尼(bumetanide)在制備降低肝癌細胞中磷酸化NKCCl蛋白含量的產品中的應用；所述NKCCl蛋白為如下⑴或(II)(I)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(II)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與癌細胞增殖和/或遷移和/或浸潤和/或侵襲相關的由序列I衍生的蛋白質。所述肝癌細胞為肝癌細胞株MHCC97H或Huh7細胞。
本發(fā)明還保護一種抑制肝癌細胞增殖和/或侵襲和/或轉移的藥物，它的活性成分為布美他尼(bumetanide)。所述肝癌細胞為肝癌細胞株MHCC97H或Huh7細胞。本發(fā)明還保護一種治療肝癌的藥物，它的活性成分為布美他尼(bumetanide)。所述肝癌為肝癌細胞株MHCC97H或Huh7細胞引起的。本發(fā)明還保護一種降低肝癌細胞中所述磷酸化NKCCl蛋白含量的產品，它的活性成分為布美他尼(bumetanide)。所述肝癌細胞為肝癌細胞株MHCC97H或Huh7細胞。質膜蛋白與腫瘤的轉移密切相關。目前已發(fā)現(xiàn)的藥物靶標大部分定位于細胞質膜，許多與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關的質膜蛋白可作為重要的藥物靶標。此外，部分質膜蛋白可從 細胞表面脫落進入體液，成為潛在的生物標志物。因此針對HCC細胞質膜蛋白的研究不僅能促進HCC轉移機理的揭示，還有利于發(fā)現(xiàn)檢測腫瘤轉移的生物標志物和臨床治療的藥物靶點。Na-K-Cl協(xié)同轉運蛋白(NKCCl)定位于細胞質膜，在高轉移肝癌細胞株中表達上調，介導轉運Na、K、Cl離子進出細胞，維持和調節(jié)細胞體積和離子濃度，調節(jié)細胞的生長和發(fā)育。布美他尼(bumetanide)可以降低肝癌細胞中磷酸化NKCCl蛋白的含量，從而抑制肝癌細胞的增殖、侵襲和轉移。本發(fā)明肝癌的治療具有重大價值。


圖I為活性實驗檢測不同轉移能力肝細胞癌細胞株中NKCCl的活性。圖2為活性實驗檢測bumetanide對肝癌細胞株MHCC97H和Huh7細胞中NKCCl活性的影響。圖3為Western blot檢測bumetanide對肝癌細胞株MHCC97H和Huh7細胞中NKCCl的活性影響。圖4為bumetanide對肝癌細胞株MHCC97H和Huh7細胞體外增殖能力的影響。圖5為bumetanide對肝癌細胞株MHCC97H和Huh7細胞體外侵襲能力的影響。圖6為bumetanide對肝癌細胞株MHCC97H和Huh7細胞MMP-2分泌量的影響。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。肝癌細胞株MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3購自復旦大學附屬中山醫(yī)院肝癌研究所，其轉移能力依次增強。Huh7細胞購自ATCC。雞抗人NKCCl —抗購自GenWay Biotech公司。鼠抗人GAPDH—抗購自Prote inTech Group JRP標記的抗雞的二抗購自Abcam公司。HRP標記的抗兔的二抗、HRP標記的抗鼠的二抗均購自北京中杉金橋生物技術公司。Cell CountingKit-8 (CCK-8試劑盒)購自株式會社同仁化學研究所。BD BioCoat Matrigel InvasionChamber購自美國BD公司。BCA法蛋白測定試劑盒購自Thermo。布美他尼(bumetanide)購自 sigma 公司。pluronic acid 與 sodium binding benzofuran isophthalate acetoxymethyl esters-AM(SBFI)購自Invitrogen公司。DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司。實施例中所用的PBS緩沖液均為將O.8g NaCl,O. 02g KCl，O. 358g Na2HPO4-12H20,0. 024g KH2PO4 溶于 IOOOmL 水得到的；pH7. 4。細胞裂解液質量百分含量為4%的SDS，質量百分含量為2%的DTT，120mMTris-Cl (pH6. 8)，5mM氟化鈉，ImM礬酸鈉，IOmM焦磷酸鈉，蛋白酶抑制劑(Cocktail)。實施例I、比較不同轉移能力肝癌細胞株中NKCCl活性的表達情況本實施例中，通過檢測蛋白液中的鈉離子含量比較不同肝癌細胞株中NKCCl活性的表達情況，相關機理見文獻 AR. Jayakumar, ML. Liu, M. Moriyama. et al. Na-K-ClCotransporter-1 in the Mechani sm of Ammonia-induced Astrocyte Swelling. TheJournal of Biological Chemi stry.2008,283 (49) :33875。
