專利名稱：可用于檢測人肝癌細胞株smmc-7721的核酸適體及其篩選方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核酸適配體及其篩選和應(yīng)用，尤其涉及一種可用于檢測人肝癌細胞的核酸適體及其篩選方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
核酸適體(aptamer)是通過指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進化技術(shù)(SELEX)篩選得到的， 能特異結(jié)合IE物質(zhì)的單鏈寡聚核苷酸(ssDNA或ssRNA)。核酸適體與抗體功能類似,但是與抗體相比具有更多的優(yōu)勢，具有更高的親和力與特異性；無免疫原性；能夠化學(xué)合成，成本低；可進行標記；穩(wěn)定性好，易于保存等優(yōu)點。核酸適體的靶分子更為廣泛，包括金屬離子、氨基酸、核酸、多肽、蛋白質(zhì)，并從單一靶標擴展至完整的病毒顆粒及細胞等復(fù)合物靶標。因此，核酸適體具有廣泛的應(yīng)用前景。肝癌是發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，包括原發(fā)性肝癌和轉(zhuǎn)移性肝癌，原發(fā)性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一。全世界每年新發(fā)肝癌患者約60萬，居惡性腫瘤的第五位。對于惡性腫瘤而言，如果能及早發(fā)現(xiàn)、盡早治療，則癌癥的病情往往容易得到控制，降低肝癌發(fā)病引起的死亡風(fēng)險。因此，開發(fā)一種更加靈敏、簡便、高效和具有特異性的肝癌檢測手段，對于肝癌的臨床治療將具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有比蛋白抗體更高的親和力與特異性、無免疫原性、能夠化學(xué)合成、分子量小、穩(wěn)定、易于保存和標記的可用于檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體及其衍生物，還提供前述核酸適體的篩選方法和應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為一種可用于檢測肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體，所述核酸適體的核苷酸序列包括以下序列I 序列5中任意一條序列所示的DNA片段
序列I :
5，-TTGACTTGCCACTGACTACCAATAGTCGAAGACTGATGGTTGAGCTGATGATCCTACGGTGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3，；
序列2
5，-TTGACTTGCCACTGACTACCATTCCGGTTCGTTTCAAAGTTATTGTCTATCTTTTCTAAAGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3，；
序列3
5，-TTGACTTGCCACTGACTACCTCACGGTCGTTTTAGTCGGAGACGTCTATAATTTTTAATTGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3’ ；
序列4 5 ’ -TTGACTTGCCACTGACTACCACAAAGAGTAGGGAAACGTTTTTTCAGGCGATAAAAGCATGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3，；
序列5
5，-TTGACTTGCCACTGACTACCACCTTTCTAGGTGGTTGAGCTGAAGATCGTACCGTGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3，。上述的可用于檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體，所述核酸適體的核苷酸序列上的某一位置可優(yōu)選被磷酸化、甲基化、氨基化、巰基化或同位素化。上述的可用于檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體，所述核酸適體的核苷酸序列上優(yōu)選結(jié)合有生物素、地高辛、熒光物質(zhì)、納米發(fā)光材料或酶標記(例如連接上熒光、放 射性和治療性物質(zhì)等)。以上不論是經(jīng)部分取代或者經(jīng)過修飾后的核苷酸序列，都具有原核酸適體基本相同的性質(zhì)和功能，即都可用于檢測人肝癌細胞株SMMC-7721。作為一個總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種可用于檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體，所述核酸適體的核苷酸序列包括以下三種序列中的任意一種
