鐵帚清濁片在制備抑制肝癌細(xì)胞h22細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種鐵帚清濁片在制備抑制肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用及鐵帚清濁片的制備方法。本發(fā)明的鐵帚清濁片在制備抑制肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，所述鐵帚清濁片由豬殃殃417g、鐵掃帚417g、粉萆薢333g、魚腥草417g、蒲公英417g、黑螞蟻250g、預(yù)知子417g、車前子250g、茯苓250g、山藥250g、益智167g、菟絲子250g、沙苑子250g、金櫻根333g、遠(yuǎn)志125g、甘草50g作為原料藥制成，采用超臨界萃取和微波萃取制備而成，使得薯蕷皂苷元含量有很大提高。
【專利說明】鐵帚清濁片在制備抑制肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種鐵帚清濁片在制備抑制肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用及鐵帚清濁片的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鐵帚清濁丸標(biāo)準(zhǔn)號WS-10190 (ZD-0190) 2002，記載于國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編內(nèi)科外科婦科分冊。由豬殃殃417g、鐵掃帚417g、粉萆蘚333g、魚腥草417g、蒲公英417g、黑螞蟻250g、預(yù)知子417g、車前子250g、獲茶250g、山藥250g、益智167g、英絲子250g、沙苑子250g、金樓根333g、遠(yuǎn)志125g、甘草50g作為原料藥制成,具有清熱解毒、利濕去池的功效。用于慢性前列腺炎下焦?jié)駸嶙C。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中，尚未有鐵帚清濁丸在在制備抑制肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用的報道，也未見有鐵帚清濁丸提取制備方面采用超臨界和微波技術(shù)的報道，而直接粉碎、滲漉、揮發(fā)油提取，水煎煮的方法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導(dǎo)致患者用量過大，不方便服用，嚴(yán)重影響了本品在臨床上應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:本發(fā)明的目的在于提供一種鐵帚清濁片在制備抑制肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的另一個目的在于提供一種鐵帚清濁片的制備方法。
[0006]本發(fā)明的目的是通過如下的方案實現(xiàn)的:
[0007]鐵帚清濁片在制備抑制肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，所述鐵帚清濁片由豬殃殃417g、鐵掃帚417g、粉萆蘚333g、魚腥草417g、蒲公英417g、黑螞蟻250g、預(yù)知子417g、車前子250g、獲茶250g、山藥250g、益智167g、英絲子250g、沙苑子250g、金樓根333g、遠(yuǎn)志125g、甘草50g作為原料藥制成,所述鐵帚清池片的制備方法由下列步驟組成:取鐵掃帚、黑螞蟻、魚腥草、益智，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生藥.min，萃取時間330-370min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎成粗粉，加入15L的60%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次15-25分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重0.5g。
[0008]優(yōu)選的，上述的鐵帚清濁片在制備抑制肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述鐵帚清濁片的制備方法由下列步驟組成:取鐵掃帚、黑螞蟻、魚腥草、益智，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力25MPa，溫度40°C，CO2流量5ml/g生藥.π?η，萃取時間350min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎成粗粉，加入15L的30%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次20分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-1O大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重0.5g。
[0009]現(xiàn)有技術(shù)中，鐵帚清濁丸每次6g，一日3次。鐵帚清濁丸服藥量大，且丸劑味道不好，患者依從性差。采用本發(fā)明方法制備成的鐵帚清濁片每片重0.5g，每次僅需3片，一日服用3次。在具有更多活性成分的條件下大大減少了服用量。此結(jié)論可以通過下述試驗證明。且制備成片劑，患者隨水吞下即可，服藥量小且無苦味，患者易于接受。
[0010]試驗一、不同方法制備的鐵帚清濁片中薯蕷皂苷元含量的比較
[0011]1、儀器及試藥本發(fā)明鐵帚清濁片:按實施例1方法制備，使用4785g原料藥，經(jīng)提取制成500片，每片重0.5g。原鐵帚清濁丸，按照WS-10190(ZD-0190)2002標(biāo)準(zhǔn)方法制備。Agilentl200高效液相色譜儀；METTLER AE240電子分析天平；薯蕷皂苷元對照品(中國藥品生物制品檢定所)。
[0012]2、方法
[0013]照高效液相色譜法(中國藥典2010年版一部附錄VI D)測定。
[0014]色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇一乙腈(60:40)為流動相；檢測波長為206nm。理論板數(shù)按薯蕷皂苷元峰計算應(yīng)不低于3000。
[0015]對照品溶液的制備精密稱取在60°C減壓干燥4小時的薯蕷皂苷元對照品適量，加甲醇制成每Iml含0.15mg的溶液，即得。
