專利名稱：：穩(wěn)定表達(dá)熒光蛋白的人肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株及其建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬微生物動(dòng)物細(xì)胞系領(lǐng)域，涉及熒光標(biāo)記的人肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株，具體涉及能穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白(RFP)或綠色熒光蛋白(GFP)、具肺與淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移能力的人肝癌細(xì)胞株，及其建立方法。
背景技術(shù)：
：原發(fā)性肝細(xì)胞癌是我國乃至全球的高發(fā)惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國—每年約有20萬人死于肝癌，占全球肝癌死亡人數(shù)的50%左右。原發(fā)性肝細(xì)胞癌已日益成為嚴(yán)重影響人們健康的一種重大惡性疾病。近年來，各國政府、相關(guān)醫(yī)療與科研機(jī)構(gòu)以及藥物研發(fā)和生產(chǎn)企業(yè)加大了對原發(fā)性肝細(xì)胞癌的臨床與基礎(chǔ)研究工作。目前在臨床上有多種肝癌治療方法，如手術(shù)切除、肝動(dòng)脈化療栓塞(TACE)、外放射治療、瘤內(nèi)酒精注射(PAI)、微波固化治療(PMCT)、射頻消融(RFA)、激光熱療(LTT)及肝移植等，但療效均有限。肝癌五年的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移率高達(dá)60%，總體生存率仍低于5%。總之，現(xiàn)有治療手段未能顯著延長肝癌患者的生存期、改善病人的生存質(zhì)量。究其原因有以下三點(diǎn)第一、肝癌發(fā)—病隱匿，癌細(xì)胞容易早期播散。第二、傳統(tǒng)療法均不能徹底消滅肝癌細(xì)胞且具有較大的毒副作用，限制了它們在臨床上的反復(fù)應(yīng)用。第三、目前國內(nèi)外尚缺乏能在體內(nèi)外長期穩(wěn)定表達(dá)的、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性能高的、熒光蛋白標(biāo)記的、淋巴結(jié)與肺高轉(zhuǎn)移的肝癌細(xì)胞系，以滿足肝癌復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移生物學(xué)行為的早期示蹤研究、分子機(jī)理研究以及抗肝癌新藥療快速效篩選的熒光標(biāo)記研究模型。為此，復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所建立了人肝細(xì)胞癌裸小鼠模型(腫瘤1986,6:10-13)、高轉(zhuǎn)移人肝細(xì)胞癌裸小鼠模型UntJCancer1996，66:239-243)、高轉(zhuǎn)移人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HCCLM3和HCCLM6(JCancerResClinOncol.2004;T30:187-196;JCancerResClinOncol.2004;130:460-468;中華醫(yī)學(xué)雜志.2004;84:675-679;CancerGenetCytogenet.2005;158:180-183;和ClinCancerRes.2006;12:7140-7148)。目前國內(nèi)外腫瘤細(xì)胞熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)多釆用熒光蛋白編碼基因的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法。釆用該技術(shù)普遍存在著以下幾大缺陷1)在體外細(xì)胞培養(yǎng)體系中，熒光蛋白編碼基因不易轉(zhuǎn)染占細(xì)胞總數(shù)70。/。左右的G0-Gl期腫瘤細(xì)胞，故目的基因轉(zhuǎn)染效率低下；2)熒光蛋白編碼基因轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞常需要一個(gè)連續(xù)、復(fù)雜的抗生素如新霉素(G418)等的體外篩選過程，極易造成細(xì)胞污染；3)熒光蛋白編碼基因在腫瘤細(xì)胞染色體上的整合效率很低，在體外連續(xù)細(xì)胞傳代過程中熒光蛋白編碼基因很容易丟失，因此不易獲得長期穩(wěn)定表達(dá)的熒光示蹤腫瘤細(xì)胞。