專利名稱：抑制肝癌細(xì)胞生長的發(fā)酵液的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域的制備方法，具體地，涉及一種抑制肝癌細(xì)胞 生長的發(fā)酵液的制備方法。
背景技術(shù)：
肝癌是全世界死亡率很高的疾病， 一般的治療方法是采用手術(shù)切除，但許 多病例中多為中心發(fā)生，極易發(fā)生癌細(xì)胞的早期轉(zhuǎn)移，這種病情限制了手術(shù)切 除的應(yīng)用。因此需要一些藥物的輔助治療，但是現(xiàn)有藥物對(duì)肝癌病人進(jìn)行的全 身化療效果較差，因此尋找新的有效化學(xué)治療藥物對(duì)提高晚期和復(fù)發(fā)肝癌病人 的生存率具有重大意義。
植物內(nèi)生真菌是一類生存在宿主植物莖葉內(nèi)并完成其生活周期的真菌，在 演化過程中二者形成了穩(wěn)定的生態(tài)關(guān)系。內(nèi)生真菌的代謝物能刺激植物生長發(fā) 育，提高寄主植物對(duì)生物和非生物脅迫的抵抗能力，特別是內(nèi)生真菌往往能與 植物相互作用，產(chǎn)生相同或相似的代謝產(chǎn)物?？紤]到微生物具有繁殖迅速，容 易培養(yǎng)，生物量大等特點(diǎn)，研究從藥用植物中分離內(nèi)生真菌，獲得產(chǎn)藥用物質(zhì) 的內(nèi)生真菌，將是一種很有潛力的藥物來源。
胡桃楸(Juglans mandshurica Maxim)是胡桃科胡桃屬的落葉喬木，主要 分布于我國黑龍江省東部小興安嶺、完達(dá)山以及張廣才嶺等山區(qū)，為我國珍貴 樹種之一。楸樹中含有豐富的環(huán)烯醚萜類化合物，不僅有利尿、降血糖及遲緩 和瀉下作用，還有抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)作用；胡桃楸有抗腫瘤活性，有可 能作為有效的端粒酶活性抑制劑。胡桃楸提取液是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而起到 抗腫瘤作用的。胡桃揪的抗腫瘤研究預(yù)示其內(nèi)生真菌也可能具有產(chǎn)抗癌物質(zhì)的 能力。然而，目前還沒有從胡桃楸中分離出具有抗腫瘤效果的內(nèi)生真菌的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種抑制肝癌細(xì)胞生長的發(fā) 酵液的制備方法。本發(fā)明利用從胡桃楸樹皮部分離純化得到純的內(nèi)生真菌菌株，
3并通過傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法，發(fā)酵方法進(jìn)行鑒定，適合工業(yè)規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)具有 抑制人肝癌細(xì)胞株H印G2生長的作用且高效低毒的發(fā)酵液。 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明菌株的獲得本發(fā)明所使用的楸樹內(nèi)生真菌菌株由胡桃楸樹皮中分 離制得。分離方法為取胡桃楸樹皮刮去浮皮，滅菌后削去表層，切取組織小 塊，置于水瓊脂固體平板培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；取切口處新長出的菌絲， 轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌落長出后，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色的差異以及長出時(shí) 間的不同，分別挑取各平板上菌落邊緣處的菌絲接于新的培養(yǎng)基平板上進(jìn)行分 離培養(yǎng)；從中篩選出具有抗腫瘤活性的內(nèi)生真菌，經(jīng)鑒定為半知菌亞門，絲孢 綱，叢梗孢目，木霉菌屬長枝木霉(Trichoderima longibrachiatum)，現(xiàn)保 存在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保存編號(hào)為CCTCC M 208102。
本發(fā)明包括以下步驟
第一步、內(nèi)生真菌的分離分離內(nèi)生真菌并且采用菌絲尖端切割法進(jìn)行純
化；
第二步、誘導(dǎo)孢子產(chǎn)生將長枝木霉CCTCC M 208102接種到馬鈴薯-瓊脂 培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)上培養(yǎng)，將長有菌絲的PDA培養(yǎng)基切下一小塊，放于CMX 培養(yǎng)基(Leach， Lang and Yoder， 1982. Journal of General Microbiology, 128: 1719-1729中公開)上，室溫下培養(yǎng)，1到3天后有孢子長出；