[0016]供試品溶液的制備取本品20片，研細(xì)，取0.25g，精密稱定，置50ml圓底燒瓶中，加2mol/L硫酸溶液30ml，加熱回流2小時，取出，冷卻，濾過，用適量水洗滌容器及濾渣，濾洛烘干(70~80°C ),用氯仿加熱回流3次(20ml、15ml、15ml),每次15分鐘,濾過,合并濾液，揮干氯仿，殘渣加流動相適量使溶解，轉(zhuǎn)移至IOml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μ m)濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0017]對照產(chǎn)品供試品溶液的制備取本品10g，精密稱定，研細(xì)，取0.50g，精密稱定，置50ml圓底燒瓶中，加2mol/L硫酸溶液30ml，加熱回流2小時，取出，冷卻，濾過，用適量水洗滌容器及濾渣，濾渣烘干(70~80°C)，用氯仿加熱回流3次(20ml、15ml、15ml)，每次15分鐘，濾過，合并濾液，揮干氯仿，殘渣加流動相適量使溶解，轉(zhuǎn)移至IOml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μ m)濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0018]含粉萆蘚以薯蕷皂苷元(C27H42O3)計，不得少于0.030mg。
[0019]3、結(jié)果
[0020]結(jié)果表明，本發(fā)明鐵帚清濁片中薯蕷皂苷元的含量為1.2-2.4mg/片；而原鐵帚清濁丸中薯蕷皂苷元的含量為0.32mg/g，每次服`用量3片的薯蕷皂苷元含量為原丸劑IOg含量的4-8倍，在服用量減少的情況下，薯蕷皂苷元含量有很大提高。
[0021]上述研究表明，采用本發(fā)明制備方法制備的鐵帚清濁片，有效成分含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于WS-10190 (ZD-0190) 2002標(biāo)準(zhǔn)記載的方法制備的鐵帚清濁丸。
【具體實施方式】[0022]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作更進一步的說明，以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解本發(fā)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0023]實施例1
[0024]取豬殃殃417g、鐵掃帚417g、粉萆蘚333g、魚腥草417g、蒲公英417g、黑螞蟻250g、預(yù)知子417g、車前子250g、獲茶250g、山藥250g、益智167g、英絲子250g、沙苑子250g、金櫻根333g、遠(yuǎn)志125g、甘草50g，將鐵掃帚、黑螞蟻、魚腥草、益智，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力25MPa，溫度40°C，CO2流量5ml/g生藥.min，萃取時間350min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎成粗粉，加入15L的30%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次20分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重0.5g。 [0025]經(jīng)檢測，成品中薯蕷皂苷元的含量為2.38mg/片。
[0026]實施例2
[0027]取豬殃殃417g、鐵掃帚417g、粉萆蘚333g、魚腥草417g、蒲公英417g、黑螞蟻250g、預(yù)知子417g、車前子250g、獲茶250g、山藥250g、益智167g、英絲子250g、沙苑子250g、金櫻根333g、遠(yuǎn)志125g、甘草50g，將鐵掃帚、黑螞蟻、魚腥草、益智，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力15MPa，溫度30°C，CO2流量lml/g生藥.min，萃取時間370min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎成粗粉，加入15L的60%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次15分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重0.5g。
[0028]經(jīng)檢測，成品中薯蕷皂苷元的含量為1.27mg/片。
[0029]實施例3
[0030]取豬殃殃417g、鐵掃帚417g、粉萆蘚333g、魚腥草417g、蒲公英417g、黑螞蟻250g、預(yù)知子417g、車前子250g、獲茶250g、山藥250g、益智167g、英絲子250g、沙苑子250g、金櫻根333g、遠(yuǎn)志125g、甘草50g，將鐵掃帚、黑螞蟻、魚腥草、益智，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力30MPa，溫度50°C，CO2流量3ml/g生藥.min，萃取時間3300min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎成粗粉，加入15L的60%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次25分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重 0.5g。
[0031]經(jīng)檢測，成品中薯蕷皂苷元的含量為1.84mg/片。[0032]實施例4:鐵帚清濁片抑制小鼠肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞增殖的實驗研究資料
[0033]1.實驗材料
[0034]1.1實驗用細(xì)胞株
[0035]小鼠肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞，山東大學(xué)實驗室細(xì)胞庫，DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。
[0036]1.2實驗藥物
[0037]研究藥物:本發(fā)明鐵帚清濁片:按實施例1方法制備。
[0038]藥液儲液:稱取IOOmg鐵帚清池片，溶于5ml無水乙醇中，0.2 μ m濾器過濾，500 μ Idoff管分裝，-20°c存儲，同時0.2 μ m濾器過濾無水乙醇以備對照組之用。[0039]1.3實驗試劑
[0040]DMEM(GIBC0 公司 Cat.N0.12100_061Lot.N0.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.N0.100419) ;NaHC03(上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat.N0.11810_033Lot.N0.1088387) ；Trypsin (AMRESC0 公司);EDTA (AMRESC0 公司);Penicillin G Sodium Salt(AMRESCO公司I) !Streptomycin Sulfate(AMRESCO);無水乙醇(溜博亞杜蘭經(jīng)貿(mào)有限公司)；MTT (Biosharp 批號:0793) =PBS (實驗室自配)；