研發(fā)新一代_穩(wěn)定表達(dá)紅色或綠色熒光的人肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系已引起本領(lǐng)域研究人員的關(guān)注。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供穩(wěn)定表達(dá)熒光蛋白的人肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株及其建立方法，更具體的是建立染色體整合型、穩(wěn)定表達(dá)紅色或綠色熒光蛋白編碼基因的、肺與淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移的人肝癌細(xì)胞系。本發(fā)明所述的人肝癌細(xì)胞系是HCCLM3-R或HCCLM3-G或HCCLM6-R或HCCLM6-G。本發(fā)明所述的熒光蛋白是具有序列1的紅色熒光蛋白UFP)或具有序列—2的綠色熒光蛋白(GFP)。本發(fā)明為克服現(xiàn)有技術(shù)上的難點(diǎn)，釆用熒光蛋白編碼基因轉(zhuǎn)染策略，用能感染包括G0-G1、S及G2期腫瘤細(xì)胞的、廣譜的、染色體整合型的Lentivinis病毒載體系統(tǒng)，替代傳統(tǒng)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，采用已克隆的肺與淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移的人肝癌細(xì)胞系HCCLM3和HCCLM6(復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所)為母細(xì)胞，通過三種慢病毒包裝質(zhì)粒PLVTHM、pCMV-dR8.74和pMD2G(Tronolab公司，圖l-3)在大腸桿菌中的質(zhì)粒DNA擴(kuò)增、回收和純化。純化獲得的三種質(zhì)粒DNA按一定比例用CaCl2方法共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，產(chǎn)生可真核表達(dá)RFP或GFP熒光蛋白基因的假慢病毒顆粒，經(jīng)病毒純化、活性測定后，感染上述HCCLM3和HCCLM6肝癌細(xì)胞株(母細(xì)胞)，按常規(guī)方法分別進(jìn)行熒光表達(dá)肝癌細(xì)胞的擴(kuò)增建系".蕕得高強(qiáng)度、染色體整合型、穩(wěn)定表達(dá)紅色或綠色熒光的、肺與淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移的人肝癌細(xì)胞。分別命名為HCCLM3-R(紅色熒光)，HCCLM3-G(綠色熒光)，HCCLM6-R(紅色熒光)和HCCLM6-G(綠色熒光)(圖4,圖5)。本發(fā)明所釆用的紅色或綠色熒光蛋白編碼基因、轉(zhuǎn)染方法及熒光表達(dá)肝癌細(xì)胞具有以下特征1、所釆用的紅色熒光及綠色熒光蛋白編碼基因是經(jīng)過基因改造，可有效延緩熒光淬滅的時(shí)間，增加熒光的表達(dá)強(qiáng)度。2、所采用的假慢病毒感染新策略，對各期即G0-G1、S及G2期的肝癌細(xì)胞均—有感染，是廣譜的、外源基因染色體整合型的、穩(wěn)定表達(dá)的病毒感染系統(tǒng)。紅色或綠色熒光陽性表達(dá)HCCLM3和HCCLM6肝癌細(xì)胞系不需要經(jīng)過體外繁復(fù)、連續(xù)的篩選程序，避免了細(xì)胞克隆中的可能污染，縮短了獲得陽性細(xì)胞的克隆時(shí)間。同時(shí)極大地提高了紅色熒光或綠色熒光蛋白編碼基因的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定表達(dá)率，提高了實(shí)驗(yàn)的重復(fù)率。3、本發(fā)明獲得的紅色熒光蛋白表達(dá)肝癌細(xì)胞HCCLM3-R,HCCLM6-R細(xì)胞以及綠色熒光蛋白表達(dá)肝癌細(xì)胞HCCLM3-G，HCCLM6-G均可在常規(guī)條件下進(jìn)行細(xì)胞傳代。其中HCCLM3-R和HCCLM6-R肝癌細(xì)胞可在激發(fā)波長為化0nm、發(fā)射波長為585nm的條件下，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察；HCCLM3-G和HCCLM6-G肝癌細(xì)胞可在激發(fā)波長為488nm、發(fā)射波長為509nm的條件下，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。4、本發(fā)明所獲得的紅色或綠色熒光蛋白表達(dá)的高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞系，其特征是穩(wěn)定發(fā)射紅色或綠色熒光,細(xì)胞呈多邊形上皮樣，貼壁生長，接觸性生長抑制喪失，亞三倍體核型，染色體數(shù)目50-58條，均分泌AFP蛋白。