第三歩、液體發(fā)酵培養(yǎng)挑取孢子轉(zhuǎn)接到裝有CM液體培養(yǎng)基(Leach, Lang and Yoder， 1982. Journal of General Microbiology, 128: 1719-1729中公 開)中，26。C到28t:， 180 rpm搖床振蕩培養(yǎng)，7 8天后中止發(fā)酵，即得具有 抑制肝癌細(xì)胞生長作用的發(fā)酵液。
所述第一歩中分離內(nèi)生真菌的方法如下取胡桃楸樹皮刮去浮皮，使用自 來水沖洗20分鐘后置于無菌超凈工作臺(tái)，用無菌水沖洗3到4遍，再用體積百分 比為75。/。的酒精浸泡3到5分鐘，然后用質(zhì)量百分比為P/。的NaC10溶液滅菌20分鐘， 再使用無菌水反復(fù)洗滌4到5遍，用無菌紙吸干樹皮上的無菌水，削去黑色表層， 切取0.5cnV'的小塊，置于水瓊脂固體平板培養(yǎng)基上，放入25'C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
所述第一歩中的純化方法如下取切口處新長出的菌絲，及時(shí)轉(zhuǎn)接至新鮮 的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌落長出后，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色的差異以及長出時(shí)間的不同，分別挑取各平板上菌落邊緣處的菌絲接于新的PDA平板上進(jìn)行分離 培養(yǎng)，然后切取培養(yǎng)菌絲的尖端，移入一新的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，切割3到5次即 可得到純化的菌株。
所述第二步中PDA培養(yǎng)基組成為200 g新鮮土豆煮的汁，20 g葡萄糖， 固體培養(yǎng)基加1.5%瓊脂，加蒸餾水至總體積為1000 ml。
本發(fā)明所述的一種從楸樹樹皮中分離出來的內(nèi)生真菌長枝木霉CCTCC M 208102的生物學(xué)特性如下
1、 菌落形態(tài)特征固體培養(yǎng)基上，菌落產(chǎn)生白色絨狀菌絲體，呈輻射狀分
布，菌絲發(fā)達(dá)，液體培養(yǎng)液中形成均勻的圓形菌球，菌球表面粗糙有絲狀，質(zhì) 地疏松，發(fā)酵液呈黃色。
2、 孢子形態(tài)特征肉眼觀孢子為綠色，顯微觀察可見孢子為橢球型，表面 光滑。分生孢子梗的主軸長而粗壯，二次分支短，且分枝呈壇形，柄梗常常單 生，孢子著生于二次分支的頂端。
3、 培養(yǎng)特征該菌在PDA平板上生長迅速，接種2天即可見直徑約2厘
米的菌落，正面觀菌絲為白色絨狀，輻射狀向外生長，菌體分泌黃色色素類物
質(zhì)，使得培養(yǎng)基反面均勻呈淡黃色。在CMX培養(yǎng)基上培養(yǎng)能很快長出孢子，產(chǎn) 孢簇松散，孢子為綠色。在液體培養(yǎng)液中發(fā)酵后菌體呈圓形，表面粗糙有絲狀， 質(zhì)地疏松，發(fā)酵液呈淡黃色，并有一種芳香氣味。
4、 菌株具有較好的穩(wěn)定性菌株繼代培養(yǎng)5次，發(fā)酵液仍具有很好的活
性，發(fā)酵液具有較好的熱穩(wěn)定性，在80'C以下處理2小時(shí)，仍具有較好的活性。 可以在-2(TC保存3個(gè)月以上。
本發(fā)明通過利用從胡桃楸樹皮部分離純化得到純的內(nèi)生真菌菌株，其發(fā)酵 液高效低毒具有抑制人肝癌細(xì)胞株H印G2生長的作用，顯示出較好的癌細(xì)胞選 擇性。同時(shí)考慮到發(fā)酵液成份具有較好的水溶性，避免了目前抗癌藥物水溶性 差的弊端，具有良好的開發(fā)前景。
本發(fā)明所使用的菌株為
菌株分類命名木霉菌屬長枝木霉(Trichoderima longibrachiatum)， 保藏單位名稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)， 保藏H期2008年6月27 R，保存號(hào)CCTCC M 208102。


圖1長枝木霉CCTCC M 208102在PDA平板上的形態(tài)學(xué)圖。 圖2長枝木霉CCTCC M 208102真菌孢子顯微鏡下圖。 圖3長枝木霉CCTCC M 208102真菌發(fā)酵液圖。
圖4不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵液對(duì)H印G2及HL-7702增殖抑制率情況示意圖。
具體實(shí)施例方式
以下對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提 下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述 的實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或 按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例l
內(nèi)生真菌的分離