(1)與上述所列核酸適體的核苷酸序列的同源性在60%以上(例如可將上述核酸適體序列刪除或增加部分互補的核苷酸);
(2)與上述所列核酸適體的核苷酸序列進行雜交的序列；或者
(3)上述所列核酸適體的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的RNA序列。作為一個總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種可用于檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體衍生物，所述衍生物是上述所列核酸適體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是上述核酸適體改造成的相應(yīng)肽核酸。以上不論是衍生出的核酸適體還是衍生出的其他衍生物，都具有原核酸適體基本相同的性質(zhì)和功能，即都可用于檢測人肝癌細胞株SMMC-7721。作為一個總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種上述的核酸適體的篩選方法，包括以下步驟
(1)合成以下序列所示的隨機單鏈DNA文庫和引物
隨機文庫 RS40 :5’ - TTGACTTGCCACTGACTACC(40N) GAAGTCAGTCGGTCGTCATC5’ 引物5’ -Biotin-GATGACGACCGACTGACTTC-3’
3’ 引物5’ -FAM-ITGACTTGCCACTGACTACC-3，；
(2)Cell-SELEX獲得人肝癌細胞株SMMC-7721特異核酸適體培養(yǎng)SMMC-7721細胞至基本鋪滿瓶底，去除培養(yǎng)基后用緩沖液洗滌，然后與隨機序列在冰上孵育后，棄溶液；再將上述隨機文庫溶解、恒溫振蕩后與經(jīng)前述處理后的SMMC-7721細胞在冰上孵育；孵育完成后棄掉孵育瓶內(nèi)的液體，并用緩沖液沖洗孵育瓶，然后用無菌水刮取孵育瓶內(nèi)的SMMC-7721細胞并置于沸水浴中加熱，加熱完成后再離心取上清，即為篩選所得的SMMC-7721特異核酸適體文庫；
(3)PCR擴增文庫將步驟(2)中篩選所得的SMMC-7721特異核酸適體文庫進行常規(guī)PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物；
(4)制備DNA單鏈文庫將鏈霉親和素修飾的瓊脂糖微球離心去上清，再將步驟(3)中PCR擴增所得的雙鏈DNA與瓊脂糖微球在常溫下孵育，通過雙鏈DNA上的生物素與瓊脂糖微球上的鏈霉親和素的親和作用將雙鏈DNA充分捕獲到瓊脂糖微球表面，洗滌后加入堿液至瓊脂糖微球中，常溫下反應(yīng)、離心、收集上清；將上清液過除鹽柱后收集滴下的溶液，此即為DNA單鏈文庫；
(5)重復(fù)篩選將步驟(4)得到的DNA單鏈文庫重復(fù)上述步驟(2) (4)的過程一次；
(6)陰性篩選以人肝癌細胞H印G為對照，將步驟(5)后篩選得到的DNA單鏈文庫進行陰性篩選，陰性篩選的具體操作為培養(yǎng)人肝癌細胞H印G至基本鋪滿瓶底，去除培基后用緩沖液洗滌，然后與無關(guān)序列在冰上孵育后，棄溶液；再將篩選得到的DNA單鏈文庫溶解、恒溫振蕩后與經(jīng)前述處理后的人肝癌細胞H印G在冰上孵育，孵育完成后收集細胞孵育后的溶液；
(7)多輪篩選將步驟(6)所收集的溶液繼續(xù)進行上述步驟(2) (4)的操作過程，然后再依次重復(fù)步驟(6)、步驟(2)、步驟(3)、步驟(4)的過程；重復(fù)篩選過程中用流式細胞 術(shù)監(jiān)測文庫對SMMC-7721細胞識別能力的增強情況，直至文庫對SMMC-7721細胞的識別能力滿足要求后，將所得產(chǎn)物經(jīng)克隆測序分析，最終得到可用于檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體。