其余主要生物學(xué)行為與其相應(yīng)的母細(xì)胞基本一致。本發(fā)明用慢病毒感染的方法獲得了高染色體整合度、高熒光強(qiáng)度、遺傳性狀穩(wěn)定的、肺與淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞系HCCLM3-R，CCLM3-G，HCCLM6-R和HCCLM6-G。所述的肝癌細(xì)胞具有持續(xù)表達(dá)高強(qiáng)度紅色熒光及綠色熒光的能力，其熒光強(qiáng)度不隨肝癌細(xì)胞的連續(xù)傳代(觀察至36代)而-丟失。熒光基因的整合和表達(dá)不影響肝癌細(xì)胞的主要生物學(xué)行為，為理想的、熒光示蹤的肝癌細(xì)胞模型。本發(fā)明獲得的熒光表達(dá)肝癌細(xì)胞系，在體外常規(guī)的二維及三維細(xì)胞培養(yǎng)體系中生長良好，可用于肝癌生長、轉(zhuǎn)移及死亡的分子機(jī)理研究；或作為抗腫瘤新藥療效判別的效應(yīng)細(xì)胞。此外，還可作為裸鼠皮下接種的肝癌細(xì)胞，用于裸鼠皮下和肝臟原位熒光示蹤肝癌模型的建立，為盡早發(fā)現(xiàn)裸鼠體內(nèi)肝癌細(xì)胞復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的變化提供參考，以及為在體抗腫瘤新藥或其他干預(yù)治療的效果評估提供便利。本發(fā)明在肝癌基礎(chǔ)研究及藥物臨床前期研究中具有廣闊的應(yīng)用前景和潛^E的社會(huì)與經(jīng)濟(jì)價(jià)值。圖l、慢病毒包裝質(zhì)粒pLVTH的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2、慢病毒包裝質(zhì)粒pCMV-dR8.74的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3、慢病毒包裝質(zhì)粒pMD2.G的結(jié)構(gòu)示意圖。圖4不同傳代時(shí)間的HCCLM3-R和HCCLM6-R肝癌細(xì)胞的紅色熒光表達(dá)情況。圖5—不同傳代時(shí)間的HCCLM3-G和HCCLM6-G肝癌細(xì)胞的綠色熒光表達(dá)情況。具體實(shí)施方式實(shí)施例11、慢病毒包裝質(zhì)粒(Lentivirualvector):釆用Lentivirus慢病毒載體系統(tǒng)(Tronolab公司)。該病毒包裝系統(tǒng)由pLVTHM(圖1),pCMV-dR8.74(圖2)和pMD2G(圖3)三質(zhì)粒組成，其中pLVTH含有RFP或GFP基因，由EF1(ElongationFactor)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)(圖1)。pCMV-dR8.74含有HIV病毒的gag基因，編碼病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白；pol基因，編碼病毒特異性的酶；rev基因，編碼調(diào)節(jié)gag和pol基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子(圖2)。pMD2G含有單純皰疹病毒來源的VSVg基因，提供病毒包—裝所需要的衣殼蛋白(圖3)。2、質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增質(zhì)粒pLVTHM、pCMV-dR8.74和pMD2G按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用相應(yīng)抗生素條選陽性克隆,用DM提取試劑盒(Qiagen公司)進(jìn)行質(zhì)粒DNA抽提，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Promega公司)進(jìn)行質(zhì)粒純化。3、慢病毒的包裝與純化將lOjagpLVTHM,5|iigpCMV-dR8.74和3.5ygpMD2G的質(zhì)粒DNA溶于1800(il無菌水中，加入200^U2.5mol/LCaC12溶液，混勻后再逐滴加入2000pi2xBBS緩沖液，在室溫放置20~30min。將上述DNA-磷酸鉤混合液轉(zhuǎn)染融合度為50%-70%的新鮮培養(yǎng)29—3細(xì)胞，置于37。C、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中，12小時(shí)后換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，經(jīng)低速離心、過濾和超速離心，收集上清液中的病毒顆粒。4、病毒滴度的測定用5x105/100pl/孔的293細(xì)胞鋪在96孔板中。用DMEM培養(yǎng)液IO倍連續(xù)稀釋病毒顆粒。