取胡桃楸樹皮刮去浮皮，在自來水下沖洗20分鐘后置于無菌超凈工作臺(tái)， 用無菌水沖洗3 4遍，用體積百分比為75%的酒精浸泡3 5分鐘，然后用質(zhì)量百 分比為l。/。的NaC10溶液滅菌20分鐘，再使用無菌水反復(fù)洗滌4 5遍，用無菌紙吸 干樹皮上的無菌水，削去黑色表層，切取0.5 cmX0.5 cm的小塊，置于水瓊脂 固體平板培養(yǎng)基上，放入25'C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
取切口處新長出的菌絲，及時(shí)轉(zhuǎn)接至新鮮的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌落長出 后，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色的差異以及長出時(shí)間的不同，分別挑取各平板上菌落 邊緣處的菌絲接于新的PDA平板上進(jìn)行分離培養(yǎng)。切取培養(yǎng)菌絲的尖端，移入一 新的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，切割3 5次即可得到純化的菌絲。對(duì)菌株編號(hào)后，轉(zhuǎn)至PDA 斜面培養(yǎng)基上，于28'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 5天，期間觀察并記錄菌株生長形態(tài)，
然后放入4t:冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2
楸樹內(nèi)生真菌的鑒定
菌落形態(tài)固體培養(yǎng)基上，菌落產(chǎn)生白色絨狀菌絲體，呈輻射狀分布，菌 絲發(fā)達(dá)，如圖1所示。液體培養(yǎng)液中形成均勻的圓形菌球，菌球表面粗糙有絲狀， 質(zhì)地疏松，發(fā)酵液呈黃色。
6孢子形態(tài)肉眼觀孢子為綠色，顯微觀察可見孢子為橢球型，表面光滑。 分生孢子梗的主軸長而粗壯，二次分支短，且分枝呈壇形，柄梗常常單生，孢 子著生于二次分支的頂端。顯微鏡下觀該分生孢子梗的主軸長，著生的二次分 支短，再次分枝少，且分枝呈壇形和柄梗常常單生；此外，分生孢子為單細(xì)胞， 呈橢圓形。如圖2所示。
培養(yǎng)特征該菌在PDA平板上生長迅速，接種2天即可見直徑約2厘米的 菌落，正面觀菌絲為白色絨狀，輻射狀向外生長，菌體分泌黃色色素類物質(zhì)， 使得培養(yǎng)基反面均勻呈淡黃色。在CMX培養(yǎng)基上培養(yǎng)能很快長出孢子，產(chǎn)孢簇 松散，孢子為綠色。在液體培養(yǎng)液中發(fā)酵后菌體呈圓形，表面粗糙有絲狀，質(zhì) 地疏松，發(fā)酵液呈淡黃色，如圖3所示，并有一種芳香氣味。
菌株具有較好的穩(wěn)定性，繼代培養(yǎng)5次，發(fā)酵液仍具有很好的活性，發(fā)酵 液具有較好的熱穩(wěn)定性，在8(TC以下處理2小時(shí)，仍具有較好的活性?？梢栽?-20。C保存3個(gè)月以上。
經(jīng)過鑒定該內(nèi)生真菌為半知菌亞門，絲孢綱，叢梗孢目，木霉菌屬長枝木 霉(Trichoderima longibrachiatum)。 實(shí)施例3
抑制肝癌細(xì)胞生長的發(fā)酵液的制備
將分離出來的長枝木霉CCTCC M 208102于PDA平板上培養(yǎng)，然后將長有菌絲 的PDA培養(yǎng)基切下一小塊，放于CMX培養(yǎng)基上，于室溫下培養(yǎng)，兩天后可見有孢 子長出。然后挑取孢子轉(zhuǎn)接到裝有250ml CM液體培養(yǎng)基的三角瓶中，26'C到 28°C， 180rpm搖床振蕩培養(yǎng)，7 8天后中止發(fā)酵，即得具有抑制人肝癌細(xì)胞株 H印G2生長作用的發(fā)酵液。收集菌液用于抗腫瘤活性初步分析。 實(shí)施例4
真菌發(fā)酵液的體外抗癌試驗(yàn)
用含重量百分比為10%的胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)液(購自Gibco 公司)培養(yǎng)的人肝癌H印G2細(xì)胞株(購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子與遺 傳研究室)以及人肝正常細(xì)胞HL-7702 (購自中國生命科學(xué)院生化與細(xì)胞所)以 1X10MV孔接種于96孔板，37°C, 5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后用系列梯度(發(fā) 酵液稀釋倍數(shù)分別為40， 20， 10, 5)稀釋后的發(fā)酵液處理細(xì)胞，每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孑L，以未發(fā)酵的CM培養(yǎng)液作空白對(duì)照，以姜黃素作為陽性對(duì)照，于37'C， 5%C02 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至24h后，加入3- (4， 5-二甲基噻唑-2) -2, 5-二苯基 四氮唑溴鹽(MTT)孵育4h后，吸棄上清液，加入150yL/孔二甲基亞砜(DMSO) 振蕩IO min，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上檢測(cè)570nm處的0D值。重復(fù)三次。