[0041]1.4實驗器材
[0042]萊卡倒置顯微鏡(德國Leica型號:DMIL);可見-紫外光微孔板檢測儀(美國MD公司型號:SPECTRAMAX190);C02培養(yǎng)箱(F0RMA型號:3111);超凈臺(蘇凈集團安泰公司制造型號=SW-CJ-ZFD);純水儀(美國Spring公司型號:S/N020579);精密移液器(法國吉爾森公司型號:P2);電子天平(德國賽多利斯有限公司型號:BT323S);全自動高壓滅菌鍋(日本SANYO公司型號:MLS-3020);臺式電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實驗設(shè)備公司型號:DHG9123A);冰箱(西門子公司型號:KG18V21TI);液氮罐(CBS型號:2001);低速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠型號:ΚΑ-1000);0.2μπι濾器(MILLIP0RE 型號:SLGP033RB);lcm 培養(yǎng)皿(NEST 公司)、96孔培養(yǎng)板(NEST公司)；細(xì)胞計數(shù)板；離心管、移液管、Tips若干。
[0043]2.實驗方法
[0044]I) H22細(xì)胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02進行常規(guī)培養(yǎng)(IOcm培養(yǎng)皿)，當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)期時，收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA,37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)入離心管中，1000rpm離心5min，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度3X IO4個/ml。
[0045]2)將細(xì)胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液180 μ 1，培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37°C，5%C02)常規(guī)培養(yǎng)。
[0046]3)根據(jù)細(xì)胞生長情況，一般長至50%_70%，加入鐵帚清濁片溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
[0047]4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
[0048]5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔如入200 μ I 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。
[0049]6)同時設(shè)置本底(不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液)，對照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定6個復(fù)孔。
[0050]7)結(jié)果以藥物對細(xì)胞的抑制率表示:細(xì)胞增值抑制率(%)=(對照孔OD值-給藥孔OD值)、對照孔OD值X 100%。實驗重復(fù)3次。
[0051]3.統(tǒng)計處理[0052]采用Microsoft Excel2007軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗,數(shù)據(jù)以mean± S.D.表不。
[0053]4.實驗結(jié)果
[0054]MTT法實驗后統(tǒng)計結(jié)果顯示，與對照組比較，當(dāng)劑量達到5mg/ml時，對H22細(xì)胞增殖抑制有差異(p〈0.05)，劑量在10mg/ml時該差異具有顯著性(P〈0.01)，當(dāng)劑量達到15-20mg/ml時有極顯著性差異(P〈0.001)。
[0055]表1鐵帚清濁片對H22細(xì)胞增殖抑制影響研究(X土 SD)
[0056]
【權(quán)利要求】
1.鐵帚清濁片在制備抑制肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，所述鐵帚清濁片由豬殃殃417g、鐵掃帚417g、粉萆蘚333g、魚腥草417g、蒲公英417g、黑螞蟻250g、預(yù)知子417g、車前子250g、獲茶250g、山藥250g、益智167g、英絲子250g、沙苑子250g、金樓根333g、遠(yuǎn)志125g、甘草50g作為原料藥制成，其特征在于，所述鐵帚清濁片的制備方法由下列步驟組成:取鐵掃帚、黑螞蟻、魚腥草、益智，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生藥.min，萃取時間330-370min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎成粗粉，加入15L的60%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次15-25分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-1O大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重0.5g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鐵帚清濁片在制備抑制肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述鐵帚清濁片的制備方法由下列步驟組成:取鐵掃帚、黑螞蟻、魚腥草、益智，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力25MPa，溫度40°C，CO2流量5ml/g生藥.min，萃取時間350min，得超臨界萃取物，備用；取其余中 藥，粉碎成粗粉，加入15L的30%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次20分鐘，合并萃取液，濃縮,加到Diaion HP-10大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重0.5g。
【文檔編號】A61P1/16GK103690864SQ201310746646
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】孫亞平 申請人:孫亞平