12小時(shí)后吸盡96孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液，加人45nl病毒顆粒稀釋液，37。C溫育36小時(shí)后，更換含10%FBS的新鮮培養(yǎng)液，3天后在倒置熒光顯微鏡下檢測GFP或RFP的表達(dá)量。以5個(gè)克隆細(xì)胞均為陽性的病毒最高稀釋度為該批病毒的最終滴度。5、HCCLM3和HCCLM6細(xì)胞的病毒感染用1x106/2ml/孔的HCCLM3和HCCLM6細(xì)胞鋪在6孔板中，12小時(shí)后吸盡細(xì)胞培養(yǎng)上清液，加入2ml5xl05-lxl06Tl)/ml病毒感染液，48小時(shí)后換用新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，72小時(shí)觀察熒光表達(dá)細(xì)胞的陽性率。當(dāng)HCCLM3和HCCLM6細(xì)胞的病毒感染率小于95%時(shí)，用400-600ng/ml的G418殺滅低表達(dá)或不表達(dá)熒光的細(xì)胞。6、熒光表達(dá)細(xì)胞的擴(kuò)增及表達(dá)穩(wěn)定性的鑒定熒光表達(dá)HCCLM3和HCCLM6細(xì)胞，經(jīng)體外180天的連續(xù)傳代培養(yǎng)，結(jié)果顯示，肝癌細(xì)胞的熒光表達(dá)強(qiáng)度及表達(dá)率沒有發(fā)生明顯的改變。獲得穩(wěn)定表達(dá)紅色和綠色熒光的HCCLM3和HCCLM6細(xì)胞。分別命名為HCCLM3-R(紅色熒光)，HCCLM3-G(綠色熒光),HCCLM6-R(紅色熒光和HCCLM6-G(綠色熒光，)(圖4「圖5)。7、熒光表達(dá)細(xì)胞的生物學(xué)功能驗(yàn)證HCCLM3-R,HCCLM3-G,HCCLM6-R和HCCLM6-G肝癌細(xì)胞的一般生物學(xué)特性為，多邊形上皮樣腫瘤細(xì)胞，貼壁生長，接觸性生長抑制喪失，亞三倍體核型，染色體數(shù)目50-58條，可在裸鼠皮下及肝臟原位成瘤。HCCLM3-R和HCCLM3-G細(xì)胞的倍增時(shí)間、細(xì)胞周期、侵襲與轉(zhuǎn)移能力與其母細(xì)胞HCCLM3相似；HCCLM6-R和HCCLM6-G細(xì)胞的倍增時(shí)間、侵襲與轉(zhuǎn)移能力與其母細(xì)胞HCCLM6相結(jié)果表明，本發(fā)明較現(xiàn)有技術(shù)明顯地提高了紅色熒光及綠色熒光蛋白編—碼基因的轉(zhuǎn)染效率及對肝癌細(xì)胞染色體的整合效率；同時(shí)對紅色及綠色蛋白編碼基因通過有目的性的基因改造，有效地延緩了熒光淬滅的時(shí)間，增加熒光的強(qiáng)度；此外，免除了紅色及綠色熒光表達(dá)的肝癌HCCLM3和HCCLM6細(xì)胞系的體外連續(xù)篩選程序。本發(fā)明所獲得的紅色熒光及綠色熒光標(biāo)記的、肺與淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移的人肝癌HCCLM3和HCCLM6細(xì)胞，經(jīng)體外180天、36代的連續(xù)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，紅色及綠色熒光表達(dá)HCCLM3和HCCLM6肝癌細(xì)胞具有熒光強(qiáng)度強(qiáng)、熒光不易被淬滅，熒光表達(dá)穩(wěn)定，且不改變原有細(xì)胞生物學(xué)功能等特性，是較為理想的人高轉(zhuǎn)移肝癌熒光示蹤細(xì)胞?？稍隗w外二維及三維細(xì)胞培養(yǎng)體系中作為熒光,示記的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，用于肝癌生長、轉(zhuǎn)移及死亡的分子機(jī)理研究；也可作為效療判別細(xì)胞用于抗肝癌新藥的療效觀察；也可作為裸鼠皮下接種的熒光標(biāo)記肝癌細(xì)胞，用于熒光可視人高轉(zhuǎn)移肝癌裸鼠皮下模型和肝臟原位模型的建立，用于肝癌早期復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移生物學(xué)行為的監(jiān)視，以及在體藥物或其他干預(yù)治療效果的評估。表1是慢病毒與其他常用病毒感染系統(tǒng)的特性比較。表2是HCCLM3-R，HCCLM3-G與野生型HCCLM3的生物學(xué)特性比較。