上述的核酸適體的篩選方法，所述PCR擴增時的工藝條件優(yōu)選為94°C 3min,94°C 30sec,60°C 30sec,72°C 30sec，經(jīng)合適循環(huán)輪數(shù)(可在PCR擴增前進行循環(huán)輪數(shù)的優(yōu)化，選取能夠滿足條帶亮度及特異性好的循環(huán)輪數(shù)作為PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù))，720C 3min。上述的核酸適體的篩選方法，所述步驟(2)中，與無關(guān)序列在冰上孵育的時間優(yōu)選控制在15 min 30min，與所述SMMC-7721細胞在冰上孵育的時間優(yōu)選控制在30 min 60min,所述沸水浴中的加熱時間優(yōu)選控制在10 min 15min ;所述步驟(4)中，與瓊脂糖微球在常溫下孵育的時間優(yōu)選控制在30 min 45min，加入堿液后的反應(yīng)時間優(yōu)選控制在15min 20mino作為一個總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種上述的各核酸適體或者上述的核酸適體衍生物在識別人肝癌細胞株SMMC-7721或者制備檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的試劑盒中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明通過SELEX篩選得到的核酸適配體具有比蛋白抗體更高的親和力與特異性；無免疫原性；能夠體外化學(xué)合成，分子量小，可以對不同部位進行修飾和取代，且序列穩(wěn)定，易于保存，便于標記(不需要標記的二抗)等。采用本發(fā)明的核酸適體進行肝癌細胞的檢測時，操作更為簡單、迅速，由于核酸適體的合成成本較抗體制備成本低，且周期短，重現(xiàn)性好。本發(fā)明的可識別人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體均能特異性且高親和力的識別人肝癌細胞株SMMC-7721，且結(jié)合能力強，解離常數(shù)均在納摩爾范圍以內(nèi)。利用本發(fā)明的核酸適體對其結(jié)合的靶分子進行研究，可以得到其腫瘤標志物，這對于肝癌的早期檢測具有重要意義，在肝癌的診斷方面有良好的應(yīng)用前景。


圖I為本發(fā)明實施例中利用Valfold軟件模擬的FAM-ZYl核酸適體的二級結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為本發(fā)明實施例中利用Valfold軟件模擬的FAM-ZY2核酸適體的二級結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3為本發(fā)明實施例中利用Valfold軟件模擬的FAM-ZY3核酸適體的二級結(jié)構(gòu)示意圖。圖4為本發(fā)明實施例中利用Valfold軟件模擬的FAM-ZY4核酸適體的二級結(jié)構(gòu)示意圖。圖5為本發(fā)明實施例中利用Valfold軟件模擬的FAM-ZY8核酸適體的二級結(jié)構(gòu)示意圖。圖6為本發(fā)明實施例中流式細胞儀檢測五條核酸適體對人肝癌細胞株SMMC-7721的結(jié)合能力的檢測結(jié)果。圖7為本發(fā)明實施例中流式細胞儀檢測五條核酸適體對人肝癌細胞株IfepG的結(jié)合能力的檢測結(jié)果。圖8為本發(fā)明實施例中激光共聚焦檢測五條核酸適體對人肝癌細胞株SMMC-7721的結(jié)合能力及特異性的檢測結(jié)果(圖中的兩組圖片，一個是熒光通道的成像，一個是熒光通 道和明場的疊加成像，是同一個照片不同通道的信息)。圖9為本發(fā)明實施例中流式細胞儀測定FAM-ZYl核酸適體結(jié)合SMMC-7721的解離常數(shù)繪制曲線。圖10為本發(fā)明實施例中流式細胞儀測定FAM-ZY2核酸適體結(jié)合SMMC-7721的解離常數(shù)繪制曲線。圖11為本發(fā)明實施例中流式細胞儀測定FAM-ZY3核酸適體結(jié)合SMMC-7721的解離常數(shù)繪制曲線。圖12為本發(fā)明實施例中流式細胞儀測定FAM-ZY4核酸適體結(jié)合SMMC-7721的解離常數(shù)繪制曲線。圖13為本發(fā)明實施例中流式細胞儀測定FAM-ZY8核酸適體結(jié)合SMMC-7721的解離常數(shù)繪制曲線。
具體實施例方式以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步描述。實施例
一種可用于檢測人上皮源性肝細胞肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體，該核酸適體的核苷酸序列包括以下序列I 序列5中的任意一條序列所示的DNA片段(5’端標記有FAM):FAM-ZYl