分別將MHCC97L、MHCC97H和HCCLM3進行如下操作I、將細胞按2X IO5個/ml的密度接種于六孔培養(yǎng)板，每孔接種2ml細胞懸液，置于37°C,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；待細胞生長至80-90%匯合度后，吸棄液體，加入DMEM高糖培養(yǎng)基于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)30min。2、吸棄培養(yǎng)基，加入含有0.05% (體積百分含量)pluronic acid和ΙΟμΜsodiumbinding benzofuran isophthalate acetoxy methyl esters-AM(SBFI)的 DMEM 高糖培養(yǎng)基于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)2h。3、吸棄培養(yǎng)基，用冷的PBS緩沖液清洗2次后加入500 μ I 0. 2% (體積百分含量)的Triton X-100水溶液，用細胞刮把細胞刮下來后超聲破碎IOs (每個循環(huán)為超聲0. 2s,停2s ;超聲振幅為24% )，得到的溶液即為蛋白液。4、一部分蛋白液用來測定蛋白濃度，剩下的蛋白液用熒光分光光度計測熒光密度(激發(fā)光波長為340nm/385nm，吸收光波長為510nm)，NKCC1的活性以“熒光強度單位units/mg蛋白”為單位呈現(xiàn)。結果見圖I。HCCLM3中NKCCl的活性最高，MHCC97H次之，MHCC97L活性最低，即在這三種細胞中，NKCCl的活性與細胞的轉移能力一致。實施例2、檢測bumetanide對肝癌細胞NKCCl活性的影響一、熒光分光光度計檢測I、肝癌細胞株MHCC97H(I)將肝癌細胞株MHCC97H按2X IO5個/ml的密度接種于六孔培養(yǎng)板，每孔接種2ml細胞懸液，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(2)待細胞生長至80-90%匯合度后，吸棄液體，分成兩組第一組(MHCC97H):加入DMEM高糖培養(yǎng)基；第二組(MHCC97H+BUM):加入含50 μ M bumetanide 的 DMEM 高糖培養(yǎng)基；于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)30min。(3)吸棄培養(yǎng)基，加入含有0.05% (體積百分含量)pluronic acid和ΙΟμΜsodium binding benzofuran isophthalate acetoxy methyl esters-AM(SBFI)的DMEM高糖培養(yǎng)基于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)2h。(4)吸棄培養(yǎng)基，用冷的PBS緩沖液清洗2次后加入500 μ I 0.2% (體積百分含量)的Triton X-IOO水溶液，用細胞刮把細胞刮下來后超聲破碎IOs (每個循環(huán)為超聲
O.2s，停2s ;超聲振幅為24% )，得到的溶液即為蛋白液。(5) 一部分蛋白液用來測定蛋白濃度，剩下的蛋白液用熒光分光光度計測熒光密度(激發(fā)光波長為340nm/385nm，吸收光波長為51Onm)，NKCCl的活性以“熒光強度單位units/mg蛋白”為單位呈現(xiàn)。結果見圖2A。bumetanide作用后的肝癌細胞株MHCC97H中NKCCl的活性下降，即bumetanide可降低肝癌細胞株MHCC97H中NKCCl的活性。2、Huh7 細胞(I)將Huh7細胞按2 X IO5個/ml的密度接種于六孔培養(yǎng)板，每孔接種2ml細胞懸液，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 (2)待細胞生長至80-90%匯合度后，吸棄液體，分成兩組第一組(Huh7):加入DMEM高糖培養(yǎng)基；第二組(Huh7+BUM):加入含50 μ M bumetanide 的 DMEM 高糖培養(yǎng)基；于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)30min。步驟(3)至步驟(5)同步驟I的步驟(3)至步驟(5)。結果見圖2B。bumetanide作用后的Huh7細胞中NKCCl的活性下降，即bumetanide可降低Huh7細胞中NKCCl的活性。二、Western blot 檢測I、肝癌細胞株MHCC97H(I)將肝癌細胞株MHCC97H按2X IO5個/ml的密度接種于六孔培養(yǎng)板，每孔接種2ml細胞懸液，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；(2)待細胞生長至80-90%匯合度后，吸棄液體，分成兩組第一組(MHCC97H):加入DMEM高糖培養(yǎng)基；第二組(MHCC97H+BUM):加入含50 μ M bumetanide 的 DMEM 高糖培養(yǎng)基；于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)30min后收集細胞。