由圖4可以看出，MTT法結(jié)合定時(shí)顯微鏡觀察記錄顯示真菌發(fā)酵液對(duì)人肝癌 細(xì)胞株H印G2有較強(qiáng)的抑制作用，發(fā)酵液雖然對(duì)正常細(xì)胞也具有一定的抑制或 殺傷作用，但不如對(duì)肝癌細(xì)胞作用強(qiáng)。
8
權(quán)利要求
1、一種抑制肝癌細(xì)胞生長的發(fā)酵液的制備方法，其特征在于，包括如下步驟第一步、內(nèi)生真菌的分離分離內(nèi)生真菌并且采用菌絲尖端切割法進(jìn)行純化；第二步、誘導(dǎo)孢子產(chǎn)生將長枝木霉CCTCC M 208102接種到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將長有菌絲的PDA培養(yǎng)基切下一小塊，放于CMX培養(yǎng)基上，室溫下培養(yǎng)，1到3天后有孢子長出；第三步、液體發(fā)酵培養(yǎng)挑取孢子轉(zhuǎn)接到裝有CM液體培養(yǎng)基中，26℃到28℃，180rpm搖床振蕩培養(yǎng)，7到8天后中止發(fā)酵，即得具有抑制肝癌細(xì)胞生長作用的發(fā)酵液。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制肝癌細(xì)胞生長的發(fā)酵液的制備方法，其特 征是，第一歩中分離內(nèi)生真菌的方法如下取胡桃楸樹皮刮去浮皮，使用自來 水沖洗20分鐘后置于無菌超凈工作臺(tái)，用無菌水沖洗3到4遍，再用體積百分 比為75%的酒精浸泡3到5分鐘，然后用質(zhì)量百分比為1%的NaClO溶液滅菌20 分鐘，再使用無菌水反復(fù)洗滌4到5遍，用無菌紙吸干樹皮上的無菌水，削去 黑色表層，切取0.5 cnr'的小塊，置于水瓊脂固體平板培養(yǎng)基上，放入25'C培 養(yǎng)箱培養(yǎng)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制肝癌細(xì)胞生長的發(fā)酵液的制備方法，其特 征是，第一步中的純化，其方法如下取切口處新長出的菌絲，及時(shí)轉(zhuǎn)接至新 鮮的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌落長出后，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色的差異以及長出 時(shí)間的不同，分別挑取各平板上菌落邊緣處的菌絲接于新的PDA平板上進(jìn)行分 離培養(yǎng)，然后切取培養(yǎng)菌絲的尖端，移入一新的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，切割3到5次 即得到純化的菌絲。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制肝癌細(xì)胞生長的發(fā)酵液的制備方法，其特 征是，第二歩中PDA培養(yǎng)基組成為200 g新鮮土豆煮的汁，20g葡萄糖，固 體培養(yǎng)基加1.5%瓊脂，加蒸餾水至總體積為1000 ml。
全文摘要
一種分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域的制備方法，該制備方法包括如下步驟第一步、內(nèi)生真菌的分離分離內(nèi)生真菌并且采用菌絲尖端切割法進(jìn)行純化；第二步、誘導(dǎo)孢子產(chǎn)生將長枝木霉CCTCC M 208102接種到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將長有菌絲的PDA培養(yǎng)基切下一小塊，放于CMX培養(yǎng)基上，室溫下培養(yǎng)，1到3天后有孢子長出；第三步、液體發(fā)酵培養(yǎng)挑取孢子轉(zhuǎn)接到裝有CM液體培養(yǎng)基中，26℃到28℃，180rpm搖床振蕩培養(yǎng)，7到8天后中止發(fā)酵，即得具有抑制肝癌細(xì)胞生長作用的發(fā)酵液。本發(fā)明適合工業(yè)規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)具有抑制人肝癌細(xì)胞株HepG2生長的作用且高效低毒的發(fā)酵液。
文檔編號(hào)C12P1/02GK101487022SQ20081004121
公開日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2008年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月31日
發(fā)明者唐克軒, 李美芽, 苗志奇 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)