5，-TTGACTTGCCACTGACTACCAATAGTCGAAGACTGATGGTTGAGCTGATGATCCTACGGTGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3，；
FAM-ZY2
5，-TTGACTTGCCACTGACTACCATTCCGGTTCGTTTCAAAGTTATTGTCTATCTTTTCTAAAGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3，；
FAM-ZY3
5，-TTGACTTGCCACTGACTACCTCACGGTCGTTTTAGTCGGAGACGTCTATAATTTTTAATTGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3’ ；
FAM-ZY4 5 ’ -TTGACTTGCCACTGACTACCACAAAGAGTAGGGAAACGTTTTTTCAGGCGATAAAAGCATGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3，；
FAM-ZY8
5，-TTGACTTGCCACTGACTACCACCTTTCTAGGTGGTTGAGCTGAAGATCGTACCGTGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3，。上述的各核酸適體的核苷酸序列上的某一位置可被磷酸化、甲基化、氨基化、巰基化或同位素化。上述各核酸適體的核苷酸序列上可結(jié)合生物素、地高辛、熒光物質(zhì)、納米發(fā)光材料或酶標。上述核酸適體的核苷酸序列的骨架還可衍生出可用于檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的硫代磷酸酯骨架，上述核酸適體還可改造成相應(yīng)肽核酸，還可衍生出其他的核 酸適體，衍生出的核酸適體的核苷酸序列可以為以下三種序列中的任意一種
(1)與上述所列核酸適體的核苷酸序列的同源性在60%以上(例如可將上述核酸適體序列刪除或增加部分互補的核苷酸);
(2)與上述所列核酸適體的核苷酸序列進行雜交的序列；或者
(3)上述所列核酸適體的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的RNA序列。本實施例的上述五條可用于檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體主要采用以下篩選方法篩選得到
I.合成以下序列所示的隨機單鏈DNA文庫和引物
隨機文庫 RS40 :5’ - TTGACTTGCCACTGACTACC(40N)GAAGTCAGTCGGTCGTCATC
5，引物5’ -Biotin-GATGACGACCGACTGACTTC-3’
3’ 引物5’ -FAM-ITGACTTGCCACTGACTACC-3，。2. Cell-SELEX獲得人肝癌細胞株SMMC-7721特異核酸適體。2. I細胞預(yù)處理1640培養(yǎng)基加12%小牛血清培養(yǎng)SMMC-7721細胞至鋪滿瓶底95%,去除培基后用10mT, washing buffer洗漆，與ImL含InM隨機序列的binding buffer在冰上孵育15min，棄溶液。2. 2 孵育用 300 ii I binding buffer 溶解 IOnmol 上述的隨機單鏈DNA 文庫，95°C恒溫振蕩5min,迅速放入冰中；在隨機文庫中補充binding buffer至終體積為ImL,與步驟
2.I中已經(jīng)處理好的SMMC-7721細胞在冰上孵育lh。2. 3解離孵育完成后倒出孵育培養(yǎng)瓶內(nèi)的液體，用IOmL washing buffer洗滌孵育培養(yǎng)瓶中的細胞；用ImL無菌水刮取孵育培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞，置于EP管中沸水浴加熱lOmin，12000 rmp離心取上清，即為篩選所得的SMMC-7721特異核酸適體文庫。3.進行PCR擴增文庫取100 U I篩選所得的SMMC-7721特異核酸適體文庫進行常規(guī) PCR 擴增，擴增條件為94°C 3min,94°C 30sec,60°C 30sec,72°C 30sec，經(jīng)合適循環(huán)輪數(shù)，72°C 3min。第一輪篩選后需將全部所得的SMMC-7721特異核酸適體文庫預(yù)擴增10個循環(huán)，再進行本步驟的擴增，得到擴增產(chǎn)物。