(3)用細胞裂解液裂解步驟I收集的細胞，然后4°C、IOOOOg離心15min，收集裂解液上清，即為細胞總蛋白。(4)將細胞總蛋白在95°C下煮5min,然后進行Western blot檢測。Western blot檢測的具體參數(shù)采用12% SDS-PAGE電泳；總NKCCl的檢測采用雞抗人NKCCl—抗(I 1000稀釋)和HRP標記的抗雞的二抗(I 10000稀釋)；P-NKCCl (磷酸化NKCC1)的檢測采用P-NKCCl兔多抗(I 3000稀釋)和HRP標記的抗兔的二抗(I 10000稀釋)；內參為GAPDH，采用鼠抗人GAPDH—抗(I 10000稀釋)和HRP標記的抗鼠的二抗(I 10000稀釋)。(5)對條帶進行光密度掃描，檢測各組NKCCl蛋白和內參GAPDH蛋白所對應條帶A值，然后將ΑΡ_Νκα;1/Α_Η的比值進行統(tǒng)計學分析(Quantity One軟件)。肝癌細胞株MHCC97H的Western blot膠片圖見圖3A。bumetanide作用后的肝癌細胞株MHCC97H中p-NKCCl的蛋白含量下降(見圖3B)，而總蛋白量不變(見圖3C)，說明bumetanide可降低肝癌細胞株MHCC97H中p-NKCCl的蛋白含量，從而降低了 NKCCl的活性。2、Huh7 細胞
(I)將Huh7細胞按2 X IO5個/ml的密度接種于六孔培養(yǎng)板，每孔接種2ml細胞懸液，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(2)待細胞生長至80-90%匯合度后，吸棄液體，分成兩組第一組(Huh7):加入DMEM高糖培養(yǎng)基；第二組(Huh7+BUM):加入含50 μ M bumetanide 的 DMEM 高糖培養(yǎng)基；于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)30min后收集細胞。步驟(3)至步驟(5)同步驟I的步驟(3)至步驟(5)。Huh7細胞的Western blot膠片圖見圖3D。bumetanide作用后的Huh7細胞中p-NKCCl的蛋白含量下降(見圖3E),而總蛋白量不變(見圖3F),說明bumetanide可降低Huh7細胞中p-NKCCl的蛋白含量，從而降低了 NKCCl的活性。 實施例3、bumetanide對肝癌細胞株MHCC97H和Huh7細胞體外增殖能力的影響一、肝癌細胞株MHCC97HI、取對數(shù)生長期(70%-80%匯合度)的肝癌細胞株MHCC97H，用O. 25%胰酶(Hyclone公司)消化成細胞懸液。2、將96孔板中的孔分為兩組第一組(MHCC97H):加入含有10 % (體積百分含量)FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，然后接種細胞懸液，細胞濃度為1000個/ μ I ;第二組(MHCC97H+BUM):加入含有10% (體積百分含量)FBS和 50 μ M bumetanide的DMEM高糖培養(yǎng)基，然后接種細胞懸液，細胞濃度為1000個/ μ I ;置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)12小時。3、采用CCK-8試劑盒分別在O天、I天、2天、3天、4天、5天、6天、7天在酶標儀0D450nm處測量各孔的吸光值(自接種細胞開始第一個12小時完成后作為起始時刻，記作第O天，自起始時刻開始第24小時結束后作為第I天，依次類推)。設置三次重復實驗，結果取平均值。結果見圖4A。NKCCl的活性受bumetanide抑制后，細胞的體外貼壁增殖能力與MHCC97H組細胞相比有顯著的降低，說明降低NKCCl的活性使MHCC97H細胞的增殖能力顯著下降，即bumetanide通過降低NKCCl的活性水平抑制了了 MHCC97H細胞的增殖。二、Huh7 細胞I、取對數(shù)生長期(70% -80%匯合度)的Huh7細胞，用O. 25%胰酶(Hyclone公司)消化成細胞懸液。2、將96孔板中的孔分為兩組第一組(Huh7):加入含有10% (體積百分含量)FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，然后接種細胞懸液，細胞濃度為1000個/ μ I ;第二組(Huh7+BUM):加入含有10% (體積百分含量)FBS和50 μ M bumetanide的DMEM高糖培養(yǎng)基，然后接種細胞懸液，細胞濃度為1000個/ μ I ;置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)12小時。步驟3同步驟一的3。結果見圖4B。NKCCl的活性受bumetanide抑制后，細胞的體外貼壁增殖能力與Huh7組細胞相比有顯著的降低，說明降低NKCCl的活性使Huh7細胞的增殖能力顯著下降，即bumetanide通過降低NKCCl的活性水平抑制了 Huh7細胞的增殖。實施例4、bumetanide對肝癌細胞株MHCC97H和Huh7細胞體外侵襲能力的影響一、bumetanide對肝癌細胞株MHCC97H體外侵襲能力的影響(Transwell實驗)1、將肝癌細胞株冊1097!1按2\105個/1111的密度接種于六孔培養(yǎng)板，每孔接種2ml細胞懸液，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；2、待細胞生長至80-90%匯合度后，吸棄液體，分成兩組第一組(MHCC97H):加入DMEM高糖培養(yǎng)基；第二組(MHCC97H+BUM):加入含50 μ M bumetanide 的 DMEM 高糖培養(yǎng)基；