表3是HCCLM6-R,HCCLM6-G與野生型HCCLM6的生物學(xué)特性比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2HCCLM3HCCLM3-RHCCLM3-G表達(dá)熒光類型無紅色綠色激發(fā)波長(nm)無560488發(fā)射波長(nm)無585509病毒感染后72小時(shí)的0>99.0>99.0細(xì)胞熒光表達(dá)率(％)體外傳代180天后的0>99.0>99.0細(xì)胞熒光表達(dá)率(％)熒光表達(dá)強(qiáng)度(MOI)0>95>100AFP+++細(xì)胞倍增時(shí)間(h)35.035.032.0中期染色體數(shù)50-5650-5650-56表3:--—HCCLM6HCCLM6-RHCCLM6-G表達(dá)熒光類型無紅色綠色激發(fā)波長(nm)無560488發(fā)射波長(nm)無585509病毒感染后72小時(shí)的0>99.0>99.0細(xì)胞熒光表達(dá)率(％)體外傳代180天后的0>99.0>99.0細(xì)胞熒光表達(dá)率(％)熒光表達(dá)強(qiáng)度(MOI)0>卯>100AFP+++細(xì)胞倍增時(shí)間(h)33.034.030.0中期染色體數(shù)52-5852-5852-58SEQUENCELISTING<110〉復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院<120>穩(wěn)定表達(dá)熒光蛋白的人肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株及其建立方法<130〉11<160〉2<170>Patentlnversion3.1<210>——1<211〉675<212〉DNA<213〉昆蟲<400>1atggcctcctcatggagggcaccgtgaacgctac鵬ggccacaacaccgctgggacatcctgtcccccccgacatccccgactacaagagaacttcgaggacggcggcgcttcatctacaaggt，gtgaagaagaccatgggctgggg^gggcgagacccacaaggcaagtccatcccgagaacgt60gccacgagtt120tgaagctgaa180agttccagta240agctgtcctt300tggcgaccgt360tcatcggcgt420sggcctccac480ccctgaagct540catcaccgagcgagatcgagggtgaccaagcggctccaagccccgagggcgacccaggacgaacttcccccgagcgcctggaaggacggcUcatgcgctggcgagggcgggcggcccccgtgtacgtgattcaagtgggtcctccctgctccgacggcctacccccgcgggccactacctcaaggtgcgagggccgccctgcccttcgcagcaccccgcagcgcgtgataggacggctgccgtgatgcaacggcgtgcttggtggagtttacatggccaagaagcccgtgcagctgcccggctactactacgtggacgccaagctggac600atcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggagcagtacgagcgcaccgagggccgc660caccacctgttcctg675<210>2<211>720<212>隠<213>昆蟲<400>2atggtgagcacgagctggacggcgacgtaatgcca—cctacggcaagctgeictggcccaccctcgtgaccaccacatgaagcagcacgactcaccatcttcttcaaggacgcgacaccctggtgaETCicgcacctggggcacaagctggagtgcagaagaacagggcgagga60acggccacaa120ccctgaagtt180ccctgaccta240tcttcaagtc300acggcaacta360tcgagctgaa420acaactacaa480gctgttcaccgttcagcgtgcatctgcacccggcgtgcagcgccatgccccaagacccgcgggcatcgaccagccacaacggggtggtgctccggcgaggaccggcaagctgcttcagccgaaggcUcggccgaggtgattcaaggagggtctatatcaccatcctggtgcgagggcgatgcccgtgccgctaccccgatccaggagcgagttcgagggacggcaacattggccgacaaggcatcaagggcagctcgccgaccactacccgacaaccactacctgagcatcacatggtcctgctggagtgtaca—agtaatgaacttcaa540agcagaacac600cccagtccgc660tcgtgaccgc720gatccgccacccccatcggccctgagcaaacgccgggatcaacatcgagggacggccccggaccccaacgactctcggcaacggcagcgttgctgctgccagaagcgcgatggacgagct權(quán)利要求1、穩(wěn)定表達(dá)熒光蛋白的人肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株，其特征是以HCCLM3或HCCLM6為母細(xì)胞，假慢病毒轉(zhuǎn)染熒光蛋白編碼基因，穩(wěn)定發(fā)射紅色或綠色熒光，命名為紅色熒光蛋白表達(dá)肝癌細(xì)胞HCCLM3-R或HCCLM6-R以及綠色熒光蛋白表達(dá)肝癌細(xì)胞HCCLM3-G或HCCLM6-G，細(xì)胞呈多邊形上皮樣，貼壁生長，接觸性生長抑制喪失，亞三倍體核型，染色體數(shù)目50-58條，分泌AFP蛋白。