4.制備DNA單鏈文庫將100 U I鏈霉親和素修飾的瓊脂糖微球5000rmp離心去上清，再用500 u I PBS洗滌，離心去上清；重復(fù)洗滌一次。將步驟3中PCR擴增所得的雙鏈DNA與瓊脂糖微球在常溫下孵育半小時，通過雙鏈DNA上的生物素與瓊脂糖微球上的鏈霉親和素的親和作用將雙鏈DNA充分捕獲到瓊脂糖微球表面；5000rmp離心去上清，用PBS離心洗滌兩次。然后加入200mM NaOH溶液500 U I至瓊脂糖微球中用于雙鏈DNA的變性處理，常溫反應(yīng)15min, 5000rmp離心5min,收集上清。除鹽柱用IOmL無菌水洗漆后,加入堿變性后收集得到的上清液，自然滴完。加入ImL無菌水，收集滴下的溶液，此即為DNA單鏈文庫。5.重復(fù)篩選將步驟(4)得到的DNA單鏈文庫重復(fù)上述步驟2 4所示的陽性篩選(即步驟2)、PCR擴增及制取單鏈DNA文庫過程。6.陰性篩選在第三輪篩選及以后，以人肝癌細胞H印G為對照，將步驟(5)后篩選得到的DNA單鏈文庫進行陰性篩選，陰性篩選的具體操作為培養(yǎng)人肝癌細胞H印G至鋪滿瓶底95%，去除培基后用緩沖液洗滌，然后與無關(guān)序列在冰上孵育后，棄溶液；再將篩選 得到的DNA單鏈文庫溶解、恒溫振蕩后與經(jīng)前述處理后的人肝癌細胞H印G在冰上孵育，孵育完成后收集細胞孵育后的溶液。7.多輪篩選將步驟6所收集的溶液繼續(xù)進行上述步驟2 4的操作過程，然后再依次重復(fù)步驟6、步驟2、步驟3、步驟4的過程；在第一輪篩選以后，用于細胞孵育篩選的文庫量約為200pmol，從第三輪篩選開始，陽性篩選細胞預(yù)處理的孵育溶液中需加入胎牛血清，隨著篩選輪數(shù)的增加，添加量從5%增加至20% ;重復(fù)篩選過程中用流式細胞術(shù)監(jiān)測所得文庫對SMMC-7721細胞識別能力的增強情況，直至13輪篩選后文庫對SMMC-7721細胞的識別能力滿足要求，將所得產(chǎn)物(產(chǎn)物中含有19條序列)經(jīng)克隆測序分析，對測序結(jié)果整理分析后，最終可得到富集度高的五條序列，這五條序列即為本實施例的可用于檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體。考察I :用Valfold軟件對該本實施例五條序列進行二級結(jié)構(gòu)模擬。用Valfold軟件對本實施例的五條序列進行二級結(jié)構(gòu)模擬后的結(jié)構(gòu)示意圖如圖I 圖5所示?？疾? :流式細胞儀檢測本實施例五條核酸適體與SMMC-7721細胞的結(jié)合效果及其特異性。將處于對數(shù)期生長的SMMC-7721細胞用胰酶消化后打散，在培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)4h, 2000rpm離心去上清,用5mL PBS離心洗漆兩次。細胞與含250nM DNA序列的bindingbuffer冰上孵育半小時，2000rmp去上清，用ImL binding buffer洗漆兩次，最后加入400 u I binding buffer，用于流式細胞儀檢測，以人肝癌細胞株H印G作為對照，檢測結(jié)果如圖6、圖7所示。由圖6、圖7流式細胞術(shù)的檢測結(jié)果證明，本實施例的ZYl、ZY2、ZY3、ZY4、ZY8五條核酸適體均對靶細胞人肝癌細胞SMMC-7721具有較強的特異性識別能力，而對對照細胞人肝癌細胞株H印G無識別，與陰性探針(FAM-RS80)也無識別。FAM-RS80
FAM-5， -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3，
注N代表A、T、G、C中任一堿基?？疾? :激光共聚焦檢測本實施例五條核酸適體與SMMC-7721細胞的結(jié)合效果及其特異性。在激光共聚焦小皿中分別培養(yǎng)人肝癌細胞SMMC-7721和人肝癌細胞株HepG，倒出培養(yǎng)基，用PBS將細胞洗滌三次。細胞與含250nM上述本實施例五條核酸適體的bindingbuffer冰上孵育半小時，倒出反應(yīng)液，用binding buffer洗漆兩次，最后加入200 U Ibinding buffer用于檢測,檢測結(jié)果如圖8所示。檢測結(jié)果表明本實施例的五條核酸適體均能識別原位生長狀態(tài)下的靶細胞SMMC-7721，而不能識別對照細胞IfepG?？疾? :流式細胞儀測定本實施例五條核酸適體對SMMC-7721細胞的解離常數(shù)。特異性檢測的操作與考察2的操作基本一致，平行配制不同濃度的含本實施例核酸適體的反應(yīng)液與SMMC-7721細胞孵育，以流式細胞儀的熒光幾何平均值為縱坐標，以核酸適體的濃度為橫坐標，由Y=B_*X/(Kd+X)方程模擬曲線，得到本實施例五條核酸適體的解離常數(shù)繪制曲線如圖9 圖13，由此可得到解離常數(shù)Kd如下表I所示。圖9 圖13及表I的檢測結(jié)果表明ZY1、ZY2、ZY3、ZY4、ZY8與靶細胞SMMC-7721細胞的結(jié)合能力很強，解離常數(shù)均在納摩爾級別。 表I :解離常數(shù)結(jié)果 ^_