于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時。3、消化后，離心棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗，用含有1% (體積百分含量)BSA的DMEM高糖培養(yǎng)基重懸，調整細胞密度為I X 106/ml (細胞懸液)。把小室從_20°C取出，放置至室溫；在小室和24孔板中加入預溫的DMEM高糖培養(yǎng)基，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱孵育2小時；下室加入750 μ I含有10% (體積百分含量)FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，用無菌鑷將Transwell小室放入有培養(yǎng)基的孔內，必須確認膜下沒有氣泡，并避免小室在液體中形成角度。分別取二組細胞懸液500 μ I加入Transwell小室中，每組細胞設3個平行復孔實驗；置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24h ;24h后從培養(yǎng)箱中取出Transwell小室，用棉簽蘸無血清的DMEM培養(yǎng)基擦拭除去Transwell小室上層的膠和細胞JfTranswell小室置于甲醇中固定IOmin, PBS緩沖液清洗5minX3次；將Traswell小室移入O. I %結晶紫中，染色30min，PBS緩沖液清洗5minX3次；取出Transwell小室，底面朝上，置于光鏡下，膜上滴一滴水，上置蓋玻片；每個濾膜隨即選取5個視野，計數(shù)穿膜細胞數(shù)，以穿膜細胞的數(shù)目表示細胞的相對侵襲能力。結果見圖5(B為照片；A為每個視野中的細胞數(shù)量，5個視野的平均值)。NKCCl的活性受bumetanide抑制后，肝癌細胞株MHCC97H的體外侵襲能力有顯著的降低，說明降低NKCCl的活性使肝癌細胞株MHCC97H的侵襲能力顯著下降，即bumetanide通過降低NKCCl的活性水平降低了肝癌細胞株MHCC97H的侵襲能力。二、bumetanide對Huh7細胞體外侵襲能力的影響(Transwell實驗)I、將Huh7細胞按2X IO5個/ml的密度接種于六孔培養(yǎng)板，每孔接種2ml細胞懸液，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2、待細胞生長至80-90%匯合度后，吸棄液體，分成兩組第一組(Huh7):加入DMEM高糖培養(yǎng)基；第二組(Huh7+BUM):加入含50 μ M bumetanide 的 DMEM 高糖培養(yǎng)基；于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時。步驟3同步驟一的3。結果見圖5 (D為照片；C為每個視野中的細胞數(shù)量，5個視野的平均值)。NKCCl的活性受bumetanide抑制后，Huh7細胞的體外侵襲能力有顯著的降低，說明降低NKCCl的活性使Huh7細胞的侵襲能力顯著下降，即bumetanide通過降低NKCCl的活性水平降低了Huh7細胞的侵襲能力。實施例5、bumetanide對肝癌細胞株MHCC97H和Huh7細胞MMP-2分泌量的影響一、bumetanide對肝癌細胞株MHCC97H MMP-2分泌量的影響(明膠酶譜法)
1、將肝癌細胞株冊1097!1按2\105個/1111的密度接種于六孔培養(yǎng)板，每孔接種2ml細胞懸液，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2、待細胞生長至80-90%匯合度后，吸棄液體，分成兩組第一組(MHCC97H):加入DMEM高糖培養(yǎng)基；第二組(MHCC97H+BUM):加入含50 μ M bumetanide 的 DMEM 高糖培養(yǎng)基；于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 4小時，收集上清液。3、將上清液與2X上樣緩沖液(O. 125mol/L Tris-HCl, pH6. 8，體積百分含量為20%的甘油，質量百分含量為4%的SDS，質量百分含量為O. 002%的溴酚藍)按I : I的體積比混合后靜置10分鐘。 