2、按權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定表達(dá)熒光蛋白的人肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株，其特征是所述的熒光蛋白是具有序列1的紅色熒光蛋白R(shí)FP或具有序列2的綠色熒光蛋白GFP。3、按權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定表達(dá)熒光蛋白的人肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株，真—特征是所述的HCCLM3-R和HCCLM6-R肝癌細(xì)胞的熒光顯微鏡觀察條件是激發(fā)波長為560nm、發(fā)射波長為585nm;HCCLM3-G和HCCLM6-G肝癌細(xì)胞的熒光顯微鏡觀察條件是激發(fā)波長為488nm、發(fā)射波長為509nm。4、權(quán)利要求1的穩(wěn)定表達(dá)熒光蛋白的人肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株的建立方法，其特征是釆用熒光蛋白編碼基因轉(zhuǎn)染，用假慢病毒感染替代傳統(tǒng)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，通過下述步驟1)采用肺與淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移的人肝癌細(xì)胞系HCCLM3和HCCLM6為母細(xì)胞，通過三種慢病毒包裝質(zhì)粒pLVTHM、pCMV-dR8.74和pMD2G在大腸—tf菌中的質(zhì)粒DNA擴(kuò)增、回收和純化；2)純化獲得的三種質(zhì)粒DNA按比例用CaCh方法共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，產(chǎn)生可真核表達(dá)RFP或GFP熒光蛋白基因的假慢病毒顆粒，經(jīng)病毒純化、活性測定后，感染上述HCCLM3和HCCLM6肝癌細(xì)胞株；3)分別進(jìn)行熒光表達(dá)肝癌細(xì)胞的擴(kuò)增建系，獲得高強(qiáng)度、染色體整合型、穩(wěn)定表達(dá)紅色或綠色熒光的、肺與淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移的人肝癌細(xì)胞HCCLM3-R或HCCLM3-G或HCCLM6-R或HCCLM6-G。全文摘要本發(fā)明屬微生物動(dòng)物細(xì)胞系領(lǐng)域，涉及可發(fā)射高強(qiáng)度紅色或綠色熒光，具肺與淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移能力的人肝癌細(xì)胞系及其建立方法。本發(fā)明以肺與淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移的人肝癌細(xì)胞系HCCLM3、HCCLM6為母細(xì)胞，通過慢病毒包裝質(zhì)粒對293細(xì)胞的質(zhì)粒DNA共轉(zhuǎn)染，獲得真核表達(dá)紅色或綠色熒光蛋白基因的假慢病毒顆粒，感染上述母細(xì)胞肝癌細(xì)胞株，得到染色體整合型、可穩(wěn)定表達(dá)紅色或綠色熒光的肺及淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞系。本發(fā)明的肺與淋巴結(jié)人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞系在體內(nèi)外可作為腫瘤細(xì)胞的示蹤研究、肝癌復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理研究，以及抗腫瘤新藥臨床前期的藥物療效研究等，有廣闊的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)C12N15/65GK101381706SQ20071004567公開日2009年3月11日申請日期2007年9月6日優(yōu)先權(quán)日2007年9月6日發(fā)明者吳偉忠,夏景林,孫惠川,泱徐,楊畢偉,英梁,湯釗猷,魯王申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院