序列名Kd (nM)_
權(quán)利要求
1.ー種可用于檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體，所述核酸適體的核苷酸序列包括以下序列I 序列5中的任意一條序列所示的DNA片段 序列I :5，-TTGACTTGCCACTGACTACCAATAGTCGAAGACTGATGGTTGAGCTGATGATCCTACGGTGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3，； 序列2 5，-TTGACTTGCCACTGACTACCATTCCGGTTCGTTTCAAAGTTATTGTCTATCTTTTCTAAAGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3，； 序列3 5，-TTGACTTGCCACTGACTACCTCACGGTCGTTTTAGTCGGAGACGTCTATAATTTTTAATTGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3’ ； 序列4 5，-TTGACTTGCCACTGACTACCACAAAGAGTAGGGAAACGTTTTTTCAGGCGATAAAAGCATGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3，； 序列5 5，-TTGACTTGCCACTGACTACCACCTTTCTAGGTGGTTGAGCTGAAGATCGTACCGTGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3，。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的可用于檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體，其特征在于所述核酸適體的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巰基化或同位素化。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的可用于檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體，其特征在于所述核酸適體的核苷酸序列上結(jié)合有生物素、地高辛、熒光物質(zhì)、納米發(fā)光材料或酶標記。
4.ー種可用于檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體，其特征在于所述核酸適體的核苷酸序列包括以下三種序列中的任意ー種 (1)與權(quán)利要求I或2或3中所述核酸適體的核苷酸序列的同源性在60%以上； (2)與權(quán)利要求I或2或3中所述核酸適體的核苷酸序列進行雜交的序列；或者 (3)權(quán)利要求I或2或3中所述核酸適體的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的RNA序列。
5.ー種可用于檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體衍生物，其特征在于所述衍生物是權(quán)利要求I或2或3中所述核酸適體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是權(quán)利要求I或2或3中所述核酸適體改造成的相應(yīng)肽核酸。