4、將步驟3的混合液進行恒壓125V的10 % SDS-PAGE (含O. I %明膠)電泳，結束后將凝膠置IX復性緩沖液(Invitrogen)室溫振蕩洗脫2次，每次40分鐘；棄復性緩沖液，加IX孵育緩沖液(InvitiOgen)室溫振蕩平衡30分鐘；將凝膠置新鮮IX孵育緩沖液中，37°C孵育至少4h ;考馬斯亮藍染液染色30分鐘；用脫色液脫色至亮帶出現(xiàn)。設置三次重復實驗，結果取平均值。電泳結果見圖6B。以第一組(MHCC97H)中MMP-2的表達量為1，計算第二組(MHCC97H+BUM)中MMP-2的相對表達量(Ratio)，見圖6A。結果顯示NKCCl活性受到抑制后，肝癌細胞株MHCC97H培養(yǎng)上清中MMP-2的活性顯著下降，即其分泌量顯著下降，也就表明肝癌細胞株MHCC97H的轉移和侵襲能力顯著下降，也就可以解釋前期實驗所得結果第二組(MHCC97H+BUM)細胞的轉移和侵襲能力下降。二、bumetanide對Huh7細胞MMP-2分泌量的影響(明膠酶譜法)I、將Huh7細胞按2X IO5個/ml的密度接種于六孔培養(yǎng)板，每孔接種2ml細胞懸液，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2、待細胞生長至80-90%匯合度后，吸棄液體，分成兩組第一組(Huh7):加入DMEM高糖培養(yǎng)基；第二組(Huh7+BUM):加入含50 μ M bumetanide 的 DMEM 高糖培養(yǎng)基；于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時，收集上清液。步驟3和4同步驟一的3和4。電泳結果見圖6D。以第一組(Huh7)中MMP-2的表達量為1，計算第二組(Huh7+BUM)中MMP-2的相對表達量(Ratio)，見圖6C。結果顯示NKCCl活性受到抑制后，Huh7細胞培養(yǎng)上清中MMP-2的活性顯著下降，即其分泌量顯著下降，也就表明Huh7細胞的轉移和侵襲能力顯著下降，也就可以解釋前期實驗所得結果第二組(Huh7+BUM)細胞的轉移和侵襲能力下降。
權利要求
1.布美他尼在制備抑制肝癌細胞増殖和/或侵襲和/或轉移的藥物中的應用。
2.如權利要求I所述的應用，其特征在于所述肝癌細胞為肝癌細胞株MHCC97H或Huh7細胞。
3.布美他尼在制備治療肝癌的藥物中的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述肝癌為肝癌細胞株MHCC97H或Huh7細胞引起的。
5.布美他尼在制備降低肝癌細胞中磷酸化NKCCl蛋白含量的產品中的應用； 所述NKCCl蛋白為如下⑴或(II): (I)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (II)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經過ー個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與癌細胞増殖和/或遷移和/或浸潤和/或侵襲相關的由序列I衍生的蛋白質。
6.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述肝癌細胞為肝癌細胞株MHCC97H或Huh7細胞。
7.ー種抑制肝癌細胞増殖和/或侵襲和/或轉移的藥物，它的活性成分為布美他尼。
8.一種治療肝癌的藥物，它的活性成分為布美他尼。
9.一種降低肝癌細胞中磷酸化NKCCl蛋白含量的產品，它的活性成分為布美他尼； 所述NKCCl蛋白為如下⑴或(II) (I)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (II)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經過ー個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與癌細胞増殖和/或遷移和/或浸潤和/或侵襲相關的由序列I衍生的蛋白質。
10.如權利要求7或8所述的藥物，或如權利要求9所述的產品，其特征在于所述肝癌細胞為肝癌細胞株MHCC97H或Huh7細胞；所述肝癌為肝癌細胞株MHCC97H或Huh7細胞引起的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種bumetanide在抑制肝癌轉移中的應用。布美他尼(bumetanide)可用于制備抑制肝癌細胞增殖和/或侵襲和/或轉移的藥物，制備治療肝癌的藥物，制備降低肝癌細胞中磷酸化NKCC1蛋白含量的產品。布美他尼(bumetanide)可以降低肝癌細胞中磷酸化NKCC1蛋白的含量，從而抑制肝癌細胞的增殖、侵襲和轉移。本發(fā)明肝癌的治療具有重大價值。
文檔編號A61P35/04GK102813643SQ20111015538
公開日2012年12月12日 申請日期2011年6月10日 優(yōu)先權日2011年6月10日
發(fā)明者姜穎, 賀福初, 周亞亞, 孫薇, 林巍然, 魏漢東 申請人:北京蛋白質組研究中心