6.一種如權(quán)利要求I所述的核酸適體的篩選方法，包括以下步驟 (1)合成以下序列所示的隨機單鏈DNA文庫和引物隨機文庫 RS40 :5’ - TTGACTTGCCACTGACTACC(40N)GAAGTCAGTCGGTCGTCATC5’ 引物5’ -Biotin-GATGACGACCGACTGACTTC-3’3’ 引物5’ -FAM-ITGACTTGCCACTGACTACC-3，； (2)Cell-SELEX獲得人肝癌細胞株SMMC-7721特異核酸適體培養(yǎng)SMMC-7721細胞至基本鋪滿瓶底，去除培養(yǎng)基后用緩沖液洗滌，然后與隨機序列在冰上孵育后，棄溶液；再將上述隨機文庫溶解、恒溫振蕩后與經(jīng)前述處理后的SMMC-7721細胞在冰上孵育；孵育完成后棄掉孵育瓶內(nèi)的液體，并用緩沖液沖洗孵育瓶，然后用無菌水刮取孵育瓶內(nèi)的SMMC-7721細胞并置于沸水浴中加熱，加熱完成后再離心取上清，即為篩選所得的SMMC-7721特異核酸適體文庫； (3)PCR擴增文庫將步驟(2)中篩選所得的SMMC-7721特異核酸適體文庫進行常規(guī)PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物； (4)制備DNA單鏈文庫將鏈霉親和素修飾的瓊脂糖微球離心去上清，再將步驟(3)中PCR擴增所得的雙鏈DNA與瓊脂糖微球在常溫下孵育，通過雙鏈DNA上的生物素與瓊脂糖微球上的鏈霉親和素的親和作用將雙鏈DNA充分捕獲到瓊脂糖微球表面，洗滌后加入堿液至瓊脂糖微球中，常溫下反應(yīng)、離心、收集上清；將上清液過除鹽柱后收集滴下的溶液，此即為DNA單鏈文庫； (5)重復(fù)篩選將步驟(4)得到的DNA單鏈文庫重復(fù)上述步驟(2) (4)的過程一次； (6)陰性篩選以人肝癌細胞H印G為對照，將步驟(5)后篩選得到的DNA單鏈文庫進行陰性篩選，陰性篩選的具體操作為培養(yǎng)人肝癌細胞H印G至基本鋪滿瓶底，去除培基后用緩沖液洗滌，然后與無關(guān)序列在冰上孵育后，棄溶液；再將篩選得到的DNA單鏈文庫溶解、恒溫振蕩后與經(jīng)前述處理后的人肝癌細胞H印G在冰上孵育，孵育完成后收集細胞孵育后的溶液； (7)多輪篩選將步驟(6)所收集的溶液繼續(xù)進行上述步驟(2) (4)的操作過程，然后再依次重復(fù)步驟(6)、步驟(2)、步驟(3)、步驟(4)的過程；重復(fù)篩選過程中用流式細胞術(shù)監(jiān)測文庫對SMMC-7721細胞識別能力的增強情況，直至文庫對SMMC-7721細胞的識別能カ滿足要求后，將所得產(chǎn)物經(jīng)克隆測序分析，最終得到可用于檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的篩選方法，其特征在于，所述PCR擴增時的エ藝條件為94°C3min，94°C 30sec,60°C 30sec，72°C 30sec，經(jīng)合適循環(huán)輪數(shù)，72°C 3min。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的篩選方法，其特征在于所述步驟(2)中，與隨機序列在冰上孵育的時間控制在15min 30min，與所述SMMC-7721細胞在冰上孵育的時間控制在30min 60min,所述沸水浴中的加熱時間控制在IOmin 15min ;所述步驟(4)中，與瓊脂糖微球在常溫下孵育的時間控制在30min 45min,加入堿液后的反應(yīng)時間控制在15min 20mino
9.一種如權(quán)利要求I 4中任一項所述的核酸適體或者如權(quán)利要求5所述的核酸適體衍生物在識別人肝癌細胞株SMMC-7721或者制備檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可用于檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體，包括序列1～序列5中所示的DNA片段，還包括該核酸序列的一系列衍生物。本發(fā)明核酸適體的篩選方法包括以下步驟首先合成隨機單鏈DNA文庫和引物，然后Cell-SELEX獲得人肝癌細胞株SMMC-7721特異核酸適體，PCR擴增文庫，制備DNA單鏈文庫，然后經(jīng)過重復(fù)篩選、陰性篩選、多輪篩選等步驟后，得到可用于檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體。本發(fā)明的核酸適體可在識別人肝癌細胞株SMMC-7721或者制備檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的試劑盒中應(yīng)用，具有特異性強、無免疫原性、分子量小、穩(wěn)定、易于保存和標記等優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK102766693SQ20121025902
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月25日
發(fā)明者周玉, 王柯敏, 羊小海, 譚譽宇, 郭秋平 申請人:湖南大學(xué)